一种检测中肋骨条藻生长率的方法转让专利
申请号 : CN200710121497.2
文献号 : CN100582242C
文献日 : 2010-01-20
发明人 : 米铁柱 , 何闪英 , 赵丽媛 , 孙静 , 于志刚 , 甄毓
申请人 : 中国海洋大学
摘要 :
本发明公开了一种检测中肋骨条藻生长率的方法，包括：a.提取中肋骨条藻RNA；b.分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列；c.克隆中肋骨条藻Cyt b基因部分序列；d.根据PCNA与Cyt b基因序列，建立检测中肋骨条藻PCNA与Cyt b基因的实时荧光定量PCR的标准曲线；e.以PCNA为目的基因、以Cyt b为管家基因，根据中肋骨条藻PCNA基因相对表达量REQ检测中肋骨条藻生长率。本发明提供了一种准确估算中肋骨条藻现场生长率的技术方法，用于估算浮游藻类生产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测等。
权利要求 :
1、一种检测中肋骨条藻生长率的方法，其特征在于，包括以下步骤：a.提取中肋骨条藻RNA；
b.分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的 中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得750～850bp的PCNA序列；
c.克隆中肋骨条藻Cyt b基因部分序列；
d.将所述PCNA序列基因、所述Cyt b基因部分序列导入质粒，并根 据转载所述PCNA序列基因、转载所述Cyt b基因部分序列的质粒构建检测 中肋骨条藻PCNA与Cyt b基因的实时荧光定量PCR的标准曲线；
e.以PCNA为目的基因、以Cyt b为管家基因，根据中肋骨条藻PCNA 基因相对表达量REQ检测中肋骨条藻生长率；
所述步骤b中，克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列使用的引物序列 为：5-CAG TCT CGG GTT CAA TGC GGC-3，ScPCNArp 5-GGA TAC TCC ACC ACC ACA GGC-3；
所述步骤b中，应用于3’端RACE的4个引物如下：
pcfp1：AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGT
Adaptor dT：GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTTAdaptor：GACTCGAGTCGACGAATTCAA
Pcfp2：TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG；
所述步骤c克隆中肋骨条藻Cyt b基因部分序列使用的引物序列为： TpCbfp：5-ATA CGC TTG GAG TTT TGG GTC TTC T-3，TpCbrp5-ATG AGC CGG AGT TGA CAT AGG ATC T-3；
所述步骤d进一步包括：根据测得的Cyt b序列设计RFQ-PCR引物探 针SC-FQ-Cyt b；引物SC-FQ-Cyt b序列为：5-GTG TTG AGC ACA TTA TGC GAG AT-3；rp，5-GAA CGC CTG AGC ATC AAA GTA A-3；探针SC- FQ-Cyt b序列为：5-TGC AAA TGG TGC TTC AAT GTT CTT CA-3。
2、根据权利要求1所述检测中肋骨条藻生长率的方法，其特征在于， 所述步骤b中，分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE 对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得786bp的PCNA序列。
3、根据权利要求1所述检测中肋骨条藻生长率的方法，其特征在于， 所述步骤d中进一步包括：通过对已知浓度样品的检测，验证所建立标准曲 线的准确性。
4、根据权利要求1所述检测中肋骨条藻生长率的方法，其特征在于， 所述步骤a提取中肋骨条藻RNA进一步包括：(1)收集藻细胞，在不断添加液氮条件下用研钵研磨成细粉状；
(2)将研磨液加入到1mL TRIZOL试剂中，置室温下匀化5min；
(3)加入200μL氯仿剧烈振荡15s，室温下温育3min；
(4)4℃条件下以12000rpm离心15min；
(5)获取界面上层液体加入250μL高浓度盐溶液，混匀后再加入250μL 异丙醇，混匀后于室温下沉淀10min，再在4℃以12000rpm转速离心10min；
(6)移去上清后用1mL 75％乙醇漂洗沉淀，4℃以11000rpm转速离心 5min；
(7)适量DEPC水或去离子甲酰氨溶液溶解，RNA于-8℃保存。
5、根据权利要求1所述检测中肋骨条藻生长率的方法，其特征在于， 所述步骤b中，进一步包括：使用克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列的 引物对与中肋骨条藻分类地位相近的4～20种藻cDNA进行扩增，并以28S rDNA通用引物为阳性验证，验证所述引物对中肋骨条藻的特异性。
6、根据权利要求1所述检测中肋骨条藻生长率的方法，其特征在于， 所述步骤e进一步包括：将收集的藻进行RNA提取和反转录后，用荧光定 量PCR扩增每个样品的PCNA和Cyt b基因，以Cyt b基因为管家基因，考 察PCNA基因表达量的变化，以得到的CT值推算单位细胞中基因的表达量， 按以下公式计算PCNA相对表达量REQ：REQ＝lg[PCNA基因表达量/Cyt b基因表达量]+K
其中K为一个常数。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种浮游硅藻的检测方法，特别涉及一种实时荧光定量PC R检测肋骨条藻生长率的方法。
背景技术
中肋骨条藻是广温广盐的典型代表，分布极广，从北极到赤道，从外海 高盐水到沿海低盐水团，甚至半成水中皆有，但以沿岸最多。中肋骨条藻多 在夏末秋初形成优势种，并引发赤潮，发生赤潮时，细胞密度为4.3×103～ 7.2×105个mL-1(Wang et al.，1991)。长江口处于赤潮临界状态的中肋骨条藻 密度为7×106个m-3，约占浮游植物总量的96％(Hong et al.，1992)。我国的南 海珠江口，闽南九龙江口，闽东闽江口，咸淡水汇合处，一般其它硅藻生长 不良，本种特别繁茂，每升水中可达2～4百万个细胞。
Swift等(1972)建立了细胞周期法，即通过计数处于特定细胞周期的细 胞分数来估算生长率，该方法的理论基础是细胞种群动力学原理。McDuff & Chisholm(1982)，Carpenter等(1988)对其进行了改进，Vaulot修正了其计 算式，使之更适用于现场测定。由于这一方法在一个光照循环中在现场间隔 一定时间(常为2小时)采样，分析染色体，计算处于分裂周期的细胞分数， 从而彻底摆脱了培养造成的各种偏差，同时也避免了捕食产生的误差，其结 果更接近于真实情况。但区分不同细胞周期对操作者有着很高的技术要求。
前述这些方法均不能估算特定种类的浮游植物的生长率，传统方法获得 特定种类的浮游植物生长率有两个途径：一是在稀释培养法或细胞周期法中 进行细胞计数时进行种类鉴定；另一种方法是将现场分离的单一种进行实验 室培养，计算其指数生长期的生长率。前者费时费力，并且受光镜分辨率的 限制，难以对某些种类的进行鉴定；后者则由于脱离了现场条件，因而其结 果代表性差。
林森杰(Lin et al.1994；Lin et al.1995)提出的增殖细胞核抗原 (Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)方法显示了其在浮游植物生长率研 究中的巨大潜在应用价值。该方法是从细胞周期法衍生而得，这种方法是基 于分析如PCNA一类的细胞周期标志物(Lin et al.1995)来确定处于不同细 胞周期的细胞分数(f：含有PCNA的细胞/细胞总数)。以PCNA为细胞周 期标志物测定生长率的方法由于其直接与S期相关，以f＝含有PCNA的细 胞/细胞总数来计算而不是采用细胞浓度，使得生长率的估算精度不受细 胞死亡和破裂的影响(Chang et al.1993)，有着“直接、可靠”的优越性(Celis et al.1985；Bravo et al.1987；Sasaki et al.1994)。这一方法不需要培养，避免了“培 养瓶效应”。更重要的是，该方法可以结合定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术，对PCNA基因表达的信使RNA(messenger RNA， mRNA)反转录为cDNA后进行定量PCR检测，直接获得细胞分数，实现高 通量的检测。该方法可以有两种方式应用：
(1)采用抗PCNA抗体，用荧光标记的PCNA抗体对浮游植物样品进行全 细胞免疫荧光法(immunofluorescence，IF)染色，由于PCNA在细胞周期的S 期大量表达，处于S期的细胞被染色(图1右上角)，通过荧光显微镜即 可对含有PCNA的细胞计数。
1994年林森杰等用Rat-PCNA抗体在四类微藻中检测到analogous proteins，并观察了PCNA-like protein含量在培养过程不同生长时期的变化。 对于杜氏盐藻Dunaliella tertiolecta免疫荧光研究发现PCNA是表征生长状 态的合适标志物，可以用来估算生长率(Lin et al.，1995)。1995年Lin等首次 用PCNA免疫荧光技术研究海洋浮游植物自然种群的细胞周期，联合特征 DNA序列分析了北大西洋西南部和加勒比海域Ethmodiscus rex细胞周期中 生命活动的过程，并且粗略估算了生长率。
受研究方法的限制，目前研究者较少使用现场生产率这一参数，多使用 光合速率常数及初级生产力来估算生物量。对于浮游植物生长率的研究主要 采用稀释法和培养计数法对实验室培养的浮游植物种群对环境因子的响应 (林元烧等，1994；张诚等，1997；齐雨藻等，1997；周名江等，1997；颜 天等，2002；朱明远等，2000)。焦念志等(2002)利用流式细胞仪测定处 于不同分裂期的原绿球藻(Prochlorococcus)的细胞分数，估算其生长率， 取得了较好的结果。这是国内采用细胞周期法现场测定单一种类浮游植物生 长率的首次尝试。而采用细胞周期标志物(如PCNA)来区分细胞周期进而 测定现场生产率的研究则未见报道。
整体来说，国际上在该领域的研究仍处于起步阶段，有待于进一步发展。目 前采用细胞周期标志物估算现场生产率的研究中面临的主要问题有以下几个 方面：
(1)目前的研究主要是针对费氏杀鱼藻Dunaliella tertiolecta的，缺乏对 其它浮游植物，特别是海域优势藻和多发赤潮藻的研究，研究多处于对实验 室培养的纯种藻的测定，缺乏更多的现场实验。
(2)前述研究采用的PCNA抗体是借用的针对哺乳动物的商业抗体 (PC10)，由于浮游植物与哺乳动物的PCNA基因差异较大，抗体仅对绿 藻等几种藻有效，效价低，且其种属特异性较差。
(3)在采用定量PCR技术时，由于已知PCNA基因序列的藻种类较少， 难以设计种间特异性高的引物和探针，从而影响了该方法测定单一藻种生长 率的优势。
(4)通常作为管家基因的基因在不同种类间具有高 度的同源性，在对现场样品测定时会产生非特异性扩增，影响结果的准确性。
由此可见，对于中肋骨条藻生长率的研究目前还缺乏一种准确估算单一 种类现场生长率的技术方法；这严重限制了浮游植物生产率这一参数的应 用。
Swift等(1972)建立了细胞周期法，即通过计数处于特定细胞周期的细 胞分数来估算生长率，该方法的理论基础是细胞种群动力学原理。McDuff & Chisholm(1982)，Carpenter等(1988)对其进行了改进，Vaulot修正了其计 算式，使之更适用于现场测定。由于这一方法在一个光照循环中在现场间隔 一定时间(常为2小时)采样，分析染色体，计算处于分裂周期的细胞分数， 从而彻底摆脱了培养造成的各种偏差，同时也避免了捕食产生的误差，其结 果更接近于真实情况。但区分不同细胞周期对操作者有着很高的技术要求。
