胸腺素β4衍生物及其应用转让专利
申请号 : CN200680025339.0
文献号 : CN100582121C
文献日 : 2010-01-20
发明人 : 聂李亚 , 马素永 , 许松山 , 文美玉
申请人 : 北京诺思兰德生物技术有限责任公司
摘要 :
本发明提供了胸腺素β4(Tβ4)衍生物以及含有其的药物组合物。这种衍生物是Gly-Tβ4和Ala-Tβ4。也提供了这些衍生物用于制备治疗皮肤组织损伤、心脏组织损伤、角膜损伤和/或冠心病的药物的用途。
权利要求 :
1.胸腺素β4衍生物，其选自具有SEQ ID NO：6所示氨基酸序列 的Gly-Tβ4和具有SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的Ala-Tβ4。
2.一种多核苷酸序列，其编码权利要求1所述的胸腺素β4衍生 物。
3.一种药物组合物，其含有权利要求1所述的胸腺素β4衍生 物，以及任选的药物上可接受的载体。
4.权利要求1的胸腺素β4衍生物用于制备治疗皮肤组织损伤、 心脏组织损伤、角膜损伤和/或冠心病的药物的用途。
说明书 :
技术领域
本发明涉及新的胸腺素β4(Tβ4)衍生物Gly-Tβ4和Ala-T β4。本发明还涉及含有所述Tβ4衍生物的药物组合物。本发明还 涉及所述Tβ4衍生物用于制备治疗皮肤组织损伤、心脏组织损伤、 角膜损伤和/或冠心病的药物的用途。本发明还涉及利用所述Tβ4 衍生物治疗皮肤组织损伤、心脏组织损伤、角膜损伤和/或冠心病的 疾病的方法。
发明背景
免疫系统是人体的防御系统。参与免疫反应的主要细胞有T淋巴 细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。而胸腺是T淋巴细胞发育、分化的免 疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴细胞发育分化 所需的一系列必需物质，其中Tβ4是现已结构和功能较为明确的一 种主要的胸腺因子。本领域周知，Tβ4是Goldstein等人，(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.257，No.2，pp.1000 -1006，1982，Chemical Characterization of Thymosin beta)最 早从小牛胸腺中提取的胸腺素组分5(TF5)中分离出来的一种多肽， 含43个氨基酸，如SEQ ID NO：1所示，分子量4.963KD，无二硫键与 糖基化。
Tβ-4是一种胚胎在心脏发病过程中表达的蛋白，它能促进心 脏细胞的迁移并影响这些细胞的生死存亡(Thymosin beta 4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration，survival and cardiac repair.Nature，Vol.432，2004 年11月25日)。上述文献研究表明，这种蛋白能够在实验诱导的心 脏病发作后防止细胞的死亡并限制疤痕组织形成的程度。Tβ-4已经 被用于临床试验，以促进皮肤创伤的痊愈。研究人员相信不久的将 来，Tβ-4蛋白将会进入心脏病治疗的临床试验阶段。
正如上述用Tβ4的活性所做的一项研究所表明的那样，Tβ4增 强组织培养物中胚胎及出生后心肌细胞的存活能力，在大鼠冠状动 脉结扎后腹膜内注射该蛋白，能成功刺激心脏修复和激活Akt存活 激酶。这些结果说明，T-β4对于急性冠状动脉闭塞是一个可能的治 疗目标。
德克萨斯州大学的研究人员在上述文献中还发现一种在心脏发 育过程中制造的蛋白质(即：Tβ-4)在心脏病发作后能够帮助心脏 器官的自我修复。这些在大鼠实验中获得的发现最终可能导致新的 心脏病疗法的出现并且可能改变医护人员对心脏病的处理方式。
本发明人通过对已知Tβ-4进行蛋白质三级结构分析，采用基 因工程方法对所述蛋白质的N-末端加以修饰，出人意料的获得在皮 肤组织损伤修复、心脏组织损伤修复等方面活性明显高于天然Tβ-4 的新Tβ-4衍生物。
Tβ-4是一种胚胎在心脏发病过程中表达的蛋白，它能促进心 脏细胞的迁移并影响这些细胞的生死存亡(Thymosin beta 4 activates integrin-linked kinase and promotes cardiac cell migration，survival and cardiac repair.Nature，Vol.432，2004 年11月25日)。上述文献研究表明，这种蛋白能够在实验诱导的心 脏病发作后防止细胞的死亡并限制疤痕组织形成的程度。Tβ-4已经 被用于临床试验，以促进皮肤创伤的痊愈。研究人员相信不久的将 来，Tβ-4蛋白将会进入心脏病治疗的临床试验阶段。
正如上述用Tβ4的活性所做的一项研究所表明的那样，Tβ4增 强组织培养物中胚胎及出生后心肌细胞的存活能力，在大鼠冠状动 脉结扎后腹膜内注射该蛋白，能成功刺激心脏修复和激活Akt存活 激酶。这些结果说明，T-β4对于急性冠状动脉闭塞是一个可能的治 疗目标。
德克萨斯州大学的研究人员在上述文献中还发现一种在心脏发 育过程中制造的蛋白质(即：Tβ-4)在心脏病发作后能够帮助心脏 器官的自我修复。这些在大鼠实验中获得的发现最终可能导致新的 心脏病疗法的出现并且可能改变医护人员对心脏病的处理方式。
本发明人通过对已知Tβ-4进行蛋白质三级结构分析，采用基 因工程方法对所述蛋白质的N-末端加以修饰，出人意料的获得在皮 肤组织损伤修复、心脏组织损伤修复等方面活性明显高于天然Tβ-4 的新Tβ-4衍生物。
发明内容
本发明的一个方面，涉及一种新Tβ4衍生物，其分别为SEQ ID NO：6所示的Gly-Tβ4，和SEQ ID NO：5所示的Ala-Tβ4。
本领域普通技术人员知晓，所述Gly-Tβ4以及Ala-Tβ4可以 通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本发明中， 所述Gly-Tβ4以及Ala-Tβ4是通过基因工程重组表达的方法获得 的。
在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得N-末端修饰 的胸腺素β4衍生物：Gly-Tβ4或Ala-Tβ4，包括如下步骤：
1)表达载体的构建
依据已知Tβ4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好 密码子全基因合成Tβ4DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序 列之N末端和C末端加上限制性酶切位点，并进行N-末端修饰，得 到编码Tβ4衍生物：Gly-Tβ4或Ala-Tβ4的核酸序列。依据已知 GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成先导肽DNA序 列且在相应于所编码的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶 切位点，得到先导肽核酸序列。
再分别将如上述制备的先导肽序列、Tβ4衍生物序列以及筛选 质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔 比加入T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子。
用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好 的本公司质粒pGM(该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达 GST类融合蛋白，为本公司构建)连接，经筛选得到正确地重组子。
2)重组Tβ4衍生物的表达及分离纯化
将如上述所得重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基 因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质 机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST 亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用凝血酶酶切后，再将样品通过阴 离子柱进一步纯化，使得最终蛋白纯度大于98％的终产物。
本发明的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的 Tβ4衍生物：Gly-Tβ4和/或Ala-Tβ4，以及任选的药物上可接受 的载体。
在本发明知，术语“药物上可接受的”意味着制药领域公认的 可用于动物，更特别的是可用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐 剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用 治疗剂的介质。
这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、 动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、 诸如此类。静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液 以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射 溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、 麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、 氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果 需要，组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂如透明质酸钠， 或是pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、 丸剂、胶囊粉剂、缓释配方、诸如此类的形式。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂形 式，其中含有0.01％-0.2％的胸腺素衍生物Gly-Tβ4或Ala-Tβ4， 以及5％的甘露醇，以及药物上可接受的载体。
将本发明的药用组合物配制成与其意向施用路径相容。施用路 径的实例包括但不限于肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口腔、 鼻内(例如吸入)、经皮(例如局部)、经粘膜、和直肠施用。在一 个具体实施方案中，依照常规流程将组合物配制成适合静脉内、皮 下、肌肉内、口腔、鼻内、或局部施用于人类的药用组合物。通常， 用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需 要，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂诸如麦角胺以减轻注射 部位的疼痛。
本发明的一个实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有 50-500μg/ml的胸腺素衍生物Gly-Tβ4和/或Ala-Tβ4，以及选自 氯霉素或氧氟沙星的抗生素，以及药物上可接受的载体；在本发明 的又一实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有50-500μg/ml 的胸腺素衍生物Gly-Tβ4和/或Ala-Tβ4，适量的透明质酸钠，以 及药物上可接受的载体；在本发明的另一实施方案中，所述组合物 为滴眼液，其中含有50-500μg/ml的胸腺素衍生物Gly-Tβ4和/或 Ala-Tβ4，适量的透明质酸钠，氯霉素或氧氟沙星，以及药物上可接 受的载体。
若要局部施用本发明的组合物，则可以将组合物配制成软膏、 乳膏、皮肤贴、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳 液的形式或是本领域技术人员众所周知的其它形式。参阅例如《雷 明顿氏药物科学和药物剂型导论》(Remington′s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)， 第19版，Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚，1995年。
