一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒转让专利
申请号 : CN200710027789.X
文献号 : CN100582746C
文献日 : 2010-01-20
发明人 : 王前 , 张梦宇 , 郑磊
申请人 : 南方医科大学
摘要 :
本发明提供了一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒含有引物：5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)；和荧光探针：5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-13’(SEQ NO.3)。本发明试剂盒特异性扩增曲霉菌ITS I区间的基因，产物大小为79bp，能快速准确地检测出常见的多种致病曲霉菌(如烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉和构巢曲霉)，最低检测下线达到5～10CFU/ml，用于临床诊断侵袭性曲霉菌感染具有很好的敏感度和特异度。
权利要求 :
1、一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由引物、DNA聚合酶、荧光探针、 荧光定量PCR反应液、定量阳性模板和阴性对照血清组成，其特征在于：(1)所述的引物为特异性扩增曲霉菌ITS I区域的引物，其中，上游引物序列为：5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，下游引物序列为：5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)；
(2)所述的荧光探针序列为：
5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-13’(SEQ NO.3)，其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQ-1为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；
(3)所述的定量阳性模板为含有序列为SEQ NO.4的DNA片段的pMD19-T重组质粒。
2、权利要求1所述的一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，其中所述的定量阳性模板 的制备方法，该方法由以下步骤组成：(1)以从曲霉菌提取出总DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增 出序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为：93℃变性3min后进入循环，93℃ 30s， 56℃ 30s，72℃ 40s，共33个循环，最后一步为70℃ 40s延伸；
(2)回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；
(3)将DNA片段SEQ NO.4插入到pMD19-T中，即可，上述步骤(1)中所用的曲霉菌是烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉或构巢曲霉。
说明书 :
技术领域
本发明涉及检验微生物的组合物，具体是检验曲霉菌的组合物，特别是检验曲霉菌基因 中的一段核酸序列的试剂盒。
背景技术
目前临床上常见的深部病原菌是念珠菌、曲霉菌、新隐球菌等，其中念珠菌约占70％。 近年来霉菌感染率明显增高，在中性粒细胞缺乏和骨髓移植的患者中，侵袭性曲霉病的感染率 高达50％，病死率高达40％以上，存活主要依赖于早期诊断和恰当的抗真菌治疗，而传统的 实验室诊断耗时较长，缺乏敏感性，所以探索一种检测曲霉菌的快速可靠的方法已经成为临 床实验研究的热点问题。
致病性曲霉的种群有13个，严重的播散性感染总发生于免疫缺陷的患者。其中烟曲霉是 最常见的菌种，黄曲霉居第二，免疫缺陷侵袭性肺感染和鼻窦感染中黑曲霉是第三位常见分 离菌，其他致病曲霉还包括土曲霉、构巢曲霉、阿姆斯特丹曲霉、亮白曲霉、肉色曲霉。
诊断深部曲霉菌感染的方法有传统的培养方法、影像学方法、血清学方法以及分子生物 学方法。传统的真菌培养和组织活检是诊断曲霉菌感染的金标准，但因其所需时间较长，敏 感度较低，组织活检给病人带来一定的创伤，已无法满足临床的需要。影像学检查是用高分 辨率CT对侵袭性肺曲霉感染的病人胸部进行观察，感染曲霉菌的典型特征是发现光晕征和新 月形空气征，这些对诊断曲霉感染高危病人有一定的早期诊断价值，但特异度差，在其他感 染和非感染病人中均可出现此特征。血清学方法具有较高的敏感度和特异度，但一些临床常 见的致病菌如隐球菌等会引起假阳性。分子生物学方法主要是指PCR(聚合酶链反应)方法。 PCR方法具有很高的敏感度，但特异度较差，容易受到外源污染造成假阳性。目前PCR方法 主要朝两个方向发展，一个是结合免疫学方法的PCR-ELISA方法，利用ELISA方法的高特异 度来克服PCR方法的缺点，但ELISA方法检测曲霉菌抗原结果不稳定，受操作人员、温度等 多方面的影响较大，尤其对判定结果的cutoff值的大小是急需解决的问题。另一个实时荧光 定量PCR方法，从进样到检测出结果一步到位，可避免中间操作带来的外源污染。