前述这些方法均不能估算特定种类的浮游植物的生长率，传统方法获得 特定种类的浮游植物生长率有两个途径：一是在稀释培养法或细胞周期法中 进行细胞计数时进行种类鉴定；另一种方法是将现场分离的单一种进行实验 室培养，计算其指数生长期的生长率。前者费时费力，并且受光镜分辨率的 限制，难以对某些种类的进行鉴定；后者则由于脱离了现场条件，因而其结 果代表性差。
林森杰(Lin et al.1994；Lin et al.1995)提出的增殖细胞核抗原 (Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)方法显示了其在浮游植物生长率研 究中的巨大潜在应用价值。该方法是从细胞周期法衍生而得，这种方法是基 于分析如PCNA一类的细胞周期标志物(Lin et al.1995)来确定处于不同细 胞周期的细胞分数(f：含有PCNA的细胞/细胞总数)。以PCNA为细胞周 期标志物测定生长率的方法由于其直接与S期相关，以f＝含有PCNA的细 胞/细胞总数来计算而不是采用细胞浓度，使得生长率的估算精度不受细 胞死亡和破裂的影响(Chang et al.1993)，有着“直接、可靠”的优越性(Celis et al.1985；Bravo et al.1987；Sasaki et al.1994)。这一方法不需要培养，避免了“培 养瓶效应”。更重要的是，该方法可以结合定量聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术，对PCNA基因表达的信使RNA(messenger RNA， mRNA)反转录为cDNA后进行定量PCR检测，直接获得细胞分数，实现高 通量的检测。该方法可以有两种方式应用：
(1)采用抗PCNA抗体，用荧光标记的PCNA抗体对浮游植物样品进行全 细胞免疫荧光法(immunofluorescence，IF)染色，由于PCNA在细胞周期的S 期大量表达，处于S期的细胞被染色(图1右上角)，通过荧光显微镜即 可对含有PCNA的细胞计数。
1994年林森杰等用Rat-PCNA抗体在四类微藻中检测到analogous proteins，并观察了PCNA-like protein含量在培养过程不同生长时期的变化。 对于杜氏盐藻Dunaliella tertiolecta免疫荧光研究发现PCNA是表征生长状 态的合适标志物，可以用来估算生长率(Lin et al.，1995)。1995年Lin等首次 用PCNA免疫荧光技术研究海洋浮游植物自然种群的细胞周期，联合特征 DNA序列分析了北大西洋西南部和加勒比海域Ethmodiscus rex细胞周期中 生命活动的过程，并且粗略估算了生长率。
受研究方法的限制，目前研究者较少使用现场生产率这一参数，多使用 光合速率常数及初级生产力来估算生物量。对于浮游植物生长率的研究主要 采用稀释法和培养计数法对实验室培养的浮游植物种群对环境因子的响应 (林元烧等，1994；张诚等，1997；齐雨藻等，1997；周名江等，1997；颜 天等，2002；朱明远等，2000)。焦念志等(2002)利用流式细胞仪测定处 于不同分裂期的原绿球藻(Prochlorococcus)的细胞分数，估算其生长率， 取得了较好的结果。这是国内采用细胞周期法现场测定单一种类浮游植物生 长率的首次尝试。而采用细胞周期标志物(如PCNA)来区分细胞周期进而 测定现场生产率的研究则未见报道。
整体来说，国际上在该领域的研究仍处于起步阶段，有待于进一步发展。目 前采用细胞周期标志物估算现场生产率的研究中面临的主要问题有以下几个 方面：
(1)目前的研究主要是针对费氏杀鱼藻Dunaliella tertiolecta的，缺乏对 其它浮游植物，特别是海域优势藻和多发赤潮藻的研究，研究多处于对实验 室培养的纯种藻的测定，缺乏更多的现场实验。
(2)前述研究采用的PCNA抗体是借用的针对哺乳动物的商业抗体 (PC10)，由于浮游植物与哺乳动物的PCNA基因差异较大，抗体仅对绿 藻等几种藻有效，效价低，且其种属特异性较差。
(3)在采用定量PCR技术时，由于已知PCNA基因序列的藻种类较少， 难以设计种间特异性高的引物和探针，从而影响了该方法测定单一藻种生长 率的优势。
(4)通常作为管家基因的基因在不同种类间具有高 度的同源性，在对现场样品测定时会产生非特异性扩增，影响结果的准确性。
由此可见，对于中肋骨条藻生长率的研究目前还缺乏一种准确估算单一 种类现场生长率的技术方法；这严重限制了浮游植物生产率这一参数的应 用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种准确估算中肋骨条藻现场生长率 的技术方法，用于估算浮游藻类生产力、研究浮游藻种群变迁、构建生态动 力学模型乃至赤潮预测，克服现有技术中单一品种浮游藻现场生长率等基本 生理生态学参数无法测定的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测中肋骨条藻生长率的方 法，包括以下步骤：
a.提取中肋骨条藻RNA；
b.分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的 中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得750～850bp的PCNA序列；
c.克隆中肋骨条藻Cyt b基因部分序列；
d.将所述PCNA序列基因、所述Cyt b基因部分序列导入质粒，并根 据转载所述PCNA序列基因、转载所述Cyt b基因部分序列的质粒构建检测 中肋骨条藻PCNA与Cyt b基因的实时荧光定量PCR的标准曲线；
e.以PCNA为目的基因、以Cyt b为管家基因，根据中肋骨条藻PCNA 基因相对表达量REQ检测中肋骨条藻生长率。
所述步骤b可以为：分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通 过3’RACE对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得786bp的 PCNA序列。所述步骤d可以进一步包括：通过对已知浓度样品的检测，验 证所建立标准曲线的准确性。
所述步骤a提取中肋骨条藻RNA可以进一步包括：
(1)收集藻细胞，在不断添加液氮条件下用研钵研磨成细粉状；
(2)将研磨液加入到1mL TRIZOL试剂中，置室温下匀化5min；
(3)加入200μL氯仿剧烈振荡15s，室温下温育3min；
(4)4℃条件下以12000rpm离心15min；
(5)获取界面上层液体加入250μL高浓度盐溶液，混匀后再加入250μL 异丙醇，混匀后于室温下沉淀10min，再在4℃以12000rpm转速离心10min；
(6)移去上清后用1mL 75％乙醇漂洗沉淀，4℃以11000rpm转速离心 5min；
(7)适量DEPC水或去离子甲酰氨溶液溶解，RNA于-80℃保存。
所述步骤b中，克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列使用的引物序列 可以为：5-CAG TCT CGG GTT CAA TGC GGC-3，ScPCNArp 5-GGA TAC TCC ACC ACC ACA GGC-3。
所述步骤b中，应用于3’端RACE的4个引物可以为：
pcfp1：AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGT
Adaptor dT：GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTT
Adaptor：GACTCGAGTCGACGAATTCAA
Pcfp2：TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG。
所述步骤b中，可以进一步包括下列PCNA序列分析的过程：用ClustalX V1.81比对PCNA的核酸序列，通过运行ProtTest V1.3确定最适进化模式， 使用PHYML V2.4.3程序构建进化树，ProtTest参数值被应用于最大相似 度分析和系统树优化。
所述步骤b中，可以进一步包括：使用克隆中肋骨条藻PCNA基因部 分序列的引物对与中肋骨条藻分类地位相近的4～20种藻cDNA进行扩增， 并以28S rDNA通用引物为阳性验证，验证所述引物对中肋骨条藻的特异 性。
所述步骤c克隆中肋骨条藻Cyt b基因部分序列使用的引物序列可以 为：TpCbfp：5-ATA CGC TTG GAG TTT TGG GTC TTC T-3，TpCbrp5-ATG AGC CGG AGT TGA CAT AGG ATC T-3。
所述步骤d可以进一步包括：根据测得的Cyt b序列设计RFQ-PCR引 物探针SC-FQ-Cyt b；引物SC-FQ-Cyt b序列为：5-GTG TTG AGC ACA TTA TGC GAG AT-3；rp，5-GAA CGC CTG AGC ATC AAA GTA A-3；探针 SC-FQ-Cyt b序列为： 5-TGC AAA TGG TGC TTC AAT GTT CTT CA-3。
所述步骤e可以进一步包括：将收集的藻进行RNA提取和反转录后， 用荧光定量PCR扩增每个样品的PCNA和Cyt b基因，以Cyt b基因为管家 基因，考察PCNA基因表达量的变化，以得到的CT值推算单位细胞中基因 的表达量，按以下公式计算PCNA相对表达量REQ：
REQ＝lg[PCNA基因表达量/Cyt b基因表达量]+K
其中K为一个常数。
本发明建立了有效提取中肋骨条藻RNA的方法，进而通过反转录 PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了其PCNA基因的部 分序列，首次得到了714bp的中肋骨条藻细胞色素b(cytochrome b，Cyt b) 基因序列，并分别建立了PCNA进化树和Cyt b进化树。进一步地，根据得 到的PCNA与Cyt b基因序列，分别设计了符合实时荧光定量PCR(RFQ- PCR)检测要求的引物和TaqMan探针，建立了检测中肋骨条藻PCNA与Cyt b基因的实时荧光定量PCR的标准曲线，其曲线方程分别为：对PCNA，y＝ -3.055x+41.093(R＝0.999，其中x为细胞数对数值，y为CT值，R为相关 系数)；对Cyt b，y＝-4.0x+44.96(R＝0.997)。
本发明实时荧光定量PCR检测中肋骨条藻生长率的方法，可以准确定量 108～102个拷贝，且标准曲线回归系数达0.998，稳定性好，且6份样品的CT 值的相对标准偏差为1.5％，证明了RNA提取与反转录体系的稳定。PCNA 基因表达量在中肋骨条藻培养的不同时期有着明显变化，培养6天时藻处于 指数增长期，PCNA的表达量处于较高水平(46.2PCNA copy/cell)，11天 时处于生长平稳期，PCNA表达量处于较低水平(0.950PCNA copy/cell)， 而18天时已处于衰亡期，PCNA表达量最低(0.040PCNA copy/cell)。结 果证明，PCNA具有检测中肋骨条藻生长潜能的价值。
生长潜能估算的最终目的是应用于现场的观测研究中，这就必须解决检 测特异性的问题，以便区分不同藻类的生长参数。本发明通过使用SC-FQ- PCNA引物对16种藻cDNA的扩增，并以28S rDNA通用引物为阳性验证， 证实了SC-FQ-PCNA引物对中肋骨条藻的特异性。而Taqman技术由于在 PCR过程中结合了特异探针杂交，因此在提高特异性方面比荧光染料法更 具优势。提供了一种运用分子生物学技术实现中肋骨条藻现场生长率估算的 方法，为赤潮藻研究提供了有效的观测和研究手段。