对于非可喷雾局部剂量形式，通常采用包含与局部应用相容的 载体或一种或多种赋形剂且具有优选大于水的动态粘滞度的粘性至 半固体或固体形式。合适的配方包括但不限于溶液、悬浮液、乳状 液、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、药膏、诸如此类，如果需要，是无 菌的或与辅助试剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂缓冲剂、或盐) 混和以改变各种特性，诸如例如渗透压。其它合适的局部剂量形式 包括可喷雾气雾剂制剂，其中优选联合固相或液相惰性载体的活性 成分包装在含有增压挥发物(例如压缩气体，诸如氟利昂)的混合 物或是挤瓶中。如果需要，还可以向药物组合物和剂量形式中添加 增湿剂或湿润剂。这些额外成分的实例在本领域是众所周知的。
在本发明的又一实施方案中，所述药物组合物为软膏形式，其 中含有0.01％-0.2％的胸腺素衍生物Gly-Tβ4或Ala-Tβ4，和药物 上可接受的赋形剂如凡士林。
若本发明的方法包括组合物的鼻内施用，则组合物可以配制成 气雾剂、喷雾剂、轻雾剂、或滴剂的形式。具体而言，依照本发明 使用的预防性或治疗性试剂可以使用合适的推进剂(例如二氯二氟 甲烷、三氯单氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合适其它) 以气雾剂喷雾呈现的形式由增压包装或喷雾器进行方便的投递。在 增压气雾剂的情况中，可以通过提供阀门来确定剂量单位，以投递 计量数量。吸入器或吹入器中所使用的胶囊和药筒(由例如明胶构 成)可以配制成含有化合物及合适粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末 混合物。
在本发明的又一实施方案中，所述药物组合物为喷剂，其中含 有5-500μg/ml的胸腺素衍生物Gly-Tβ4或Ala-Tβ4，以及0.003％ 的尼泊金乙酯，和药物上可接受的载体。
若本发明的方法包括口服施用，则组合物可以配制成片剂、胶 囊、药包、软胶囊、溶液、悬浮液、诸如此类的形式。可以通过常 规手段用药用可接受赋形剂诸如粘合剂(例如预胶凝玉米淀粉、聚 乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维 素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、或硅石)；分解 质(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如月桂醇硫酸 钠)片剂或胶囊。可以通过本领域众所周知的方法包被片剂。用于 口腔施用的液体制剂可以采取但不限于溶液、糖浆、或悬浮液的形 式，或者它们可以以干燥产品的形式存在，使用前用水或其它合适 介质溶解。可以通过常规手段用药用可接受添加剂，诸如悬浮剂(例 如山梨醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵 磷脂或阿拉伯树胶)；非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇、或 分馏植物油)；以及防腐剂(例如甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山 梨酸)制备这些液体制剂。制剂还可以适当包含缓冲盐、芳香剂、 着色剂、和甜味剂。可以适当配制用于口腔施用的制剂以缓慢释放、 受控释放、或持续释放预防性或治疗性试剂。
本发明的方法还包括配制用于通过注射(例如通过推注或连续 输液)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的配方可以以含有额 外防腐剂的单位剂量形式(例如在安瓿中或在多剂量容器中)存在。 组合物可以采取诸如油性或水性介质中的悬浮液、溶液、或乳状液 等形式，而且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂、和/或分散剂。 或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适介质(例如无菌、 无热原水)溶解。
可用于提供本发明肠胃外剂量形式的合适介质对于本领域技术 人员而言是众所周知的。在某些实施方案中，适于肠胃外剂量形式 的介质包括但不限于注射用水USP；水性介质包括但不限于氯化钠注 射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、 以及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介质包括但不限于乙醇、聚乙 二醇、和聚丙二醇；以及非水性介质包括但不限于玉米油、棉籽油、 花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、和苯甲酸苯甲酯。
本发明的再一方面，涉及选自Gly-Tβ4和Ala-Tβ4之Tβ4 N 末端修饰衍生物用于制备治疗心脏组织损伤、皮肤组织损伤、角膜 损伤和/或冠心病的药物的用途。
本发明人出人意料的发现，在通过模式动物实验研究对受损心脏 组织修复、皮肤组织损伤修复、角膜损伤修复的活性方面，本发明 的Gly-Tβ4均具有明显高于天然Tβ4的活性。
本发明人首先研究了Gly-Tβ4和Ala-Tβ4对心脏组织修复的作 用。研究人员将60只成年大鼠的冠状动脉结扎模拟心脏病发作，从 而得到大鼠冠状动脉左前降支结扎再灌流模型。连续注射胸腺素衍 生物Gly-Tβ4、Ala-Tβ4或胸腺素Tβ4一月的大鼠受损心脏中， 细胞很少死亡，并在心脏病发后数周改善了心脏功能，而且Gly-T β4或Ala-Tβ4的治疗效果比Tβ4明显。本发明人发现胸腺素衍生 物Gly-Tβ4或Ala-Tβ4均能够改变细胞的代谢并创造出更强大的 心肌细胞，这些细胞能够抵抗心脏病发后的低氧状况。
本发明人还研究了Gly-Tβ4和Ala-Tβ4对受损表皮组织的作 用。研究人员将30只成年大鼠的表皮划伤，从而得到大鼠表皮损伤 模型。连续涂抹胸腺素Gly-Tβ4、Ala-Tβ4或Tβ4 5天的大鼠的 伤口长度比空白对照小50％，而且Gly-Tβ4或Ala-Tβ4的治疗效果 比Tβ4明显。
本发明人还研究了Gly-Tβ4对受损角膜组织的作用，研究人员 将30只成年大鼠的角膜用1N烧碱烧伤，从而得到大鼠角膜损伤模 型。连续眼部滴胸腺素Gly-Tβ4或Tβ4 4天的大鼠的受损角膜完 全恢复，而用生理盐水组的动物角膜不但没恢复，还出现了严重的 炎症和充血。
上述结果表明，本发明的Tβ4衍生物Gly-Tβ4和/或Ala-Tβ4 在治疗心脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤等方面具有 明显高于天然Tβ4的活性。
本发明的又一方面涉及利用所述Tβ4衍生物Gly-Tβ4和/或 Ala-Tβ4治疗受试对象特别是人的心脏组织损伤、表皮组织损伤以 及角膜组织损伤的方法。自本发明的一个实施方案中，所述治疗心 脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤的方法包括向所述受 试对象施用治疗有效量的本发明所述Tβ4衍生物Gly-Tβ4和/或 Ala-Tβ4。
本领域普通技术人员知晓，施用的方式、频率和剂量将根据所 治疗的病症、病况和个体的不同而异。一般来说，可以通过注射(例 如皮内、肌内、静脉内或皮下)、局部施用(例如表皮施用)或滴加施 用(例如滴眼剂)等方式施用。也可以根据患者个体的不同选择合 理的施用途径和施用方案。合适的剂量为当施用上述的药物组合物 后能够有效治疗心脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤的 的量。
一般来说，对于含有本发明所述Tβ4衍生物Gly-Tβ4和/或 Ala-Tβ4的药物组合物，存在于每一个剂量中的量大约为 100μg-5mg。合适的剂量的多少将因患者病症以及给药方式而异，但 一般从大约0.1ml-5ml。
本领域普通技术人员知晓，所述Gly-Tβ4以及Ala-Tβ4可以 通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本发明中， 所述Gly-Tβ4以及Ala-Tβ4是通过基因工程重组表达的方法获得 的。
在本发明的一个实施方案中，通过如下方法获得N-末端修饰 的胸腺素β4衍生物：Gly-Tβ4或Ala-Tβ4，包括如下步骤：
1)表达载体的构建
依据已知Tβ4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好 密码子全基因合成Tβ4DNA序列，同时在相应于所编码的氨基酸序 列之N末端和C末端加上限制性酶切位点，并进行N-末端修饰，得 到编码Tβ4衍生物：Gly-Tβ4或Ala-Tβ4的核酸序列。依据已知 GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成先导肽DNA序 列且在相应于所编码的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶 切位点，得到先导肽核酸序列。
再分别将如上述制备的先导肽序列、Tβ4衍生物序列以及筛选 质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔 比加入T4连接体系。经转化、筛选成功的重组子。
用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好 的本公司质粒pGM(该质粒为卡那霉素抗性筛选标记，能大量表达 GST类融合蛋白，为本公司构建)连接，经筛选得到正确地重组子。
2)重组Tβ4衍生物的表达及分离纯化
将如上述所得重组子转化到表达宿主菌，经表达筛选出高表达基 因工程菌，然后经发酵，得到目的蛋白高表达的工程菌。高压均质 机破碎细菌并离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST 亲和柱上，洗脱目的前体蛋白并用凝血酶酶切后，再将样品通过阴 离子柱进一步纯化，使得最终蛋白纯度大于98％的终产物。
本发明的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的 Tβ4衍生物：Gly-Tβ4和/或Ala-Tβ4，以及任选的药物上可接受 的载体。
在本发明知，术语“药物上可接受的”意味着制药领域公认的 可用于动物，更特别的是可用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐 剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用 治疗剂的介质。
这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、 动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、 诸如此类。静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液 以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射 溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、 麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、 氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果 需要，组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂如透明质酸钠， 或是pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、 丸剂、胶囊粉剂、缓释配方、诸如此类的形式。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂形 式，其中含有0.01％-0.2％的胸腺素衍生物Gly-Tβ4或Ala-Tβ4， 以及5％的甘露醇，以及药物上可接受的载体。
将本发明的药用组合物配制成与其意向施用路径相容。施用路 径的实例包括但不限于肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口腔、 鼻内(例如吸入)、经皮(例如局部)、经粘膜、和直肠施用。在一 个具体实施方案中，依照常规流程将组合物配制成适合静脉内、皮 下、肌肉内、口腔、鼻内、或局部施用于人类的药用组合物。通常， 用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需 要，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂诸如麦角胺以减轻注射 部位的疼痛。