Development and Validation of a Quantitative Real-Time PCR Assay Using Fluorescence Resonance Energy Transfer Technology for Detection of Aspergillus fumigatus in Experimental Invasive Pulmonary Aspergillosis(Journal Of ClinIcal Microbiology，Dec.2003，p.5676-5682 Vol. 41，No.12)一文公开了一种利用实时PCR扩增ITS1-ITS2片段来检测烟曲霉的方法，具有很 高的敏感度和特异度，但该方法仅限于检测烟曲霉。
世界知识产权组织2003年11月27日公开了一项“Molecular Identification of Aspergillus Species”发明专利申请(WO03/097815)，该申请公开了一种利用实时PCR方法扩增ITS1五 个区域的序列来鉴定和检测曲霉，还公开了该方法可用于诊断曲霉感染，但该方法鉴定不同 种的曲霉需要使用不同的探针，成本极高，且临床诊断并不需要鉴定曲霉菌到种，因此该检 测方法并不适用于临床诊断。
致病性曲霉的种群有13个，严重的播散性感染总发生于免疫缺陷的患者。其中烟曲霉是 最常见的菌种，黄曲霉居第二，免疫缺陷侵袭性肺感染和鼻窦感染中黑曲霉是第三位常见分 离菌，其他致病曲霉还包括土曲霉、构巢曲霉、阿姆斯特丹曲霉、亮白曲霉、肉色曲霉。
诊断深部曲霉菌感染的方法有传统的培养方法、影像学方法、血清学方法以及分子生物 学方法。传统的真菌培养和组织活检是诊断曲霉菌感染的金标准，但因其所需时间较长，敏 感度较低，组织活检给病人带来一定的创伤，已无法满足临床的需要。影像学检查是用高分 辨率CT对侵袭性肺曲霉感染的病人胸部进行观察，感染曲霉菌的典型特征是发现光晕征和新 月形空气征，这些对诊断曲霉感染高危病人有一定的早期诊断价值，但特异度差，在其他感 染和非感染病人中均可出现此特征。血清学方法具有较高的敏感度和特异度，但一些临床常 见的致病菌如隐球菌等会引起假阳性。分子生物学方法主要是指PCR(聚合酶链反应)方法。 PCR方法具有很高的敏感度，但特异度较差，容易受到外源污染造成假阳性。目前PCR方法 主要朝两个方向发展，一个是结合免疫学方法的PCR-ELISA方法，利用ELISA方法的高特异 度来克服PCR方法的缺点，但ELISA方法检测曲霉菌抗原结果不稳定，受操作人员、温度等 多方面的影响较大，尤其对判定结果的cutoff值的大小是急需解决的问题。另一个实时荧光 定量PCR方法，从进样到检测出结果一步到位，可避免中间操作带来的外源污染。
Development and Validation of a Quantitative Real-Time PCR Assay Using Fluorescence Resonance Energy Transfer Technology for Detection of Aspergillus fumigatus in Experimental Invasive Pulmonary Aspergillosis(Journal Of ClinIcal Microbiology，Dec.2003，p.5676-5682 Vol. 41，No.12)一文公开了一种利用实时PCR扩增ITS1-ITS2片段来检测烟曲霉的方法，具有很 高的敏感度和特异度，但该方法仅限于检测烟曲霉。
世界知识产权组织2003年11月27日公开了一项“Molecular Identification of Aspergillus Species”发明专利申请(WO03/097815)，该申请公开了一种利用实时PCR方法扩增ITS1五 个区域的序列来鉴定和检测曲霉，还公开了该方法可用于诊断曲霉感染，但该方法鉴定不同 种的曲霉需要使用不同的探针，成本极高，且临床诊断并不需要鉴定曲霉菌到种，因此该检 测方法并不适用于临床诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在实现同时检测曲霉菌属中的多种曲霉菌种，范围广并进一 步提高检测曲霉菌的特异度。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由引物、DNA聚合酶、荧光探针、定 量阳性模板、荧光定量PCR反应液和阴性对照血清(即健康人的血清)组成，其特征在于：
(1)所述的引物为特异性扩增曲霉菌ITS I区域的引物，其中，
上游引物序列为：5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，
下游引物序列为：5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)；
(2)所述的荧光探针序列为：
5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-13’(SEQ NO.3)，
其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQ-1为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；
(3)所述的定量阳性模板为含有序列为SEQ NO.4的DNA片段的pMD19-T重组质粒。
上述方案中序列SEQNO.4具体为：
cggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggc gggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctg ttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcg。