在实际海区中，浮游藻种类繁多，必然要求所建立的检测方法可以区分 单种(检测具有种特异性)，因此对于本发明建立的方法，要求所设计的目 的基因和管家基因的RFQ-PCR引物与探针对于中肋骨条藻是特异的。本发 明已经以16种浮游藻作为参照藻，对所设计PCNA的RFQ-PCR引物的特 异性进行了验证，表明其具有特异性。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种检测中肋骨条藻生长率的方 法，包括以下步骤：
a.提取中肋骨条藻RNA；
b.分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的 中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得750～850bp的PCNA序列；
c.克隆中肋骨条藻Cyt b基因部分序列；
d.将所述PCNA序列基因、所述Cyt b基因部分序列导入质粒，并根 据转载所述PCNA序列基因、转载所述Cyt b基因部分序列的质粒构建检测 中肋骨条藻PCNA与Cyt b基因的实时荧光定量PCR的标准曲线；
e.以PCNA为目的基因、以Cyt b为管家基因，根据中肋骨条藻PCNA 基因相对表达量REQ检测中肋骨条藻生长率。
所述步骤b可以为：分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通 过3’RACE对获得的中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得786bp的 PCNA序列。所述步骤d可以进一步包括：通过对已知浓度样品的检测，验 证所建立标准曲线的准确性。
所述步骤a提取中肋骨条藻RNA可以进一步包括：
(1)收集藻细胞，在不断添加液氮条件下用研钵研磨成细粉状；
(2)将研磨液加入到1mL TRIZOL试剂中，置室温下匀化5min；
(3)加入200μL氯仿剧烈振荡15s，室温下温育3min；
(4)4℃条件下以12000rpm离心15min；
(5)获取界面上层液体加入250μL高浓度盐溶液，混匀后再加入250μL 异丙醇，混匀后于室温下沉淀10min，再在4℃以12000rpm转速离心10min；
(6)移去上清后用1mL 75％乙醇漂洗沉淀，4℃以11000rpm转速离心 5min；
(7)适量DEPC水或去离子甲酰氨溶液溶解，RNA于-80℃保存。
所述步骤b中，克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列使用的引物序列 可以为：5-CAG TCT CGG GTT CAA TGC GGC-3，ScPCNArp 5-GGA TAC TCC ACC ACC ACA GGC-3。
所述步骤b中，应用于3’端RACE的4个引物可以为：
pcfp1：AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGT
Adaptor dT：GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTT
Adaptor：GACTCGAGTCGACGAATTCAA
Pcfp2：TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG。
所述步骤b中，可以进一步包括下列PCNA序列分析的过程：用ClustalX V1.81比对PCNA的核酸序列，通过运行ProtTest V1.3确定最适进化模式， 使用PHYML V2.4.3程序构建进化树，ProtTest参数值被应用于最大相似 度分析和系统树优化。
所述步骤b中，可以进一步包括：使用克隆中肋骨条藻PCNA基因部 分序列的引物对与中肋骨条藻分类地位相近的4～20种藻cDNA进行扩增， 并以28S rDNA通用引物为阳性验证，验证所述引物对中肋骨条藻的特异 性。
所述步骤c克隆中肋骨条藻Cyt b基因部分序列使用的引物序列可以 为：TpCbfp：5-ATA CGC TTG GAG TTT TGG GTC TTC T-3，TpCbrp5-ATG AGC CGG AGT TGA CAT AGG ATC T-3。
所述步骤d可以进一步包括：根据测得的Cyt b序列设计RFQ-PCR引 物探针SC-FQ-Cyt b；引物SC-FQ-Cyt b序列为：5-GTG TTG AGC ACA TTA TGC GAG AT-3；rp，5-GAA CGC CTG AGC ATC AAA GTA A-3；探针 SC-FQ-Cyt b序列为： 5-TGC AAA TGG TGC TTC AAT GTT CTT CA-3。
所述步骤e可以进一步包括：将收集的藻进行RNA提取和反转录后， 用荧光定量PCR扩增每个样品的PCNA和Cyt b基因，以Cyt b基因为管家 基因，考察PCNA基因表达量的变化，以得到的CT值推算单位细胞中基因 的表达量，按以下公式计算PCNA相对表达量REQ：
REQ＝lg[PCNA基因表达量/Cyt b基因表达量]+K
其中K为一个常数。
本发明建立了有效提取中肋骨条藻RNA的方法，进而通过反转录 PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得了其PCNA基因的部 分序列，首次得到了714bp的中肋骨条藻细胞色素b(cytochrome b，Cyt b) 基因序列，并分别建立了PCNA进化树和Cyt b进化树。进一步地，根据得 到的PCNA与Cyt b基因序列，分别设计了符合实时荧光定量PCR(RFQ- PCR)检测要求的引物和TaqMan探针，建立了检测中肋骨条藻PCNA与Cyt b基因的实时荧光定量PCR的标准曲线，其曲线方程分别为：对PCNA，y＝ -3.055x+41.093(R＝0.999，其中x为细胞数对数值，y为CT值，R为相关 系数)；对Cyt b，y＝-4.0x+44.96(R＝0.997)。
本发明实时荧光定量PCR检测中肋骨条藻生长率的方法，可以准确定量 108～102个拷贝，且标准曲线回归系数达0.998，稳定性好，且6份样品的CT 值的相对标准偏差为1.5％，证明了RNA提取与反转录体系的稳定。PCNA 基因表达量在中肋骨条藻培养的不同时期有着明显变化，培养6天时藻处于 指数增长期，PCNA的表达量处于较高水平(46.2PCNA copy/cell)，11天 时处于生长平稳期，PCNA表达量处于较低水平(0.950PCNA copy/cell)， 而18天时已处于衰亡期，PCNA表达量最低(0.040PCNA copy/cell)。结 果证明，PCNA具有检测中肋骨条藻生长潜能的价值。
生长潜能估算的最终目的是应用于现场的观测研究中，这就必须解决检 测特异性的问题，以便区分不同藻类的生长参数。本发明通过使用SC-FQ- PCNA引物对16种藻cDNA的扩增，并以28S rDNA通用引物为阳性验证， 证实了SC-FQ-PCNA引物对中肋骨条藻的特异性。而Taqman技术由于在 PCR过程中结合了特异探针杂交，因此在提高特异性方面比荧光染料法更 具优势。提供了一种运用分子生物学技术实现中肋骨条藻现场生长率估算的 方法，为赤潮藻研究提供了有效的观测和研究手段。
在实际海区中，浮游藻种类繁多，必然要求所建立的检测方法可以区分 单种(检测具有种特异性)，因此对于本发明建立的方法，要求所设计的目 的基因和管家基因的RFQ-PCR引物与探针对于中肋骨条藻是特异的。本发 明已经以16种浮游藻作为参照藻，对所设计PCNA的RFQ-PCR引物的特 异性进行了验证，表明其具有特异性。
附图说明
图1为本发明实施例所述cDNA的SC-FQ-PCNA PCR扩增图，图中：
1：H2O；2：新月菱形藻；3：红色裸甲藻；4：微小原甲藻；5：直链藻；6： 圆海链藻；7：柔弱角毛藻；8：纤细角毛藻；10：旋链角毛藻；11：膜质舟 形藻；12：米氏裸甲藻；13：尖刺拟菱形藻；14：东海原甲藻；15：锥状斯 克里普藻；16：塔玛亚历山大藻；17：球等鞭金藻；18：中肋骨条藻；9，19： DNA Marker；SC-FQ-PCNA引物对cDNA的扩增结果 只有中肋骨条藻 得到约为160bp的扩增条带，其它藻均未得到扩增条带，表明所设计的SC- FQ-PCNA引物是对中肋骨条藻特异的；
图2为本发明实施例所述Cyt b基因部分序列扩增图，图中：1：Marker (DL2000)；2：扩增条带；
图3为本发明实施例所述第一组(培养25天)S.costatum细胞密度随 时间的变化图，图中藻类为3L锥形瓶培养，起始浓度为4.0×102cells/mL；
图4为本发明实施例所述第二组(培养14天)S.costatum细胞密度随 时间的变化图，图中藻类为3L锥形瓶培养，起始浓度为1.3×102cells/mL；
图5为本发明实施例所述培养不同阶段藻细胞内PCNA表达量的变化 图，图中○代表细胞密度，▲代表生长率，●代表PCNA表达量，■代表 REQ；
图6为本发明实施例所述培养不同阶段藻细胞内PCNA表达量的变化 图，图中○代表细胞密度，▲代表生长率，●代表PCNA表达量，■代表 REQ。
1：H2O；2：新月菱形藻；3：红色裸甲藻；4：微小原甲藻；5：直链藻；6： 圆海链藻；7：柔弱角毛藻；8：纤细角毛藻；10：旋链角毛藻；11：膜质舟 形藻；12：米氏裸甲藻；13：尖刺拟菱形藻；14：东海原甲藻；15：锥状斯 克里普藻；16：塔玛亚历山大藻；17：球等鞭金藻；18：中肋骨条藻；9，19： DNA Marker；SC-FQ-PCNA引物对cDNA的扩增结果 只有中肋骨条藻 得到约为160bp的扩增条带，其它藻均未得到扩增条带，表明所设计的SC- FQ-PCNA引物是对中肋骨条藻特异的；
图2为本发明实施例所述Cyt b基因部分序列扩增图，图中：1：Marker (DL2000)；2：扩增条带；
图3为本发明实施例所述第一组(培养25天)S.costatum细胞密度随 时间的变化图，图中藻类为3L锥形瓶培养，起始浓度为4.0×102cells/mL；
图4为本发明实施例所述第二组(培养14天)S.costatum细胞密度随 时间的变化图，图中藻类为3L锥形瓶培养，起始浓度为1.3×102cells/mL；
图5为本发明实施例所述培养不同阶段藻细胞内PCNA表达量的变化 图，图中○代表细胞密度，▲代表生长率，●代表PCNA表达量，■代表 REQ；
图6为本发明实施例所述培养不同阶段藻细胞内PCNA表达量的变化 图，图中○代表细胞密度，▲代表生长率，●代表PCNA表达量，■代表 REQ。
具体实施方式
本发明实施例中，中肋骨条藻的培养过程为：中肋骨条藻(Skeletonema costatum)在实验室中用F/2培养基培养至对数生长期，培养条件：光照/黑 暗周期为12h/12h，光照强度为4000Lux，培养温度为22～25℃。
收集5份培养一周的中肋骨条藻(细胞密度为4.1×107cells/mL)约 3.8×107个细胞(藻浓缩液重量约为150mg)。用下列RNA提取方法提取：
(1)收集藻细胞，在不断添加液氮条件下用研钵研磨成细粉状；
(2)将研磨液加入到1mL TRIZOL试剂中，置室温下匀化5min；
(3)加入200μL氯仿剧烈、振荡15s，室温下温育3min；
(4)4℃条件下以12000rpm离心15min；
(5)获取界面上层液体加入250μL高浓度盐溶液，混匀后再加入250μL 异丙醇，混匀后于室温下沉淀10min，再在4℃以12000rpm转速离心10min；
(6)移去上清后用1mL 75％乙醇漂洗沉淀，4℃以11000rpm转速离心 5min；
(7)适量DEPC水或去离子甲酰氨溶液溶解，RNA于-80℃保存。
提取后的中肋骨条藻PCNA基因cDNA的部分序列扩增产物，经EB 染色的琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出特异性的条带，产物大小约为520bp。
RT-PCR引物为5-CAG TCT CGG GTT CAA TGC GGC-3，ScPCNArp 5-GGA TAC TCC ACC ACC ACA GGC-3。
连接反应体系10μL，目标DNA片段的量约为50ng，按照插入片段与 载体的摩尔比为1∶3做连接反应。反应物充分混匀后，于16℃连接过夜。
