一种新型肝靶向的、具有siRNA导入能力的融合蛋白转让专利
申请号 : CN200610132354.7
文献号 : CN100579987C
文献日 : 2010-01-13
发明人 : 王强 , 李宝健 , 陆春
申请人 : 广州拓谱基因技术有限公司
摘要 :
本发明提供一种新型肝靶向的、具有siRNA导入能力的融合蛋白，它由两部分构成，其N端是人组织型纤溶酶原激活剂成熟形式第1-第274位氨基酸，其C端是人精蛋白I第2-第51位氨基酸。该融合蛋白，未采用与肝亲和基本无关的htPA蛋白酶结构域部分，这样既避免了由此产生的溶血风险，又避免了PAI的抑制性结合。所进行的体外体内实验均显示：htPA-hPRM1融合蛋白能靶向性地把小干扰RNA导入肝细胞。
权利要求 :
1.一种新型肝靶向的、具有siRNA导入能力的融合蛋白，其特征在于：它 由两部分构成，其N端是人组织型纤溶酶原激活剂成熟形式第1-第274位氨基酸， 其C端是人精蛋白I第2-第51位氨基酸；它的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.权利要求1所述的融合蛋白作为肝靶向的小干扰RNA导入制剂的应用。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白，尤其涉及一种肝靶向的、具有小干扰RNA(siRNA)导入 能力的融合蛋白。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是线虫、果蝇、高等植物、哺乳动物体内存 在的一种抑制基因表达的调控机制。当与某基因序列对应的双链RNA(double strand RN， dsRNA)出现在这些生物细胞内时，该dsRNA会被细胞内的Dicer酶切割成小分子双链 RNA，这些小分子RNA和细胞内一些蛋白形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced Silencing Complex，RISC)，RISC和对应基因的信使RNA(messager RNA，mRNA)结合， 切断该mRNA，从而导致对应基因表达的下调、抑制乃至完全沉默。
1998年，人们发现双链RNA抑制基因表达的效果比单链反义RNA好得多(Fire A， et al.Nature，1998，391：806)，首次揭示RNAi机制。随后的实验(Elbashir SM，et al. Nature，2001，411：494.)显示21～23nt长度的双链RNA(small interfering RNA，siRNA)可 以抑制哺乳动物细胞中的基因表达而不引发干扰素反应，为RNAi的实际应用打开了大 门。
RNAi从其1998年被发现以来的短短8年间，已广泛应用到生物医学研究应用的各 个领域(GrunwellerA，et al.Curr Med Chem，2005，12：3143.)。基于RNAi制剂的siRNA药 物，已在乙型肝炎、禽流感、AMD、艾滋病治疗研究中显示出很好的效果。
目前siRNA药物研发的瓶颈在于siRNA的导入技术。siRNA本身很难穿过细胞膜。 在体内，siRNA很容易被血浆和组织液稀释、降解。因此，讫需导入制剂来保护siRNA、 携载其到达靶区域并帮助siRNA穿过靶细胞膜。siRNA药物应用于肝病治疗领域也是 如此。
目前，在肝靶向siRNA导入研究领域主要采用以下方法来把siRNA导入体内肝脏 细胞。
1.HD法
流体动力学(hydrodynamic)注射把siRNA通过尾静脉导入肝脏。该方法导入的siRNA 多分布在肝、肾、脾、肺以及胰腺等器官中，器官特异性不强；更重要的是，该方法会 造成小鼠右侧心衰，不可能应用于人体。(Zender L，et al.Proc Natl Acad Sci USA， 2003，100：7797；Song E，et al.Nat Biotechnol，2005，23：709.)