本发明所述的定量阳性模板的构建方法是用引物SEQ NO.5和SEQ NO.6扩增曲霉菌 ITS I基因，所得片段大小为234bp，然后将该片段插入质粒载体中构建重组质粒，具体方法 为：
1)以从曲霉菌提取出总DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增出 序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为：93℃变性3min后进入循环，93℃30s、56℃ 30s、72℃40s，共33个循环，最后一步为70℃40s延伸；
2)回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；
3)将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载体中，即可。
上述方法中，所述的曲霉菌可以是烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉或构巢曲霉；所述 的质粒载体是T克隆载体，如pMD19-T载体；所述的将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载 体的方法为本领域的常规方法，具体的步骤和工艺参数视所选的质粒载体而定。
本发明所述的试剂盒的使用方法为：
(1)反应体系如表1所示。
表1本发明试剂盒PCR反应体系
(2)反应程序：37℃ 5min
94℃ 1min
(3)定量标准曲线制备：将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成109～101copies/ml 9个 浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序，每个浓度平行加入3个反应管同时进行扩增，共 做4次；反应结束后计算机自动绘制标准曲线Y＝aX+b，R2，其中Y表示起始模板拷贝数的 对数，X表示C(t)值。
(4)样品检测：取病人血清200μl，按常规提取曲霉菌DNA的方法提取DNA，取5μl 作为模板，按照上述反应体系和反应程序进行扩增即可。
(5)结果判断：C(t)值小于35.0为阳性，大于35.0为阴性，起始模板拷贝数则根据标 准曲线和所得的C(t)值计算。
rDNA是真核生物基因组DNA中的中等重复、并有转录活性的基因家族，本发明人通过 大量曲霉菌属内外菌株的多处rRNA基因比对，发现各菌属在ITS I区间差别较大，而曲霉 菌种在此间较保守，本发明试剂盒正是通过检测这段序列来判断样品中是否存在曲霉菌，扩增 的片段为cggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcggg(SEQ NO.7)，在曲霉基因组中的位置如图1所示，大小为79bp。
与以往检测单种曲霉菌的PCR试剂盒不同的是本发明所述的试剂盒能同时检测出临床上 常见的导致侵袭性曲霉感染的曲霉菌如烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和构巢曲霉等，不 需要针对不同的曲霉来设计不同的引物和探针，与血清学方法类的试剂盒相比，本发明具有 更高的特异度，能快速准确地检测出血液或血清中的曲霉菌，最低检测下线达到5～ 10CFU/ml，可用于诊断侵袭性曲霉菌感染。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由引物、DNA聚合酶、荧光探针、定 量阳性模板、荧光定量PCR反应液和阴性对照血清(即健康人的血清)组成，其特征在于：
(1)所述的引物为特异性扩增曲霉菌ITS I区域的引物，其中，
上游引物序列为：5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，
下游引物序列为：5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)；
(2)所述的荧光探针序列为：
5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-13’(SEQ NO.3)，
其中FAM为标记在探针5’端的荧光基团，BHQ-1为标记在探针3’端的荧光淬灭基团；
(3)所述的定量阳性模板为含有序列为SEQ NO.4的DNA片段的pMD19-T重组质粒。
上述方案中序列SEQNO.4具体为：
cggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggc gggcccgccgtttcgacggccgccggggaggccttgcgcccccgggcccgcgcccgccgaagaccccaacatgaacgctg ttctgaaagtatgcagtctgagttgattatcgtaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcg。
本发明所述的定量阳性模板的构建方法是用引物SEQ NO.5和SEQ NO.6扩增曲霉菌 ITS I基因，所得片段大小为234bp，然后将该片段插入质粒载体中构建重组质粒，具体方法 为：