本发明的一个实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有 50-500μg/ml的胸腺素衍生物Gly-Tβ4和/或Ala-Tβ4，以及选自 氯霉素或氧氟沙星的抗生素，以及药物上可接受的载体；在本发明 的又一实施方案中，所述组合物为滴眼液，其中含有50-500μg/ml 的胸腺素衍生物Gly-Tβ4和/或Ala-Tβ4，适量的透明质酸钠，以 及药物上可接受的载体；在本发明的另一实施方案中，所述组合物 为滴眼液，其中含有50-500μg/ml的胸腺素衍生物Gly-Tβ4和/或 Ala-Tβ4，适量的透明质酸钠，氯霉素或氧氟沙星，以及药物上可接 受的载体。
若要局部施用本发明的组合物，则可以将组合物配制成软膏、 乳膏、皮肤贴、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液、乳 液的形式或是本领域技术人员众所周知的其它形式。参阅例如《雷 明顿氏药物科学和药物剂型导论》(Remington′s Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms)， 第19版，Mack出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚，1995年。
对于非可喷雾局部剂量形式，通常采用包含与局部应用相容的 载体或一种或多种赋形剂且具有优选大于水的动态粘滞度的粘性至 半固体或固体形式。合适的配方包括但不限于溶液、悬浮液、乳状 液、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、药膏、诸如此类，如果需要，是无 菌的或与辅助试剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂缓冲剂、或盐) 混和以改变各种特性，诸如例如渗透压。其它合适的局部剂量形式 包括可喷雾气雾剂制剂，其中优选联合固相或液相惰性载体的活性 成分包装在含有增压挥发物(例如压缩气体，诸如氟利昂)的混合 物或是挤瓶中。如果需要，还可以向药物组合物和剂量形式中添加 增湿剂或湿润剂。这些额外成分的实例在本领域是众所周知的。
在本发明的又一实施方案中，所述药物组合物为软膏形式，其 中含有0.01％-0.2％的胸腺素衍生物Gly-Tβ4或Ala-Tβ4，和药物 上可接受的赋形剂如凡士林。
若本发明的方法包括组合物的鼻内施用，则组合物可以配制成 气雾剂、喷雾剂、轻雾剂、或滴剂的形式。具体而言，依照本发明 使用的预防性或治疗性试剂可以使用合适的推进剂(例如二氯二氟 甲烷、三氯单氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合适其它) 以气雾剂喷雾呈现的形式由增压包装或喷雾器进行方便的投递。在 增压气雾剂的情况中，可以通过提供阀门来确定剂量单位，以投递 计量数量。吸入器或吹入器中所使用的胶囊和药筒(由例如明胶构 成)可以配制成含有化合物及合适粉末基质诸如乳糖或淀粉的粉末 混合物。
在本发明的又一实施方案中，所述药物组合物为喷剂，其中含 有5-500μg/ml的胸腺素衍生物Gly-Tβ4或Ala-Tβ4，以及0.003％ 的尼泊金乙酯，和药物上可接受的载体。
若本发明的方法包括口服施用，则组合物可以配制成片剂、胶 囊、药包、软胶囊、溶液、悬浮液、诸如此类的形式。可以通过常 规手段用药用可接受赋形剂诸如粘合剂(例如预胶凝玉米淀粉、聚 乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如乳糖、微晶纤维 素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、或硅石)；分解 质(例如马铃薯淀粉或淀粉乙醇酸钠)；或润湿剂(例如月桂醇硫酸 钠)片剂或胶囊。可以通过本领域众所周知的方法包被片剂。用于 口腔施用的液体制剂可以采取但不限于溶液、糖浆、或悬浮液的形 式，或者它们可以以干燥产品的形式存在，使用前用水或其它合适 介质溶解。可以通过常规手段用药用可接受添加剂，诸如悬浮剂(例 如山梨醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵 磷脂或阿拉伯树胶)；非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇、或 分馏植物油)；以及防腐剂(例如甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山 梨酸)制备这些液体制剂。制剂还可以适当包含缓冲盐、芳香剂、 着色剂、和甜味剂。可以适当配制用于口腔施用的制剂以缓慢释放、 受控释放、或持续释放预防性或治疗性试剂。
本发明的方法还包括配制用于通过注射(例如通过推注或连续 输液)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的配方可以以含有额 外防腐剂的单位剂量形式(例如在安瓿中或在多剂量容器中)存在。 组合物可以采取诸如油性或水性介质中的悬浮液、溶液、或乳状液 等形式，而且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂、和/或分散剂。 或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适介质(例如无菌、 无热原水)溶解。
可用于提供本发明肠胃外剂量形式的合适介质对于本领域技术 人员而言是众所周知的。在某些实施方案中，适于肠胃外剂量形式 的介质包括但不限于注射用水USP；水性介质包括但不限于氯化钠注 射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、 以及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介质包括但不限于乙醇、聚乙 二醇、和聚丙二醇；以及非水性介质包括但不限于玉米油、棉籽油、 花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、和苯甲酸苯甲酯。
本发明的再一方面，涉及选自Gly-Tβ4和Ala-Tβ4之Tβ4 N 末端修饰衍生物用于制备治疗心脏组织损伤、皮肤组织损伤、角膜 损伤和/或冠心病的药物的用途。
本发明人出人意料的发现，在通过模式动物实验研究对受损心脏 组织修复、皮肤组织损伤修复、角膜损伤修复的活性方面，本发明 的Gly-Tβ4均具有明显高于天然Tβ4的活性。
本发明人首先研究了Gly-Tβ4和Ala-Tβ4对心脏组织修复的作 用。研究人员将60只成年大鼠的冠状动脉结扎模拟心脏病发作，从 而得到大鼠冠状动脉左前降支结扎再灌流模型。连续注射胸腺素衍 生物Gly-Tβ4、Ala-Tβ4或胸腺素Tβ4一月的大鼠受损心脏中， 细胞很少死亡，并在心脏病发后数周改善了心脏功能，而且Gly-T β4或Ala-Tβ4的治疗效果比Tβ4明显。本发明人发现胸腺素衍生 物Gly-Tβ4或Ala-Tβ4均能够改变细胞的代谢并创造出更强大的 心肌细胞，这些细胞能够抵抗心脏病发后的低氧状况。
本发明人还研究了Gly-Tβ4和Ala-Tβ4对受损表皮组织的作 用。研究人员将30只成年大鼠的表皮划伤，从而得到大鼠表皮损伤 模型。连续涂抹胸腺素Gly-Tβ4、Ala-Tβ4或Tβ4 5天的大鼠的 伤口长度比空白对照小50％，而且Gly-Tβ4或Ala-Tβ4的治疗效果 比Tβ4明显。
本发明人还研究了Gly-Tβ4对受损角膜组织的作用，研究人员 将30只成年大鼠的角膜用1N烧碱烧伤，从而得到大鼠角膜损伤模 型。连续眼部滴胸腺素Gly-Tβ4或Tβ4 4天的大鼠的受损角膜完 全恢复，而用生理盐水组的动物角膜不但没恢复，还出现了严重的 炎症和充血。
上述结果表明，本发明的Tβ4衍生物Gly-Tβ4和/或Ala-Tβ4 在治疗心脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤等方面具有 明显高于天然Tβ4的活性。
本发明的又一方面涉及利用所述Tβ4衍生物Gly-Tβ4和/或 Ala-Tβ4治疗受试对象特别是人的心脏组织损伤、表皮组织损伤以 及角膜组织损伤的方法。自本发明的一个实施方案中，所述治疗心 脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤的方法包括向所述受 试对象施用治疗有效量的本发明所述Tβ4衍生物Gly-Tβ4和/或 Ala-Tβ4。
本领域普通技术人员知晓，施用的方式、频率和剂量将根据所 治疗的病症、病况和个体的不同而异。一般来说，可以通过注射(例 如皮内、肌内、静脉内或皮下)、局部施用(例如表皮施用)或滴加施 用(例如滴眼剂)等方式施用。也可以根据患者个体的不同选择合 理的施用途径和施用方案。合适的剂量为当施用上述的药物组合物 后能够有效治疗心脏组织损伤、表皮组织损伤以及角膜组织损伤的 的量。
一般来说，对于含有本发明所述Tβ4衍生物Gly-Tβ4和/或 Ala-Tβ4的药物组合物，存在于每一个剂量中的量大约为 100μg-5mg。合适的剂量的多少将因患者病症以及给药方式而异，但 一般从大约0.1ml-5ml。
附图说明
图1是对大鼠模型注射Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠心脏壁厚度 的影响结果。
图2是对大鼠模型注射Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠心脏壁纤维 化程度的影响结果。
图3是对大鼠模型使用Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠表皮伤口愈 合程度的影响结果。
图4是对大鼠模型使用Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠的损伤角膜 表皮形成程度的影响结果。
图5是对大鼠模型注射Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠心脏壁厚度 的影响结果。
图6是对大鼠模型注射Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠心脏壁纤维 化程度的影响结果。
图7是对大鼠模型使用Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠表皮伤口愈 合时间的影响结果。
图8是对大鼠模型使用Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠表皮伤口瘢 痕程度的影响结果。
图9是对家兔角膜碱烧伤模型中施用Tβ4组(C)、Ala-Tβ4 组(B)和PBS组(A)第1天时，观察到角膜上皮被碱烧毁的结果。
图10是对家兔角膜碱烧伤模型中施用Tβ4组(B)、Ala-Tβ 4组(C)和PBS组(A)后第5天时，观察到角膜上皮恢复的结果。
依照用于专利程序的布达佩斯条约，发明人于2006年7月5日 分别将通过基因工程重组获得的重组菌株PGMT β4-A/BL21和PGMT β4-G/BL21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC，北京，中关村北一条，)，保藏号为CGMCC 1750和CGMCC 1751。
以下结合附图和实施例对本发明进一步示例性说明，但不构成对 本发明产生任何限制。
实施例1.胸腺素β4衍生物Gly-Tβ4的制备
1.重组质粒pGMTβ4-G的制备
依据已知Tβ4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，如下：
Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys
Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys
Gln Ala Gly Glu Ser
(SEQ ID NO：1)；
选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成Tβ4DNA序列，得到Gly-T β4核酸序列，为方便基因重组操作，同时在相应于所述多肽之N 末端和C末端加上限制性酶切位点BamHI、XhoI，在N末端修饰上甘 氨酸Gly，如SEQ ID NO：2所示。
GGA TCC GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTC GAT AAG TCG
BamHI
AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCC AAA GAA ACG ATT
GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG
XhoI(SEQ ID NO：2)；
其中限制性酶切位点用下划线标明。
其所对应的氨基酸序列如下：
Gly Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys
Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu
Lys Gln Ala Gly Glu Ser
(SEQ ID NO：6)；
