嵌合多肽及其用途转让专利
申请号 : CN200480009095.8
文献号 : CN100584950C
文献日 : 2010-01-27
发明人 : 克里斯蒂娜·库恩 , 安德拉斯·西蒙克西特斯
申请人 : 国际遗传工程和生物技术中心
摘要 :
权利要求 :
1.一种嵌合多肽，其包含：
a.一种显示对特异性核苷酸序列的亲和力的多肽；
b.一种DNA修饰酶；和
c.一个具有胞内传递活性的区域，
其中所述DNA修饰酶是II类限制性核酸内切酶或它们的亚基或 功能性片段。
2.权利要求1的多肽，其中a.、b.、和c.区域彼此共价连接。
3.权利要求2的多肽，其中胞内传递活性选自肽、脂类和碳水化 合物。
4.权利要求1的多肽，其中多肽a.和DNA修饰酶b.的活性包含 于同一个分子中。
5.权利要求1或4的多肽，其中具有特异性核苷酸结合活性的多 肽是限制性核酸内切酶或它们的亚基或功能性片段。
6.权利要求1到4中任一项的多肽，其中限制性核酸内切酶选自 EcoRV、PvuII、HinfI和它们的亚基和功能性片段。
7.权利要求1到4中任一项的多肽，其中核酸内切酶活性被修 饰，但是核酸结合特异性与天然酶相当。
8.权利要求1到4中任一项的多肽，其中用于胞内传递的区域包 含至少一个选自单纯疱疹病毒的VP22、HIV-1的Tat、HIV-1的 Rev、触角同源域及其片段的肽。
9.权利要求8的多肽，其中HIV-1 Tat蛋白包含肽： YGRKKRRQRRR或其点突变或功能性突变。
10.权利要求5的多肽，其中具有特异性核苷酸结合亲和力和 DNA修饰酶的多肽为选自EcoRV、PvuII和HinfI的II类限制性核酸 内切酶或其亚基或功能性片段的单个多肽，而且胞内传递功能是包含 于HIV-1 tat的氨基酸序列中的肽。
11.权利要求10的多肽，其中限制性核酸内切酶的亚基共价连接 为单链蛋白质。
12.权利要求11的多肽，其由序列SEQ ID NO：2组成。
13.权利要求1到4中任一项的嵌合多肽，其包含非天然氨基 酸。
14.编码权利要求1到12中任一项包含的多肽的分离的多核苷 酸。
15.权利要求14的分离的多核苷酸，其由SEQ ID NO：1组成。
16.一种包含权利要求14或15的多核苷酸序列的载体。
17.用权利要求16的载体转化的细胞。
18.一种药物制剂，其含有权利要求1到13中任一项的多肽、权 利要求14或15的多核苷酸、权利要求16的载体或权利要求17的细 胞。
19.一种药物组合物，包含权利要求1到13中任一项的多肽作为 活性成分并且包含合适的赋形剂、乳化剂或稀释剂。
20.权利要求1-12任一项的多肽、权利要求14或15的多核苷 酸、权利要求16的载体、权利要求17的细胞用于制备预防、治疗或 诊断肿瘤疾病或该疾病倾向性的药物的用途。
21.一种在分离细胞的基因组中的特异性位点处进行修饰的方 法，其包括用权利要求1到13中任一项的嵌合多肽对这些细胞进行 处理。
22.权利要求21的方法，其基于使用权利要求1到13中任一项 的嵌合多肽，而且其中在分离细胞的基因组中的特异性位点处引入的 修饰为DNA双链断裂。
23.一种用于筛选能在细胞系统中调节基因组修复活性或调节细 胞周期控制和限制点活性的组合物的方法，其包括以下步骤：i)把分离的细胞与权利要求1到13中任一项的嵌合多肽一起孵 育，ii)在任选的产自由基物质的存在下，添加组合物或组合物的集 合，iii)细胞应答的表征和/或测定。
24.一种使用权利要求21或22的方法，或使用权利要求1到13 中任一项的嵌合多肽，体外激活DNA修复的方法。
25.一种使用权利要求21或22的方法，或使用权利要求1到13 中任一项的嵌合多肽，体外激活限制点机制的方法。
26.权利要求1到13中任一项的嵌合分子用于引入细胞周期阻断 到分离的细胞中的用途。
27.权利要求1到13中任一项的嵌合分子用于在成神经细胞瘤来 源的分离细胞中诱导细胞凋亡的用途。
28.一种用于诊断分离细胞的DNA修复系统中或细胞周期控制系 统中的遗传缺陷的试剂盒，其包含权利要求1到13中任一项的嵌合 多肽，以及包含用于对照的嵌合多肽的试管，其中该用于对照的多肽 显示特异性DNA结合活性但是核酸酶活性降低。
29.权利要求28的试剂盒，其中权利要求1到13中任一项的嵌 合多肽由序列SEQ ID NO：2组成，而且用于对照的嵌合多肽为 多肽SC34。
30.权利要求29的试剂盒，其用于在分离的细胞中体外诊断决定 肿瘤倾向性的遗传缺陷。
31.权利要求30的试剂盒，其用于诊断肿瘤的放射敏感性。
说明书 :
本发明的技术领域，涉及用于研究控制DNA修复活性的细胞体 系和控制细胞周期的分子和方法。
活的生物的基因组持续暴露于由自发的内源化学或生物化学损害 产生的，或由暴露于外源的基因组损害物质产生的化学损害。
为了确保必要的基因组稳定率，而且提供所有活的物种不可缺少 的进化和适应所必需的基因组通量，DNA修复和DNA重组机制的非 常复杂的体系已经在细胞中进化。通过确保准确度和精确度的控制机 制来调节一方负责基因组保真度、一方负责分子多样性产生的2个系 统之间的平衡。用有助于确保任何活生物中的基因组保真度的所谓 “限制点(checkpoint)”或“监视控制(surveillance control)”来表示控 制的水平。关于该机制和相关的已知基因的综述，以及权威的命名 法，参见，例如，Zhou B.and S，Elledge，Nature，2000，408：433- 439。
近年来，开发了许多分子工具用于分析与DNA修复相关的机 制，以及更重要的，用于这些机制的控制和调节。例如在美国专利 6,307,015中，描述了基于蛋白质Chk1的产物和方法，其被认为能鉴 定对通过Chk1蛋白来控制细胞限制点和DNA修复而言重要的机制和 基因产物。
此外，还开发了在细胞基因组中引入重组的方法：例如，Peitz et al.in Proc Natl.Acad Sci.，2002，99：4489-4494获得了一种嵌合Cre 重组酶的翻译，该嵌合Cre重组酶能够以50％的效率重组预先引入到 基因组中的lox-P位点。而且，在WO 00/46386中，也描述了结合使 用表达大范围核酸酶SceI的载体，在特异性引入的SceI位点处引入 染色体重组。
在用基因毒物诱导之后，分析DNA损伤修复的困难为，所有这 些DNA损伤剂同时引起许多不同类型的DNA损害：因此引入以单特 异性方式作用于DNA的系统是非常令人感兴趣的。这允许高精确度 地确定与细胞周期控制途径，尤其是与DNA修复相关的基因产物。 这些途径的效率是正确的细胞复制所必需的，而且对它们的详细了解 可以开发用于更有选择性的药物和更具针对性的治疗干预的筛选系 统。
广泛范围的身体的和遗传疾病，与DNA修复机制的缺陷有关， 或者更常见地与DNA编码的遗传信息的控制的缺陷相关。这些缺陷 中许多是引起肿瘤病理的主要原因(例如，p53、ARF、14-3-3sigma、 p16、Rb等基因中的突变)，但是此外，这些缺陷还可能引起许多迄 今为止没有表征，而只是简单的分类为“体细胞突变”或“遗传倾向 性”的病理。在一个途径中已经定位的，而且其构成遗传疾病的遗传 基础的突变有：共济失调毛细血管扩张(A-T)，与共济失调相关的紊乱 (共济失调毛细血管扩张样紊乱ATLD，Mre11)，Nijmegen断裂综合征 (NBS)，凡科尼贫血，Rothmund-Thomson综合征，非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)，维尔纳氏综合征，布卢姆氏综合征，DNA连接酶IV(LIG4) 综合征，着色性干皮病，BRCA1。
DNA双链断裂(DSB)是最危险的基因组损害。这些能例如通过电 离辐射诱导，通过可能来自外源的，或者来自例如通过细胞应激造成 的内源条件的活性氧类别(ROS)诱导。ROS也可由用于肿瘤治疗的化 疗剂诱导，例如由DNA嵌入剂或DNA交联剂诱导。DSB的修复比 其他类型的DNA损伤更困难：修复事件和DSB末端的连接可能引起由 于遗传物质的丢失、扩增或修饰而致的遗传不稳定性，是潜在致肿瘤 的。
由于这些事件诱导了修复途径及其细胞控制的事实，对它们的了 解具有重要意义，因为这又能提供关于可能的治疗应用的暗示。
因此本发明的目的是提供一种治疗这种DNA修复机制或遗传信 息控制中的缺陷的有效因子。优选地，这些因子必须传递到细胞中， 尤其是传递到细胞核中，以在那里发挥它们的活性。
因此，本发明提供了一种嵌合多肽，其包含：
a.一种显示对特异性核苷酸序列有亲和力的多肽
b.一种DNA修饰酶
c.一种具有细胞内传递活性的区域。
本发明提供了一种通过用显示特异性相关位点的本发明嵌合分子 向基因组中引入DSB来修饰细胞基因组的系统。本发明的嵌合分子 的一个优点是，线性的活性动力学，单特异性活性，和这些分子能以 不依赖受体的方式穿透全部细胞群体的事实。有利地，这些由嵌合分 子所引起的事件，可由选择性试剂无选择性地诱导，而且可大大简化 它们的应用。
本发明的第一个实施方案涉及由以下物质组成的嵌合分子：一种 区域，优选多肽性质的区域，其含有特异性的DNA结合活性，有利 地来源于II类限制性内切酶；一种优选的多肽性质的区域，其显示催 化DNA修饰活性，有利地包括核酸内切(endonucleolytic)活性，和一 种具有细胞膜和/或核膜-交叉传递活性的区域。上面所述的功能区域 优选地彼此共价连接。
本发明的另一个重要的实施方案涉及编码本发明的嵌合分子的分 离的多核苷酸，如果这些嵌合分子全部或部分是多肽性质的话。