1)以从曲霉菌提取出总DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增出 序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为：93℃变性3min后进入循环，93℃30s、56℃ 30s、72℃40s，共33个循环，最后一步为70℃40s延伸；
2)回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；
3)将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载体中，即可。
上述方法中，所述的曲霉菌可以是烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉或构巢曲霉；所述 的质粒载体是T克隆载体，如pMD19-T载体；所述的将DNA片段SEQ NO.4插入到质粒载 体的方法为本领域的常规方法，具体的步骤和工艺参数视所选的质粒载体而定。
本发明所述的试剂盒的使用方法为：
(1)反应体系如表1所示。
表1本发明试剂盒PCR反应体系
(2)反应程序：37℃ 5min
94℃ 1min
(3)定量标准曲线制备：将定量阳性模板按10倍稀释法稀释成109～101copies/ml 9个 浓度梯度，按照上述反应体系和反应程序，每个浓度平行加入3个反应管同时进行扩增，共 做4次；反应结束后计算机自动绘制标准曲线Y＝aX+b，R2，其中Y表示起始模板拷贝数的 对数，X表示C(t)值。
(4)样品检测：取病人血清200μl，按常规提取曲霉菌DNA的方法提取DNA，取5μl 作为模板，按照上述反应体系和反应程序进行扩增即可。
(5)结果判断：C(t)值小于35.0为阳性，大于35.0为阴性，起始模板拷贝数则根据标 准曲线和所得的C(t)值计算。
rDNA是真核生物基因组DNA中的中等重复、并有转录活性的基因家族，本发明人通过 大量曲霉菌属内外菌株的多处rRNA基因比对，发现各菌属在ITS I区间差别较大，而曲霉 菌种在此间较保守，本发明试剂盒正是通过检测这段序列来判断样品中是否存在曲霉菌，扩增 的片段为cggaaggatcattaccgagtgagggccctctgggtccaacctcccacccgtgtctatcgtaccttgttgcttcggcggg(SEQ NO.7)，在曲霉基因组中的位置如图1所示，大小为79bp。
与以往检测单种曲霉菌的PCR试剂盒不同的是本发明所述的试剂盒能同时检测出临床上 常见的导致侵袭性曲霉感染的曲霉菌如烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉和构巢曲霉等，不 需要针对不同的曲霉来设计不同的引物和探针，与血清学方法类的试剂盒相比，本发明具有 更高的特异度，能快速准确地检测出血液或血清中的曲霉菌，最低检测下线达到5～ 10CFU/ml，可用于诊断侵袭性曲霉菌感染。
附图说明
图1是本发明试剂盒扩增的DNA片段的在曲霉基因组中的位置图，图中剖面线方框所 示的部位是本发明试剂盒扩增的DNA片段。
图2是实施例2所述的试剂盒的荧光定量PCR的标准曲线图。
图3是实施例2所述的试剂盒检测标准菌株等比例稀释液结果，其中1～6分别为浓度为 105个/ml、104个/ml、103个/ml、102个/ml、10个/ml、1个/ml的标准菌稀释液。
图2是实施例2所述的试剂盒的荧光定量PCR的标准曲线图。
图3是实施例2所述的试剂盒检测标准菌株等比例稀释液结果，其中1～6分别为浓度为 105个/ml、104个/ml、103个/ml、102个/ml、10个/ml、1个/ml的标准菌稀释液。
具体实施方式
下面将结合实施例来说明本发明具有的有益效果。
实施例1：本发明所述的试剂盒的制备
1、检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒的组成：
上游引物：5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，5pmol/μl；
下游引物：5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)，5pmol/μl；
荧光探针：5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-13’(SEQ NO.3)， 10pmol/μl；
定量阳性模板：含有DNA片段SEQ NO.4的pMD19-T重组载体，浓度是105copy/ml。
DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶，购自华银生物基因有限公司；
PCR Mix：购自华银生物基因有限公司；
上述核酸均由广州华银生物技术有限公司合成。
2、所述定量阳性模板的制备方法是：
(1)以从曲霉菌提取出总DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增 出序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为：93℃变性3min后进入循环，93℃ 30s、 56℃ 30s、72℃ 40s，共33个循环，最后一步为70℃ 40s延伸；
(2)使用DNA胶回收试剂盒回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；
(3)将DNA片段SEQ NO.4插入到pMD19-T载体中，具体方法是：
a.DNA片段SEQ NO.4与T载体的连接和转化：
1)在微量离心管中加入：
PMD19-T Vector 1μl