依据已知GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成 先导肽DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位点EcoRI、BamH I， 得到先导肽的核酸序列，如SEQ ID NO：3所示：
GAATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCA
EcoRI
CTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATG
GCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTA
ACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTG
CAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGA
CTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGT
CATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTT
TATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCC
ACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT
GGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCC
BamHI(SEQ ID NO：3)；
按照本领域常用方法，参见如《分子克隆(第二版)：实验室指 南》(1992，冷泉港实验室)，将如上述制备的先导肽、Gly-Tβ4以 及筛选质粒pBSK(Stratagene公司，货号212205)用限制性内切酶 EcoRI、XhoI、BamHI处理，其中EcoRI和BamHI切先导肽，XhoI和 BamHI切Gly-Tβ4，EcoRI和XhoI切筛选质粒pBSK，经计算各样品 浓度后，按摩尔比1∶1加入T4连接体系。经转化、筛选出得到包 含上述Gly-Tβ4核酸序列和先导肽融合蛋白基因的重组质粒，命为 pSK-Tβ41。
分别用相应的限制性内切酶切下所述融合蛋白基因，再将该融合 蛋白基因片段与经XhoI和EcoR I双酶切后质粒pGM(该质粒为卡那 霉素抗性筛选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本公司构建) 的回收大片段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片段进行连接。 经酶切和序列测定对所得重组子筛选鉴别，得到正确连接的重组质 粒，命名为pGMTβ4-G。
2.含有重组质粒pGMTβ4-G的基因工程菌的制备
然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50μg/ml卡那霉 素的LB平板，挑选阳性菌落，鉴别合有上述重组质粒pGMTβ4-G的 转化子。
在LK液体培养基中培养所述转化子至OD600为0.6-0.8时，加 入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％ SDS-PAGE电泳时出现一条30KD左右的蛋白带，表达量为40％。经T β4的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。获得高效表达胸腺 素衍生物Gly-Tβ4蛋白的基因工程菌，命名为PGM2Tβ4/BL21。
按照上述制备方法，申请人还获得了高效表达胸腺素衍生物 Gly-Tβ4蛋白的基因工程菌，命名为PGMTβ4-G/BL21(保藏号： CGMCC No：1751)。
3.Gly-Tβ4的表达及纯化
1)摇瓶表达：将如上述制备的含Gly-Tβ4蛋白基因的基因工程 菌PGMTβ4-G/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中摇瓶过 夜培养(37℃，200rpm)，再按体积比1∶30接种至含有50μg/ml 卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱 导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素衍生物Gly- Tβ4(30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的60％。
2)大规模发酵表达：
a.培养基组成：
a)种子液培养基(LK)：
胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、 卡那霉素：50微克/毫升。
b)种养基(15升)：
磷酸氢二钠：315克、磷酸二氢钾：100克、氯化钠：10.05克、 氯化铵：50克、胰蛋白胨：90克。
以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁：15克、葡萄糖：450克、补料(500克/升)：葡萄糖。
b.发酵及诱导表达：
i)种子培养：
从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角 瓶)LK中，36℃、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到 700毫升LK中，36℃、200转/分，培养过夜。
ii)发酵及诱导表达过程：
将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36℃、 150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时， 约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(三小时)。
3).层析：
(i)亲和层析
采用GSH-Agrose层析介质(Pharmacia公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱(Pharmacia公司)，平衡后用含10mM还原型谷胱 甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。
(ii)酶解
上一步的洗脱液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小时。
(iii)阴离子交换层析
采用Source30Q层析(Pharmacia公司)介质，平衡液为20mM PB (磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液)，pH7，将步骤(2)酶解得到的样 品用水稀释1倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7，0-1M NaCl 的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
4).检测
将经过上述纯化步骤得到的Gly-Tβ4通过SDS-PAGE纯度检测和 反相HPLC检测，纯度大于98％。
实施例2胸腺素β4衍生物Ala-Tβ4的制备
1.重组质粒pGMTβ4-A的制备
依据已知Tβ4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好 密码子全基因合成Tβ4 DNA序列，得到Ala-Tβ4核酸序列，为方 便基因重组操作，同时在相应于所述多肽之N末端和C末端加上限 制性酶切位点BamHI、XhoI，在N末端修饰上丙氨酸Ala，如SEQ ID NO：4所示：
GGA TCC CCT CGA GCT TCT GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA
BamHI
TTC GAT AAG TCG AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCC
AAA GAA ACG ATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG
XhoI
(SEQ ID NO：4)；
其中限制性酶切位点用下划线标明。
其所对应当氨基酸序列如下：
Ala Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys
Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu
Lys Gln Ala Gly Glu Ser
(SEQ ID NO：5)；
依据已知GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成 先导肽DNA序列且在在相应于所述多肽之N末端和C末端加上限制 性酶切位点EcoRI、BamH I，得到先导肽核酸序列(如SEQ ID NO：3 所示)
按照本领域常用方法，参见如《分子克隆(第二版)：实验室指 南》(1992，冷泉港实验室)，将如上述制备的先导肽核酸序列、Ala-T β4核酸序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶EcoRI、XhoI、BamHI 处理，其中EcoRI和BamHI切先导肽，XhoI和BamHI切Ala-Tβ4， EcoRI和XhoI切筛选质粒pBSK，经计算各样品浓度后，按摩尔比1∶ 1加入T4连接体系。经转化、筛选出得到包含上述Ala-Tβ4核酸序 列和先导肽融合蛋白基因的重组质粒，命为pSK-Tβ42。
用限制性内切酶切下所述融合蛋白基因，再将该融合蛋白基因片 段与经XhoI和EcoR I双酶切后质粒PGM(该质粒为卡那霉素抗性筛 选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本公司构建)的回收大片 段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片断进行连接。经酶切和 序列测定对所得重组子筛选鉴别，得到正确连接的重组质粒，命名 为pGMTβ4-A。
2.含有所述重组质粒的基因工程菌的制备
然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50μg/ml卡那霉 素的LB平板，挑选阳性菌落，鉴别含有上述重组质粒pGMTβ4-A的 转化子。
在LK液体培养基中培养所述转化子至OD600为0.6-0.8时，加 入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％ SDS-PAGE电泳时出现一条30KD左右的蛋白带，表达量为40％。经胸 腺素β4的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。获得高效表达 胸腺素衍生物Ala-Tβ4蛋白的基因工程菌，命名为PGMTβ4/BL21
按照上述制备方法，申请人还获得了高效表达胸腺素衍生物 Gly-Tβ4蛋白的基因工程菌，命名为PGMTβ4-A/BL21(保藏号： CGMCC No：1750)。
3.Ala-Tβ4的表达及纯化
1)摇瓶表达：将如上述制备的含Ala-Tβ4蛋白基因的基因工程 菌pGMTβ4-A/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中摇瓶过 夜培养(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有50μg/ml卡那霉素 的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱导4小时。 收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素衍生物Ala-Tβ4 (30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的60％。
2)大规模发酵表达：
a.培养基组成：
a)种子液培养基(LK)：
胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、 卡那霉素：50微克/毫升。
b)种养基(15升)：
磷酸氢二钠：315克、磷酸二氢钾：100克、氯化钠：10.05克、 氯化铵：50克、胰蛋白胨：90克。
以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁：15克、葡萄糖：450克、补料(500克/升)：葡萄糖。
c.发酵及诱导表达：
i)种子培养：