取E.coli DHα-5甘油菌于LB琼脂平皿上划线，37℃培养过夜。挑单个 菌落接种于50mL LB培养液里，37℃摇床250rpm振荡培养过夜；细胞沉 淀用10mL冰冷的CaCl2溶液重悬，分装于预冷的无菌聚丙烯管中，冻存于- 80℃中。
将所得的10μL体系全部转入感受态细胞，轻轻旋动，并于冰上放置 30min。然后将试管放入42℃水浴2min进行热休克，快速移至冰浴中2分 钟；加入100μL LB培养液，于37℃摇床250rpm振荡培养1h，使细胞复苏 同时表达质粒编码的抗生素抗性基因；菌液涂布到含有X-Gal、IPTG、Amp 的LB固体培养基(100mL LB固体培养基中加入200μL的X-Gal的二甲基 甲酰胺溶液(20mg/mL)、100μL的IPTG(24mg/mL)和60μL的Amp (100mg/mL)平板上，于37℃静置培养12-16h。
在过夜LB平板上挑取白色单菌落，置2mL LB培养基(含100μg/mL 氨苄青霉素)中，于37℃摇床上过夜培养。取1.5mL菌液，用微量离心机 12000rpm离心一分钟(剩余菌液保存于4℃)。倾倒去上层清液，控干沉 淀加入预冷的溶液I 100μL悬浮细胞，混匀，即加入溶液II 200μL，上下轻 柔颠倒数次混匀，冰浴5分钟。加溶液III 150μL，小心混匀，冰浴5-10分 钟。12000rpm离心10分钟，将上清液移至另一Eppendorf管中。加两倍体 积预冷的无水乙醇混匀，室温放置10分钟，13500rpm离心10分钟，弃去 上清液，70％乙醇洗涤，超净台中干燥。加含有胰RNA酶(20μg/mL)的 TE(pH 8.0)溶液40-50μL，溶解质粒，待完全溶解后取5μL电泳鉴定。
双酶切反应体系为50μL，反应的条件为37℃过夜消化。酶切结果以琼 脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检验。取经鉴定的阳性克隆，送交上海生物工 程有限公司测序(ABI3730)。测序引物为M13/PUC Sequencing Primer(-20)和 M13/PUC Reverse Sequencing Primer(-48)。
提交测序结果至NCBI的Blast服务器，验证克隆片段的PCNA基因同 源性。
根据RACE的要求和测得的PCNA部分序列，设计应用于3’端RACE 技术的4个引物如下：
pcfp1：AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGT
Adaptor dT：GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTT
Adaptor：GACTCGAGTCGACGAATTCAA
Pcfp2：TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG
RNA的提取同前述提取方法
cDNA链的生成：RT-PCR以引物Adaptor dT(GAC TCG AGT CGA CGA ATT CAA TTT TTT TTT TTT TTT TT)介导生成cDNA链。
3’RACE第一轮PCR反应：以生成的cDNA链为模板，以表1中的体系和 程序进行PCR扩增。
3’RACE第二轮PCR反应：第二轮PCR以第一轮PCR产物(稀释50 倍)为模版，以表2中的体系和程序进行PCR扩增。
表1 3’RACE第一轮PCR反应反应体系及程序
表2 3’RACE第二轮PCR反应反应体系及程序
分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的 中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得786bp的PCNA序列。
进化分析：用ClustalX V1.81比对PCNA的核酸序列。通过运行ProtTest V1.3(Abascal et al.2005)确定最适进化模式。使用PHYML V2.4.3程序构建 进化树，ProtTest参数值被应用于最大相似度分析和系统树优化。
使用SC-FQ-PCNA引物对16种藻cDNA的扩增，并以28S rDNA通用 引物为阳性验证，证实了SC-FQ-PCNA引物对中肋骨条藻的特异性。
表3实验用藻种名称及来源
藻种名 拉丁文 来源 旋链角毛藻 Chaetoceros curvisetus 胶州湾 柔弱角毛藻 C.debilis 胶州湾 纤细角毛藻 C.gracile 胶州湾 膜质舟形藻 Navicula membranacea 胶州湾 新月菱形藻 Nitzschia closterium 胶州湾 米氏裸甲藻 G.mikimoto 胶州湾 直链藻 Melosira sp. 胶州湾 尖刺拟菱形藻 Pseudonitzschia pungens 胶州湾 圆海链藻 Thalassiosira rotula 胶州湾 中肋骨条藻 Skeletonema costatum 胶州湾 塔玛亚历山大藻 Alexandrium tamarens 大鹏湾 微小原甲藻 Prorocentrum minimun 渤海湾 东海原甲藻 Prorocentrum donghaiense 胶州湾 锥状斯克里普藻 Scrippsiella trochoidea 胶州湾 球等鞭金藻 Isochrysis galbana 胶州湾 红色裸甲藻 G.sanguineum 东海
如前述获得转入PCNA基因的阳性克隆，将培养好的带质粒的细菌收 集到1.5mL离心管中，弃去上清，使细菌沉淀尽量干燥；加100μL预冷的 质粒抽提溶液I悬浮细胞，混匀，即加200μL质粒抽提溶液II，上下轻柔颠 倒数次混匀，冰浴5分钟；加150μL质粒抽提溶液IIII小心混匀，冰浴5-10 分钟；12000rpm离心10分钟，将上清移至另一离心管中；加两倍体积的预 冷的无水乙醇混匀，室温放置10分钟，13000rpm离心10分钟，弃上清，70％ 乙醇洗涤，干燥后加40μL TE缓冲液溶解。酶切验证，测260nm处的吸光 度(Absorbance260，A260)得光密度(optical density，OD)(贝克曼核酸和蛋白质 分析仪，Backman DU640)为0.0705，备用。
将测定的OD值换算成质粒的拷贝，浓度换算公式如下：拷贝浓度 (copy/mL)＝[OD值×50×6.02×1023]/[碱基数×660]，求得浓度为 1×109copy/μL。将重组质粒标准品原液作梯度稀释成1×108、1×107、 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copy/μL，-80℃保存。
根据测得的PCNA序列设计RFQ-PCR引物与探针，所设计的引物SC- FQ-PCNA序列为(fp，5-AGG TGT CCG GTT CTC AGT ATC AG-3；rp，5- AGT AGC CTT GGT AAA GAA GTT GAG G-3)，探针SC-FQ-PCNA序列 为(5-GTC CTC GTT CGT CAA AAC AGC TCT CA-3)，探针5’端用FAM 标记，3’端用TAMRA标记。在ABI7500荧光定量仪上进行荧光定量PCR反 应，体系为：双蒸水8.5μL，2×TaqManUniversal PCR Master Mix 12.5μL， SC-FQ-PCNA正反向引物(10μM)各1μL，TaqMan SC-FQ-PCNA(10mM) 1μL，模板1μL；PCR程序：52℃ 2分钟，95℃10分钟；95℃15秒，60℃ 1分钟，40个循环。每个质粒稀释浓度做三个平行样。以质粒浓度对数值为 横座标，以实时荧光定量PCR反应中相应的CT值为纵座标，绘制标准曲 线。
分别提取各藻的RNA，用Oligo(dT18)反转录成cDNA，用核糖体大亚基 通用引物LSU5’(5’-CGG AGG AAA AGA AAC TAA C-3’)LSU3’(5’-GCG AAA GAC TAA TCG AAC-3’)扩增各藻的cDNA，验证cDNA的质量。
用SC-FQ-PCNA引物对分别扩增各藻的cDNA.扩增。
培养中肋骨条藻，接种密度为1.2×103cells/mL，收集处于指数生长期、 稳定期、衰亡期的藻样品各一份，收集藻细胞，如上所述提取RNA，进行 RT-PCR，取1μL进行Real Time PCR扩增。
稀释的质粒及primer SC-FQ-PCNA和TaqMan SC-FQ-PCNA进行荧光 定量PCR检测。每个稀释度重复测量3次，用测得的CT值对细胞密度的 对数值作图。回归曲线方程为y＝-3.055x+41.093，其中x为细胞数对数值， y为CT值，其回归系数为：R＝0.999。
根据从GenBank数据库中获得的与中肋骨条藻同科的伪矮海链藻 (Thalassiosira pseudonana)的Cytochrome B基因序列，设计中肋骨条藻的引 物为TpCbfp5-ATA CGC TTG GAG TTT TGG GTC TTC T-3，TpCbrp5-ATG AGC CGG AGT TGA CAT AGG ATC T-3。
RNA提取与反转录如前述方法
PCR扩增中肋骨条藻Cyt b基因的部分cDNA片段
反转录的cDNA分别稀释10倍、100倍作为扩增模板，扩增体系与程 序见表4。
表4 Cyt b基因扩增体系与程序
测得OD值为：0.015，利用计算公式：质粒浓度(copy/mL)＝(OD 值×50×6.02×1023)/(660×3406)。求得浓度为2×108copy/μL。将重组质粒 标准品原液作梯度稀释成2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、 2×101copy/μL，贮于-80℃。
根据测得的Cyt b序列设计RFQ-PCR引物探针SC-FQ-Cyt b，引物SC- FQ-Cyt b序列为(fp，5-GTG TTG AGC ACA TTA TGC GAG AT-3；rp，5- GAA CGC CTG AGC ATC AAA GTA A-3)，探针SC-FQ-Cyt b序列为(5- TGC AAA TGG TGC TTC AAT GTT CTT CA-3)。Taqman探针5’端用FAM 标记，3’端用TAMRA标记。在ABI7500荧光定量仪上进行荧光定量PCR反 应，体系为：双蒸水8.5μL，Universal PCR Master Mix12.5μL， SC-FQ-Cyt b正反向引物(10μM)各1μL，TaqMan SC-FQ-Cyt b(10mM) 1μL，模板1μL；PCR程序：52℃2分钟，95℃ 10分钟；95℃ 15秒，60℃1 分钟，40个循环。每个质粒稀释浓度做三个平行样。以质粒浓度对数值为横 座标，以实时荧光定量PCR反应中相应的CT值为纵座标，绘制标准曲线。
如图2所示，中肋骨条藻Cyt b基因cDNA的部分序列扩增产物，经EB 染色的琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出特异性的条带，产物大小约为720bp。
稀释的质粒及primer SC-FQ-Cyt b和TaqMan SC-FQ-Cyt b进行荧光定 量PCR检测。每个稀释度重复测量3次，用测得的CT值对质粒拷贝的对 数值作图。回归曲线方程为y＝-4.0x+44.96，其中x为细胞数对数值，y为 CT值，其回归系数为：R＝0.997。
将海水经0.22μm的滤膜过滤和煮沸法消毒灭菌处理后，用营养自动分 析仪测得其NO3--N浓度为0.96μmol/L，PO4 3--P浓度为0.28μmol/L。根据 Monod方程，硝酸盐影响中肋骨条藻生长速率的半饱和常数KN为 4.0μmol/L；磷酸盐影响中肋骨条藻生长速率的半饱和常数KP为0.54μmol/L (李铁等，2000)。调整N试验组中的NaNO3浓度，使N1、N2、N3、N4 组的NO3--N终浓度分别为0.96μmol/L(约为1/4×KN)、2.0μmol/L(1/2×KN)、 4.0μmol/L(1×KN)、8.0μmol/L(2×KN)，其它条件同前述海藻培养方法；调整 P试验组中的NaH2PO4浓度，使P1、P2、P3组中的PO4 3--P终浓度分别为 0.28μmol/L(约为1/2×KP)、0.54μmol/L(1×KP)、1.08μmol/L(2×KP)，其它条 件同前述海藻培养方法。用于条件实验的各实验组中肋骨条藻的接种密度均 为3.0×103cells/mL。接种的藻液中带入的NO3 --N与PO4 3--P浓度引起的误 差忽略不计。中肋骨条藻均在3L锥形瓶中培养。