根据本发明的另一个实施方案，从本发明多肽由于引入DNA双 链断裂而干扰细胞周期调节及其限制点控制的关键点的活性推断，本 发明包括不同的方法，其特征均在于在体内的细胞中使用本发明的嵌 合分子。特别地，根据本发明的这些方法包括诊断方法，用于评估编 码与细胞周期控制和DNA修复相关的产物的基因的遗传损害，包括 筛选具有能够调节这些控制活性的生物学活性的组合物的方法。
本发明还包括使用本发明的嵌合分子来筛选新的传递活性或传递 活性的组合的方法。
本发明更进一步地提供所述组合物作为抗增殖、抗肿瘤、抗生 素、抗寄生虫或抗病毒药的治疗用途。
本发明的不同方面是基于发明人提供的实验结果，即可以引入单 特异性DNA双链断裂(DSB)到体内细胞的基因组中，而且这些DSB 是足以活化细胞周期期间的控制点(限制点)的信号。这些活化中的大 多数在从人到酵母的整个进化中是保守的，而且相应的机制也存在于 原核生物和古细菌中。
在真核生物中，通过调节如下物质来介导这些活化：来自ATM (共济失调-毛细血管扩张突变蛋白)、ATR(共济失调-毛细血管扩张相 关的)、DNA-PKcs(DNA依赖性蛋白激酶-催化亚基)的基因产物，和 它们的直接或间接底物例如Chk1(限制点激酶1)，Chk2(限制点激酶 2)，Brca1(乳腺癌易感性-1)，Brca2(乳腺癌易感性-2)，Mre11(减数 分裂重组11)，Rad50(放射50双链断裂修复)，Nbsl(Nijemegen断裂综 合征)，Rad51(放射51双链断裂修复)，FANCD2(凡科尼贫血互补 D2)，组蛋白，解旋酶样BLM(布卢姆氏综合征突变)，WRN(维尔纳 氏综合征突变)，p53，和p53样的直接或间接转录靶标，例如p21和 14-3-3sigma，而该列举不是全部的，还有许多其他的靶标是已知 的，甚至还没有发现。
尤其，发现这些基因产物中的一些的活化应该在DNA修复、细 胞凋亡或细胞周期阻断期间协调维持基因组完整性的体内稳态。
本发明提供了如下嵌合分子，其能跨过细胞膜，在真核细胞的情 况下进入细胞核，或进入细胞中的寄生物，并结合到DNA双链的特 异性位点，用一级动力学理想地修饰DNA。
明显地，这些发现和它们的使用模式开启了用于医学以及科学目 的的许多实际应用的大门，并且申请用于研究DNA修复机制、DNA 修复控制和通常细胞周期控制的独特方法，以及能以选择性方式修饰 任何细胞的基因组的产物。
在一个主要的实施方案中，本发明的嵌合分子含有3个功能性组 分：
-一种区域，其优选由显示与特异性DNA或RNA序列有亲和力 的多肽组成。该区域的代表优选是II类限制性内切酶，能识别DNA 中回文序列的它的亚基或功能性片段；
-一种区域，其优选由显示DNA或RNA修饰催化活性的多肽组 成，仅作为举例而不是排除，该活性包括，甲基化酶，乙酰化酶，具 有或没有CAD抑制剂(ICAD)和激活剂EndoG的胱天蛋白酶(caspase) 激活的DNase(CAD)，RNase，DNA或RNA连接酶，DNA或RNA 聚合酶，核酸内切酶和拓扑异构酶或它们的亚基或功能性片段，但是 优选包括酶，优选限制性内切酶，甚至更优选II类限制性内切酶的核 酸内切活性；
-一种含有传递活性的区域，其能跨过细胞膜和/或核膜，并把异 源分子转运到细胞和细胞器中；这种活性称为“传递体”，而“传递 体”是指一种化学结构，该化学结构优选由多肽或肽，和脂类、脂质 体、有机或无机化合物或纳米颗粒组成，能穿透细胞的生物膜，而对 于真核生物的情况，此外还能穿透细胞和细胞核的膜或任何其他的细 胞器包括线粒体或质体的膜。特别优选能转运到细胞核中的传递体。
上面所述的功能域优选共价连接。本发明的嵌合分子通过化学合 成获得，或如果功能区域是肽性质的，优选通过重组DNA技术合 成。对于该实施方案和对于本发明，编码包含上述3个功能区域的嵌 合蛋白的核苷酸序列用于在优选原核来源的宿主系统中表达重组多 肽。
本发明的嵌合分子还可以用通过化学或重组方法的混合技术来制 备，而至少一个区域使用化学方法与通过重组DNA技术制备的另外 两个产物偶联。
在本发明的嵌合分子的一个优选方案中，具有特异性的DNA结 合活性的区域来自于II类核酸内切酶。优选地选自以下的核酸内切酶： EcoRV、PvuII、HinfI或它们的亚基或功能性片段。在本发明的下文 中，功能性片段是指这样一种多肽：其包含的氨基酸序列部分来源于 具有天然酶的至少一种功能的这些完整蛋白质之一的序列。
在另一个优选实施方案中，DNA修饰活性的区域也是II类限制 性核酸内切酶，也选自含有特异性DNA结合活性的相同核酸内切 酶，尤其是：EcoRV、PvuII、HinfI或它们的功能性亚基或片段。在该 优选实施方案中，在单个同型二聚体蛋白质中，DNA识别和DNA修 饰活性是相连的。
在该最后的情况中，在一个优选的实施方案中，有利地包含限制 性内切酶作为单链分子，而酶的所有亚基共价连接并表达为单链多 肽，如同Simoncsits A.et al.J.Mol.Biol，2001，309：89-97中对于酶 PvuII所述，保持与野生型酶相当的结合和切割特性。
在本发明中，发明人还提供了一种嵌合分子，其中包含限制性内 切酶作为单链蛋白质，而且其中由于限制性内切酶的区域、亚基或催 化结构域的点突变、缺失或其他的结构变异而导致修饰活性改变或丢 失，而关连DNA识别和结合的亲和力保持与天然的酶相当。尤其优 选的突变包括这种突变：其基本上保持(或甚至增强)它们与核酸的结 合能力，但是失去了(显著部分(例如＞50％)或大部分(＞80％))它们的酶 促(切割)活性。
至于本发明的最后的方面，还包括如下嵌合分子，其包含至少如 上面所述的用于转导或细胞内传递的区域或传递体和DNA结合区 域，其特征在于显示对特异性DNA序列的亲和力的氨基酸序列优选 具有核酸内切性质，而且与II类限制性内切酶至少有95％序列同源性 的事实。在这些嵌合分子中，酶活性丧失，它们用作传递到基因组中 的特异性DNA序列的载体，而不使用修饰能力。本发明的该方面的 一个优选实施方案包括如下获得的嵌合酶：使用如Nastri et al，1997，J. Biol.Chem.272：25761-25767中所述通过PvuII酶的位点34的置换突 变(Asp34/Gly34)而获得的催化位点的突变体D34G代替PvuII酶的天 然序列(类似于SCPVUTATA中的)。在这种突变的酶(SC34)中，DNA 识别活性与野生型的酶相当，但是核酸内切活性丧失。这种分子还可 用作对照，与显示修饰活性的嵌合分子平行使用。
传递体或用于传递跨过细胞膜和/或核膜的区域有利地为肽。其较 好地选自：HSV的VP22蛋白质，触角蛋白质的同源域的第三个α-螺 旋，HIV-1的Tat和Rev蛋白或它们的片段或功能性突变体。功能性 突变的例子有Ho et al.2001，Cancer Res.，61：474-577中描述的那些。 优选的实施方案为来自Tat的肽，和包含具有肽 SYGRKKRRQRRRGGS的序列YGRKKRRQRRR(相当于Tat的47- 57区域)的功能域的这些肽。该肽的功能性突变可交换使用HO et al. 描述的突变。在其他的实施方案中，传递体序列可能对任何物种的任 何细胞型和寄生物包括病毒是特异性的。例如，所述序列选自细菌传 递体序列，其导致嵌合分子特异性进入到原核生物中。用于例证而不 是限制性的，细菌传递体可选自Rajarao et al.2002，FEMS Microbiology Letters；215：267-272中描述的和综述的寡肽序列。这些 肽可包含用于传递跨过大肠杆菌的膜的FKDE基序，如序列 CFFKDEL和它们的功能性衍生物。例如，对于金黄色葡萄球菌(S. aureus)，可使用含有PFS的基序例如VLTNENPFSDP，对于枯草芽 孢杆菌(B.subtilis)，可使用含有PFS的基序YKKSNNPFSD。在另一 个例子中，本发明的分子，其包含本领域已知能穿透入酵母中的序列 例如酿酒酵母(S.cerevisiae)α的同系物和/或与核进入序列结合的一 种因子，可用于酵母细胞特异性传递。用于传递到各种酵母菌株中的 序列的例子有Riezman et al.1997；Cell 91，731-738和Rajarao et al.， 2002，FEMS Microbiology Letters；215：267-272中描述的那些，尤其 是包含PFS、YQR、PFR、PMF或DCMD的基序。
本发明该方面的一个优选的实施方案是，使用能跨过细菌的膜， 并能靶向和裂解它们的DNA的II类限制性核酸内切酶。限制性内切 酶是在原核生物王国中最有效的和发展最高级的自然进化的杀伤体 系。酶促核酸酶活性类似于DNA损伤的巨大放大，而且消灭细菌生 长只需要微量的酶。在本发明该方面的一个优选的实施方案中，这些 嵌合分子可用于抗生素活性，而且可有利地以高选择性的方式用于停 止细菌生长。细菌传递体应该不进入其他的细胞型如人细胞，相反 地，传递体如TAT序列不进入细菌细胞。
抗生素、抗肿瘤剂(例如，细胞抑制剂)以及其它活性剂，可通过 本发明的因子，优选通过本发明的多肽与所述其它活性剂共价偶联， 来进行特异性传递。