从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角 瓶)LK中36℃、200转/分培养，8小时后将这50毫升种子液转接 到700毫升LK中，36℃、200转/分，培养过夜。
ii)发酵及诱导表达过程：
将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36℃、 150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时， 约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(三小时)。
3)层析：
(i)亲和层析
采用GSH-Agrose层析介质(Pharmacia公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱(Pharmacia公司)，平衡后用含10mM还原型谷胱 甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。
(ii)酶解
上一步的洗脱液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小时。
(iii)阴离子交换层析
采用Source30Q层析(Pharmacia公司)介质，平衡液为20mM PB， pH7，将步骤(2)酶解得到的样品用水稀释1倍进行上样，平衡后 采用20mM PB，pH7，0-1M NaCl的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
4)检测
得到的Ala-Tβ4通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯 度大于98％。
实施例3胸腺素β4衍生物Gly-Tβ4和Ala-Tβ4与天然胸腺素T β4对大鼠心脏缺血模型的治疗效果评价
1.病态动物模型的制作与试验方法
为了评价和比较Gly-Tβ4与Tβ4减少心脏组织损伤和减少心肌 纤维化的生物学活性，建立了急性心肌梗塞的病态动物模型---大鼠 冠状动脉左前降支再灌流模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒 精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位，在 完全无菌状态下进行手术。切开大鼠前胸壁皮肤，切断第3到第6 肋骨，露出胸腔，将肺推向一侧，打开心囊，露出心脏。从冠状动 脉左前降支起点到3mm处，用6-0聚丙烯结扎丝与NELATON结扎血 管，1小时后再灌注。确认无出血后，将切断的肋骨与胸骨缝合，再 缝合皮肤。手术后肌肉注射庆大霉素3mg/kg/天，共3天，防止感染。
2.利用超声心动图比较左心室前壁厚度
1)Gly-Tβ4与Tβ4的比较
依步骤1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组(每 组20只，注射生理盐水200μl/只/天)，阳性对照组(每组20只， 腹腔注射天然胸腺素Tβ4 10μg/只/天)，试验组(每组20只，腹 腔注射胸腺素衍生物Gly-Tβ4 10μg/只/天)给药。
给药后第14、28、56天利用心脏超声心动图(Live 3D Echo 7500) 与探针(probe 15-16L)，测定各组动物左心室前壁厚度。结果如下：
基础值(第0天，给药前)，阴性对照组0.2682±0.01，阳性对 照组0.2513±0.032，Gly-Tβ4组0.2499±0.0225，各组之间无显 著性差异。给药14天，阴性对照组0.1365±0.0125，阳性对照组 0.1919±0.012，与阴性对照组相比，有显著性差异(p＝0.048＜0.05)。 Gly-Tβ4组0.2162±0.0078，与阴性对照组相比，有显著性差异 (p＝0.003＜0.05)。与阳性对照组相比，有差异(p＝0.086＜0.1)。
这些结果显示，Gly-Tβ4与Tβ4均能有效恢复心肌梗塞引起的 左心室壁厚度的减少(见图1)。其中，所述Gly-Tβ4引起心脏左心 室前壁厚度增加的效果出人意料的大大高于Tβ4的效果。
2)Ala-Tβ4与Tβ4的比较
依步骤1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组(每 组20只，注射生理盐水200μl/只/天)，阳性对照组(每组20只， 腹腔注射天然胸腺素Tβ4 10μg/只/天)，试验组(每组20只，腹 腔注射胸腺素衍生物Ala-Tβ4 10μg/只/天)给药。
给药后第14、28、56天利用心脏超声心动图(Live 3D Echo 7500) 与探针(probe 15-16L)，测定各组动物左心室前壁厚度。结果如下：
基础值(第0天，给药前)，阴性对照组0.2594±0.0225，阳 性对照组0.2378±0.018，Ala-Tβ4组0.2432±0.01，各组之间无 显著性差异。
给药第14天阴性对照组0.1306±0.0128，阳性对照组0.1215 ±0.013，Ala-Tβ4组0.1299±0.011，各组之间无显著性差异。
给药第28天，阴性对照组0.1207±0.0151，阳性对照组0.1233 ±0.0071，Ala-Tβ4组0.1288±0.012，各组之间无显著性差异。
给药56天，阴性对照组0.1265±0.0125，阳性对照组0.1232 ±0.0057，Ala-Tβ4组0.1672±0.0078，Ala-Tβ4组心脏左心室 前壁厚度增加(p＜0.05)。
这些结果显示，Ala-Tβ4能有效恢复心肌梗塞引起的左心室壁 厚度的减少(见图5)。其中，所述Ala-Tβ4引起心脏左心室前壁厚 度增加的效果出人意料的大大高于Tβ4的效果。
3。利用组织学图片比较心室纤维化程度
依步骤1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组(每 组20只，注射生理盐水200μl/只/天)，阳性对照组(每组20只， 腹腔注射胸腺素Tβ4 10μg/只/天)，试验组(每组20只，腹腔注 射胸腺素Gly-Tβ4 10μg/只/天)给药。结果如下：
在给药后第56天，取心脏，以乳头状肌肉为准，横切心脏，做 成切片。用1％福尔马林浸泡24小时，制造石腊组织切片及玻片，进 行Masson’trichrom染色。各组之间比较采用了Image-PLUS ver.4.1(Media Cybernetics)方法。
1)Gly-Tβ4与Tβ4的比较
心肌纤维化部分占全左心室心肌的比率为，阴性对照组30.02± 5.1％，阳性对照组23.15±2.9％(P＜0.05)，Gly-Tβ4组15.36 ±2.7％(P＜0.0005)。
由上述结果显示，阴性对照组与阳性对照组、Gly-Tβ4组之间 有显著性差异，尤其Gly-Tβ4组有非常显著性差异。所述结果表明 Gly-Tβ4和Tβ4均能有效减少心肌梗塞引起的心肌纤维化(见图 2)。其中，所述Gly-Tβ4引起所述心肌纤维化的减少效果出人意料 的大大高于Tβ4的效果。
2)Ala-Tβ4与Tβ4的比较
心肌纤维化部分占全左心室心肌的比率为，阴性对照组28.13± 2.1％，阳性对照组22.91±2.3％(P＜0.05)，Ala-Tβ4组16.86± 1.8％(P＜0.0005)；阴性对照组与阳性对照组、Ala-Tβ4组之间有 显著性差异，尤其Ala-Tβ4组有非常显著性差异。这些结果表明 Ala-Tβ4和Tβ4均能有效减少心肌梗塞引起的心肌纤维化(见图 6)。其中，所述Ala-Tβ4引起所述心肌纤维化的减少效果出人意料 的大大高于Tβ4的效果。
实施例4Gly-Tβ4、Ala-Tβ4与Tβ4对大鼠表皮损伤模型的治疗 效果评价
1.病态动物模型的制作与试验方法
为了评价和比较Gly-Tβ4与Tβ4修复表皮组织损伤的活性性， 建立了表皮损伤的病态动物模型：大鼠表皮损伤模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒 精消毒大鼠后背皮肤；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位， 在完全无菌状态下进行手术。切开大鼠后背皮肤3cm。
2.利用电脑图像分析系统测量伤口长度
1)Gly-Tβ4与Tβ4的比较
如上述步骤1)建立大鼠表皮损伤模型后，分别向阴性对照组 (每组10只，生理盐水50μl/只)，阳性对照组(每组10只，天然 胸腺素5μg/50μl/只)，试验组(每组20只，胸腺素衍生物Gly-T β4 5μg/50μl/只)表皮涂抹给药，每天4次。
给药5天后，利用电脑图像分析系统测量伤口长度。结果如下：
基础值(第0天，给药前)，阴性对照组3.15±0.21，阳性对 照组3.07±0.18，Gly-Tβ4组3.13±0.11，各组之间无显著性差异。
给药第5天阴性对照组2.37±0.18，阳性对照组1.62±0.13， Gly-Tβ4组1.14±0.12各组之间有显著性差异。
这些结果显示，Gly-Tβ4能有效促进表皮伤口愈合(见图3)。 其中，Gly-Tβ4促进表皮伤口愈合的活性出人意料的明显强于Tβ4。
2)Ala-Tβ4与Tβ4的比较
如步骤1)建立大鼠表皮损伤模型后，用喷雾器局部喷射给予 阴性对照物(PBS)、阳性对照物(Tβ4)、试验物质(Ala-Tβ4)， 每天喷4次。Tβ4、Ala-Tβ4的药物浓度为100μg/ml，
用药后每天观察伤口愈合情况。
试验结果
①伤口炎症反应：PBS组伤口的红肿、渗出等炎症反应较明显， 持续约2-3天；Tβ4组和Ala-Tβ4组的炎症反应较轻微，持续约 1-2天。
②伤口愈合时间：伤口愈合时间PBS组为7.3±1.02天，Tβ4 组为5.8±0.91天，Ala-Tβ4组为4.7±0.83天。各组之间比较， Tβ4组和Ala-Tβ4组伤口愈合时间明显短于PBS组(P＜0.05)，结 果见图7。
结果表明Tβ4和Ala-Tβ4均具有明显的促进伤口愈合的作 用。其中，施用Ala-Tβ4的伤口愈合时间明显比施用Tβ4的短
③瘢痕大小：给药2周后，比较各组的瘢痕大小，其结果为： 阴性对照组为2.3±0.31cm，Tβ4组为1.9±0.23cm，Ala-Tβ4组 为1.7±0.30cm；而且Tβ4组和Ala-Tβ4组的瘢痕为较细的线 状瘢痕、表面比较平整，而阴性对照组瘢痕为较粗、表面不平。
各组之间比较，Tβ4组和Ala-Tβ4组伤口瘢痕明显小于PBS组 (P＜0.05)，结果见图8。
结果表明，Tβ4和Ala-Tβ4均具有明显的抗瘢痕形成作用。 其中，施用Ala-Tβ4的伤口瘢痕明显比施用Tβ4的小
实施例5Gly-Tβ4、Ala-Tβ4与Tβ4对大鼠角膜损伤模型的治疗 效果评价
1.Gly-Tβ4与Tβ4的比较
1)、病态动物模型的制作与试验方法
为了评价Gly-Tβ4与Tβ4修复角膜组织损伤的活性性，建立 了急性角膜损伤的病态动物模型：大鼠角膜碱烧伤模型。
把直径2毫米的滤纸片浸泡到1N的烧碱中，然后将浸泡好的 滤纸片放到大鼠角膜正中央，30秒以后用PBS充分冲洗。立刻用 Gly-Tβ4与Tβ4治疗，4天后挖出眼球，10％甲醛固定后用石蜡包 埋，沿着瞳孔视神经平面连续切片，切好的片用图像分析系统采集、 分析角膜上皮恢复情况。
2).利用电脑图像分析系统测量角膜上皮恢复情况
如上述步骤1)建立大鼠角膜损伤模型后，分别向阴性对照组 (每组10只，用滴眼液局部给予生理盐水30μl/只，4次/天)，阳 性对照组(每组10只，天然胸腺素30μl/只，4次/天)，试验组(每 组10只，胸腺素Gly-Tβ4 30μl/只，4次/天)眼部给药。
给药4天后挖出眼球，10％甲醛固定后用石蜡包埋，沿着瞳孔视 神经平面连续切片，切好的片用图像分析系统采集、分析角膜上皮 恢复情况。结果如下：
基础值(第0天，给药前)，阴性对照组4.82±0.12，Tβ4组 4.76±0.18，Gly-Tβ4组4.85±0.16，各组之间无显著性差异。
给药第4天阴性对照组4.89±0.12，Tβ4组7.03±0.13，Gly-T β4组7.62±0.11，阴性对照组与Tβ4组、Gly-Tβ4组之间有显著 性差异，尤其Gly-Tβ4组有非常显著性差异。
这些结果表明Gly-Tβ4和Tβ4均能有效促进角膜碱烧伤后的 恢复(见图4)。其中，Gly-Tβ4促进角膜损伤修复的活性出人意料 的明显强于Tβ4。
2.Ala-Tβ4与Tβ4的比较
1)、病态动物模型的制作与试验方法
为了评价Ala-Tβ4与Tβ4的药物有效性，建立了急性角膜损伤 的病态动物模型：家兔角膜碱烧伤模型。
把直径8毫米的滤纸片浸泡到1N的烧碱中，然后将浸泡好的滤 纸片放到家兔角膜正中央，30秒以后用生理盐水充分冲洗。立刻用 Ala-Tβ4与Tβ4治疗。分别于1，5天后挖出眼球，10％甲醛固定 后用石蜡包埋，沿着瞳孔视神经平面连续切片，切好的片经染色后 用图像分析系统采集、分析角膜上皮恢复情况。
2)、给药方法
建立家兔角膜碱烧伤模型后，用滴眼液局部给予阴性对照物 (PBS)、阳性对照物(Tβ4)、试验物质(Ala-Tβ4)，每天滴4次。 Tβ4、Ala-Tβ4的药物浓度为500μg/ml，用药后每天观察角膜上 皮恢复情况。