2.胆固醇法
Soutschek等(Soutschek J，et al.Nature，2004，432：173.)把胆固醇偶联在化 学修饰过的siRNA一条链的一个末端，然后进行常规静脉注射，发现特异的siRNA能够特 异地抑制肝细胞内特定基因的表达。然而该方法所用剂量很高，达到50mg/kg体重/针， 这样的剂量离实际应用还很远；
3.AAV法
Uprichard(Uprichard SL，et al.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：773.)等 使用肝靶向性很好的腺相关病毒(AAV)载体，把特异的shRNA导入肝脏，发现可以很好地 抑制HBV的复制，并且抑制效果至少可持续26天。然而，Grimm等的研究显示：使用AAV 把shRNA导入小鼠体内，会导致小鼠肝损伤乃至死亡，原因是：shRNA的转录无法控制， 导致大量的shRNA饱和阻塞了机体正常生命活动所需的一些RNAi途径。在可控shRNA转录 启动子出现以前，AAV导入shRNA方式无实际应用价值(Grimm D，et al.Nature，2006， 441：537.)。
4.SNALP法
Morrissey等(Morrissey DV，et al.Nat Biotechnol，2005，23：1002.)使用一种 特殊的脂质体SNALP作为导入制剂包裹siRNA，该导入制剂由阳离子脂类和融合脂类混 合，混合物外再包裹着一层可扩散的PEG制成，整个聚合物直径大概在120nm左右。常规 静脉注射，3mg/kg/天，连续注射3天后，发现能够有效抑制HBV在小鼠体内的复制，而 且药效持续六星期左右，非常令人鼓舞。然而，临床试验显示该制剂会造成非常严重的 贫血。
5.单抗法
Song等(Song E，et al.Nat Biotechnol，2005，23：709.)采用针对HIV的env蛋白 的单克隆抗体片段与hPRM1的形成的融合蛋白作为导入制剂，成功地将抑制HIV的siRNA 导入所有测试的表达HIV env蛋白的细胞类型中；并应用该策略特异地抑制了肿瘤的生 长(剂量：2.5mg/kg/针，移植肿瘤后0，1，3天各静脉注射一针)。但是现今所采用的单 抗，很多是鼠源序列，对人而言属异种蛋白，存在一定的免疫原性，而针对某一特定靶 标的人源单抗目前尚较难获得。
1998年，人们发现双链RNA抑制基因表达的效果比单链反义RNA好得多(Fire A， et al.Nature，1998，391：806)，首次揭示RNAi机制。随后的实验(Elbashir SM，et al. Nature，2001，411：494.)显示21～23nt长度的双链RNA(small interfering RNA，siRNA)可 以抑制哺乳动物细胞中的基因表达而不引发干扰素反应，为RNAi的实际应用打开了大 门。
RNAi从其1998年被发现以来的短短8年间，已广泛应用到生物医学研究应用的各 个领域(GrunwellerA，et al.Curr Med Chem，2005，12：3143.)。基于RNAi制剂的siRNA药 物，已在乙型肝炎、禽流感、AMD、艾滋病治疗研究中显示出很好的效果。
目前siRNA药物研发的瓶颈在于siRNA的导入技术。siRNA本身很难穿过细胞膜。 在体内，siRNA很容易被血浆和组织液稀释、降解。因此，讫需导入制剂来保护siRNA、 携载其到达靶区域并帮助siRNA穿过靶细胞膜。siRNA药物应用于肝病治疗领域也是 如此。
目前，在肝靶向siRNA导入研究领域主要采用以下方法来把siRNA导入体内肝脏 细胞。
1.HD法
流体动力学(hydrodynamic)注射把siRNA通过尾静脉导入肝脏。该方法导入的siRNA 多分布在肝、肾、脾、肺以及胰腺等器官中，器官特异性不强；更重要的是，该方法会 造成小鼠右侧心衰，不可能应用于人体。(Zender L，et al.Proc Natl Acad Sci USA， 2003，100：7797；Song E，et al.Nat Biotechnol，2005，23：709.)
2.胆固醇法
Soutschek等(Soutschek J，et al.Nature，2004，432：173.)把胆固醇偶联在化 学修饰过的siRNA一条链的一个末端，然后进行常规静脉注射，发现特异的siRNA能够特 异地抑制肝细胞内特定基因的表达。然而该方法所用剂量很高，达到50mg/kg体重/针， 这样的剂量离实际应用还很远；
3.AAV法