在一个特别有利的实施方案中，传递体或用于传递跨过细胞膜和/ 或核膜和细胞器膜的区域，可包含附加的修饰组分或“辅助”结构 域，优选多肽或化合物。该结构域可与传递体序列连接，或可位于本 发明的嵌合分子的任何其它部分。这些分子的添加可使用本领域已知 的技术例如重组技术或化学偶联获得。用于例证而不是排除，为了使 本发明的嵌合分子具有细胞型特异性，而添加携带细胞型特异性的结 合位点的附加辅助结构域，以及例如肿瘤特异性扩增受体。这些受体 为例如，Her2、TGFβ RI或CD20受体。这可通过添加EGF的结合 片段、TGFβ或Fv或单链Fv(scFv)免疫球蛋白片段到辅助结构域中而 获得。在一个特别的实施方案中，限制性内切酶以它的天然二聚体形 式使用，而包含功能性CDRL区域的特异性免疫球蛋白轻链片段与第 一个蛋白质的N末端连接，而且包含功能性CDR1-3H区域的可变免 疫球蛋白重链蛋白质与同型二聚体的另一个蛋白质的N末端连接。这 种嵌合蛋白能通过轻链重链二聚作用，和通过限制性内切酶结构域的 二聚作用而二聚化。因此，该嵌合蛋白能靶向与某些细胞型的特异性 选择性结合，并导致强烈增加所选择的细胞对本发明嵌合蛋白的优先 吸收。显然这些辅助结构域可以是多重的。例如，可以添加用于特异 性靶向细胞内非染色体DNA例如线粒体或寄生物DNA(即病毒、无 脊椎动物和细菌感染的细胞)的附加序列。在另一个实施方案中，可以 添加传递体的增强子元件。
在一个特别有利的实施方案中，嵌合分子由II类限制性内切酶组 成，其中PvuII、EcoRV或HinfI具有通过肽接头连接的亚基，该肽接 头优选含有两个或多个甘氨酸，更优选序列GSGG或 GSGGSGSGG。另外，本领域已知的相应的肽接头也可用于共价连接 同型二聚体亚基，使之保持功能性活性。
任选的，嵌合分子包含可用于本领域熟知的纯化的多肽序列，例 如聚组氨酸标签、GST标签或蛋白质A标签、myc-标签、HA-标签、 生物素。
本发明嵌合分子的一个特别优选的实施方案如序列IDN2所示， 其中2个亚基连接为一个单链蛋白质(SCPVU)的限制性内切酶PvuII 为负责DNA结合亲和力和核酸内切活性所致DNA修饰活性的结构域 或区域，而且Tat的肽SYGRKKRRQRRRGGS包含细胞质间传递亚 基。
本发明嵌合蛋白的一个有利的实施方案是，在存在血清时，它们 在细胞培养基中也是稳定的。最终可以在本领域技术上可能的范围 内，通过用D氨基酸或用非天然氨基酸置换L构型的氨基酸来增强该 稳定性。如在点突变的情况中，这些嵌合蛋白的变体显示与优选的限 制性内切酶相同的酶活性，或失去与用作对照的分子相同的核溶解活 性，并因此包含于本发明的范围内。
本发明还包括分离的多核苷酸，其编码本发明的嵌合分子，而且 全部或部分是重组的。这些多核苷酸序列的一个优选实施方案如序列 IDN1，序列IDN1编码PvuII酶的嵌合单链型，该PvuII酶的蛋白质 传递区域相应于序列IDN4，并由核苷酸序列IDN3编码。优选的实施 方案更进一步地包含聚组氨酸标签，其使嵌合蛋白能通过镍NTA亲 和层析法容易地纯化。
本发明还包括编码任何可能的实现体(realization)的所有多核苷酸 序列，其中嵌合分子是多肽，而且能使用重组DNA技术用例如 Sambrook and Maniatis，1989，CSH ed中所述的本领域技术人员熟知的 方法获得。根据这些方法，而且例如对于其他的限制性内切酶、用作 合成接头的肽或用于亲和纯化的肽所描述的，本领域的技术能制备与 本发明的实现体没有本质差异的实现体，因此该实现体包含于本发明 的实现体中。
本发明中还包括本发明的嵌合分子、尤其是核酸酶活性降低但是 具有DNA结合活性的嵌合分子、以及RNA结合的嵌合分子的一个特 别有利的实施方案。在该实施方案中，嵌合分子的DNA或RNA结合 活性能用作细胞中的特异性核酸靶向分子。这使化合物能作为货物 (cargo)传递到细胞的DNA或RNA中。为此，特异性化合物通过重组 技术或化学偶联与这些嵌合分子共价或非共价连接。用于说明而非排 除，这些化合物包括：纳米颗粒，无机或有机化合物及其组合，用于 说明而非排除，例如放射性化合物，化疗剂如阿霉素、博来霉素、长 春新碱、鬼臼亚乙苷、顺铂，及其他拟辐射物质和DSB诱导剂，抗 体及其片断，显色化合物例如荧光分子，天然的和非天然的核酸，含 有或不含酶促活性的肽或多肽。化学偶联可用本领域已知的方法来实 现，例如顺丁烯二酰亚胺激活的化合物与嵌合分子中的还原半胱氨酸 偶联。对于本发明的嵌合分子不包含天然半胱氨酸，如PvuII的情 况，可通过本领域熟知的重组或合成技术进入半胱氨酸。作为另外一 个例子，可使用与游离氨基偶联的溴-氰基。一种特别有吸引力的偶联 可通过蛋白质剪接和与选择的化合物的蛋白质连接来实现。这些分子 还可以与多种标签偶联，该标签与蛋白质融合用于纯化，例如聚组氨 酸标签、GST-标签或蛋白A标签、myc标签、HA-标签、生物素，这 些标签允许偶联例如但不限于抗体、抗体片段或包含谷胱甘肽的化合 物。以这种方式与本发明的蛋白质结合的分子，可以或不能使用化学 试剂和UV交联。用于例示而不是排除，对于这些偶联方法，嵌合分 子中特别有吸引力的位点如N或C末端部分。在单链型的情况中，也 可有利地使用2个亚基之间的接头。
此外，还包括包含如上所述的多核苷酸序列的载体，尤其是用于 在通常更适于表达大量重组蛋白的原核生物中表达的载体。
本发明优选的嵌合分子(其中DNA修饰酶是II类限制性内切酶) 的用途使它可应用于本发明的主要方面，包括在回文位点处引起、诱 导或产生DNA双链断裂的方法，该回文位点是给定酶的关连位点， 因此有利地是序列CAG/CTG(PvuII)、GAT/ATC(EcoRV)或G/ ANTC(HinfI)，这些序列以大约6000bp(EcoRV和PvuII)或400-600 bp(HinfI)的统计频率随机存在于基因组中。
在用本发明的嵌合蛋白处理培养中的细胞之后诱导的作用，通过 FACS分析进行细胞周期分布分析，或通过Southern印迹、TUNEL 分析、溴脱氧尿苷标记(BrdU)和通过使用特异性抗体或绿色荧光蛋白 质衍生物及其显色衍生物的免疫荧光分析直接进行基因组分析，所有 的方法都可常规使用。此外，对用本发明的蛋白质处理的细胞的产克 隆活性和增殖能力的测定，是增殖调节、细胞周期调节和DNA修复 功能的指示。
例如通过TUNEL分析所测定的，本发明蛋白质的优选实施方案 的活性的动力学是线性的，在0.001nM-100μM，更优选0.1nM-1μ M，甚至更优选1-500nM的范围内。这种线性是除了单特异性活性与 它们能穿透所有细胞的特征以外，本发明的嵌合分子，尤其是 SCPVUTAT的一个优点。而且，嵌合分子引起的事件不必用特异性 选择剂进行选择，从而显著和有利地简化了后者的使用。
用本发明的嵌合蛋白，尤其是用本发明优选的实现体处理之后观 察到的作用，再以非限制性模式作如下假定：
-处于细胞周期的特定阶段，例如G0-G1/S-S-G2-G2/M-M或细 胞凋亡或多倍性的细胞的百分比增加。这些变化的性质是细胞型特异 性的，而且这种特异性表示将来在诊断上实现本发明所述方法，并能 检测未知样品与一个或多个对照相比的变化和/或遗传突变或外遗传/ 体细胞改变，该对照例如是含有较好描述的遗传缺陷的细胞系或是正 常细胞。例如，相对于用本发明所述的蛋白质对正常细胞进行处理后 所见的分布，用本发明的所述蛋白质处理在决定G1/S的细胞周期控 制上包含特异性缺陷的细胞，如p21CIP/WAF1基因的突变体，显示G2 期细胞数目增加。在p21CIP/WAF1的情况中，细胞不终止于G1/S期， 但是仍然显示部分功能性的G2/M控制点(限制点)，从而显示在G2/M 期的峰相对增加，如在通过FACS对DNA含量分布进行分析，并与 正常对照细胞进行比较的实验中所见。使用编码与DNA修复限制点 控制相关的基因产物例如ATM和Nb的基因突变体进行的实验可获得 类似的结果。
如前面所示的，该方法的重要性包括细胞相对于对照细胞(正常或 对照细胞)的分布比较或行为比较。
-与细胞周期和修复调节相关的关键蛋白质的稳态水平改变。如 测定在蛋白质含量上蛋白质变异的稳态水平的变化，例如，其可能源 于表达水平的变异，或mRNA稳定性的变化，或蛋白质修饰例如蛋 白水解、磷酸化、遍在蛋白化(ubiquitinylation)或其他的翻译后修饰的 变化。
-作为ATM/ATR/DNA-PKcs控制途径的中心，并在用本发明所 述的蛋白质进行处理之后显示变化的蛋白质的磷酸化水平。在磷酸化 上显示变化的蛋白质在下面的实验部分中较好地描述，但是这里以非 限制性的方式列举：ATM(共济失调-毛细血管扩张突变蛋白)，ATR (共济失调毛细血管扩张相关蛋白质)，DNA-PKcs(DNA依赖性蛋白激 酶催化亚基)，和它们的直接或间接底物例如Chk1(限制点激酶1)、 Chk2(限制点激酶2)、Brca-1(乳腺癌敏感性1)，Brca2(乳腺癌敏感 性2)、Mre11(减数分裂重组蛋白11)，Rad 50(放射50双链断裂修复 蛋白)、Nbs(Nijemegen断裂综合征)、Rad51(放射51双链断裂修复蛋 白)、FANC-A，C，D2，E，F和G(凡科尼贫血互补蛋白)、组蛋白、解 旋酶、BLM(布卢姆氏综合征突变)、WRN(维尔纳氏综合征突变)、 p53，等等。尤其优选的是分子和生物化学标记：Nbs、Mre11、 Rad51、p53、Chk2、Brca1。
一个特别的实施方案是在p53和p53的直接或间接转录靶例如 p21CIP/WAF1、14-3-3sigma上诱导的变异。在用本发明的蛋白质处理之 后，对这些蛋白质水平的变化或蛋白质的活性和/或磷酸化状态的变化 的分析，是本发明的一个重要方面，对于诊断而言是特别有意义的。 这些测定可以如本领域熟知的使用，例如，利用例如针对蛋白质磷酸 化形式的特异性抗体，通过免疫学方法(例如Western印迹分析)进行 测定，如利用抗p53-S15P检测p53的磷酸化形式的增加。如在下面 的实验部分中更详细地证实的，用本发明的蛋白质处理不同的细胞系 导致p53蛋白质和/或磷酸化作用水平增加。