目的DNA SEQ NO.4 5μl
dH2O 3μl；
2)加入9μl的Ligation Mix；
3)16℃反应过夜；
4)把感受态细胞DH5α从-80℃冰箱中取出，置于冰中。60μl移至灭菌处理的试管内；
5)加入目的DNA 10μl；
6)冰中放置30min；
7)42℃ 60S；
8)冰中放置2～3min；
9)加入37℃ LB液体培养基1ml；
10)37℃振荡1h(120r/min)；
11)取200μl培养基涂板于LB氨苄青霉素固体培养基中；
12)37℃过夜培养；
13)取3个菌落放入LB氨苄青霉素液体培养基3ml中摇菌扩增24h。
b.重组质粒提取：
1)取扩增菌液2ml离心10,000g 1min；
2)弃上清，加入250μl Solution I/R NaseA悬浮细胞；
3)加入250μl SolutionII，轻轻混均，上下颠倒4～6次；
4)加入350μl SolutionIII，轻轻混均，上下颠倒直到白色絮状物形成；
5)离心10,000g 10min；
6)小心把清澈的上清加入到干净的HiBindTMDNAMiricolumn中，离心Miricolumn 10,000g 1min；
7)去液，加500μl bufferHB洗管后，离心10,000g 1min；
8)弃液，加入700μl DNA wash buffer，离心10,000g 1min；
9)重复步骤8)；
10)再离心空管10,000g 1min；
11)把空管放入干净的1.5ml离心管中，加入去离子水300μl，离心10,000g 1min。
3、鉴定：将所得重组质粒用引物SEQ NO.5和SEQ NO.6扩增，反应条件同上，所得 产物大小为234bp。
下述实施例所用的试剂盒均为实施例1所述的试剂盒。
实施例2：体外检测实验
1、模板DNA的制备：
a.试剂：核酸提取试剂盒，购自广州华银生物技术有限公司合成。
b.标准菌株培养及制备：
曲霉菌标准菌株：烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉，由南方医院提供；
待检测样品：临床分离的几种曲霉菌；
阴性对照菌株：白色光滑念珠菌、热带念珠菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌。
c.DNA的提取：取含菌悬液0.5ml，13000r/min离心6min，弃上清，加入0.2mlTris (100mmol/L，pH7.4)缓冲液，lyticase酶5U，37℃水浴1h。取50μl，用核酸提取试剂盒提 取DNA，终体积为20μl(详细步骤请参照试剂盒说明书)。提取的DNA模板-20℃保存备用。
2、荧光定量PCR反应：
1)反应体系如表2所示：
表2本实施例试剂盒PCR反应体系
2)方法：每批反应设一个阳性对照，一个空白对照(由dH2O取代)，一个阴性对照(为 正常人血的提取标本)，反应程序为：
37℃ 5min；
94℃ 1min
仪器：MJ opticon 2荧光定量PCR仪，MJ公司(美国)。
3)定量标准曲线制备：
将定量阳性模板10倍倍比稀释成109～101copies/ml浓度梯度，在上述反应条件下每个 浓度平行加入3个反应管同时进行扩增，共做4次，反应结束后计算机自动绘制标准曲线， 如图2所示，起始模板在107～104copies/ml时线性较好，结果在Opticon monitor 2软件上 分析，得到标准曲线：Y＝-0.37X+16.05，R2＝0.997。
4)敏感性、特异度测定：
取标准菌株储备液按比例稀释为105、104、103、102、10、1个孢子/ml，按照上述方法 消化提取模板，用荧光定量PCR分析，以确定最低检测下线。取白色念珠菌、隐球菌、金黄 色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株以及其他几种曲霉菌，挑取菌落制备成细菌悬浊液，消 化、提取DNA后分析检测。
结果如图3所示，标准菌株等比例稀释液real-time PCR结果呈现规律的Ct值变化，说 明仪器参数稳定，最低检测下线达到5～10CFU/ml。其他几种曲霉菌为阳性扩增。对白色念 珠菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的检测结果均为阴性，与预期结果完全相同， 无非特异度扩增。
实施例3：临床实验
1、实验方法：
1)临床标本的收集：
2006年4月至2007年2月，在广州南方医院共收集高度疑似曲霉菌感染病例71例，标 本232份。普通生化管抽取病人静脉血2ml，4000r/min离心8min，取300μl、400～600μl 血清分装在无菌1.5mlEP管中，编号登记，-20℃冰箱保存。
2)主要仪器
MJopticon2荧光定量PCR仪 MJ公司(美国)
生物安全柜 haier公司(中国)
高速离心机 TG16-WS(中国)
水浴槽 江苏太仓市实验设备厂
超净工作台 苏州净化设备厂
涡旋振荡器 Thermolyne M63210-26(美国)
全自动酶标分析仪 BIO-RAD公司(美国)
3)纳入排除标准：对血液科、肿瘤科、肝肾移植的免疫力低下高度疑似曲霉菌感染的病 人进行研究。纳入病人必须符合1项宿主因素、1项临床标准或微生物学标准。如下：
宿主因素：(1)外周血中性粒细胞减少：中性粒细胞计数＜0.5×109/L，且持续10d以 上；(2)体温＞38℃或＜36℃，且存在下列任何1种易感因素：①之前60d内出现过长期中 性粒细胞减少(10d以上)；②之前30d内，曾使用过或正在使用强效免疫抑制剂；③侵袭性 真菌感染病史；④患者同时患有艾滋病；⑤存在移植物抗宿主病的症状和体征；⑥长期使用 类固醇激素(3周以上)。