3)、试验结果
角膜上皮恢复情况：Tβ4组、Ala-Tβ4组和PBS组在给药第 一天时，均观察到角膜上皮被碱烧毁(参见图9A-C)。然而，PBS 组在第五天试验结束时，有部分角膜上皮细胞还未长出(见图10A)； Tβ4组在第五天试验结束时，所有损伤的角膜上皮细胞均恢复正常， 且可以观察到1-2层上皮细胞出现(见图10B)；Ala-Tβ4组在第 五天试验结束时，所有损伤的角膜上皮细胞均恢复正常，且可以观 察到3-4层上皮细胞出现(见图10C)。各组之间比较，Tβ4组和Ala -Tβ4组角膜上皮恢复情况明显优于PBS组，Ala-Tβ4组角膜上皮 恢复情况明显优于Tβ4组。结果表明，Tβ4和Ala-Tβ4具有明显 的促进膜碱烧伤的角膜上皮恢复作用，其中Ala-Tβ4的角膜上皮 恢复作用优于Tβ4。
序列表
<110>北京诺思兰德生物技术有限责任公司
<120>胸腺素β4衍生物及其应用
<130>IEC060029PCT
<150>200510083894.6
<151>2005-07-15
<150>200510103293.7
<151>2005-09-23
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>43
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys
1 5 10 15
Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu
20 25 30
Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser
35 40
<210>2
<211>141
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Gly-T-beta 4
<400>2
ggatccgaca aacccgatat ggctgagatc gagaaattcg ataagtcgaa actgaagaag 60
acagagacgc aagagaaaaa tccactgcct tccaaagaaa cgattgaaca ggagaagcaa 120
gcaggcgaat cgtaactcga g 141
<210>3
<211>684
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>CST
<400>3
gaattcatgt cccctatact aggttattgg aaaattaagg gccttgtgca acccactcga 60
cttcttttgg aatatcttga agaaaaatat gaagagcatt tgtatgagcg cgatgaaggt 120
gataaatggc gaaacaaaaa gtttgaattg ggtttggagt ttcccaatct tccttattat 180
attgatggtg atgttaaatt aacacagtct atggccatca tacgttatat agctgacaag 240
cacaacatgt tgggtggttg tccaaaagag cgtgcagaga tttcaatgct tgaaggagcg 300
gttttggata ttagatacgg tgtttcgaga attgcatata gtaaagactt tgaaactctc 360
aaagttgatt ttcttagcaa gctacctgaa atgctgaaaa tgttcgaaga tcgtttatgt 420
cataaaacat atttaaatgg tgatcatgta acccatcctg acttcatgtt gtatgacgct 480
cttgatgttg ttttatacat ggacccaatg tgcctggatg cgttcccaaa attagtttgt 540
tttaaaaaac gtattgaagc tatcccacaa attgataagt acttgaaatc cagcaagtat 600
atagcatggc ctttgcaggg ctggcaagcc acgtttggtg gtggcgacca tcctccaaaa 660
tcggatctgg ttccgcgtgg atcc 684
<210>4
<211>153
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>Ala-T-beta4
<400>4
ggatcccctc gagcttctga caaacccgat atggctgaga tcgagaaatt cgataagtcg 60
aaactgaaga agacagagac gcaagagaaa aatccactgc cttccaaaga aacgattgaa 120
caggagaagc aagcaggcga atcgtaactc gag 153
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<211>44
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>Ala-T-beta 4
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Ala Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser
1 5 10 15
Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys
20 25 30
Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser
35 40
<210>6
<211>44
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>Gly-T-beta 4
<400>6
Gly Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser
1 5 10 15
Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys
20 25 30
Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser
35 40
图2是对大鼠模型注射Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠心脏壁纤维 化程度的影响结果。
图3是对大鼠模型使用Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠表皮伤口愈 合程度的影响结果。
图4是对大鼠模型使用Tβ4和Gly-Tβ4后对大鼠的损伤角膜 表皮形成程度的影响结果。
图5是对大鼠模型注射Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠心脏壁厚度 的影响结果。
图6是对大鼠模型注射Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠心脏壁纤维 化程度的影响结果。
图7是对大鼠模型使用Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠表皮伤口愈 合时间的影响结果。
图8是对大鼠模型使用Tβ4和Ala-Tβ4后对大鼠表皮伤口瘢 痕程度的影响结果。
图9是对家兔角膜碱烧伤模型中施用Tβ4组(C)、Ala-Tβ4 组(B)和PBS组(A)第1天时，观察到角膜上皮被碱烧毁的结果。
图10是对家兔角膜碱烧伤模型中施用Tβ4组(B)、Ala-Tβ 4组(C)和PBS组(A)后第5天时，观察到角膜上皮恢复的结果。
依照用于专利程序的布达佩斯条约，发明人于2006年7月5日 分别将通过基因工程重组获得的重组菌株PGMT β4-A/BL21和PGMT β4-G/BL21保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC，北京，中关村北一条，)，保藏号为CGMCC 1750和CGMCC 1751。
以下结合附图和实施例对本发明进一步示例性说明，但不构成对 本发明产生任何限制。
实施例1.胸腺素β4衍生物Gly-Tβ4的制备
1.重组质粒pGMTβ4-G的制备
依据已知Tβ4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，如下：
Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys
Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys
Gln Ala Gly Glu Ser
(SEQ ID NO：1)；
选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成Tβ4DNA序列，得到Gly-T β4核酸序列，为方便基因重组操作，同时在相应于所述多肽之N 末端和C末端加上限制性酶切位点BamHI、XhoI，在N末端修饰上甘 氨酸Gly，如SEQ ID NO：2所示。
GGA TCC GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA TTC GAT AAG TCG
BamHI
AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCC AAA GAA ACG ATT
GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG
XhoI(SEQ ID NO：2)；
其中限制性酶切位点用下划线标明。
其所对应的氨基酸序列如下：
Gly Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys
Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu
Lys Gln Ala Gly Glu Ser
(SEQ ID NO：6)；
依据已知GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成 先导肽DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位点EcoRI、BamH I， 得到先导肽的核酸序列，如SEQ ID NO：3所示：
GAATTCATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCA
EcoRI
CTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATG
GCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTA
ACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTG
CAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGA
CTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGT
CATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTT
TATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCC
ACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGT
GGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCC
BamHI(SEQ ID NO：3)；
按照本领域常用方法，参见如《分子克隆(第二版)：实验室指 南》(1992，冷泉港实验室)，将如上述制备的先导肽、Gly-Tβ4以 及筛选质粒pBSK(Stratagene公司，货号212205)用限制性内切酶 EcoRI、XhoI、BamHI处理，其中EcoRI和BamHI切先导肽，XhoI和 BamHI切Gly-Tβ4，EcoRI和XhoI切筛选质粒pBSK，经计算各样品 浓度后，按摩尔比1∶1加入T4连接体系。经转化、筛选出得到包 含上述Gly-Tβ4核酸序列和先导肽融合蛋白基因的重组质粒，命为 pSK-Tβ41。
分别用相应的限制性内切酶切下所述融合蛋白基因，再将该融合 蛋白基因片段与经XhoI和EcoR I双酶切后质粒pGM(该质粒为卡那 霉素抗性筛选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本公司构建) 的回收大片段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片段进行连接。 经酶切和序列测定对所得重组子筛选鉴别，得到正确连接的重组质 粒，命名为pGMTβ4-G。