-复合物的细胞分布改变，其中包括用于细胞周期控制或用于在 DNA修复的应激应答中至关重要的控制的重要蛋白质。可从 Rad/Mre11/Nbs复合物定位的核点(nuclear foci)中的细胞应答中观察这 些变异(Zhong Q.et al.1999，Science 285：747-750)，Chk2的Thr68的 磷酸化、ATM的磷酸化、组蛋白2AX-Ser135的磷酸化使用免疫学方 法进行分析。
-可选择地，可以通过比较由本发明蛋白质处理引起的突变细胞 对比正常细胞的变化，来跟踪Cdc2/细胞周期蛋白B1、Cdc25C、 p21CIP/WAF1和14-3-3sigma复合物的细胞质/核分布的变化。这可如实 验实施例12所述，例如通过对于这些组分之一特异的荧光标记和显 微镜分析来进行；
-细胞凋亡可使用本领域熟知的方法进行测定，例如通过FACS分 析，通过细胞色素C释放或胱天蛋白酶活性，或通过利用膜联蛋白V 特异性抗体标记。利用本发明的蛋白质对细胞进行处理之后，例如可 通过FACS分析检测成神经细胞瘤中亚G1期DNA含量的增加，作为 细胞凋亡的增加。
-用本发明的蛋白质处理所诱导的作用也可通过用本领域熟知的显 色反应测定产克隆活性或增殖能力来进行分析。可选择地，蛋白质的 长期作用例如可通过在动物模型系统中的致瘤活性或侵入来进行测 定。
从本发明的蛋白质中筛选能调节基因组损伤的组合物可通过姊妹 染色单体交换(SCE)、倍性分析、遗传扩增、杂合性(heterozygousity) 丧失以及本领域熟知的其它分析来进行分析。
最后，本发明申请一种方法，其用于对从未知样品(例如从活组织 检查)获得的细胞进行测定，测定肿瘤发展的遗传倾向性或基因毒性敏 感性(例如对放射或嵌入剂的敏感性)，该方法基本上包括利用本发明 的蛋白质进行处理，优选平行使用对照细胞，并且使用特异性分析试 剂，包括通过免疫酶法，连续测定癌基因如myc、ras或者肿瘤抑制 基因如ARF、p16、p53、Brca1的表达或活化水平。
细胞周期控制系统(限制点)中的组分的突变导致肿瘤敏感性增 加，而编码与DNA双链断裂修复有关的因子的基因中的遗传缺陷显 示较低的穿透性，尽管这些缺陷与其他危险因子的组合可决定肿瘤的 主要(mayor)发病率，这些危险因子可以是例如活性氧类别(ROS)水平 的增加，来自慢性炎症的因子。
综合地，本发明涉及某些不同的方法，所有这些方法的特征均在 于在体内、先体外后体内(ex vivo)或在体外在细胞中使用本发明的多 肽。具体地，根据本发明的方法包括用于评估与细胞周期控制和 DNA修复有关的遗传损害的诊断方法，以及用于筛选具有能调节这些 控制活性的生物学活性的化合物的方法。本发明的一些完全不同的方 面是基于本发明的嵌合多肽的生物学活性，由于用上面描述的特异性 诱导了DNA双链断裂，该嵌合多肽可激活细胞周期和DNA修复(限 制点)的控制途径。
如在实施例部分中观察到的和更详细地描述的，而且作为诱导单 特异性DNA双链断裂的结果，本发明的多肽显示治疗活性，尤其是 抗增殖和抗肿瘤发生活性。该活性因此代表本发明的另一个目的。因 此，本发明包括药物组合物，其包含如本发明中所述的多肽或编码这 些多肽的多核苷酸作为活性物质。而且，本发明包括本发明的嵌合多 肽和/或编码这些多肽的多核苷酸用于制备预防、治疗或诊断肿瘤疾病 或该疾病倾向性的药物的用途。
本发明更进一步的实施方案包括本发明的多肽或多核苷酸在肿瘤 病理诊断中的诊断用途，或用于诊断如在实施例部分中详细描述的这 些疾病的倾向性的诊断用途。
作为一个优选实施方案，例如为了在诊断中的应用和如上所述使 用，用本发明的蛋白质处理细胞可应用于测试样品，并平行用于不含 有假定的突变的细胞系(对照)。在一个甚至更优选的分析实施方案 中，实验中包括用本发明的嵌合蛋白进行另外的对照处理，其中在 DNA修复途径的选择的步骤中，使用例如含有突变的测试细胞系，通 过比较其允许对各个遗传变化进行精细作图。
在较长的时间周期之后，例如在施用本发明的蛋白质24小时之 后，根据细胞是否能修复本发明的蛋白质诱导的遗传损害(DNA双链 断裂，DSB)，和在这种情况下，细胞群体在细胞周期的不同阶段中的 分布是否恢复正常，能够检测差异作用。在编码ATM的基因中具有 突变，或例如在编码NHEJ(非同源的末端连接)DNA修复途径相关产 物的其他基因中有突变的细胞中，细胞凋亡不能立即观察到，但是具 有低发生率的间接作用。相反地，在成神经细胞瘤细胞中，立即而且 是以直接的方式诱导细胞凋亡。总的说来，在另一个实施方案中，本 发明包括嵌合蛋白和编码这些蛋白质的多核苷酸的用途，用于诱导神 经元来源的细胞的凋亡，优选用于成神经细胞瘤，并因此用于制备治 疗神经元来源的肿瘤的药物。
成神经细胞瘤中细胞凋亡的诱导与lp36缺失以及双微体(DM) myc-N癌基因扩增相关。这种超敏性与17q15易位的存在无关。DM myc-N扩增是游离型myc-N簇，被认为是最具攻击性的形式的myc-N 扩增的NB，而且其具有极低的预后。大部分攻击性恶性NB显示这 种致癌扩增。在另一个特别的实施方案中，还包括包含癌基因的DM 扩增的其他肿瘤，用于例示而不是排除，例如包含DM的前列腺癌或 乳腺癌的治疗。通常，与所述化合物偶联的嵌合分子可用于制备治疗 选择的肿瘤的药物。
对用本发明的蛋白质处理的细胞应答不同于在DNA修复途径中 具有突变的细胞，或者显示负责控制这些细胞周期和/或修复(限制点) 的途径的组分改变的细胞。因此，本发明包括一系列方法，所有方法 的特征基本上在于以下事实，通过应用本发明嵌合分子的优选实施方 案，在测试细胞基因组中诱导DSB，并利用如上所述的试验来分析应 答，优选通过比较测试样品与最可能具有等基因性质的标准细胞的结 果。
在存在自由基(ROS)的诱导物，例如H2O2时，本发明的蛋白质对 细胞周期和DNA修复机制的作用是协同的。在极低浓度的嵌合蛋白 时，优选低于10nM的SCPVUTAT蛋白质和低于10μuM的H2O2 时，也可观察到这种协同作用。因此，本发明包括在基因组中诱导 DSB的方法，其特征在于本发明的蛋白质与产活性氧物质(ROS)，例 如H2O2一起使用的事实。该方法还可用于筛选拮抗或协同化合物。
在体内的细胞中诱导DSB激活了细胞和分子应答，其类似于经 常用于抗肿瘤治疗的电离辐射所诱导的应答；但是与其相比，显示了 降低的副作用。因此，本发明一个更进一步的实施方案包括本发明的 嵌合多肽的用途，用于制备具有抗肿瘤活性的药物，或用于治疗、诊 断或预防遗传疾病，其又限定了个体发生疾病的倾向性，所述疾病是 由细胞的增殖活性失调所引起的，尤其是包括DNA修复控制机制的 必需基因产物肿瘤疾病。
基于这方面，本发明包括一种治疗方法，其基本上基于在体内或 先体外后体内施用如上所定义的本发明的嵌合多肽，其中需要抗增殖 作用，优选抗肿瘤发生作用。
本发明的另一个实施方案包括一种方法，其用于对从生物样品中 获得的分离的细胞，体外诊断DNA修复中的遗传或体细胞缺陷，或 细胞周期调节的缺陷，该方法基本上由以下步骤组成：
a)在培养物中生长分离的细胞，打算测定其DNA修复途径或细 胞周期途径中的效率或损害。
b)这些细胞与本发明的优选分子一起孵育，其中修饰酶是II类 核酸内切酶，更优选PvuII酶的单链型(SCPVU)。有利地，也用显示 特异性DNA结合活性，但是核酸酶活性降低的对照多肽如SC34平行 处理细胞。任选的，更进一步地平行处理合适的细胞系，该细胞系是 突变的和/或DNA修复、DNA修复和/或细胞周期控制中有缺陷的， 而这些细胞系优选是最具等基因性质的；
c)细胞应答的表征和测定；
d)任选的与对照细胞系进行比较。
至于等基因的两个或更多细胞系，是指显示尽可能最相似的遗传 背景的细胞系，例如以下细胞系：如以下的实验实施例中所述和使用 的MRC-5和AT-5；CHO-K1和KU70；MO59K和MO59J。标准对 照细胞系还可以是在细胞周期和DNA修复的控制途径中没有变化的 正常细胞系，而且应该是最可能与测试样品等基因的，或者是具有较 好表征的遗传变化的细胞系。
在本发明方法的一个优选实施方案中，测试细胞和对照细胞在相 同条件下一起生长。因此，它们以直接方式保持并比较培养标记中的 差异，例如：产克隆能力，凋亡或静止状态的细胞的％，例如通过利 用活的细胞颜色测定增殖能力，或通过测定上述生化标记来进行测 定。Torrance C.J.et al.，2001，Nature Biotechnology，19，940-945中描 述了这种分析的一个例子。
在用于表征c)中所述的应答的一个优选实施方案中，使用了本领 域所熟知的产克隆活性的测定，例如通过细胞生长于培养物中，或通 过测定随着在软琼脂中生长的产克隆活性，或通过在DNA染色之后 进行FACS分析。
本发明中所述的一个尤其有用的实施方案尤其可用于诊断和/或预 后，以评估：发生肿瘤疾病的遗传倾向性，肿瘤治疗的敏感性，尤其 是患者对放疗或化疗抗肿瘤治疗的耐受性，或者由于预后原因，肿瘤 组织相较于健康组织的敏感性。
本发明此外还包括进行本发明方法的试剂盒，因此优选诊断试剂 盒或用于研究的试剂盒。
该试剂盒的一些优选实施方案包含：