Uprichard(Uprichard SL，et al.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：773.)等 使用肝靶向性很好的腺相关病毒(AAV)载体，把特异的shRNA导入肝脏，发现可以很好地 抑制HBV的复制，并且抑制效果至少可持续26天。然而，Grimm等的研究显示：使用AAV 把shRNA导入小鼠体内，会导致小鼠肝损伤乃至死亡，原因是：shRNA的转录无法控制， 导致大量的shRNA饱和阻塞了机体正常生命活动所需的一些RNAi途径。在可控shRNA转录 启动子出现以前，AAV导入shRNA方式无实际应用价值(Grimm D，et al.Nature，2006， 441：537.)。
4.SNALP法
Morrissey等(Morrissey DV，et al.Nat Biotechnol，2005，23：1002.)使用一种 特殊的脂质体SNALP作为导入制剂包裹siRNA，该导入制剂由阳离子脂类和融合脂类混 合，混合物外再包裹着一层可扩散的PEG制成，整个聚合物直径大概在120nm左右。常规 静脉注射，3mg/kg/天，连续注射3天后，发现能够有效抑制HBV在小鼠体内的复制，而 且药效持续六星期左右，非常令人鼓舞。然而，临床试验显示该制剂会造成非常严重的 贫血。
5.单抗法
Song等(Song E，et al.Nat Biotechnol，2005，23：709.)采用针对HIV的env蛋白 的单克隆抗体片段与hPRM1的形成的融合蛋白作为导入制剂，成功地将抑制HIV的siRNA 导入所有测试的表达HIV env蛋白的细胞类型中；并应用该策略特异地抑制了肿瘤的生 长(剂量：2.5mg/kg/针，移植肿瘤后0，1，3天各静脉注射一针)。但是现今所采用的单 抗，很多是鼠源序列，对人而言属异种蛋白，存在一定的免疫原性，而针对某一特定靶 标的人源单抗目前尚较难获得。
发明内容
本发明的目的是研发一种肝靶向的、具有siRNA导入能力的融合蛋白。
本发明所述的融和蛋白由两部分构成：蛋白N端部分，由人组织型纤溶酶原激活 剂(human tissue plasminogen activator，htPA)成熟形式第1-第274位氨基酸构成；蛋 白C端部分，由人精蛋白I(humanprotamine 1，hPRM1)第2-第51位氨基酸构成。 人组织型纤溶酶原激活剂(htPA)成熟形式氨基酸全序列详见NCBI数据库 (http://www.ncbi.nih.gov，Accession：NP_000921，第36-第562位氨基酸序列)，人精蛋白I (hPRM1)氨基酸全序列详见NCBI数据库(http://www.ncbi.nih.gov，Accession： NP_002752)。所形成的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述。
融合蛋白C端hPRM1部分，富含碱性氨基酸，带较多正电荷，可以和核酸等带负 电荷的生物大分子结合。在本融合蛋白中，起吸附、结合、运载siRNA的作用。
融合蛋白N端的人组织性纤溶酶原激活剂部分，具有很好的肝嗜性，可以引导融 合蛋白-siRNA复合物靶向肝脏。人组织型纤溶酶原激活剂(htPA)是人体内天然存在的 一种蛋白，是纤溶系统的组分之一。人组织型纤溶酶原激活剂(htPA)在人体内半衰期很 短，这主要由两方面原因造成：人纤溶酶原激活剂抑制物I(human plasminogen activator inhibitor I，PAI)与htPA的快速结合抑制以及当血液流经肝脏时肝实质细胞对htPA的快 速清除。PAI通过与htPA蛋白酶结构域中第299-第302位氨基酸结合来起作用，PAI 对删除这段氨基酸的htPA突变体基本无抑制作用。肝实质细胞在htPA体内清除中发挥 关键作用，有研究显示输入体内的htPA的80％在半小时之内就被肝脏从血液中清除干 净。肝实质细胞清除htPA主要通过两种方式进行：利用细胞表面的甘露糖受体来和htPA 分子上第117位、第184位氨基酸上的糖基结合，捕获htPA；通过细胞表面的低密度脂 蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)与htPA的指形结 构域结合而捕获htPA。(Narita M，et al.J Clin Invest，1995，96：1164；Biessen EA，et al. Circulation，1997，95：46；Lansink M，et al.Blood，1999，94：1330.)有研究显示去除了第117 位、第184位上糖基化位点的htPA突变体半衰期大大延长；去除或突变掉指形结构域 具有同样延长半衰期的效果。(Larsen GR，et al.Blood，1989，73：1842；Bassel-Duby R，et al. J Biol Chem，1992，267：9668.)