每天中午12点计数各实验组的藻细胞密度，绘制各培养条件下的生长 曲线。
第一组从培养的第三天开始，隔天收集样品，藻样均约为2×107个细胞， 离心去除水分后用液氮冻存。
第二组每天收集藻样，藻样均为2×107个细胞离心去除水分后用液氮冻 存。
第三组分别收集在指数生长期、稳定期及衰亡期的藻样，藻样均约为 2×107个细胞离心去除水分后用液氮冻存。
将收集的藻进行RNA提取和反转录后，用荧光定量PCR扩增每个样 品的PCNA和Cyt b基因，以Cyt b基因为管家基因，考察PCNA基因表达 量的变化。以得到的CT值推算单位细胞中基因的表达量，按以下公式计算 PCNA相对表达量REQ：
REQ＝lg[PCNA基因表达量/Cyt b基因表达量]+10。
通过显微镜计数方法，得到第一组的生长曲线(如图3所示)，第二组 的生长曲线(如图4所示)。
根据显微镜镜检得到的细胞密度计算生长率μ，对第一组实验中收集的 样品进行PCNA和Cyt b基因的荧光定量PCR检测，计算单位细胞中的PCNA 拷贝量与REQ值，结果如表5所示。对培养四周中的中肋骨条藻细胞密度、 藻生长率μ以及PCNA基因表达量的变化趋势作图(如图5所示)，图5显示 出中肋骨条藻的生长率μ、PCNA基因表达量以及REQ之间有高度一致性， 在藻的指数生长期变化幅度都很大。对生长率μ与PCNA基因相对表达量 (REQ)进行线性回归，得到回归方程为μ＝0.273REQ-2.02，R＝0.9。
表5 4周培养中11个样品PCNA相对表达量的变化
培养日 期(day) 生长率 μ(d-1) PCNA的 CT值 单位细胞中 PCNA的拷贝量 (copies/cell) Cyt b 的CT 值 单位细胞中 Cyt b的拷贝 量 (copies/cell) REQ 3 1.00 22.50 292 21.27 200 10.2 5 0.651 23.53 85.5 19.99 266 9.48 7 0.602 23.95 45.4 19.69 231 9.29 9 0.148 27.54 7.04 20.87 27l 8.41 11 0.304 24.32 30.6 19.23 268 9.06 13 0.107 26.72 7.45 20.39 204 8.56 15 0.039 29.45 2.49 21.55 274 7.96 17 -0.016 29.02 2.03 21.14 205 8.00 19 -0.016 31.28 0.164 19.54 228 6.86 21 -0.059 31.65 0.203 20.35 235 6.94 23 -0.087 32.05 0.083 19.23 246 6.53
根据显微镜镜检得到的细抱密度讨算生长率μ，对第二组实验中收集的 样品进行PCNA和Cyt b基因的荧光定量PCR检测，计算单位细胞中的PCNA 拷贝量与REQ值(表6)，对培养两周中的中肋骨条藻细胞密度、藻生长 率μ以及PCNA基因表达量的变化趋势作图(如图6所示)，图6也显示出中 肋骨条藻的生长率μ、PCNA基因表达量以及REQ之间有高度一致性，在藻 的指数生长期变化幅度都很大。对14个样品的生长率μ和REQ进行线性回 归，得到回归方程为μ＝0.375REQ-2.79，R＝0.971。
表6 14天培养过程中PCNA的表达量变化
培养 日期 (day) 生长率 μ(d-1) PCNA 的CT 值 单位细胞中 PCNA的拷贝 量 (copies/cell) Cyt b的 CT值 单位细胞中 Cyt b的拷贝 量 (copies/cell) REQ 1 0.956 22.85 180 20.62 234 9.89 2 0.961 22.60 166 20.41 202 9.92 3 1.03 21.98 190 19.87 197 9.98 4 0.968 22.51 161 20.19 208 9.89 5 1.02 22.33 201 20.17 228 9.94 6 0.841 22.96 108 20.08 207 9.72 7 0.783 23.44 86 19.92 260 9.52 8 0.814 23.12 97 20.05 214 9.66 9 0.331 24.54 24 19.23 246 8.99 10 0.167 26.19 6 19.35 194 8.48 11 0.0303 28.94 0.7 19.04 225 7.50 12 -0.008 29.97 0.3 19.27 199 7.22 13 -0.015 30.13 0.3 19.14 218 7.13 14 0.015 29.21 0.6 19.17 211 7.44
氮磷控制组在接种后的4、6、8、10、12日收集样品，对样品进行RFQ- PCR检测。根据得到的PCNA的CT值与Cyt b的CT值推算REQ(表7、8)， 并与生长率μ建立相关关系，对氮不同浓度与磷不同浓度控制组的REQ与μ 进行相关性的拟合，各组生长率μ和REQ进行线性回归方程见表5.5。其中 N1组由于藻的密度随培养时间的增加而减少，样品的量不足以提取RNA 进行后续的检测，因此未能得到相应的生长率μ与REQ的相关关系。
表7 N组PCNA的表达量变化
培养时 (day) 细胞密度 (cells/mL) 生长率 μ(d-1) PCNA的 CT值 Cyt b的 CT值 REQ值
N1-4 67000 0.516 #* # # N1-6 98000 0.0632 # # # N1-8 70000 -0.357 # # # N1-10 63000 -0.0910 # # # N1-12 61000 0.0165 # # # N2-4 91000 0.450 24.22 19.78 9.23 N2-6 110000 0 31.52 19.71 6.82 N2-8 130000 0.080 31.08 19.70 6.96 N2-10 120000 -0.223 32.66 19.81 6.47 N2-12 120000 0.0870 31.99 19.62 6.65 N3-4 120000 0.431 24.44 19.47 9.08 N3-6 170000 0.268 25.93 19.86 8.69 N3-8 150000 -0.125 31.77 19.88 6.78 N3-10 170000 -0.111 31.23 19.61 6.89 N3-12 170000 -0.0572 31.73 19.46 6.69 N4-4 150000 0.406 24.40 20.01 9.23 N4-6 180000 0.0572 28.45 19.54 7.78 N4-8 190000 0.111 26.45 19.89 8.53 N4-10 220000 -0.0445 29.50 19.68 7.47 N4-12 210000 0.0488 31.23 19.78 6.93
*N1-4表示N1的第四天，以此类推；#代表未检出。
表8 P组PCNA的表达量变化.
培养时间 (day) 细胞密度 (cells/mL) 生长率 μ(d-1) PCNA的 CT值 Cytb的 CT值 REQ值 P1-4 84000 0.334 25.47 20.06 8.89 P1-6 150000 0.0690 29.55 19.79 7.49
P1-8 130000 -0.325 32.75 19.95 6.48 P1-10 81000 -0.306 32.42 19.78 6.54 P1-12 44000 -0.310 32.29 19.67 6.56 P2-4 130000 0.262 27.45 19.27 8.04 P2-6 170000 0.0606 30.04 19.88 7.35 P2-8 170000 -0.0572 31.29 19.58 6.86 P2-10 110000 -0.241 33.90 19.71 6.04 P2-12 68000 -0.163 33.03 19.67 6.32 P3-4 140000 0.241 27.61 19.44 8.03 P3-6 240000 0.182 29.62 19.35 7.35 P3-8 240000 -0.223 33.40 19.67 6.20 P3-10 130000 -0.431 34.40 19.84 5.91 P3-12 76000 -0.274 33.50 20.17 6.29
表9不同培养条件下生长率μ和REQ的线性回归方程与相关系数
实验组 生长率μ和REQ的线性回归方程 (y为生长率μ，x为REQ) 相关系数(R) N2组 y＝0.194x-1.32 0.907 N3组 y＝0.214x-1.55 0.983 N4组 y＝0.160x-1.17 0.845 P1组 y＝0.282x-2.14 0.984 P2组 y＝0.246x-1.73 0.997 P3组 y＝0.321x-2.27 0.971
从图5可以看出，单位细胞中PCNA基因表达量在中肋骨条藻培养的 不同阶段有着明显变化，在培养初期(2-5天)藻细胞密度迅速增加，处于 对数生长期，生长率较高，最高达到2.79d-1，相应的此阶段的单位细胞中 PCNA基因表达量也较高，最高达到292copies/cell，随后生长率逐渐变小， PCNA表达量逐渐降低，在培养的9-12天，生长率再次出现一个小的峰值， PCNA表达量亦有反映，在培养的后期生长率为0或负值，PCNA表达量亦 降到很低的范围(＜0.10copies/cell)。
从图6同样可以看到，在第二组实验的培养初期(2-5天)藻细胞密度 迅速增加，生长率较高，最高达到1.03d-1，相应的此阶段的单位细胞中PCNA 基因表达量也较高，最高达到201copies/cell，随后生长率逐渐变小，PCNA 表达量也逐渐降低。
因此，从第一、二组实验中肋骨条藻培养过程中，PCNA的表达量与生 长率表现出高度的一致性，显示出其与细胞分裂的密切关系。
用建立的荧光定量PCR检测样品的PCNA和Cyt b基因表达量，以PCNA 为目的基因，以Cyt b基因为管家基因。一般地，基因的相对表达量直接以 目的基因与管家基因的比值来表示，但在本发明中，由于PCNA表达量变 化程度很大，对PCNA和Cyt b表达量的比值取对数可以使表述更为简便， 且通过加上一个常数使得计算结果为正值(这里选取常数10)，因此我们 按以下公式计算PCNA相对表达量：
PCNA的相对表达量REQ＝lg[PCNA基因表达量/Cyt b基因表达量]+ 10。
REQ值越大，则在单位细胞内PCNA基因的相对表达量越多。
计算PCNA相对表达量的方法较单独计算单位细胞内的PCNA表达量 可以得到更稳定的结果，这是因为计算单位细胞内的PCNA的方法需要计 数细胞密度，一方面计数误差会影响结果的准确性(通常情况下计数误差是 较大的)，另一方面，对于野外样品，区分不同的种类是一项需要专业人员 的工作；更重要的是，单独计算单位细胞内的PCNA的表达量无法避免RNA 提取效率与反转录效率对于mRNA表达量检测的影响。而本发明建立相对 表达量的方法，由于以同为mRNA的Cyt b为管家基因进行归一化，不再 需要细胞计数，同时校正了RNA提取效率、反转录效率的影响，从而使得 结果更加稳定。图15与16显示，REQ值与PCNA的表达量以及生长率之 间高度一致。
从各组拟和公式可以看出，PCNA的相对表达量与生长率有着较好的相 关性(相关系数在0.845～0.997)，表明在不同培养条件下获得的数据没有 显著性的偏移，显示不同N、P营养盐水平对PCNA的表达的影响和对生长 率的影响是一致的，PCNA可以较好的作为指示生长率变化的指标。