1)一个试管，其含有嵌合多肽，优选选自EcoRV、PvuII或HinfI 作为单链型与Tat传递肽融合得到的嵌合核酸内切酶，或一种包含编 码嵌合蛋白的多核苷酸的表达载体，以及另一个试管，该试管包含对 照多肽，即显示特异性的DNA结合活性，但是核酸内切酶活性降低 的嵌合蛋白，或者包含编码该嵌合蛋白的多核苷酸的表达载体。在一 个优选的实施方案中，试剂盒包括包含嵌合蛋白SCPVUTAT的试 管，和有利地包含冻干形式或水溶液中的嵌合蛋白SC34的另一个试 管；
2)试剂盒，任选地包含一个试管，其具有抗全部或部分嵌合多肽 的抗体，优选抗SCPVUTAT抗体；
3)试剂盒，任选地包含一个试管或烧瓶，其中包含如上所限定的 对照细胞，例如对DSB超敏的细胞，或者在编码与DNA修复和细胞 周期途径及其控制(限制点)相关的蛋白质的基因中含有较好表征的突 变的细胞。这种细胞可能作为冷冻原种包含或包含在适于运输的烧瓶 中；
4)试剂盒，任选地包含化疗试剂如嵌入剂、拟辐射物质，或其他 种类的化学制剂，包括用于测定和比较定性和定量作用的药物。
作为基于优选嵌合多肽的活性的另一个重要的实施方案，本发明 包括一种方法，该方法通过使用基于细胞的高通量筛选，在细胞体系 中筛选能调节、具有协同、拮抗作用或不改变DNA修复活性和/或基 因组控制和基因组稳定性的组合物，该方法基本上包括如下步骤：
a)使测试细胞与本发明的嵌合蛋白一起孵育，优选存在合适的对 照多肽(在包括一种嵌合分子的特殊情况中，该嵌合分子含有特异性 DNA结合活性，但是显示核酸内切酶活性降低，如嵌合多肽 SC34)，任选的还存在协同的物质，例如H2O2或其他的产自由基物 质和/或其他的调节或拮抗物质；
b)任选地还用其他的对照细胞进行平行孵育，该对照细胞尽可能 地与测试细胞是等基因的，例如包含报道基因的相同细胞。各种报道 基因是本领域技术人员熟知的，其中例如包括如Torrance et al.，2001， Nature Biotechnology，19，940-945中所描述的EGFP蛋白和它们的突 变体；或其它种类的报道基因，其可以进行有效的自动分析读数；
c)添加组合物，其将被测试为可能有活性或没有活性，其中包括 例如单一分子，或化学文库，或化学制剂、肽或其它物质的集合，或 生物样品的集合；
d)细胞应答的读数优选以自动化模式进行，而且优选使用高通量 的筛选(HTS)装置。其例子是基于测定形态学表型变化的系统，这种 变化如作为对对照物质和在细胞中显示生物学活性的阳性测试物质的 应答而诱导的荧光信号。细胞应答可包括任何细胞信号或来自包含的 生化标记的信号，或原野结合可以进行自动检测的系统检测细胞参 数，例如钙通量、自由基通通、细胞色素C的变化。
在本发明的这种方法中，步骤b)和c)的顺序可以颠倒。
该分析可以筛选具有重要生物学活性的组合物，该活性如控制细 胞周期、DNA修复途径、诱导细胞凋亡、诱导衰老、或通过中断一个 途径而激活另一个途径。
第一轮筛选获得的分离的化合物在有利地修饰之后，可对其进行 进一步的筛选循环，以最终获得更适合药用的组合物，或选择另外的 有利的特征，例如生物相容性或产物稳定性。
除了以上所述的更进一步的方面之外，本发明还包括一种方法， 该方法用于诱导细胞循环阻断，或者可选择地优选在神经元起源的细 胞中诱导细胞凋亡，或者可选择地在分离的细胞中诱导DNA修复， 该方法基于使用本发明的嵌合分子，优选为II类限制性核酸内切酶， 甚至更优选作为单链型，或甚至更优选为酶SCPVUTAT，以及编码 这些分子的多核苷酸，其中在存在如产自由基剂的组合物时，这种作 用是协同的。这些方法基本上是基于用本发明的嵌合多肽诱导DNA 双链断裂的原则。
本发明的另一个实施方案包括一种用于筛选新的穿透序列和筛选 辅助序列的方法。在该实施方案中，穿透或辅助序列不是由单一化合 物组成的，而是使用化合物文库分子筛选推断的穿透或辅助结构域。 这些方法是非常适用于能分析许多不同样品的高通量筛选。本发明中 描述的用于诊断的原则也是筛选方法的基础，该筛选方法可发现基本 上可用于任何细胞型或生物的新的穿透序列和辅助序列。自动化的和 机器人装置可执行下面的步骤，具有高通量能力。这可用本领域已知 的移液和读数单元进行。用于举例而不是排除，对特异性辅助或穿透 序列的筛选基本上包括以下步骤：
1.对于特异性辅助序列，穿透序列是恒定的，而且用本领域的方 法构建本发明的嵌合蛋白的文库。举一个例子，不同的轻链和功能性 CDRL片段融合到本发明的嵌合蛋白的N末端，然后与融合到包含功 能性CDR1-3H区域的可变重链免疫球蛋白的本发明相同蛋白质混 合。这可通过重组技术在2个质粒表达系统，优选在大肠杆菌中获 得。通常，免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或受体结合蛋白质的文库， 或从合成或天然来源产生的随机文库，可通过重组技术或如上所述的 其他偶联方法与本发明的蛋白质连接。例如，抗体片段文库可通过结 合于本发明分子中包含的蛋白质A而与本发明的蛋白质连接。
2.对于穿透序列筛选的情况，可通过本领域熟知的技术获得文 库。例如，这些文库可获自天然来源或合成来源，包括任何种类的化 合物。一个尤其有利的实施方案，从来自相同或来自不同物种的随机 DNA片段筛选细菌穿透序列。
3.培养表达文库蛋白质的细菌，并诱导蛋白质产生。可从分泌系 统以及细胞裂解的上清液中分离这些蛋白质，接着使用例如不同的亲 和标签高通量亲和制备嵌合蛋白，这些亲和标签如聚组氨酸标签、 GST-标签、蛋白质A标签、myc标签、HA-标签或生物素。
4.这些蛋白质用于分析来自文库的给定分子的功能或差示功能。 如果序列是功能性的，则嵌合蛋白是功能性的。当它们能跨过细胞膜 并最终跨过核膜，而且与DNA结合，并偶尔引入DSB时，情况是这 样。或者对于辅助筛选，当可在选择的细胞中检测到功能时，情况是 这样。检测可如上所述进行。
5.测试细胞或组织可以是任何来源的，包括原核细胞，其中本发 明的嵌合蛋白的功能可以按照如上所述的模式进行检测。
6.在一个尤其有用的实施方案中，为了容易读数，测试细胞用 EGFP(增强的绿色荧光蛋白)稳定地转染；7.在另一个特别有用的实施 方案中，对照细胞例如用EYFP(增强的黄色荧光蛋白)进行区别地稳 定转染；
8.测试和对照细胞或者分开生长，或者在多孔的装置中或在特异 性膜上混合生长。细胞可能很类似，只具有一个改变(即，用于发现辅 助序列，如来自相同来源的肿瘤和非肿瘤细胞)或非常不同(即，测试 细胞是应当发生传递的细胞，而对照细胞不一定发生传递；这还包括 来自不同种的细胞，如测试细胞是细菌细胞，而对照细胞是人类来源 的)。细胞的选择可以是任何技术上可能的组合。
9.添加蛋白质到细胞的上清液，并进行孵育；
10.将对如上面例子中所述的嵌合分子的功能读数。在一个特别有 利的例子中，对如上制备的绿色和黄色细胞进行检测。利用本领域熟 知的重组和质谱方法，通过反向筛选(back-screening)和分析，进一步 分离能产生显著多于绿色细胞的黄色细胞的蛋白质作为单克隆。在嵌 合分子进入细胞后引入DNA损伤的优选应用中，这种分析甚至更灵 敏。通过基因破坏或基因沉默或引入显性阴性或显性增加的功能突变 体，使测试细胞(即肿瘤细胞)和对照细胞(即相应的非致瘤的)对DSB 引入具有超敏性。这可通过本领域熟知的方法获得，例如通过用 siRNA进行共转染，通过使用表达siRNA的载体，用于基因破坏或诱 变的靶向载体，用于表达突变体或过量产生能抑制DNA修复中的重 要功能并显示对DSB、化学抑制剂或活化剂有超敏性的蛋白质的载 体。这允许在低浓度时更快地和更差示地读数。例如，Ku70、 Ku80、DNAPKcs、ATM、XRCC4和连接酶IV、Bcl2的siRNA抑 制。以及化合物例如咖啡因对ATM的抑制。也可引入P53或其他的 细胞凋亡调节因子。
11.为了再次更进一步地最后确认筛选获得的序列，优选使用自 动化步骤：
-确认含有纯蛋白质的克隆
-滴定浓度；
-以核酸酶致死模式测试选择的序列；
-测试其他的细胞；
-在小鼠中测试毒性。
本发明更进一步地通过以下的实施例和附图进行描述，但是它们 不是对本发明的限制。
图1.从大肠杆菌中纯化SCPVUTAT
SCPVUTAT的表达和纯化
诱导包含用于SCPVUTAT的表达质粒的大肠杆菌细胞，进行蛋 白质的表达并如实验部分中所述的进行纯化。NI和I分别表示从未诱 导或诱导的大肠杆菌中提取的总细胞提取物。H1和H2是在Hi Trap 螯合Ni++琼脂糖柱上进行纯化所获得的峰级分；S1和S2是在SP- Sepharose柱上进行纯化所获得的峰级分；M表示分子量标记(从上到 下以kDa为单位：94，67，43，33，20，14)；SCPVU表示不含有TAT序 列，并以类似方式进行纯化的蛋白质。
图2.在蛋白质转导之后，对来自U2OS细胞的蛋白质提取物的免 疫学分析。
分析的蛋白质为：浓度逐渐增加的SCPVUTAT(1，19，50， 100，200nM；泳道2-6)，SCPVU(200nM，不含有TAT序列，泳道 7)，SC34(200nM，不显示酶活性的SCPVUTAT衍生物，泳道8)， 对照(没有向细胞中添加蛋白质，泳道1)。添加蛋白质到细胞培养上 清液中10分钟之后，用PBS进行充分洗涤后制备提取物，在SDS- PAGE上进行分离，并利用PvuII的单特异性抗体通过免疫印迹进行 分析(下图，进入)。为了进行比较，在分析中也包括在提取物制备之 前取的细胞培养物上清液的等分试样(上图，上清液)。
图3.通过共焦显微术进行的免疫荧光分析