由此可见，htPA上第1-第274位氨基酸部分在htPA与肝细胞结合中起关键作用， 因此本融合蛋白取htPA的第1-第274位氨基酸作为靶向部分，引导融合蛋白-siRNA 复合物靶向肝脏。htPA共5个结构域：指形结构域、类表皮生长因子结构域、K1结构 域、K2结构域以及蛋白酶结构域。结构域在结构和功能上都是分立的(Novokhatny V，et al.J Biol Chem，1995，270：8680；Madison EL，et al.J Biol Chem，1995，270：7558.)，删除掉 某个结构域或在结构域间插入新氨基酸序列对其他结构域影响不大(Waldenstrom M，et al.Gene，1991，99：243；Smith J W，et al.J Biol Chem，1995，270：30486.)。而蛋白酶结构域 与其他4个结构域的分界就在第275位氨基酸-第276位氨基酸之间。因此，截取htPA 第1-第274位作为我们发明的融合蛋白的N端部分，从理论上讲不会影响其肝亲和性 质。
htPA具有很高的肝亲和性，同时它是人体内天然存在的蛋白质，不存在免疫原性 问题。同时，本发明提供的融合蛋白，未采用与肝亲和基本无关的htPA蛋白酶结构域 部分，这样既避免了由此产生的溶血风险(蛋白酶部分负责激活血栓溶解功能)，又避免 了PAI的抑制性结合(PAI的结合位点在蛋白酶结构域内)。所进行的体外体内实验均显 示：htPA-hPRM1融合蛋白能靶向性地把siRNA导入肝细胞。
本发明所述的融和蛋白由两部分构成：蛋白N端部分，由人组织型纤溶酶原激活 剂(human tissue plasminogen activator，htPA)成熟形式第1-第274位氨基酸构成；蛋 白C端部分，由人精蛋白I(humanprotamine 1，hPRM1)第2-第51位氨基酸构成。 人组织型纤溶酶原激活剂(htPA)成熟形式氨基酸全序列详见NCBI数据库 (http://www.ncbi.nih.gov，Accession：NP_000921，第36-第562位氨基酸序列)，人精蛋白I (hPRM1)氨基酸全序列详见NCBI数据库(http://www.ncbi.nih.gov，Accession： NP_002752)。所形成的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所述。
融合蛋白C端hPRM1部分，富含碱性氨基酸，带较多正电荷，可以和核酸等带负 电荷的生物大分子结合。在本融合蛋白中，起吸附、结合、运载siRNA的作用。
融合蛋白N端的人组织性纤溶酶原激活剂部分，具有很好的肝嗜性，可以引导融 合蛋白-siRNA复合物靶向肝脏。人组织型纤溶酶原激活剂(htPA)是人体内天然存在的 一种蛋白，是纤溶系统的组分之一。人组织型纤溶酶原激活剂(htPA)在人体内半衰期很 短，这主要由两方面原因造成：人纤溶酶原激活剂抑制物I(human plasminogen activator inhibitor I，PAI)与htPA的快速结合抑制以及当血液流经肝脏时肝实质细胞对htPA的快 速清除。PAI通过与htPA蛋白酶结构域中第299-第302位氨基酸结合来起作用，PAI 对删除这段氨基酸的htPA突变体基本无抑制作用。肝实质细胞在htPA体内清除中发挥 关键作用，有研究显示输入体内的htPA的80％在半小时之内就被肝脏从血液中清除干 净。肝实质细胞清除htPA主要通过两种方式进行：利用细胞表面的甘露糖受体来和htPA 分子上第117位、第184位氨基酸上的糖基结合，捕获htPA；通过细胞表面的低密度脂 蛋白受体相关蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)与htPA的指形结 构域结合而捕获htPA。(Narita M，et al.J Clin Invest，1995，96：1164；Biessen EA，et al. Circulation，1997，95：46；Lansink M，et al.Blood，1999，94：1330.)有研究显示去除了第117 位、第184位上糖基化位点的htPA突变体半衰期大大延长；去除或突变掉指形结构域 具有同样延长半衰期的效果。(Larsen GR，et al.Blood，1989，73：1842；Bassel-Duby R，et al. J Biol Chem，1992，267：9668.)