用显微镜观察方法计算中肋骨条藻的生长率μ(d-1)，通过RFQ-PCR方 法对细胞周期中不同生长阶段的样品进行PCNA与Cyt b基因检测，发现单 个细胞中PCNA表达量与生长率相关，其表达量在细胞周期的不同生长阶 段变化很大，变化趋势与生长率表现出高度一致性，表明PCNA表达量与 细胞分裂密切相关，体现了其作为细胞增殖指标的潜能；而Cyt b基因的表 达量变化很小，表达稳定，可认为Cyt b基因是个理想的管家基因。进而建 立了以PCNA为目的基因、Cyt b为管家基因的中肋骨条藻PCNA基因相对 表达量(REQ)的实时荧光定量PCR检测方法，并研究了REQ与中肋骨条 藻生长率的关系。结果表明，PCNA相对表达量与生长率μ有着较好的相关 性；不同浓度的硝酸盐、磷酸盐对于中肋骨条藻生长率和PCNA基因相对 表达量REQ的关系式没有显著影响。这些都表明，中肋骨条藻PCNA基因 相对表达量可以作为指示其生长率变化的良好指标。在此基础上经过进一步 研究，完全有可能利用PCNA基因相对表达量来估算实际海区中肋骨条藻 的现场生长率，从而为中肋骨条藻赤潮预测和研究提供一种全新的方法。
在实际海区中，浮游藻种类繁多，必然要求所建立的检测方法可以区分 单种(检测具有种特异性)，因此对于本发明建立的方法，要求所设计的目 的基因和管家基因的RFQ-PCR引物与探针对于中肋骨条藻是特异的。本发 明已经以16种浮游藻作为参照藻，对所设计PCNA的RFQ-PCR引物的特 异性进行了验证，表明其具有特异性。
本发明通过对中肋骨条藻PCNA基因的克隆测序，获得了522bp的序 列，并进行了24种藻的PCNA基因系统进化分析。在此基础上，针对中肋 骨条藻PCNA基因序列，设计了荧光定量PCR的引物和探针SC-FQ-PCNA， 以梯度稀释的中肋骨条藻PCNA基因阳性质粒为标准品，建立了检测中肋 骨条藻PCNA基因的荧光定量PCR检测标准曲线：y＝-3.055x+41.093，R 为0.999，并通过已知浓度的质粒样品的检测，验证了此标准曲线的准确性。 通过对16种藻的28S rDNA通用引物和SC-FQ-PCNA的扩增，证实了所设 计的引物对中肋骨条藻的特异性。而进一步地，通过对不同生长期的中肋骨 条藻的PCNA基因检测，则表明了PCNA可能作为中肋骨条藻生长率检测 的良好指标。
本发明中肋骨条藻PCNA检测方法，可以准确定量108～102个拷贝，且 标准曲线回归系数达0.998，稳定性好，且6份样品的CT值的相对标准偏 差为1.5％，也证明了RNA提取与反转录体系的稳定。
样品检测的数据看，PCNA基因表达量在中肋骨条藻培养的不同时期有 着明显变化，培养6天时藻处于指数增长期，PCNA的表达量处于较高水平 (46.2PCNA copy/cell)，11天时处于生长平稳期，PCNA表达量处于较低 水平(0.950PCNA copy/cell)，而18天时已处于衰亡期，PCNA表达量最 低(0.040PCNA copy/cell)。这个结果也证明，PCNA具有检测中肋骨条藻 生长潜能的价值。
本发明通过管家基因的方法来解决RNA提取和反转录稳定性的问题是 更具优势的途径(Rachel et al.，2001；Tsuyoshi et al.，2000；Andrew et al.， 2000)，通过PCNA与管家基因表达量的相对比值形式来反映不同时期PCNA 的相对表达量变化，进一步建立PCNA相对表达量与中肋骨条藻生长率之 间的关系，从而为计算中肋骨条藻的生长率，提供新的方法。
生长潜能估算的最终目的是应用于现场的观测研究中，这就必须解决检 测特异性的问题，以便区分不同藻类的生长参数。本发明通过用SC-FQ-PCNA 引物对16种藻cDNA的扩增，并以28S rDNA通用引物为阳性验证，从而 证实了SC-FQ-PCNA引物对中肋骨条藻的特异性。
收集5份培养一周的中肋骨条藻(细胞密度为4.1×107cells/mL)约 3.8×107个细胞(藻浓缩液重量约为150mg)。用下列RNA提取方法提取：
(1)收集藻细胞，在不断添加液氮条件下用研钵研磨成细粉状；
(2)将研磨液加入到1mL TRIZOL试剂中，置室温下匀化5min；
(3)加入200μL氯仿剧烈、振荡15s，室温下温育3min；
(4)4℃条件下以12000rpm离心15min；
(5)获取界面上层液体加入250μL高浓度盐溶液，混匀后再加入250μL 异丙醇，混匀后于室温下沉淀10min，再在4℃以12000rpm转速离心10min；
(6)移去上清后用1mL 75％乙醇漂洗沉淀，4℃以11000rpm转速离心 5min；
(7)适量DEPC水或去离子甲酰氨溶液溶解，RNA于-80℃保存。
提取后的中肋骨条藻PCNA基因cDNA的部分序列扩增产物，经EB 染色的琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出特异性的条带，产物大小约为520bp。
RT-PCR引物为5-CAG TCT CGG GTT CAA TGC GGC-3，ScPCNArp 5-GGA TAC TCC ACC ACC ACA GGC-3。
连接反应体系10μL，目标DNA片段的量约为50ng，按照插入片段与 载体的摩尔比为1∶3做连接反应。反应物充分混匀后，于16℃连接过夜。
取E.coli DHα-5甘油菌于LB琼脂平皿上划线，37℃培养过夜。挑单个 菌落接种于50mL LB培养液里，37℃摇床250rpm振荡培养过夜；细胞沉 淀用10mL冰冷的CaCl2溶液重悬，分装于预冷的无菌聚丙烯管中，冻存于- 80℃中。
将所得的10μL体系全部转入感受态细胞，轻轻旋动，并于冰上放置 30min。然后将试管放入42℃水浴2min进行热休克，快速移至冰浴中2分 钟；加入100μL LB培养液，于37℃摇床250rpm振荡培养1h，使细胞复苏 同时表达质粒编码的抗生素抗性基因；菌液涂布到含有X-Gal、IPTG、Amp 的LB固体培养基(100mL LB固体培养基中加入200μL的X-Gal的二甲基 甲酰胺溶液(20mg/mL)、100μL的IPTG(24mg/mL)和60μL的Amp (100mg/mL)平板上，于37℃静置培养12-16h。
在过夜LB平板上挑取白色单菌落，置2mL LB培养基(含100μg/mL 氨苄青霉素)中，于37℃摇床上过夜培养。取1.5mL菌液，用微量离心机 12000rpm离心一分钟(剩余菌液保存于4℃)。倾倒去上层清液，控干沉 淀加入预冷的溶液I 100μL悬浮细胞，混匀，即加入溶液II 200μL，上下轻 柔颠倒数次混匀，冰浴5分钟。加溶液III 150μL，小心混匀，冰浴5-10分 钟。12000rpm离心10分钟，将上清液移至另一Eppendorf管中。加两倍体 积预冷的无水乙醇混匀，室温放置10分钟，13500rpm离心10分钟，弃去 上清液，70％乙醇洗涤，超净台中干燥。加含有胰RNA酶(20μg/mL)的 TE(pH 8.0)溶液40-50μL，溶解质粒，待完全溶解后取5μL电泳鉴定。
双酶切反应体系为50μL，反应的条件为37℃过夜消化。酶切结果以琼 脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检验。取经鉴定的阳性克隆，送交上海生物工 程有限公司测序(ABI3730)。测序引物为M13/PUC Sequencing Primer(-20)和 M13/PUC Reverse Sequencing Primer(-48)。
提交测序结果至NCBI的Blast服务器，验证克隆片段的PCNA基因同 源性。
根据RACE的要求和测得的PCNA部分序列，设计应用于3’端RACE 技术的4个引物如下：
pcfp1：AAGGAAGGTGTCCGGTTCTCAGT
Adaptor dT：GACTCGAGTCGACGAATTCAATTTTTTTTTTTTTTTTT
Adaptor：GACTCGAGTCGACGAATTCAA
Pcfp2：TGAGAAGGAGGAGGAACGTGTTATG
RNA的提取同前述提取方法
cDNA链的生成：RT-PCR以引物Adaptor dT(GAC TCG AGT CGA CGA ATT CAA TTT TTT TTT TTT TTT TT)介导生成cDNA链。
3’RACE第一轮PCR反应：以生成的cDNA链为模板，以表1中的体系和 程序进行PCR扩增。
3’RACE第二轮PCR反应：第二轮PCR以第一轮PCR产物(稀释50 倍)为模版，以表2中的体系和程序进行PCR扩增。
表1 3’RACE第一轮PCR反应反应体系及程序
表2 3’RACE第二轮PCR反应反应体系及程序
分离并克隆中肋骨条藻PCNA基因部分序列，通过3’RACE对获得的 中肋骨条藻PCNA序列进行3’端延伸，获得786bp的PCNA序列。
进化分析：用ClustalX V1.81比对PCNA的核酸序列。通过运行ProtTest V1.3(Abascal et al.2005)确定最适进化模式。使用PHYML V2.4.3程序构建 进化树，ProtTest参数值被应用于最大相似度分析和系统树优化。
使用SC-FQ-PCNA引物对16种藻cDNA的扩增，并以28S rDNA通用 引物为阳性验证，证实了SC-FQ-PCNA引物对中肋骨条藻的特异性。
表3实验用藻种名称及来源
藻种名 拉丁文 来源 旋链角毛藻 Chaetoceros curvisetus 胶州湾 柔弱角毛藻 C.debilis 胶州湾 纤细角毛藻 C.gracile 胶州湾 膜质舟形藻 Navicula membranacea 胶州湾 新月菱形藻 Nitzschia closterium 胶州湾 米氏裸甲藻 G.mikimoto 胶州湾 直链藻 Melosira sp. 胶州湾 尖刺拟菱形藻 Pseudonitzschia pungens 胶州湾 圆海链藻 Thalassiosira rotula 胶州湾 中肋骨条藻 Skeletonema costatum 胶州湾 塔玛亚历山大藻 Alexandrium tamarens 大鹏湾 微小原甲藻 Prorocentrum minimun 渤海湾 东海原甲藻 Prorocentrum donghaiense 胶州湾 锥状斯克里普藻 Scrippsiella trochoidea 胶州湾 球等鞭金藻 Isochrysis galbana 胶州湾 红色裸甲藻 G.sanguineum 东海
如前述获得转入PCNA基因的阳性克隆，将培养好的带质粒的细菌收 集到1.5mL离心管中，弃去上清，使细菌沉淀尽量干燥；加100μL预冷的 质粒抽提溶液I悬浮细胞，混匀，即加200μL质粒抽提溶液II，上下轻柔颠 倒数次混匀，冰浴5分钟；加150μL质粒抽提溶液IIII小心混匀，冰浴5-10 分钟；12000rpm离心10分钟，将上清移至另一离心管中；加两倍体积的预 冷的无水乙醇混匀，室温放置10分钟，13000rpm离心10分钟，弃上清，70％ 乙醇洗涤，干燥后加40μL TE缓冲液溶解。酶切验证，测260nm处的吸光 度(Absorbance260，A260)得光密度(optical density，OD)(贝克曼核酸和蛋白质 分析仪，Backman DU640)为0.0705，备用。
将测定的OD值换算成质粒的拷贝，浓度换算公式如下：拷贝浓度 (copy/mL)＝[OD值×50×6.02×1023]/[碱基数×660]，求得浓度为 1×109copy/μL。将重组质粒标准品原液作梯度稀释成1×108、1×107、 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copy/μL，-80℃保存。
根据测得的PCNA序列设计RFQ-PCR引物与探针，所设计的引物SC- FQ-PCNA序列为(fp，5-AGG TGT CCG GTT CTC AGT ATC AG-3；rp，5- AGT AGC CTT GGT AAA GAA GTT GAG G-3)，探针SC-FQ-PCNA序列 为(5-GTC CTC GTT CGT CAA AAC AGC TCT CA-3)，探针5’端用FAM 标记，3’端用TAMRA标记。在ABI7500荧光定量仪上进行荧光定量PCR反 应，体系为：双蒸水8.5μL，2×TaqManUniversal PCR Master Mix 12.5μL， SC-FQ-PCNA正反向引物(10μM)各1μL，TaqMan SC-FQ-PCNA(10mM) 1μL，模板1μL；PCR程序：52℃ 2分钟，95℃10分钟；95℃15秒，60℃ 1分钟，40个循环。每个质粒稀释浓度做三个平行样。以质粒浓度对数值为 横座标，以实时荧光定量PCR反应中相应的CT值为纵座标，绘制标准曲 线。