用SCPVUTAT进行蛋白质转导30分钟之后，洗涤细胞，用3％ PFA进行固定，用PvuII单特异性抗体进行标记，并用FITC偶联的 第二抗体进行染色，用于共焦免疫荧光分析(绿色，下图)。另外，在 RNAse A消化之后，用丙锭J-获得DNA共染色(红色，上图)。
图4.为在单细胞水平上检测DSB而进行的TUNEL分析
用SCPVUTAT处理U2OS细胞，在存在dUTP-FITC(TUNEL)时 用TdT进行标记之后，利用共焦免疫荧光显微术分析DSB。用 100nM SCPVUTAT进行指定时间的处理。
图5.SCPVUTAT诱导的核酸酶依赖的细胞周期延迟
通过FACS分析，分析蛋白质转导细胞的不同细胞周期阶段的分 布。检测细胞群体的DNA含量的分布。2n表示二倍体DNA等同物 (非复制的；G1期)，4n表示四倍体DNA等同物(复制的；G2/M期)。 为了进行FACS分析，使用可评估单细胞的DNA含量的DDM模式 来分离细胞。在指定的含量逐渐增加的SCPVUTAT(10nM，50nM， 100nM)存在下，U2OS细胞生长24小时(上排)或48小时(下排)，只添 加蛋白质；未处理的细胞(对照)；用核酸酶处理的SCPVUTAT衍生物 (SC34，100nM)处理的细胞。所示的所有直方图表示相对于只在右上 图所示的细胞数的DNA含量。
图6.SCPVUTAT诱导的激酶活性。
使用组蛋白H1作为底物，和细胞周期蛋白B1特异性免疫沉淀 物，来测定细胞周期蛋白B1激酶活性，该免疫沉淀物来自于从不用 或用SCPVUTAT(100nM)处理或用诺考达唑(0.2μg/ml)处理30小时 的生长的U2OS细胞获得的蛋白质提取物。在存在γ32P-ATP的情况 下，使细胞周期蛋白B1特异性免疫沉淀物与组蛋白H1一起孵育，反 应混合物在SDS-PAGE上进行分离，并通过放射自显影术进行分析。 底下的数字表示通过磷成象仪分析所测定的相对活性。
图7.SCPVUTAT处理之后细胞周期停滞的生化标记。
A)用含有平末端DSB的3′-OH和5′-磷酸诱导p53。U2OS细胞 (泳道1-7)和HCT116(泳道8-14)用SCPVUTAT(100nM，SC)或用阿霉 素(多柔比星，0.02μg/ml，AD)处理指定的时限；未处理的细胞用作 对照(泳道0)。制备提取物，在SDS-PAGE上进行分离，并利用p53 的特异性抗体(上图，p53)或PARP的特异性抗体(下图，PARP)，通 过免疫印迹进行分析。
B)共济失调毛细血管扩张突变(ATM)蛋白对SCPVUTAT的修复 应答。p53的SCPVUTAT依赖的Ser15磷酸化。用SCPVUTAT (100nM，SC)或用羟基脲(ImM，HU)处理ATM阳性细胞系MRC5指定 的时间；未处理的细胞用作对照(0)。制备提取物，在SDS-PAGE上 进行分离，并利用p53 Ser15的特异性抗体(上图，Ser15，p53)或肌动蛋 白的特异性抗体(下图，肌动蛋白)，通过免疫印迹进行分析。
C)共济失调毛细血管扩张突变(ATM)蛋白对SCPVUTAT的修复 应答。
p53的SCPVUTAT依赖的Ser15磷酸化的咖啡因敏感性。在存在 咖啡因(2mm)时，ATM阴性的AT-5细胞在咖啡因(2mM)存在下用 SCPVUTAT(100nM，SC)或用羟基脲(1mM，HU)处理4小时；未处理的 细胞和只用咖啡因处理的细胞用作对照。制备提取物，在SDS-PAGE 上进行分离，并利用p53，p53 Ser15的特异性抗体(上图，Ser15，p53)或 肌动蛋白的特异性抗体(下图，肌动蛋白)，通过免疫印迹进行分析。
图8.与未突变的细胞(MRC-5)相比，用SCPVUTAT诱导ATM 突变的细胞(AT-5)的细胞周期阻断和产克隆(clonogenic)活性。
A)SCPVUTAT处理(25nM，100nM)，或用阿霉素(0.02μg/ml；阿 霉素)，或用SC34(100nM)处理36小时之后，通过对AT-5细胞的 FACS分析来检测细胞周期期间DNA含量的分布，用未处理的细胞作 为对照。直方图表示相对于细胞数量的DNA含量；在右方的表格表 示用MODFITTM程序包计算的不同细胞周期阶段的相应分布的百分 比。
B)用ATM突变的，并通过SCPVUTAT诱导DNA损伤的细胞系 进行集落形成试验。不同稀释度的AT-5或MRC-5(用作ATM阳性对 照)用SCPVUTAT(25nM，灰色条；100nM，黑色条)处理60分钟或 不进行处理(白色条)；洗涤细胞，然后生长7-10天，用姬姆萨染料染 色，并计算集落。通过直方图显示概括的结果，其表示3个独立实验 的平均值以及在所示10％-15％范围内的标准差。未处理的细胞设为 100％，表示AT-5细胞的黑色条接近0％，因此没有标明。
图9.在与NHEJ途径有关的单个蛋白质中具有所选突变的细胞的 产克隆活性的比较。
对用SCPVUTAT处理的与NHEJ修复途径有关的蛋白质突变的 CHO细胞进行产克隆分析。使用的细胞系为AA8(亲本系)，V3 (DNA-PCCs(-/-))，xrss5(KU80(-/-))和XR-1(XRCC4(-/-))，HIS P1.13-11 (KU70(-/-))，以及相应的亲本细胞系CHO-K1。不同稀释度的包含指 定的NHEJ突变的CHO细胞用SCPVUTAT(25nM，灰色条； 100nM，黑色条)处理24小时或不进行处理(白色条)；洗涤细胞，然 后生长7-10天，用姬姆萨染料染色，并计算集落。通过直方图显示概 括的结果，其表示3个独立实验的平均值以及在所示10％-15％范围内 的标准差。未处理的细胞设为100％，表示V3细胞(DNA-PCcs(-/-))的 黑色条低于1％，因此没有标明。
图10.SCPVUTAT处理之后，成神经细胞瘤细胞中细胞凋亡的差 示诱导。
SCPVUTAT处理(10nM，图C；100nM，图B)之后，对成神经细胞 瘤细胞的丙锭J-染色的DNA含量进行FACS分析。样品处理30小 时。用SC34处理的样品(100nM，图D)或未处理(图A)的样品作为对 照。在每个图的底部标明了获得的细胞周期阶段分布的代表性百分比 (G1/S/G2-M)。(A)表示凋亡的细胞。
图11.低浓度的SCPVUTAT和亚致死浓度的H2O2的协同作用。
U2OS细胞与SCPVUTAT(10nM，图B)，或与H2O2(10μM，图 C)，或与两者(SCPVUTAT，10nM；H2O2，10μM；图D)一起孵育， 或者不添加试剂作为对照(图A)。更进一步地，利用FACS分析处理 细胞的DNA含量；在每个直方图的底部标明了不同细胞周期阶段的 百分比。
图12.组蛋白2AXSer-139磷酸化的显微分析，和PI3/ATM激酶 抑制剂渥曼青霉素对这种磷酸化作用的抑制。
U2OS细胞用SCPVUTAT(100nM，中间一列)处理60分钟，而 且用渥曼青霉素(50μM，WM，右边一列)进行处理，或者不添加试剂作 为对照(左边一列)。处理之后，细胞用磷酸化的H2AX-Ser-139(红色) 或组蛋白2B(用作对照，绿色)的特异性抗体进行染色，并通过荧光 显微术在单细胞水平上进行分析。
图13.通过自动分析，测定DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PKCS)催 化亚基突变的细胞的超敏性。
A)利用Versadoc 4(BioRad)成象装置，使用显色的细胞，来评估 突变细胞和相应的正常细胞的增殖能力。对结果进行统计分析，并表 示为直方图。SCPVUTAT处理之后，用人恶性胶质瘤细胞系MO59J (DNA-PKCS(-/-)，与MO59K细胞(DNA-PKcs(+/+))相比，进行集落形成 试验。显示了集落形成试验的一个例子。使用不同浓度的细胞，以3 个数量级(从上到下行，1x104，2x103，4x102，8x10)进行分析。在右边 的B)中，显示了与MO59K相比，细胞系MO59J的集落形成试验结 果的直方图。如图9所示进行分析，但是利用Versadoc 4(BioRad)系 统进行分析。白色条：未处理的样品；灰色条：25nM SCPVUTAT； 黑色条：100nM SCPVUTAT。
图14.用SCPVUTAT处理之后，细胞周期控制蛋白的细胞内分 布。
未处理的，或用SCPVUTAT(100nM)处理30小时，或用紫杉醇 (0.2μg/ml)处理的HCT116(p53(+/+))细胞的显微分析。使用细胞周 期蛋白B 1特异性的或Cdc25C特异性的第一抗体，并用FITC(绿色， 细胞周期蛋自B1)或TRITC(红色，Cdc25C)的第二偶联物进行显色， 来进行免疫荧光分析。
实施例
实施例1
用于表达重组蛋白的载体的构建
为了下面实施例中所述的试验，使用本领域的技术人员熟知的方 法制备下列重组蛋白：SCPVU，同型二聚体核酸内切酶PvuII的单链 变体，Simoncsits et al.2001中已经描述。向该构建体的C末端添加 编码GSYGRKKRRQRRRGGSHHHHHH的序列，该序列包含HIV Tat蛋白部分，接着是一个六组氨酸标签。以这种方法获得的重组融 合蛋白被称为SCPVUTAT。这形成了一种多肽，其包含酶PvuII的氨 基酸1-157，接着是连接酶PvuII的第一个亚基与第二亚基(氨基酸2- 157)的含有序列GSGG的接头，接着为序列 GSYGRKKRRQRRRGGS-HHHHHH(tat-肽+六组氨酸标签)。更进一 步地，核酸内切酶PvuII的变体SC34(Simoncsits et al.，2001)制备为 单链多肽。该衍生物显示PvuII的特异性DNA结合活性，但是由于在 PvuII酶的两个亚基的位点34处的突变(Asp34/Gly34)，其核酸内切酶 活性降低。