由此可见，htPA上第1-第274位氨基酸部分在htPA与肝细胞结合中起关键作用， 因此本融合蛋白取htPA的第1-第274位氨基酸作为靶向部分，引导融合蛋白-siRNA 复合物靶向肝脏。htPA共5个结构域：指形结构域、类表皮生长因子结构域、K1结构 域、K2结构域以及蛋白酶结构域。结构域在结构和功能上都是分立的(Novokhatny V，et al.J Biol Chem，1995，270：8680；Madison EL，et al.J Biol Chem，1995，270：7558.)，删除掉 某个结构域或在结构域间插入新氨基酸序列对其他结构域影响不大(Waldenstrom M，et al.Gene，1991，99：243；Smith J W，et al.J Biol Chem，1995，270：30486.)。而蛋白酶结构域 与其他4个结构域的分界就在第275位氨基酸-第276位氨基酸之间。因此，截取htPA 第1-第274位作为我们发明的融合蛋白的N端部分，从理论上讲不会影响其肝亲和性 质。
htPA具有很高的肝亲和性，同时它是人体内天然存在的蛋白质，不存在免疫原性 问题。同时，本发明提供的融合蛋白，未采用与肝亲和基本无关的htPA蛋白酶结构域 部分，这样既避免了由此产生的溶血风险(蛋白酶部分负责激活血栓溶解功能)，又避免 了PAI的抑制性结合(PAI的结合位点在蛋白酶结构域内)。所进行的体外体内实验均显 示：htPA-hPRM1融合蛋白能靶向性地把siRNA导入肝细胞。
附图说明
图1是本发明的转染实验结果柱形图。
具体实施方式
下面将结合附图附表和实施例对本发明作进一步说明。
【基因拼接】
首先，使用RNA提取试剂盒(Qiagen，USA)从宫颈癌细胞(Hela)培养细胞中提取总 RNA，定量后取1μg总RNA以oligo dT为引物、用cDNA合成试剂盒(宝生物大连有 限公司，中国)逆转录成cDNA。然后以此cDNA为PCR模板，使用ExTaq(宝生物大 连有限公司，中国)进行PCR扩增。扩增条件如下：
htPA第1-第274位氨基酸对应核苷酸序列的扩增
正向引物：GAATTCTCTTACCAAGTGATCTGCAG
反向引物：CGACAGCATCTGTACCTGGCAAACTGAGGCTGGCTGTACT
PCR条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，25个循环；72℃10 分钟。
PCR完成后，使用凝胶纯化回收试剂盒(齐特科公司，中国)回收备用。
hPRM1第2-第51位氨基酸对应核苷酸序列的扩增
正向引物：AGTACAGCCAGCCTCAGTTTGCCAGGTACAGATGCTGTCG
反向引物：GCGGCCGCTTAGTGTCTTCTACATCTCGGTC
PCR条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，25个循环；72℃10 分钟。
PCR完成后，使用凝胶纯化回收试剂盒(齐特科公司，中国)回收备用。
融合蛋白所对应基因的拼接：使用PCR法把htPA(1-274)和hPRM1(2-51)拼接起来。
PCR模板：上述两种PCR产物凝胶纯化回收产物等量混合物。
正向引物：GAATTCTCTTACCAAGTGATCTGCAG
反向引物：GCGGCCGCTTAGTGTCTTCTACATCTCGGTC
PCR条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，25个循环；72℃10 分钟。
PCR完成后，使用凝胶纯化回收试剂盒(齐特科公司，中国)回收，即得到纯化 的基因拼接产物。
【基因表达、纯化】
把上述纯化的基因拼接产物连接进pMD-18T载体(宝生物大连有限公司，中国)， 克隆进大肠杆菌DH5α，测序鉴定无误后，提取质粒，使用EcoRI和NotI(NEB，USA) 双酶切，凝胶回收975bp左右的片段备用；pPICZαA质粒(Invitrogen，USA)用同样的双 酶切处理、凝胶纯化，回收的片段与前面纯化的975bp左右的片段连接，转化大肠杆菌 Top10F’，提取质粒，备用。
取上述制备出的质粒10μg左右用Pme I(NEB，USA)单酶切线状化后，酚抽醇沉， 溶于10μL无菌双蒸水，电击转化毕赤酵母。电击转化方法是：毕赤酵母细胞用50毫升 YPD培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养至O.D.为1.4(600纳米波 长)时，4000转/分钟、4℃、离心5分钟收集沉淀，用25毫升左右冰冷的无菌蒸馏水 重悬后，4000转/分钟、4℃、离心5分钟，收集沉淀。沉淀加入10毫升1摩尔/升的 冰冷的无菌山梨糖醇溶液，重悬，按照上述条件再次离心，倒掉上清，沉淀重悬于200 μL1摩尔/升的冰冷的无菌山梨糖醇溶液中，取其中的80μL和前述的线状化质粒溶液 混合，转入冰冷的电击杯中，冰上放置5分钟，用电穿孔仪在1500伏，25微法，200 欧姆条件下对该细胞-DNA混合液进行电击。电击完毕后，迅速向电击杯中加入1毫升 冰冷的无菌山梨糖醇溶液(1摩尔/升)，用移液器轻轻将细胞重悬后，将电击杯中的所 有液体转入无菌塑料管中转化液30℃静置1小时后，余涂布于含Zeocin(100μg/mL) 的YPDS平板上(平板的配方是：1％酵母提取物(w/v)，2％蛋白胨(w/v)，1％琼脂 (w/v)，2％葡萄糖(w/v)，1mol/L的山梨糖醇、100μg/mLZeocin)，30℃培养，待转化子 长出后，挑取克隆进行液体培养。