2.含有重组质粒pGMTβ4-G的基因工程菌的制备
然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50μg/ml卡那霉 素的LB平板，挑选阳性菌落，鉴别合有上述重组质粒pGMTβ4-G的 转化子。
在LK液体培养基中培养所述转化子至OD600为0.6-0.8时，加 入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％ SDS-PAGE电泳时出现一条30KD左右的蛋白带，表达量为40％。经T β4的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。获得高效表达胸腺 素衍生物Gly-Tβ4蛋白的基因工程菌，命名为PGM2Tβ4/BL21。
按照上述制备方法，申请人还获得了高效表达胸腺素衍生物 Gly-Tβ4蛋白的基因工程菌，命名为PGMTβ4-G/BL21(保藏号： CGMCC No：1751)。
3.Gly-Tβ4的表达及纯化
1)摇瓶表达：将如上述制备的含Gly-Tβ4蛋白基因的基因工程 菌PGMTβ4-G/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中摇瓶过 夜培养(37℃，200rpm)，再按体积比1∶30接种至含有50μg/ml 卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱 导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素衍生物Gly- Tβ4(30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的60％。
2)大规模发酵表达：
a.培养基组成：
a)种子液培养基(LK)：
胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、 卡那霉素：50微克/毫升。
b)种养基(15升)：
磷酸氢二钠：315克、磷酸二氢钾：100克、氯化钠：10.05克、 氯化铵：50克、胰蛋白胨：90克。
以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁：15克、葡萄糖：450克、补料(500克/升)：葡萄糖。
b.发酵及诱导表达：
i)种子培养：
从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角 瓶)LK中，36℃、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到 700毫升LK中，36℃、200转/分，培养过夜。
ii)发酵及诱导表达过程：
将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36℃、 150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时， 约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(三小时)。
3).层析：
(i)亲和层析
采用GSH-Agrose层析介质(Pharmacia公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱(Pharmacia公司)，平衡后用含10mM还原型谷胱 甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。
(ii)酶解
上一步的洗脱液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小时。
(iii)阴离子交换层析
采用Source30Q层析(Pharmacia公司)介质，平衡液为20mM PB (磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液)，pH7，将步骤(2)酶解得到的样 品用水稀释1倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7，0-1M NaCl 的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
4).检测
将经过上述纯化步骤得到的Gly-Tβ4通过SDS-PAGE纯度检测和 反相HPLC检测，纯度大于98％。
实施例2胸腺素β4衍生物Ala-Tβ4的制备
1.重组质粒pGMTβ4-A的制备
依据已知Tβ4氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，选用大肠杆菌偏好 密码子全基因合成Tβ4 DNA序列，得到Ala-Tβ4核酸序列，为方 便基因重组操作，同时在相应于所述多肽之N末端和C末端加上限 制性酶切位点BamHI、XhoI，在N末端修饰上丙氨酸Ala，如SEQ ID NO：4所示：
GGA TCC CCT CGA GCT TCT GAC AAA CCC GAT ATG GCT GAG ATC GAG AAA
BamHI
TTC GAT AAG TCG AAA CTG AAG AAG ACA GAG ACG CAA GAG AAA AAT CCA CTG CCT TCC
AAA GAA ACG ATT GAA CAG GAG AAG CAA GCA GGC GAA TCG TAA CTC GAG
XhoI
(SEQ ID NO：4)；
其中限制性酶切位点用下划线标明。
其所对应当氨基酸序列如下：
Ala Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys
Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu
Lys Gln Ala Gly Glu Ser
(SEQ ID NO：5)；
依据已知GST氨基酸序列选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成 先导肽DNA序列且在在相应于所述多肽之N末端和C末端加上限制 性酶切位点EcoRI、BamH I，得到先导肽核酸序列(如SEQ ID NO：3 所示)
按照本领域常用方法，参见如《分子克隆(第二版)：实验室指 南》(1992，冷泉港实验室)，将如上述制备的先导肽核酸序列、Ala-T β4核酸序列以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶EcoRI、XhoI、BamHI 处理，其中EcoRI和BamHI切先导肽，XhoI和BamHI切Ala-Tβ4， EcoRI和XhoI切筛选质粒pBSK，经计算各样品浓度后，按摩尔比1∶ 1加入T4连接体系。经转化、筛选出得到包含上述Ala-Tβ4核酸序 列和先导肽融合蛋白基因的重组质粒，命为pSK-Tβ42。
用限制性内切酶切下所述融合蛋白基因，再将该融合蛋白基因片 段与经XhoI和EcoR I双酶切后质粒PGM(该质粒为卡那霉素抗性筛 选标记，能大量表达GST类融合蛋白，为本公司构建)的回收大片 段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片断进行连接。经酶切和 序列测定对所得重组子筛选鉴别，得到正确连接的重组质粒，命名 为pGMTβ4-A。
2.含有所述重组质粒的基因工程菌的制备
然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50μg/ml卡那霉 素的LB平板，挑选阳性菌落，鉴别含有上述重组质粒pGMTβ4-A的 转化子。
在LK液体培养基中培养所述转化子至OD600为0.6-0.8时，加 入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％ SDS-PAGE电泳时出现一条30KD左右的蛋白带，表达量为40％。经胸 腺素β4的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。获得高效表达 胸腺素衍生物Ala-Tβ4蛋白的基因工程菌，命名为PGMTβ4/BL21
按照上述制备方法，申请人还获得了高效表达胸腺素衍生物 Gly-Tβ4蛋白的基因工程菌，命名为PGMTβ4-A/BL21(保藏号： CGMCC No：1750)。
3.Ala-Tβ4的表达及纯化
1)摇瓶表达：将如上述制备的含Ala-Tβ4蛋白基因的基因工程 菌pGMTβ4-A/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中摇瓶过 夜培养(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有50μg/ml卡那霉素 的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱导4小时。 收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素衍生物Ala-Tβ4 (30KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的60％。
2)大规模发酵表达：
a.培养基组成：
a)种子液培养基(LK)：
胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、 卡那霉素：50微克/毫升。
b)种养基(15升)：
磷酸氢二钠：315克、磷酸二氢钾：100克、氯化钠：10.05克、 氯化铵：50克、胰蛋白胨：90克。
以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。
硫酸镁：15克、葡萄糖：450克、补料(500克/升)：葡萄糖。
c.发酵及诱导表达：
i)种子培养：
从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角 瓶)LK中36℃、200转/分培养，8小时后将这50毫升种子液转接 到700毫升LK中，36℃、200转/分，培养过夜。
ii)发酵及诱导表达过程：
将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36℃、 150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时， 约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(三小时)。
3)层析：
(i)亲和层析
采用GSH-Agrose层析介质(Pharmacia公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱(Pharmacia公司)，平衡后用含10mM还原型谷胱 甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。
(ii)酶解
上一步的洗脱液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小时。
(iii)阴离子交换层析
采用Source30Q层析(Pharmacia公司)介质，平衡液为20mM PB， pH7，将步骤(2)酶解得到的样品用水稀释1倍进行上样，平衡后 采用20mM PB，pH7，0-1M NaCl的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。
4)检测
得到的Ala-Tβ4通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯 度大于98％。
实施例3胸腺素β4衍生物Gly-Tβ4和Ala-Tβ4与天然胸腺素T β4对大鼠心脏缺血模型的治疗效果评价
1.病态动物模型的制作与试验方法
为了评价和比较Gly-Tβ4与Tβ4减少心脏组织损伤和减少心肌 纤维化的生物学活性，建立了急性心肌梗塞的病态动物模型---大鼠 冠状动脉左前降支再灌流模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒 精消毒大鼠前胸壁；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位，在 完全无菌状态下进行手术。切开大鼠前胸壁皮肤，切断第3到第6 肋骨，露出胸腔，将肺推向一侧，打开心囊，露出心脏。从冠状动 脉左前降支起点到3mm处，用6-0聚丙烯结扎丝与NELATON结扎血 管，1小时后再灌注。确认无出血后，将切断的肋骨与胸骨缝合，再 缝合皮肤。手术后肌肉注射庆大霉素3mg/kg/天，共3天，防止感染。