实施例2
重组蛋白的表达及纯化。
在大肠杆菌菌株XL1 MRF’(Simoncsits et al.，2001)中表达 SCPVUTAT，该蛋白质首先在HiTrap螯合亲和柱(5ml，Amersham Pharmacia Biotech)上进行纯化，然后在SP-Sepharose(5ml HiTrap SP HP，Amersham Pharmacia Biotech)上进一步纯化。在SP-Sepharose 上，在0.63M与0.67M NaCl之间洗脱蛋白质。产量为1.5升培养基 大约10mg纯化的蛋白质。以同样的方法制备与TAT序列融合的天 然PvuII蛋白质(不作为单链型)。在该情况下，在0.81M与0.85M NaCl之间从SP-Sepharose上洗脱蛋白质。根据在15％SDS-PAGE上 进行的凝胶电泳判断，把所有表达的蛋白质纯化成均一性的，而且用 API 150EX(Perkin Elmer)进行质谱分析，来确定理论质量。经使用 λDNA作为底物测定，获得的核酸内切酶衍生物的酶活性与天然酶的 酶活性相当。
实施例3
抗体的产生和免疫学分析。
抗重组蛋白的抗体通过例如以下所述的标准方法制备和使用： ″Using Antibodies：A Laboratory Manual″，Ed Harlow，and Dayid Lane； CSH press New York，1999，ISBN 0-87969-544-7，″Cells：A Laboratory Manual″，David L Spector，Robert D.Goldman；Leslie A.Leinwand； CSH press New York，1998，ISBN 0-87969-521-8。用适当的抗原免疫 新西兰白兔获得抗体，用固定于BrCN-Sepharose(Amersham Pharmacia Biotech)上的相应的抗原纯化血清。用于免疫印迹法的细胞 提取物如下获得：将细胞在含有蛋白酶抑制剂例如20μM TPCK、20 μM TLCK、磷酸酶抑制剂60mM 4-硝基苯磷酸盐的20mM Tris HCl pH 8.0，5mM EDTA，150mM NaCl中裂解，或直接在SDS加样缓冲液 中裂解。例如在将细胞在3％低聚甲醛中固定或在丙酮和甲醇的1∶1 混合物中固定之后，通过本领域已知的方法进行免疫荧光分析。抗体 染色之后，使用与LSM510共焦单元连接的Zeiss Axiovert 100M显微 镜进行分析。
实施例4
嵌合蛋白向真核细胞系中的蛋白质转导。
以下细胞系用于实施例4-11：
NHEJ修复途径缺陷细胞系：CHO系：Xrss5(KU80(-/-))，Xr-1 (XRCC4(-/-))，V3(DNA-PKcs(-/-))和相应的亲本细胞系AA8(ATCC CRL1859)以及细胞系：HIS P1.13-11(KU70(-/-))和相应的亲本细胞系 CHO-K1(ATCC CCL61)。这些细胞系生长于含有10％胎牛血清(FCS) 的DMEM培养基中。还使用人神经胶质瘤细胞系MO59J(DNA- PKcs(-/-))，和相应的亲本系MO59K(DNA-PKcs的野生型)(Lees-Miller SP，et al.Science 1995，267(5201)：1183-5)，其生长于含有10％FCS 的DMEM/NUT.MIX-F121∶1培养基中。
AT-5系源自于具有缺陷的ATM(共济失调-毛细血管扩张突变蛋 白)的个体，而且使用MRC-5作为相应的亲本细胞系(Raj K，et al. Nature.2001，412(6850)：914-7)，二者都培养于含有10％FCS的 DMEM中。
成神经细胞瘤细胞系IMR32(ATCC CCL-127)、GI-LIN和LAN- 5(Panarello C.et al.Cancer Genet.Cytogenet.，2000，116：124-132)生 长于包含必需氨基酸和10％FCS的RPMI培养基+25mM Hepes中。
人骨肉瘤细胞系U2OS(ATCC HTB96)、初级成纤维细胞IMR90 (早代)生长于含有10％FCS的DMEM培养基中。
结肠癌细胞系HCT-116(错配修复基因人MLH1蛋白缺陷(Raj K， et al.Nature.2001，412(6850)：914-7))生长于含有10％FCS的 McCoy′s培养基中。
在U2OS骨肉瘤细胞和IMR90初级成纤维细胞中测定嵌合蛋白的 转导能力。这些细胞生长于含有10％FCS的DMEM中，并通常在抗 生素的存在下，用处于相同培养基中的本发明蛋白质进行处理。细胞 与逐渐增加量的融合蛋白SCPVUTAT(1，10，50，100，200nM)， 与蛋白质SCPVU(没有TAT的单链PvuII)，与作为对照的SC34(除 了酶PvuII在位点34含有突变以外，如对于SCPVUTAT所述制备)一 起孵育10分钟之后，制备细胞提取物，在SDS-PAGE上进行分离， 并利用PvuII的单特异性抗体，通过免疫印迹分析来进行测定。进一 步在孵育30分钟之后，通过使用PvuII特异性抗体的免疫荧光分析， 和利用碘化丙锭的核共染色，，来分析吸收。数据结合起来证明，蛋 白质SCPVUTAT富集于细胞中，尤其是细胞核中，如图2所示，分 析的细胞的吸收率接近100％。相反，不含tat序列的融合蛋白 (SCPVU)没有进入。这些富集不依赖于蛋白质的变性，因为使用的蛋 白质是可溶的，而且是在天然的非变性条件下制备的。实际上，通过 描述的方法并在天然条件下制备的蛋白质在蛋白质转导方面更有效， 而且优于最近在Dowdy USP6,221,335专利中描述的用于其他蛋白质 的变性方法。
实施例5
用本发明的重组蛋白体内处理之后，通过TUNEL分析证实DSB 诱导。
用SCPVUTAT对细胞进行短暂处理之后，利用末端脱氧核苷酸 转移酶(TdT)dUTP-FITC，在体内标记DSB的TUNEL反应(原位细胞 死亡检测试剂盒，Roche Diagnostic，Mannheim Germany)中分析蛋白 质的功能。在溶于PBS中的4％低聚甲醛，0.1％Triton中固定细胞之 后，进行该分析。TUNEL反应之后，用丙锭J-对细胞进行复染色。 核酸酶活性降低的衍生物如构建体SC34用作阴性对照，可以评估背 景活性。用融合蛋白SCPVUTAT处理短暂的10分钟之后，所有测试 的细胞都显示(90-100％)TUNEL阳性反应。测试的细胞包括人或啮齿 动物细胞系，包括上皮细胞(HEK-293、MCF-7、HCT116，后者是显 示错配修复基因hMLH1缺陷的一种结肠癌细胞系)、初级成纤维细胞 (WI83、IMR90、小鼠胚胎成纤维细胞、MEF)。除了本发明的融合蛋 白有效地传递到细胞的细胞核中之外，这还证实了在迄今分析的所有 细胞型中都显示体内核酸内切活性。实际上，用SCPVUTAT处理几 分钟和细胞培养上清液中低至10nM的蛋白质浓度，在大多数细胞中 产生显著的TUNEL活性，从而证明该嵌合蛋白在体内直接和迅速的 功能。这方面使本发明中所述的系统比从转录单元诱导的核酸内切 酶，或比任何其它蛋白质转染类型如电穿孔法或磷酸钙沉淀法或脂质 衍生物即脂质转染法更有效。该活性是不依赖于细胞周期阶段的，而 且在大多数细胞中与细胞凋亡无关，这是通过丢失的细胞凋亡阳性标 记(即细胞色素C释放或阳性膜联蛋白(Anexin)V染色)所证明的。
图4中，显示了U2OS细胞用SCPVUTAT或SC34处理30分钟 之后进行的TUNEL分析所获得的结果，这类分析证明了SCPVUTAT 构建体的功能。
实施例6
用本发明的蛋白质处理对细胞周期的影响的评估。
最后，为了证实体内产生的DSB还诱导了细胞周期的扰动，在 本发明的蛋白质转导之后，通过荧光激活的细胞分选(FACS)对细胞周 期不同阶段的DNA含量进行分析。在不同时间点用不同浓度的不同 蛋白质进行处理之后，细胞在70％乙醇中固定，用RNAse A进行处 理，并用丙锭J-进行染色。
使用FACSCaliburTM(Becton Dickinson)仪器进行FACS分析。获 得的数据用CellQuestTM软件程序包进行评价。每个样品以DDM模式 分析至少3x104单一事件。用MODFIT LTTM软件程序包进行细胞周 期期间DNA含量分布的统计分析。2N二倍体DNA含量对应于细胞 周期的G1期的细胞，4N表示相对的四倍体DNA含量，对应于细胞 周期的G2和/或M期。中间DNA含量表示S期，对应于细胞周期期 间主动复制DNA的群体，低于二倍体2N的含量表示细胞凋亡的细 胞。
图5中显示，与10nM的蛋白质SCPVUTAT孵育24小时足以诱 导U2OS细胞四倍体群体的增加。用新鲜培养基稀释SCPVUTAT蛋 白质使细胞在24小时重新进入正常循环群体，而连续添加 SCPVUTAT(即每12小时)在所分析的大多数细胞中导致稳定诱导的 细胞周期延迟，而不诱导细胞凋亡。用蛋白质SC34和SCPVU(不含 TAT结构域)进行类似的处理未显示细胞周期分布有任何改变。