挑取上述YPDS平板上长出的克隆，分别接种于10毫升BMGY培养基中(BMGY： 1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1.34％YNB(Gibcol，美 国)，0.00004％生物素，1％甘油)，30℃250转/分培养到O.D.600＝2.0，4000转/分离心 培养液5分钟，弃去上清后，加入10毫升左右BMMY培养基(BMMY：1％酵母膏，2％ 蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1.34％YNB，0.00004％生物素，0.5％甲 醇)，瓶口盖3层无菌纱布保持透气，30℃250转/分钟培养，每24小时补加50μL甲醇。 96小时候离心收集上清，即获得含有融合蛋白分子的发酵液。使用常规离子交换色谱处 理发酵液，洗脱液使用G-25排阻色谱脱盐后，过G-100排阻色谱，收集37kd左右的部 分，即得到融合蛋白纯品。纯品测定蛋白含量后-70℃保存备用。
【融合蛋白靶向性导入siRNA性质测定】
转染前一天，取一定数量Hela细胞和HepG2细胞分别铺在24孔板内，使得第二 天转染时细胞汇合度在70％-90％左右。
转染当天，按照说明书配制Lipofectamine2000-pCDNALacZ转染复合物 (Lipofecatmine2000、pCDNALacZ质粒均购自Invitrogen，USA)，按照说明书操作步骤 转染细胞。
pCDNA-lacZ质粒转染后第一天，配制siRNA转染混合物(表1)。其中anti-LacZ siRNA序列为5’-AAUUUAACCGCCAGUCAGGCU-3’(Zender L，et al.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100：7797.)，对照siRNA(mock siRNA)序列为 5’-AAUUUAAACUGACCGCCGGCU-3’，均在上海吉玛制药技术有限公司合成。
表1.转染混合物配方
融合蛋白 空白对照(PBS) anti-LacZ siRNA 每孔用量：0.8μgsiRNA， 0.5μg融合蛋白 每孔用量：0.8μgsiRNA 0.5μLPBS mock siRNA 每孔用量：0.8μgsiRNA， 0.5μg融合蛋白 每孔用量：0.8μgsiRNA 0.5μLPBS
在不同灭菌管内，分别加入上述siRNA和融合蛋白，补MEM培养基(Invitrogen， USA)至50μL，用移液枪轻柔混匀，4℃放置30分钟。
弃去旧培养基，换入新鲜预温培养基，按表2每孔分别加入上述siRNA转染混合 物，轻轻晃动培养板混匀后，放入37℃细胞培养箱。
表2.所有细胞转染实验总表
anti-LacZ siRNA-融合蛋白 复合物 mock siRNA-融合蛋白 复合物 anti-LacZ siRNA-PBS Mock siRNA-PBS Hela 3孔 3孔 3孔 3孔 HepaG2 3孔 3孔 3孔 3孔
siRNA转染后48小时，使用β-Gal检测试剂盒(Invitrogen，USA)按照厂家提供 的说明书来测定各孔在405nm波长的O.D.值，每个处理3孔取平均值作为该处理的O.D. 值，再除以该种细胞经mock siRNA-PBS处理后所得到的平均O.D.值，作为该处理的最 终值。
HepG2是人肝癌细胞系，而Hela是人子宫颈癌细胞系。从图1可以看出，当不加 导入制剂时，anti-LacZ siRNA对LacZ的表达没有影响(图1：c)。加入融合蛋白作为导 入制剂后，anti-LacZ对Hela细胞中LacZ的表达仅有微弱的抑制作用，而相反地， anti-LacZ对HepG2细胞中LacZ的表达有明显的抑制作用(图1：a)。这表明：1.我们所 构建的融合蛋白的确具有siRNA导入能力；2.这种导入能力是肝细胞靶向的。
序列表
<110>广州拓谱基因技术有限公司
<120>一种新型肝靶向的、具有siRNA导入能力的融合蛋白
<160>1
<210>1
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln
1 5 10 15
Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
20 25 30
Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val
35 40 45
Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln
50 55 60
Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala
65 70 75 80
Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln
85 90 95
Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu
100 105 110
Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly
115 120 125
Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
130 135 140
Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His
180 185 190
Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile
195 200 205
Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu
210 215 220
Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys
225 230 235 240
Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
245 250 255
Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro
260 265 270