分别提取各藻的RNA，用Oligo(dT18)反转录成cDNA，用核糖体大亚基 通用引物LSU5’(5’-CGG AGG AAA AGA AAC TAA C-3’)LSU3’(5’-GCG AAA GAC TAA TCG AAC-3’)扩增各藻的cDNA，验证cDNA的质量。
用SC-FQ-PCNA引物对分别扩增各藻的cDNA.扩增。
培养中肋骨条藻，接种密度为1.2×103cells/mL，收集处于指数生长期、 稳定期、衰亡期的藻样品各一份，收集藻细胞，如上所述提取RNA，进行 RT-PCR，取1μL进行Real Time PCR扩增。
稀释的质粒及primer SC-FQ-PCNA和TaqMan SC-FQ-PCNA进行荧光 定量PCR检测。每个稀释度重复测量3次，用测得的CT值对细胞密度的 对数值作图。回归曲线方程为y＝-3.055x+41.093，其中x为细胞数对数值， y为CT值，其回归系数为：R＝0.999。
根据从GenBank数据库中获得的与中肋骨条藻同科的伪矮海链藻 (Thalassiosira pseudonana)的Cytochrome B基因序列，设计中肋骨条藻的引 物为TpCbfp5-ATA CGC TTG GAG TTT TGG GTC TTC T-3，TpCbrp5-ATG AGC CGG AGT TGA CAT AGG ATC T-3。
RNA提取与反转录如前述方法
PCR扩增中肋骨条藻Cyt b基因的部分cDNA片段
反转录的cDNA分别稀释10倍、100倍作为扩增模板，扩增体系与程 序见表4。
表4 Cyt b基因扩增体系与程序
测得OD值为：0.015，利用计算公式：质粒浓度(copy/mL)＝(OD 值×50×6.02×1023)/(660×3406)。求得浓度为2×108copy/μL。将重组质粒 标准品原液作梯度稀释成2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、 2×101copy/μL，贮于-80℃。
根据测得的Cyt b序列设计RFQ-PCR引物探针SC-FQ-Cyt b，引物SC- FQ-Cyt b序列为(fp，5-GTG TTG AGC ACA TTA TGC GAG AT-3；rp，5- GAA CGC CTG AGC ATC AAA GTA A-3)，探针SC-FQ-Cyt b序列为(5- TGC AAA TGG TGC TTC AAT GTT CTT CA-3)。Taqman探针5’端用FAM 标记，3’端用TAMRA标记。在ABI7500荧光定量仪上进行荧光定量PCR反 应，体系为：双蒸水8.5μL，Universal PCR Master Mix12.5μL， SC-FQ-Cyt b正反向引物(10μM)各1μL，TaqMan SC-FQ-Cyt b(10mM) 1μL，模板1μL；PCR程序：52℃2分钟，95℃ 10分钟；95℃ 15秒，60℃1 分钟，40个循环。每个质粒稀释浓度做三个平行样。以质粒浓度对数值为横 座标，以实时荧光定量PCR反应中相应的CT值为纵座标，绘制标准曲线。
如图2所示，中肋骨条藻Cyt b基因cDNA的部分序列扩增产物，经EB 染色的琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出特异性的条带，产物大小约为720bp。
稀释的质粒及primer SC-FQ-Cyt b和TaqMan SC-FQ-Cyt b进行荧光定 量PCR检测。每个稀释度重复测量3次，用测得的CT值对质粒拷贝的对 数值作图。回归曲线方程为y＝-4.0x+44.96，其中x为细胞数对数值，y为 CT值，其回归系数为：R＝0.997。
将海水经0.22μm的滤膜过滤和煮沸法消毒灭菌处理后，用营养自动分 析仪测得其NO3--N浓度为0.96μmol/L，PO4 3--P浓度为0.28μmol/L。根据 Monod方程，硝酸盐影响中肋骨条藻生长速率的半饱和常数KN为 4.0μmol/L；磷酸盐影响中肋骨条藻生长速率的半饱和常数KP为0.54μmol/L (李铁等，2000)。调整N试验组中的NaNO3浓度，使N1、N2、N3、N4 组的NO3--N终浓度分别为0.96μmol/L(约为1/4×KN)、2.0μmol/L(1/2×KN)、 4.0μmol/L(1×KN)、8.0μmol/L(2×KN)，其它条件同前述海藻培养方法；调整 P试验组中的NaH2PO4浓度，使P1、P2、P3组中的PO4 3--P终浓度分别为 0.28μmol/L(约为1/2×KP)、0.54μmol/L(1×KP)、1.08μmol/L(2×KP)，其它条 件同前述海藻培养方法。用于条件实验的各实验组中肋骨条藻的接种密度均 为3.0×103cells/mL。接种的藻液中带入的NO3 --N与PO4 3--P浓度引起的误 差忽略不计。中肋骨条藻均在3L锥形瓶中培养。
每天中午12点计数各实验组的藻细胞密度，绘制各培养条件下的生长 曲线。
第一组从培养的第三天开始，隔天收集样品，藻样均约为2×107个细胞， 离心去除水分后用液氮冻存。
第二组每天收集藻样，藻样均为2×107个细胞离心去除水分后用液氮冻 存。
第三组分别收集在指数生长期、稳定期及衰亡期的藻样，藻样均约为 2×107个细胞离心去除水分后用液氮冻存。
将收集的藻进行RNA提取和反转录后，用荧光定量PCR扩增每个样 品的PCNA和Cyt b基因，以Cyt b基因为管家基因，考察PCNA基因表达 量的变化。以得到的CT值推算单位细胞中基因的表达量，按以下公式计算 PCNA相对表达量REQ：
REQ＝lg[PCNA基因表达量/Cyt b基因表达量]+10。
通过显微镜计数方法，得到第一组的生长曲线(如图3所示)，第二组 的生长曲线(如图4所示)。
根据显微镜镜检得到的细胞密度计算生长率μ，对第一组实验中收集的 样品进行PCNA和Cyt b基因的荧光定量PCR检测，计算单位细胞中的PCNA 拷贝量与REQ值，结果如表5所示。对培养四周中的中肋骨条藻细胞密度、 藻生长率μ以及PCNA基因表达量的变化趋势作图(如图5所示)，图5显示 出中肋骨条藻的生长率μ、PCNA基因表达量以及REQ之间有高度一致性， 在藻的指数生长期变化幅度都很大。对生长率μ与PCNA基因相对表达量 (REQ)进行线性回归，得到回归方程为μ＝0.273REQ-2.02，R＝0.9。
表5 4周培养中11个样品PCNA相对表达量的变化
培养日 期(day) 生长率 μ(d-1) PCNA的 CT值 单位细胞中 PCNA的拷贝量 (copies/cell) Cyt b 的CT 值 单位细胞中 Cyt b的拷贝 量 (copies/cell) REQ 3 1.00 22.50 292 21.27 200 10.2 5 0.651 23.53 85.5 19.99 266 9.48 7 0.602 23.95 45.4 19.69 231 9.29 9 0.148 27.54 7.04 20.87 27l 8.41 11 0.304 24.32 30.6 19.23 268 9.06 13 0.107 26.72 7.45 20.39 204 8.56 15 0.039 29.45 2.49 21.55 274 7.96 17 -0.016 29.02 2.03 21.14 205 8.00 19 -0.016 31.28 0.164 19.54 228 6.86 21 -0.059 31.65 0.203 20.35 235 6.94 23 -0.087 32.05 0.083 19.23 246 6.53
根据显微镜镜检得到的细抱密度讨算生长率μ，对第二组实验中收集的 样品进行PCNA和Cyt b基因的荧光定量PCR检测，计算单位细胞中的PCNA 拷贝量与REQ值(表6)，对培养两周中的中肋骨条藻细胞密度、藻生长 率μ以及PCNA基因表达量的变化趋势作图(如图6所示)，图6也显示出中 肋骨条藻的生长率μ、PCNA基因表达量以及REQ之间有高度一致性，在藻 的指数生长期变化幅度都很大。对14个样品的生长率μ和REQ进行线性回 归，得到回归方程为μ＝0.375REQ-2.79，R＝0.971。
表6 14天培养过程中PCNA的表达量变化
培养 日期 (day) 生长率 μ(d-1) PCNA 的CT 值 单位细胞中 PCNA的拷贝 量 (copies/cell) Cyt b的 CT值 单位细胞中 Cyt b的拷贝 量 (copies/cell) REQ 1 0.956 22.85 180 20.62 234 9.89 2 0.961 22.60 166 20.41 202 9.92 3 1.03 21.98 190 19.87 197 9.98 4 0.968 22.51 161 20.19 208 9.89 5 1.02 22.33 201 20.17 228 9.94 6 0.841 22.96 108 20.08 207 9.72 7 0.783 23.44 86 19.92 260 9.52 8 0.814 23.12 97 20.05 214 9.66 9 0.331 24.54 24 19.23 246 8.99 10 0.167 26.19 6 19.35 194 8.48 11 0.0303 28.94 0.7 19.04 225 7.50 12 -0.008 29.97 0.3 19.27 199 7.22 13 -0.015 30.13 0.3 19.14 218 7.13 14 0.015 29.21 0.6 19.17 211 7.44
氮磷控制组在接种后的4、6、8、10、12日收集样品，对样品进行RFQ- PCR检测。根据得到的PCNA的CT值与Cyt b的CT值推算REQ(表7、8)， 并与生长率μ建立相关关系，对氮不同浓度与磷不同浓度控制组的REQ与μ 进行相关性的拟合，各组生长率μ和REQ进行线性回归方程见表5.5。其中 N1组由于藻的密度随培养时间的增加而减少，样品的量不足以提取RNA 进行后续的检测，因此未能得到相应的生长率μ与REQ的相关关系。
表7 N组PCNA的表达量变化
培养时 (day) 细胞密度 (cells/mL) 生长率 μ(d-1) PCNA的 CT值 Cyt b的 CT值 REQ值
N1-4 67000 0.516 #* # # N1-6 98000 0.0632 # # # N1-8 70000 -0.357 # # # N1-10 63000 -0.0910 # # # N1-12 61000 0.0165 # # # N2-4 91000 0.450 24.22 19.78 9.23 N2-6 110000 0 31.52 19.71 6.82 N2-8 130000 0.080 31.08 19.70 6.96 N2-10 120000 -0.223 32.66 19.81 6.47 N2-12 120000 0.0870 31.99 19.62 6.65 N3-4 120000 0.431 24.44 19.47 9.08 N3-6 170000 0.268 25.93 19.86 8.69 N3-8 150000 -0.125 31.77 19.88 6.78 N3-10 170000 -0.111 31.23 19.61 6.89 N3-12 170000 -0.0572 31.73 19.46 6.69 N4-4 150000 0.406 24.40 20.01 9.23 N4-6 180000 0.0572 28.45 19.54 7.78 N4-8 190000 0.111 26.45 19.89 8.53 N4-10 220000 -0.0445 29.50 19.68 7.47 N4-12 210000 0.0488 31.23 19.78 6.93
*N1-4表示N1的第四天，以此类推；#代表未检出。
表8 P组PCNA的表达量变化.