临床标准：持续发热超过96h，合理的广谱抗生素治疗无效。下呼吸道感染：主要标准： CT检出以下任何1种渗出征象：光晕征；新月形空气征；实变区域内出现空腔。次要标准： 下呼吸道感染症状(咳嗽，胸痛，咯血，呼吸困难等)。
微生物学标准：(1)痰液或支气管肺泡灌洗液培养呈真菌；(2)痰液或支气管肺泡灌洗液 经直接镜检或细胞学检查，发现曲霉菌；(3)支气管肺泡灌洗液、脑脊液或2份以上的血液样 品呈曲霉菌抗原阳性；(4)无菌体液中，经直接镜检或细胞学检查，发现曲霉菌；(5)血培养 呈真菌阳性；(6)肺部异常，与下呼吸道感染的相关标本中(血液、痰液和支气管肺泡灌洗液 等)无法培养出任何致病细菌。
排除标准：溶血严重的血标本。
侵袭性真菌感染(IPFI)的诊断由宿主因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学四 部分组成。临床诊断IPFI分确诊、临床诊断及拟诊3个级别，判断标准如表3所示。
表3侵袭性真菌感染的诊断标准
4)临床研究步骤：
对符合上述纳入标准的病人进行跟踪研究。争取在使用抗真菌类药物以前抽血，而后每 周1-2次，40天为一个试验研究周期。而后继续跟踪病人情况，直致出院或死亡。收集到 一定数量后，用本发明试剂盒和曲霉菌抗原检测试剂盒(sigma公司)，下面将简称为ELISA 试剂盒，对标本进行检测。
统计学方法：检测结果用SPSS12.0分析，对ELISA方法和PCR方法的敏感度、特异度 做x2检验即McNemar检验。取α＝0.05水准双侧检验。
2、实验结果：
根据中华内科杂志编辑委员会2006年8月在中华内科杂志发表的《侵袭性肺部真菌感染 的诊断标准与治疗原则(草案)》，对71个病例进行判别分类，其中确诊10例，临床诊断30 例，拟诊8例，非曲霉菌感染病例23例。
(1)实施例1所述的试剂盒对71个病例、232份标本的检测阳性率为42.2％(98/232)。 结果见表4：敏感度为87.5％(42/48)，特异度为95.6％(22/23)，准确度为90.1％(64/71)。阳 性预测值为97.6％(41/42)，阴性预测值为75.8％(22/29)。
表4本发明试剂盒的诊断结果
(2)曲霉菌抗原检测试剂盒的检测结果见表5：敏感度为91.6％(44/48)，特异度为 60.8％(14/23)，准确度为81.6％(58/71)。
表5曲霉菌抗原检测试剂盒的诊断结果
(3)两种试剂盒的比较：对48例诊断为曲霉菌感染的病人，用本发明试剂盒和ELISA试 剂盒检测结果的配对计数资料的x2检验即McNemar检验，结果如表6所示，P＝0.549(双侧)， P＞0.05，我们认为两种方法的敏感度差异无显著性意义；Kappa＝-0.119，kappa＜0.4，说明 两者吻合度较弱。
表6两种试剂盒的敏感度比较
对23例诊断为非曲霉菌感染的病人，进行荧光定量PCR和ELISA方法配对计数资料的x2检 验即McNemar检验，结果如表7所示，P＝0.021(双侧)，P＜0.05，我们认为两种方法的特异度 差异有显著性意义，荧光定量PCR的特异度较高。Kappa＝-0.085，kappa＜0.4，说明两者吻合度 较弱。
表7两种试剂盒的特异度比较
上述实验结果表明，本发明试剂盒与曲霉菌抗原检测试剂盒相比，在保证检测敏感度相 当的情况下，大大提高了特异度，可见，本发明试剂盒应用于侵袭性曲霉菌感染的诊断具有 快速且更准确的优点。
SEQUENCE LISTING
<110>南方医科大学
<120>一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cggaaggatc attaccgagt ga 22
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cccgccgaag caacaag 17
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccaacctccc acccgtgtct atygt 25
<210>4
<211>234
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cggaaggatc attaccgagt gagggccctc tgggtccaac ctcccacccg tgtctatcgt 60
accttgttgc ttcggcgggc ccgccgtttc gacggccgcc ggggaggcct tgcgcccccg 120
ggcccgcgcc cgccgaagac cccaacatga acgctgttct gaaagtatgc agtctgagtt 180
gattatcgta atcagttaaa actttcaaca acggatctct tggttccggc atcg 234
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cggaaggatc attaccgagt ga 22
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
cgatgccgga accaaga 17
<210>7
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
cggaaggatc attaccgagt gagggccctc tgggtccaac ctcccacccg tgtctatcgt 60