Gln Phe Ala Arg Tyr Arg Cys Cys Arg Ser Gln Ser Arg Ser Arg Tyr
275 280 285
Tyr Arg Gln Arg Gln Arg Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Cys Gln
290 295 300
Thr Arg Arg Arg Ala Met Arg Cys Cys Arg Pro Arg Tyr Arg Pro Arg
305 310 315 320
Cys Arg Arg His
【基因拼接】
首先，使用RNA提取试剂盒(Qiagen，USA)从宫颈癌细胞(Hela)培养细胞中提取总 RNA，定量后取1μg总RNA以oligo dT为引物、用cDNA合成试剂盒(宝生物大连有 限公司，中国)逆转录成cDNA。然后以此cDNA为PCR模板，使用ExTaq(宝生物大 连有限公司，中国)进行PCR扩增。扩增条件如下：
htPA第1-第274位氨基酸对应核苷酸序列的扩增
正向引物：GAATTCTCTTACCAAGTGATCTGCAG
反向引物：CGACAGCATCTGTACCTGGCAAACTGAGGCTGGCTGTACT
PCR条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，25个循环；72℃10 分钟。
PCR完成后，使用凝胶纯化回收试剂盒(齐特科公司，中国)回收备用。
hPRM1第2-第51位氨基酸对应核苷酸序列的扩增
正向引物：AGTACAGCCAGCCTCAGTTTGCCAGGTACAGATGCTGTCG
反向引物：GCGGCCGCTTAGTGTCTTCTACATCTCGGTC
PCR条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，25个循环；72℃10 分钟。
PCR完成后，使用凝胶纯化回收试剂盒(齐特科公司，中国)回收备用。
融合蛋白所对应基因的拼接：使用PCR法把htPA(1-274)和hPRM1(2-51)拼接起来。
PCR模板：上述两种PCR产物凝胶纯化回收产物等量混合物。
正向引物：GAATTCTCTTACCAAGTGATCTGCAG
反向引物：GCGGCCGCTTAGTGTCTTCTACATCTCGGTC
PCR条件：94℃5分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，25个循环；72℃10 分钟。
PCR完成后，使用凝胶纯化回收试剂盒(齐特科公司，中国)回收，即得到纯化 的基因拼接产物。
【基因表达、纯化】
把上述纯化的基因拼接产物连接进pMD-18T载体(宝生物大连有限公司，中国)， 克隆进大肠杆菌DH5α，测序鉴定无误后，提取质粒，使用EcoRI和NotI(NEB，USA) 双酶切，凝胶回收975bp左右的片段备用；pPICZαA质粒(Invitrogen，USA)用同样的双 酶切处理、凝胶纯化，回收的片段与前面纯化的975bp左右的片段连接，转化大肠杆菌 Top10F’，提取质粒，备用。
取上述制备出的质粒10μg左右用Pme I(NEB，USA)单酶切线状化后，酚抽醇沉， 溶于10μL无菌双蒸水，电击转化毕赤酵母。电击转化方法是：毕赤酵母细胞用50毫升 YPD培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养至O.D.为1.4(600纳米波 长)时，4000转/分钟、4℃、离心5分钟收集沉淀，用25毫升左右冰冷的无菌蒸馏水 重悬后，4000转/分钟、4℃、离心5分钟，收集沉淀。沉淀加入10毫升1摩尔/升的 冰冷的无菌山梨糖醇溶液，重悬，按照上述条件再次离心，倒掉上清，沉淀重悬于200 μL1摩尔/升的冰冷的无菌山梨糖醇溶液中，取其中的80μL和前述的线状化质粒溶液 混合，转入冰冷的电击杯中，冰上放置5分钟，用电穿孔仪在1500伏，25微法，200 欧姆条件下对该细胞-DNA混合液进行电击。电击完毕后，迅速向电击杯中加入1毫升 冰冷的无菌山梨糖醇溶液(1摩尔/升)，用移液器轻轻将细胞重悬后，将电击杯中的所 有液体转入无菌塑料管中转化液30℃静置1小时后，余涂布于含Zeocin(100μg/mL) 的YPDS平板上(平板的配方是：1％酵母提取物(w/v)，2％蛋白胨(w/v)，1％琼脂 (w/v)，2％葡萄糖(w/v)，1mol/L的山梨糖醇、100μg/mLZeocin)，30℃培养，待转化子 长出后，挑取克隆进行液体培养。
挑取上述YPDS平板上长出的克隆，分别接种于10毫升BMGY培养基中(BMGY： 1％酵母膏，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1.34％YNB(Gibcol，美 国)，0.00004％生物素，1％甘油)，30℃250转/分培养到O.D.600＝2.0，4000转/分离心 培养液5分钟，弃去上清后，加入10毫升左右BMMY培养基(BMMY：1％酵母膏，2％ 蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)，1.34％YNB，0.00004％生物素，0.5％甲 醇)，瓶口盖3层无菌纱布保持透气，30℃250转/分钟培养，每24小时补加50μL甲醇。 96小时候离心收集上清，即获得含有融合蛋白分子的发酵液。使用常规离子交换色谱处 理发酵液，洗脱液使用G-25排阻色谱脱盐后，过G-100排阻色谱，收集37kd左右的部 分，即得到融合蛋白纯品。纯品测定蛋白含量后-70℃保存备用。
【融合蛋白靶向性导入siRNA性质测定】
转染前一天，取一定数量Hela细胞和HepG2细胞分别铺在24孔板内，使得第二 天转染时细胞汇合度在70％-90％左右。
转染当天，按照说明书配制Lipofectamine2000-pCDNALacZ转染复合物 (Lipofecatmine2000、pCDNALacZ质粒均购自Invitrogen，USA)，按照说明书操作步骤 转染细胞。