培养时间 (day) 细胞密度 (cells/mL) 生长率 μ(d-1) PCNA的 CT值 Cytb的 CT值 REQ值 P1-4 84000 0.334 25.47 20.06 8.89 P1-6 150000 0.0690 29.55 19.79 7.49
P1-8 130000 -0.325 32.75 19.95 6.48 P1-10 81000 -0.306 32.42 19.78 6.54 P1-12 44000 -0.310 32.29 19.67 6.56 P2-4 130000 0.262 27.45 19.27 8.04 P2-6 170000 0.0606 30.04 19.88 7.35 P2-8 170000 -0.0572 31.29 19.58 6.86 P2-10 110000 -0.241 33.90 19.71 6.04 P2-12 68000 -0.163 33.03 19.67 6.32 P3-4 140000 0.241 27.61 19.44 8.03 P3-6 240000 0.182 29.62 19.35 7.35 P3-8 240000 -0.223 33.40 19.67 6.20 P3-10 130000 -0.431 34.40 19.84 5.91 P3-12 76000 -0.274 33.50 20.17 6.29
表9不同培养条件下生长率μ和REQ的线性回归方程与相关系数
实验组 生长率μ和REQ的线性回归方程 (y为生长率μ，x为REQ) 相关系数(R) N2组 y＝0.194x-1.32 0.907 N3组 y＝0.214x-1.55 0.983 N4组 y＝0.160x-1.17 0.845 P1组 y＝0.282x-2.14 0.984 P2组 y＝0.246x-1.73 0.997 P3组 y＝0.321x-2.27 0.971
从图5可以看出，单位细胞中PCNA基因表达量在中肋骨条藻培养的 不同阶段有着明显变化，在培养初期(2-5天)藻细胞密度迅速增加，处于 对数生长期，生长率较高，最高达到2.79d-1，相应的此阶段的单位细胞中 PCNA基因表达量也较高，最高达到292copies/cell，随后生长率逐渐变小， PCNA表达量逐渐降低，在培养的9-12天，生长率再次出现一个小的峰值， PCNA表达量亦有反映，在培养的后期生长率为0或负值，PCNA表达量亦 降到很低的范围(＜0.10copies/cell)。
从图6同样可以看到，在第二组实验的培养初期(2-5天)藻细胞密度 迅速增加，生长率较高，最高达到1.03d-1，相应的此阶段的单位细胞中PCNA 基因表达量也较高，最高达到201copies/cell，随后生长率逐渐变小，PCNA 表达量也逐渐降低。
因此，从第一、二组实验中肋骨条藻培养过程中，PCNA的表达量与生 长率表现出高度的一致性，显示出其与细胞分裂的密切关系。
用建立的荧光定量PCR检测样品的PCNA和Cyt b基因表达量，以PCNA 为目的基因，以Cyt b基因为管家基因。一般地，基因的相对表达量直接以 目的基因与管家基因的比值来表示，但在本发明中，由于PCNA表达量变 化程度很大，对PCNA和Cyt b表达量的比值取对数可以使表述更为简便， 且通过加上一个常数使得计算结果为正值(这里选取常数10)，因此我们 按以下公式计算PCNA相对表达量：
PCNA的相对表达量REQ＝lg[PCNA基因表达量/Cyt b基因表达量]+ 10。
REQ值越大，则在单位细胞内PCNA基因的相对表达量越多。
计算PCNA相对表达量的方法较单独计算单位细胞内的PCNA表达量 可以得到更稳定的结果，这是因为计算单位细胞内的PCNA的方法需要计 数细胞密度，一方面计数误差会影响结果的准确性(通常情况下计数误差是 较大的)，另一方面，对于野外样品，区分不同的种类是一项需要专业人员 的工作；更重要的是，单独计算单位细胞内的PCNA的表达量无法避免RNA 提取效率与反转录效率对于mRNA表达量检测的影响。而本发明建立相对 表达量的方法，由于以同为mRNA的Cyt b为管家基因进行归一化，不再 需要细胞计数，同时校正了RNA提取效率、反转录效率的影响，从而使得 结果更加稳定。图15与16显示，REQ值与PCNA的表达量以及生长率之 间高度一致。
从各组拟和公式可以看出，PCNA的相对表达量与生长率有着较好的相 关性(相关系数在0.845～0.997)，表明在不同培养条件下获得的数据没有 显著性的偏移，显示不同N、P营养盐水平对PCNA的表达的影响和对生长 率的影响是一致的，PCNA可以较好的作为指示生长率变化的指标。
用显微镜观察方法计算中肋骨条藻的生长率μ(d-1)，通过RFQ-PCR方 法对细胞周期中不同生长阶段的样品进行PCNA与Cyt b基因检测，发现单 个细胞中PCNA表达量与生长率相关，其表达量在细胞周期的不同生长阶 段变化很大，变化趋势与生长率表现出高度一致性，表明PCNA表达量与 细胞分裂密切相关，体现了其作为细胞增殖指标的潜能；而Cyt b基因的表 达量变化很小，表达稳定，可认为Cyt b基因是个理想的管家基因。进而建 立了以PCNA为目的基因、Cyt b为管家基因的中肋骨条藻PCNA基因相对 表达量(REQ)的实时荧光定量PCR检测方法，并研究了REQ与中肋骨条 藻生长率的关系。结果表明，PCNA相对表达量与生长率μ有着较好的相关 性；不同浓度的硝酸盐、磷酸盐对于中肋骨条藻生长率和PCNA基因相对 表达量REQ的关系式没有显著影响。这些都表明，中肋骨条藻PCNA基因 相对表达量可以作为指示其生长率变化的良好指标。在此基础上经过进一步 研究，完全有可能利用PCNA基因相对表达量来估算实际海区中肋骨条藻 的现场生长率，从而为中肋骨条藻赤潮预测和研究提供一种全新的方法。
在实际海区中，浮游藻种类繁多，必然要求所建立的检测方法可以区分 单种(检测具有种特异性)，因此对于本发明建立的方法，要求所设计的目 的基因和管家基因的RFQ-PCR引物与探针对于中肋骨条藻是特异的。本发 明已经以16种浮游藻作为参照藻，对所设计PCNA的RFQ-PCR引物的特 异性进行了验证，表明其具有特异性。
本发明通过对中肋骨条藻PCNA基因的克隆测序，获得了522bp的序 列，并进行了24种藻的PCNA基因系统进化分析。在此基础上，针对中肋 骨条藻PCNA基因序列，设计了荧光定量PCR的引物和探针SC-FQ-PCNA， 以梯度稀释的中肋骨条藻PCNA基因阳性质粒为标准品，建立了检测中肋 骨条藻PCNA基因的荧光定量PCR检测标准曲线：y＝-3.055x+41.093，R 为0.999，并通过已知浓度的质粒样品的检测，验证了此标准曲线的准确性。 通过对16种藻的28S rDNA通用引物和SC-FQ-PCNA的扩增，证实了所设 计的引物对中肋骨条藻的特异性。而进一步地，通过对不同生长期的中肋骨 条藻的PCNA基因检测，则表明了PCNA可能作为中肋骨条藻生长率检测 的良好指标。
本发明中肋骨条藻PCNA检测方法，可以准确定量108～102个拷贝，且 标准曲线回归系数达0.998，稳定性好，且6份样品的CT值的相对标准偏 差为1.5％，也证明了RNA提取与反转录体系的稳定。
样品检测的数据看，PCNA基因表达量在中肋骨条藻培养的不同时期有 着明显变化，培养6天时藻处于指数增长期，PCNA的表达量处于较高水平 (46.2PCNA copy/cell)，11天时处于生长平稳期，PCNA表达量处于较低 水平(0.950PCNA copy/cell)，而18天时已处于衰亡期，PCNA表达量最 低(0.040PCNA copy/cell)。这个结果也证明，PCNA具有检测中肋骨条藻 生长潜能的价值。
本发明通过管家基因的方法来解决RNA提取和反转录稳定性的问题是 更具优势的途径(Rachel et al.，2001；Tsuyoshi et al.，2000；Andrew et al.， 2000)，通过PCNA与管家基因表达量的相对比值形式来反映不同时期PCNA 的相对表达量变化，进一步建立PCNA相对表达量与中肋骨条藻生长率之 间的关系，从而为计算中肋骨条藻的生长率，提供新的方法。
生长潜能估算的最终目的是应用于现场的观测研究中，这就必须解决检 测特异性的问题，以便区分不同藻类的生长参数。本发明通过用SC-FQ-PCNA 引物对16种藻cDNA的扩增，并以28S rDNA通用引物为阳性验证，从而 证实了SC-FQ-PCNA引物对中肋骨条藻的特异性。