accttgttgc ttcggcggg 79
实施例1：本发明所述的试剂盒的制备
1、检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒的组成：
上游引物：5’-CGGAAGGATCATTACCGAGTGA-3’(SEQ NO.1)，5pmol/μl；
下游引物：5’-CCCGCCGAAGCAACAAG-3’(SEQ NO.2)，5pmol/μl；
荧光探针：5’FAM-CCAACCTCCCACCCGTGTCTATYGT-BHQ-13’(SEQ NO.3)， 10pmol/μl；
定量阳性模板：含有DNA片段SEQ NO.4的pMD19-T重组载体，浓度是105copy/ml。
DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶，购自华银生物基因有限公司；
PCR Mix：购自华银生物基因有限公司；
上述核酸均由广州华银生物技术有限公司合成。
2、所述定量阳性模板的制备方法是：
(1)以从曲霉菌提取出总DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增 出序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为：93℃变性3min后进入循环，93℃ 30s、 56℃ 30s、72℃ 40s，共33个循环，最后一步为70℃ 40s延伸；
(2)使用DNA胶回收试剂盒回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；
(3)将DNA片段SEQ NO.4插入到pMD19-T载体中，具体方法是：
a.DNA片段SEQ NO.4与T载体的连接和转化：
1)在微量离心管中加入：
PMD19-T Vector 1μl
目的DNA SEQ NO.4 5μl
dH2O 3μl；
2)加入9μl的Ligation Mix；
3)16℃反应过夜；
4)把感受态细胞DH5α从-80℃冰箱中取出，置于冰中。60μl移至灭菌处理的试管内；
5)加入目的DNA 10μl；
6)冰中放置30min；
7)42℃ 60S；
8)冰中放置2～3min；
9)加入37℃ LB液体培养基1ml；
10)37℃振荡1h(120r/min)；
11)取200μl培养基涂板于LB氨苄青霉素固体培养基中；
12)37℃过夜培养；
13)取3个菌落放入LB氨苄青霉素液体培养基3ml中摇菌扩增24h。
b.重组质粒提取：
1)取扩增菌液2ml离心10,000g 1min；
2)弃上清，加入250μl Solution I/R NaseA悬浮细胞；
3)加入250μl SolutionII，轻轻混均，上下颠倒4～6次；
4)加入350μl SolutionIII，轻轻混均，上下颠倒直到白色絮状物形成；
5)离心10,000g 10min；
6)小心把清澈的上清加入到干净的HiBindTMDNAMiricolumn中，离心Miricolumn 10,000g 1min；
7)去液，加500μl bufferHB洗管后，离心10,000g 1min；
8)弃液，加入700μl DNA wash buffer，离心10,000g 1min；
9)重复步骤8)；
10)再离心空管10,000g 1min；
11)把空管放入干净的1.5ml离心管中，加入去离子水300μl，离心10,000g 1min。
3、鉴定：将所得重组质粒用引物SEQ NO.5和SEQ NO.6扩增，反应条件同上，所得 产物大小为234bp。
下述实施例所用的试剂盒均为实施例1所述的试剂盒。
实施例2：体外检测实验
1、模板DNA的制备：
a.试剂：核酸提取试剂盒，购自广州华银生物技术有限公司合成。
b.标准菌株培养及制备：
曲霉菌标准菌株：烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉，由南方医院提供；
待检测样品：临床分离的几种曲霉菌；
阴性对照菌株：白色光滑念珠菌、热带念珠菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌。
c.DNA的提取：取含菌悬液0.5ml，13000r/min离心6min，弃上清，加入0.2mlTris (100mmol/L，pH7.4)缓冲液，lyticase酶5U，37℃水浴1h。取50μl，用核酸提取试剂盒提 取DNA，终体积为20μl(详细步骤请参照试剂盒说明书)。提取的DNA模板-20℃保存备用。
2、荧光定量PCR反应：
1)反应体系如表2所示：
表2本实施例试剂盒PCR反应体系
2)方法：每批反应设一个阳性对照，一个空白对照(由dH2O取代)，一个阴性对照(为 正常人血的提取标本)，反应程序为：
37℃ 5min；
94℃ 1min
仪器：MJ opticon 2荧光定量PCR仪，MJ公司(美国)。
3)定量标准曲线制备：
将定量阳性模板10倍倍比稀释成109～101copies/ml浓度梯度，在上述反应条件下每个 浓度平行加入3个反应管同时进行扩增，共做4次，反应结束后计算机自动绘制标准曲线， 如图2所示，起始模板在107～104copies/ml时线性较好，结果在Opticon monitor 2软件上 分析，得到标准曲线：Y＝-0.37X+16.05，R2＝0.997。
4)敏感性、特异度测定：
取标准菌株储备液按比例稀释为105、104、103、102、10、1个孢子/ml，按照上述方法 消化提取模板，用荧光定量PCR分析，以确定最低检测下线。取白色念珠菌、隐球菌、金黄 色葡萄球菌、铜绿假单胞菌标准菌株以及其他几种曲霉菌，挑取菌落制备成细菌悬浊液，消 化、提取DNA后分析检测。