pCDNA-lacZ质粒转染后第一天，配制siRNA转染混合物(表1)。其中anti-LacZ siRNA序列为5’-AAUUUAACCGCCAGUCAGGCU-3’(Zender L，et al.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100：7797.)，对照siRNA(mock siRNA)序列为 5’-AAUUUAAACUGACCGCCGGCU-3’，均在上海吉玛制药技术有限公司合成。
表1.转染混合物配方
融合蛋白 空白对照(PBS) anti-LacZ siRNA 每孔用量：0.8μgsiRNA， 0.5μg融合蛋白 每孔用量：0.8μgsiRNA 0.5μLPBS mock siRNA 每孔用量：0.8μgsiRNA， 0.5μg融合蛋白 每孔用量：0.8μgsiRNA 0.5μLPBS
在不同灭菌管内，分别加入上述siRNA和融合蛋白，补MEM培养基(Invitrogen， USA)至50μL，用移液枪轻柔混匀，4℃放置30分钟。
弃去旧培养基，换入新鲜预温培养基，按表2每孔分别加入上述siRNA转染混合 物，轻轻晃动培养板混匀后，放入37℃细胞培养箱。
表2.所有细胞转染实验总表
anti-LacZ siRNA-融合蛋白 复合物 mock siRNA-融合蛋白 复合物 anti-LacZ siRNA-PBS Mock siRNA-PBS Hela 3孔 3孔 3孔 3孔 HepaG2 3孔 3孔 3孔 3孔
siRNA转染后48小时，使用β-Gal检测试剂盒(Invitrogen，USA)按照厂家提供 的说明书来测定各孔在405nm波长的O.D.值，每个处理3孔取平均值作为该处理的O.D. 值，再除以该种细胞经mock siRNA-PBS处理后所得到的平均O.D.值，作为该处理的最 终值。
HepG2是人肝癌细胞系，而Hela是人子宫颈癌细胞系。从图1可以看出，当不加 导入制剂时，anti-LacZ siRNA对LacZ的表达没有影响(图1：c)。加入融合蛋白作为导 入制剂后，anti-LacZ对Hela细胞中LacZ的表达仅有微弱的抑制作用，而相反地， anti-LacZ对HepG2细胞中LacZ的表达有明显的抑制作用(图1：a)。这表明：1.我们所 构建的融合蛋白的确具有siRNA导入能力；2.这种导入能力是肝细胞靶向的。
序列表
<110>广州拓谱基因技术有限公司
<120>一种新型肝靶向的、具有siRNA导入能力的融合蛋白
<160>1
<210>1
<211>324
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln
1 5 10 15
Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu
20 25 30
Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val
35 40 45
Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln
50 55 60
Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala
65 70 75 80
Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln
85 90 95
Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu
100 105 110
Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly
115 120 125
Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
130 135 140
Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala
145 150 155 160
Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly
165 170 175
Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His
180 185 190
Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile
195 200 205
Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu
210 215 220
Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys
225 230 235 240
Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys
245 250 255
Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro
260 265 270
Gln Phe Ala Arg Tyr Arg Cys Cys Arg Ser Gln Ser Arg Ser Arg Tyr
275 280 285
Tyr Arg Gln Arg Gln Arg Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Cys Gln
290 295 300
Thr Arg Arg Arg Ala Met Arg Cys Cys Arg Pro Arg Tyr Arg Pro Arg
305 310 315 320
Cys Arg Arg His