2.利用超声心动图比较左心室前壁厚度
1)Gly-Tβ4与Tβ4的比较
依步骤1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组(每 组20只，注射生理盐水200μl/只/天)，阳性对照组(每组20只， 腹腔注射天然胸腺素Tβ4 10μg/只/天)，试验组(每组20只，腹 腔注射胸腺素衍生物Gly-Tβ4 10μg/只/天)给药。
给药后第14、28、56天利用心脏超声心动图(Live 3D Echo 7500) 与探针(probe 15-16L)，测定各组动物左心室前壁厚度。结果如下：
基础值(第0天，给药前)，阴性对照组0.2682±0.01，阳性对 照组0.2513±0.032，Gly-Tβ4组0.2499±0.0225，各组之间无显 著性差异。给药14天，阴性对照组0.1365±0.0125，阳性对照组 0.1919±0.012，与阴性对照组相比，有显著性差异(p＝0.048＜0.05)。 Gly-Tβ4组0.2162±0.0078，与阴性对照组相比，有显著性差异 (p＝0.003＜0.05)。与阳性对照组相比，有差异(p＝0.086＜0.1)。
这些结果显示，Gly-Tβ4与Tβ4均能有效恢复心肌梗塞引起的 左心室壁厚度的减少(见图1)。其中，所述Gly-Tβ4引起心脏左心 室前壁厚度增加的效果出人意料的大大高于Tβ4的效果。
2)Ala-Tβ4与Tβ4的比较
依步骤1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组(每 组20只，注射生理盐水200μl/只/天)，阳性对照组(每组20只， 腹腔注射天然胸腺素Tβ4 10μg/只/天)，试验组(每组20只，腹 腔注射胸腺素衍生物Ala-Tβ4 10μg/只/天)给药。
给药后第14、28、56天利用心脏超声心动图(Live 3D Echo 7500) 与探针(probe 15-16L)，测定各组动物左心室前壁厚度。结果如下：
基础值(第0天，给药前)，阴性对照组0.2594±0.0225，阳 性对照组0.2378±0.018，Ala-Tβ4组0.2432±0.01，各组之间无 显著性差异。
给药第14天阴性对照组0.1306±0.0128，阳性对照组0.1215 ±0.013，Ala-Tβ4组0.1299±0.011，各组之间无显著性差异。
给药第28天，阴性对照组0.1207±0.0151，阳性对照组0.1233 ±0.0071，Ala-Tβ4组0.1288±0.012，各组之间无显著性差异。
给药56天，阴性对照组0.1265±0.0125，阳性对照组0.1232 ±0.0057，Ala-Tβ4组0.1672±0.0078，Ala-Tβ4组心脏左心室 前壁厚度增加(p＜0.05)。
这些结果显示，Ala-Tβ4能有效恢复心肌梗塞引起的左心室壁 厚度的减少(见图5)。其中，所述Ala-Tβ4引起心脏左心室前壁厚 度增加的效果出人意料的大大高于Tβ4的效果。
3。利用组织学图片比较心室纤维化程度
依步骤1)建立大鼠心脏缺血模型后，分别向阴性对照组(每 组20只，注射生理盐水200μl/只/天)，阳性对照组(每组20只， 腹腔注射胸腺素Tβ4 10μg/只/天)，试验组(每组20只，腹腔注 射胸腺素Gly-Tβ4 10μg/只/天)给药。结果如下：
在给药后第56天，取心脏，以乳头状肌肉为准，横切心脏，做 成切片。用1％福尔马林浸泡24小时，制造石腊组织切片及玻片，进 行Masson’trichrom染色。各组之间比较采用了Image-PLUS ver.4.1(Media Cybernetics)方法。
1)Gly-Tβ4与Tβ4的比较
心肌纤维化部分占全左心室心肌的比率为，阴性对照组30.02± 5.1％，阳性对照组23.15±2.9％(P＜0.05)，Gly-Tβ4组15.36 ±2.7％(P＜0.0005)。
由上述结果显示，阴性对照组与阳性对照组、Gly-Tβ4组之间 有显著性差异，尤其Gly-Tβ4组有非常显著性差异。所述结果表明 Gly-Tβ4和Tβ4均能有效减少心肌梗塞引起的心肌纤维化(见图 2)。其中，所述Gly-Tβ4引起所述心肌纤维化的减少效果出人意料 的大大高于Tβ4的效果。
2)Ala-Tβ4与Tβ4的比较
心肌纤维化部分占全左心室心肌的比率为，阴性对照组28.13± 2.1％，阳性对照组22.91±2.3％(P＜0.05)，Ala-Tβ4组16.86± 1.8％(P＜0.0005)；阴性对照组与阳性对照组、Ala-Tβ4组之间有 显著性差异，尤其Ala-Tβ4组有非常显著性差异。这些结果表明 Ala-Tβ4和Tβ4均能有效减少心肌梗塞引起的心肌纤维化(见图 6)。其中，所述Ala-Tβ4引起所述心肌纤维化的减少效果出人意料 的大大高于Tβ4的效果。
实施例4Gly-Tβ4、Ala-Tβ4与Tβ4对大鼠表皮损伤模型的治疗 效果评价
1.病态动物模型的制作与试验方法
为了评价和比较Gly-Tβ4与Tβ4修复表皮组织损伤的活性性， 建立了表皮损伤的病态动物模型：大鼠表皮损伤模型。
肌肉注射甲苯噻嗪5mg/kg；氯胺酮50mg/kg麻醉，用碘酒、酒 精消毒大鼠后背皮肤；完全干燥后铺无菌手术巾，暴露手术部位， 在完全无菌状态下进行手术。切开大鼠后背皮肤3cm。
2.利用电脑图像分析系统测量伤口长度
1)Gly-Tβ4与Tβ4的比较
如上述步骤1)建立大鼠表皮损伤模型后，分别向阴性对照组 (每组10只，生理盐水50μl/只)，阳性对照组(每组10只，天然 胸腺素5μg/50μl/只)，试验组(每组20只，胸腺素衍生物Gly-T β4 5μg/50μl/只)表皮涂抹给药，每天4次。
给药5天后，利用电脑图像分析系统测量伤口长度。结果如下：
基础值(第0天，给药前)，阴性对照组3.15±0.21，阳性对 照组3.07±0.18，Gly-Tβ4组3.13±0.11，各组之间无显著性差异。
给药第5天阴性对照组2.37±0.18，阳性对照组1.62±0.13， Gly-Tβ4组1.14±0.12各组之间有显著性差异。
这些结果显示，Gly-Tβ4能有效促进表皮伤口愈合(见图3)。 其中，Gly-Tβ4促进表皮伤口愈合的活性出人意料的明显强于Tβ4。
2)Ala-Tβ4与Tβ4的比较
如步骤1)建立大鼠表皮损伤模型后，用喷雾器局部喷射给予 阴性对照物(PBS)、阳性对照物(Tβ4)、试验物质(Ala-Tβ4)， 每天喷4次。Tβ4、Ala-Tβ4的药物浓度为100μg/ml，
用药后每天观察伤口愈合情况。
试验结果
①伤口炎症反应：PBS组伤口的红肿、渗出等炎症反应较明显， 持续约2-3天；Tβ4组和Ala-Tβ4组的炎症反应较轻微，持续约 1-2天。
②伤口愈合时间：伤口愈合时间PBS组为7.3±1.02天，Tβ4 组为5.8±0.91天，Ala-Tβ4组为4.7±0.83天。各组之间比较， Tβ4组和Ala-Tβ4组伤口愈合时间明显短于PBS组(P＜0.05)，结 果见图7。
结果表明Tβ4和Ala-Tβ4均具有明显的促进伤口愈合的作 用。其中，施用Ala-Tβ4的伤口愈合时间明显比施用Tβ4的短
③瘢痕大小：给药2周后，比较各组的瘢痕大小，其结果为： 阴性对照组为2.3±0.31cm，Tβ4组为1.9±0.23cm，Ala-Tβ4组 为1.7±0.30cm；而且Tβ4组和Ala-Tβ4组的瘢痕为较细的线 状瘢痕、表面比较平整，而阴性对照组瘢痕为较粗、表面不平。
各组之间比较，Tβ4组和Ala-Tβ4组伤口瘢痕明显小于PBS组 (P＜0.05)，结果见图8。
结果表明，Tβ4和Ala-Tβ4均具有明显的抗瘢痕形成作用。 其中，施用Ala-Tβ4的伤口瘢痕明显比施用Tβ4的小
实施例5Gly-Tβ4、Ala-Tβ4与Tβ4对大鼠角膜损伤模型的治疗 效果评价
1.Gly-Tβ4与Tβ4的比较
1)、病态动物模型的制作与试验方法
为了评价Gly-Tβ4与Tβ4修复角膜组织损伤的活性性，建立 了急性角膜损伤的病态动物模型：大鼠角膜碱烧伤模型。
把直径2毫米的滤纸片浸泡到1N的烧碱中，然后将浸泡好的 滤纸片放到大鼠角膜正中央，30秒以后用PBS充分冲洗。立刻用 Gly-Tβ4与Tβ4治疗，4天后挖出眼球，10％甲醛固定后用石蜡包 埋，沿着瞳孔视神经平面连续切片，切好的片用图像分析系统采集、 分析角膜上皮恢复情况。
2).利用电脑图像分析系统测量角膜上皮恢复情况
如上述步骤1)建立大鼠角膜损伤模型后，分别向阴性对照组 (每组10只，用滴眼液局部给予生理盐水30μl/只，4次/天)，阳 性对照组(每组10只，天然胸腺素30μl/只，4次/天)，试验组(每 组10只，胸腺素Gly-Tβ4 30μl/只，4次/天)眼部给药。
给药4天后挖出眼球，10％甲醛固定后用石蜡包埋，沿着瞳孔视 神经平面连续切片，切好的片用图像分析系统采集、分析角膜上皮 恢复情况。结果如下：
基础值(第0天，给药前)，阴性对照组4.82±0.12，Tβ4组 4.76±0.18，Gly-Tβ4组4.85±0.16，各组之间无显著性差异。
给药第4天阴性对照组4.89±0.12，Tβ4组7.03±0.13，Gly-T β4组7.62±0.11，阴性对照组与Tβ4组、Gly-Tβ4组之间有显著 性差异，尤其Gly-Tβ4组有非常显著性差异。
这些结果表明Gly-Tβ4和Tβ4均能有效促进角膜碱烧伤后的 恢复(见图4)。其中，Gly-Tβ4促进角膜损伤修复的活性出人意料 的明显强于Tβ4。
2.Ala-Tβ4与Tβ4的比较
1)、病态动物模型的制作与试验方法
为了评价Ala-Tβ4与Tβ4的药物有效性，建立了急性角膜损伤 的病态动物模型：家兔角膜碱烧伤模型。
把直径8毫米的滤纸片浸泡到1N的烧碱中，然后将浸泡好的滤 纸片放到家兔角膜正中央，30秒以后用生理盐水充分冲洗。立刻用 Ala-Tβ4与Tβ4治疗。分别于1，5天后挖出眼球，10％甲醛固定 后用石蜡包埋，沿着瞳孔视神经平面连续切片，切好的片经染色后 用图像分析系统采集、分析角膜上皮恢复情况。
2)、给药方法
建立家兔角膜碱烧伤模型后，用滴眼液局部给予阴性对照物 (PBS)、阳性对照物(Tβ4)、试验物质(Ala-Tβ4)，每天滴4次。 Tβ4、Ala-Tβ4的药物浓度为500μg/ml，用药后每天观察角膜上 皮恢复情况。
3)、试验结果
角膜上皮恢复情况：Tβ4组、Ala-Tβ4组和PBS组在给药第 一天时，均观察到角膜上皮被碱烧毁(参见图9A-C)。然而，PBS 组在第五天试验结束时，有部分角膜上皮细胞还未长出(见图10A)； Tβ4组在第五天试验结束时，所有损伤的角膜上皮细胞均恢复正常， 且可以观察到1-2层上皮细胞出现(见图10B)；Ala-Tβ4组在第 五天试验结束时，所有损伤的角膜上皮细胞均恢复正常，且可以观 察到3-4层上皮细胞出现(见图10C)。各组之间比较，Tβ4组和Ala -Tβ4组角膜上皮恢复情况明显优于PBS组，Ala-Tβ4组角膜上皮 恢复情况明显优于Tβ4组。结果表明，Tβ4和Ala-Tβ4具有明显 的促进膜碱烧伤的角膜上皮恢复作用，其中Ala-Tβ4的角膜上皮 恢复作用优于Tβ4。
序列表
<110>北京诺思兰德生物技术有限责任公司
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Gly-T-beta 4
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acagagacgc aagagaaaaa tccactgcct tccaaagaaa cgattgaaca ggagaagcaa 120
gcaggcgaat cgtaactcga g 141
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<223>CST
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gataaatggc gaaacaaaaa gtttgaattg ggtttggagt ttcccaatct tccttattat 180
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cacaacatgt tgggtggttg tccaaaagag cgtgcagaga tttcaatgct tgaaggagcg 300
gttttggata ttagatacgg tgtttcgaga attgcatata gtaaagactt tgaaactctc 360
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cataaaacat atttaaatgg tgatcatgta acccatcctg acttcatgtt gtatgacgct 480
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tttaaaaaac gtattgaagc tatcccacaa attgataagt acttgaaatc cagcaagtat 600
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