结果如图3所示，标准菌株等比例稀释液real-time PCR结果呈现规律的Ct值变化，说 明仪器参数稳定，最低检测下线达到5～10CFU/ml。其他几种曲霉菌为阳性扩增。对白色念 珠菌、隐球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的检测结果均为阴性，与预期结果完全相同， 无非特异度扩增。
实施例3：临床实验
1、实验方法：
1)临床标本的收集：
2006年4月至2007年2月，在广州南方医院共收集高度疑似曲霉菌感染病例71例，标 本232份。普通生化管抽取病人静脉血2ml，4000r/min离心8min，取300μl、400～600μl 血清分装在无菌1.5mlEP管中，编号登记，-20℃冰箱保存。
2)主要仪器
MJopticon2荧光定量PCR仪 MJ公司(美国)
生物安全柜 haier公司(中国)
高速离心机 TG16-WS(中国)
水浴槽 江苏太仓市实验设备厂
超净工作台 苏州净化设备厂
涡旋振荡器 Thermolyne M63210-26(美国)
全自动酶标分析仪 BIO-RAD公司(美国)
3)纳入排除标准：对血液科、肿瘤科、肝肾移植的免疫力低下高度疑似曲霉菌感染的病 人进行研究。纳入病人必须符合1项宿主因素、1项临床标准或微生物学标准。如下：
宿主因素：(1)外周血中性粒细胞减少：中性粒细胞计数＜0.5×109/L，且持续10d以 上；(2)体温＞38℃或＜36℃，且存在下列任何1种易感因素：①之前60d内出现过长期中 性粒细胞减少(10d以上)；②之前30d内，曾使用过或正在使用强效免疫抑制剂；③侵袭性 真菌感染病史；④患者同时患有艾滋病；⑤存在移植物抗宿主病的症状和体征；⑥长期使用 类固醇激素(3周以上)。
临床标准：持续发热超过96h，合理的广谱抗生素治疗无效。下呼吸道感染：主要标准： CT检出以下任何1种渗出征象：光晕征；新月形空气征；实变区域内出现空腔。次要标准： 下呼吸道感染症状(咳嗽，胸痛，咯血，呼吸困难等)。
微生物学标准：(1)痰液或支气管肺泡灌洗液培养呈真菌；(2)痰液或支气管肺泡灌洗液 经直接镜检或细胞学检查，发现曲霉菌；(3)支气管肺泡灌洗液、脑脊液或2份以上的血液样 品呈曲霉菌抗原阳性；(4)无菌体液中，经直接镜检或细胞学检查，发现曲霉菌；(5)血培养 呈真菌阳性；(6)肺部异常，与下呼吸道感染的相关标本中(血液、痰液和支气管肺泡灌洗液 等)无法培养出任何致病细菌。
排除标准：溶血严重的血标本。
侵袭性真菌感染(IPFI)的诊断由宿主因素、临床特征、微生物学检查和组织病理学四 部分组成。临床诊断IPFI分确诊、临床诊断及拟诊3个级别，判断标准如表3所示。
表3侵袭性真菌感染的诊断标准
4)临床研究步骤：
对符合上述纳入标准的病人进行跟踪研究。争取在使用抗真菌类药物以前抽血，而后每 周1-2次，40天为一个试验研究周期。而后继续跟踪病人情况，直致出院或死亡。收集到 一定数量后，用本发明试剂盒和曲霉菌抗原检测试剂盒(sigma公司)，下面将简称为ELISA 试剂盒，对标本进行检测。
统计学方法：检测结果用SPSS12.0分析，对ELISA方法和PCR方法的敏感度、特异度 做x2检验即McNemar检验。取α＝0.05水准双侧检验。
2、实验结果：
根据中华内科杂志编辑委员会2006年8月在中华内科杂志发表的《侵袭性肺部真菌感染 的诊断标准与治疗原则(草案)》，对71个病例进行判别分类，其中确诊10例，临床诊断30 例，拟诊8例，非曲霉菌感染病例23例。
(1)实施例1所述的试剂盒对71个病例、232份标本的检测阳性率为42.2％(98/232)。 结果见表4：敏感度为87.5％(42/48)，特异度为95.6％(22/23)，准确度为90.1％(64/71)。阳 性预测值为97.6％(41/42)，阴性预测值为75.8％(22/29)。
表4本发明试剂盒的诊断结果
(2)曲霉菌抗原检测试剂盒的检测结果见表5：敏感度为91.6％(44/48)，特异度为 60.8％(14/23)，准确度为81.6％(58/71)。
表5曲霉菌抗原检测试剂盒的诊断结果
(3)两种试剂盒的比较：对48例诊断为曲霉菌感染的病人，用本发明试剂盒和ELISA试 剂盒检测结果的配对计数资料的x2检验即McNemar检验，结果如表6所示，P＝0.549(双侧)， P＞0.05，我们认为两种方法的敏感度差异无显著性意义；Kappa＝-0.119，kappa＜0.4，说明 两者吻合度较弱。
表6两种试剂盒的敏感度比较
对23例诊断为非曲霉菌感染的病人，进行荧光定量PCR和ELISA方法配对计数资料的x2检 验即McNemar检验，结果如表7所示，P＝0.021(双侧)，P＜0.05，我们认为两种方法的特异度 差异有显著性意义，荧光定量PCR的特异度较高。Kappa＝-0.085，kappa＜0.4，说明两者吻合度 较弱。
表7两种试剂盒的特异度比较
上述实验结果表明，本发明试剂盒与曲霉菌抗原检测试剂盒相比，在保证检测敏感度相 当的情况下，大大提高了特异度，可见，本发明试剂盒应用于侵袭性曲霉菌感染的诊断具有 快速且更准确的优点。
SEQUENCE LISTING
<110>南方医科大学
<120>一种检测曲霉菌荧光定量PCR试剂盒
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
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