其他的方法可能有助于最后鉴别在FACS分析中检测为四倍体 (4N)群体的G2与M期；即，在用100nM SCPVUTAT处理的包含4N DNA的HCT116和U2OS细胞中，细胞核仍然很大，而且不显示任何 有丝分裂结构或没有核被膜破裂，这表示细胞仍然处于G2期，而且 不显示任何向细胞周期的M期的进展，因此显示G2细胞周期阻断。 可使用其他生化分析来证明Cdc2-细胞周期蛋白B复合物的激酶活 性。而且，有丝分裂的启动，即用微管阻断剂诺考达唑或紫杉醇诱导 的启动，可通过Cdc2激酶的核活性，以及通过Cdc25C的核定位来进 行检测。这些分析可以详细分析SCPVUTAT处理之后精确的细胞周 期停滞点，而且这更进一步地可以检测细胞周期的该阶段相对于阳性 对照的扰动。本领域熟知也可用于细胞周期的其他阶段的类似实验。 图7A中所示的分析和图14中所示的免疫荧光分析显示了这类实验的 实例。所示的实验显示，在用融合蛋白SCPVUTAT处理的细胞系 HCT116中，诱导了DSB和随后的对应于S/G2晚期的细胞周期阶段 中的可逆阻断。
实施例7
蛋白质对具有ATM/ATR突变的细胞的影响。
共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ATM)和共济失调毛细血管扩张 相关突变蛋白(ATR)是在响应DNA损伤的限制点活化期间的主要信号 成分。这些途径协调细胞周期进展和DNA修复机制。这些控制确保 了在细胞损伤情况下事件的合适顺序，即，在DNA修复之前，细胞 不进展到细胞周期的后续阶段。这暗示可通过抑制细胞周期激酶和伴 随的负调节物诱导来控制细胞周期机制，所述负调节物包括肿瘤抑制 剂如p53和它们的已知转录靶标(即p21、14-3-3sigma)，随后诱导细 胞周期阻断的蛋白质，这对于负责DNA修复的效应蛋白质的准确功 能或精确保真度是重要的。重要的是要注意，许多这些调节蛋白的突 变显示了强烈的癌症倾向性。
用2mM咖啡因，一种甲基黄嘌呤(metylxantin)衍生物(IC50＜ 1mM)，处理U2OS细胞，诱导了细胞周期G1期的中度延迟，而且这 种抑制作用使细胞对DNA损伤敏感(Sarkaria et al.，1999)。可以表明 咖啡因抑制了磷酸肌醇3激酶(PI3)类别中至少3个成员的催化活性， 这些成员全都包含同源的丝氨酸/苏氨酸激酶区域(PIKK)ATM、ATR 和TOR。在含有100nM SCPVUTAT以及2mM咖啡因的培养基中生 长了30小时的U2OS细胞不显示SCPVUTAT的特有的细胞周期停 止，但是诱导了中度的G1延迟。这证明了咖啡因是SCPVUTAT体内 作用的拮抗物。最后的实验证明，咖啡因在体外既不抑制 SCPVUTAT，也不影响该蛋白质的转导能力。用于这些实验的同样理 论可用于筛选SCPVUTAT的拮抗组合物，该组合物在“体内”具有 活性，而且组成一般的组合物或先导化合物，其具有作为ATM和/或 ATM/ATR途径抑制剂的活性。然后可使用合适的突变细胞系最终详 细分析对ATM/ATR或对与该途径相关的任何其他蛋白质的特异 性。由于SCPVUTAT的直接较好表征的和单特异性的活性，这些分 子可有利地用于该分析。本发明的易用性使其还可大规模地例如高通 量地用于这类分析中，有利地联合应用组合化学和/或组合分子生物 学。
在另一个实施方案中，使用SCPVUTAT监控取决于ATM/ATR 激活的事件。对于与DNA损伤激活的限制点相关的许多底物，ATM 用作丝氨酸/苏氨酸激酶。底物的磷酸化作用能或不能影响限制点应答 的激活。体内已知的ATM或ATM依赖性激酶的底物包括：Nbs1、 SMC1(染色体结构维持)、MDC1(DNA损伤的介质)、H2AX(组蛋白 2Ax)、p53。
分析了ATM/ATR响应SCPVUTAT对p53-Ser15底物的体内诱 导。Ser15上p53的磷酸化作用调节p53的蛋白质稳定性和转录活性， 因此是p53的转录应答所必不可少的。
在ATM阳性或阴性细胞系(分别为MRC-5和AT-5)中，分析了响 应SCPVUTAT处理产生的Ser15上的P53磷酸化作用。用羟基脲(HU) 进行了平行实验用于比较。HU用作核糖核苷酸还原酶的抑制剂，并 在S期引起了DNA复制叉的停顿，而且引起DSB。为此，用处理之 后的提取物进行了免疫印迹实验，其中使用针对p53中磷酸化Ser15 的特异性抗体进行特异性检测。如图7所示，用SCPVUTAT处理之 后，在ATM+细胞系MRC-5(图7B)以及用于ATM-细胞系AT-5中获 得了p53-Ser15的特异性磷酸化作用。用HU处理有同样的发现，其以 相当地但是始终较高的方式诱导了p53-Ser15磷酸化作用。这种体内磷 酸化作用对ATM/ATR抑制剂咖啡因敏感；与2mM咖啡因孵育且用 SCPVUTAT或HU处理的AT-5细胞不显示显著的p53-Ser15磷酸化作 用(图7C)。作为适应本发明目标的ATM底物磷酸化作用的另一个实 施例，分析了组蛋白H2AX Ser139的磷酸化作用。表明在细胞周期的 S和G2期期间，ATM将组蛋白H2AX Ser139磷酸化，作为对辐射所 诱导的DNA损伤的速发型应答。U2OS细胞用SCPVUTAT处理60 分钟，固定并分析组蛋白H2AX Ser139的磷酸化作用。用针对组蛋白 H2AX上的磷酸Ser139的特异性抗血清对细胞进行分析，并在显微镜 下以单细胞为基础进行分析。作为对照，对组蛋白2B进行了分析。 结果证明，用SCPVUTAT处理迅速地诱导了组蛋白H2AX Ser139磷 酸化作用，而且可在位于处理细胞而不是未处理细胞的细胞核中的特 异位置处检测到这种活性(图12)。而且，ATM激酶抑制剂渥曼青霉 素(50uM)是该反应的拮抗剂。使用的渥曼青霉素的浓度是ATM特异 性的，但是不抑制ATR，因此是用于区分这2种激酶的一种简单试 验。分析ATM途径的底物的这类实验有助于确定由SCPVUTAT诱导 的DSB所诱导的生化和分子靶标。通过Western印迹、免疫荧光分析 或酶分析，对本发明处理的细胞或细胞提取物中ATM激酶的底物进 行的生化和/或免疫学分析，可用于阐明与各个途径的正常诱导相比， 特定细胞中体内限制点应答的状态。
而且，这些分析可有利地与本发明一起用于自动筛选。本发明诱 导的DNA损伤的精确和明确性质，使本发明优于以前在类似分析类 型中使用的任何其他化合物。本发明在单一分析或高通量筛选中的应 用很少需要考虑继发的或杂乱的(pleotropic)效果，这是成功进行复合 物筛选的必要先决条件。这类实验中获得的数据可被认为相当于DSB 诱导的效果。而且，不显示核酸酶活性的突变蛋白衍生物如SC34的 可获得性保证了对这些分析的重要控制。
实施例8
SCPVUTAT诱导的作用对于ATM和p53的依赖性。
通常，在DNA损伤的情况中，相应控制机制(限制点)的组分的突 变显示细胞周期停滞特征的改变，而且这些突变中许多确定了癌症的 倾向性。
相反，涉及作为DNA修复的效应分子的蛋白质通常显示正常的 细胞周期停滞特征，而且主要只在结合限制点组分缺陷时诱导肿瘤进 展，并在肿瘤倾向性中常常显示协同作用。效应分子中的突变显示对 DSB的特别超敏性，这是在限制点突变的情况下极少出现的特征。由 于本发明的蛋白质是单特异性的，可能将对DSB的敏感性和对细胞 周期的影响解释为诱导损伤的简单结果。事实上，评估缺陷是否存在 于控制机制(限制点)的组分中或修复机制中是可能的。
在p53阳性或阴性细胞中，分析对SCPVUTAT处理诱导的DSB 的细胞周期应答。p53阳性细胞在G1和G2期显示细胞周期停滞行为 和低S期值，而p53阴性细胞不显示细胞周期停滞特征。而且，还获 得了p53下游元件的这类结果，p21中的突变显示了与p53-细胞类似 的行为，14-3-3sigma中的突变显示了G1停滞，这证实了该蛋白质与 p53部分交迭，而且它只在细胞周期的G2期控制中具有作用。如在 图8A中最后证明的，用SCPVUTAT处理之后，对突变体AT-5进行 分析。ATM突变的细胞系(AT-5)与SCPVUTAT一起孵育36小时导 致细胞周期的瞬时停滞，如通过DNA含量FACS分析所测定的。AT- 5细胞显示了4N G2DNA含量的强烈增加，不显示任何G1延迟，而 且这表明了G1限制点中的复合缺陷(图8)。显著地，与ATM阳性细 胞系不同，24小时之后G2的延迟未解除，而且没有观察到重新进入 细胞周期(参见图5)。单一添加SCPVUTAT到AT-5细胞中60分钟足 以在24小时之后诱导细胞周期停止(图8A)，而且最后导致细胞死 亡，这是由不正确连接的DNA获得的，因此在用SCPVUTAT单一处 理60分钟之后，AT-5细胞的产克隆活性低于0.02％。在这些分析 中，ATM阳性对照细胞系MRC-5对SCPVUTAT处理较不敏感(图 8B)。另外，细胞与阿霉素一起孵育作为对照。这种作用应归于 SCPVUTAT的核酸内切酶活性，因为用突变的核酸酶类型处理后的 集落形成效率与未处理的相当。这些实施例证明了，不同的突变细胞 响应SCPVUTAT处理显示了不同的细胞周期分布，而且这种特征可 用于诊断由于DSB的细胞周期缺陷。
实施例9
用NHEJ(非同源末端连接)修复途径缺陷细胞对蛋白质 SCPVUTAT的诊断能力的评估。
NHEJ代表高等真核生物中双链DNA断裂修复的主要机制，不同 于更多存在通过同源重组的修复的低等真核生物。涉及该体系的蛋白 质还与V(D)J免疫球蛋白重组的最后阶段相关。为了证实本发明的 蛋白质是否还以特异性方式激活NHEJ的酶，分析了在该途径的一种 必要因子中包含多种突变的啮齿动物细胞系。
在图9和图13中概括的集落形成试验中证实了用本发明的蛋白 质SCPVUTAT单一处理足以在分析的所有NHEJ突变细胞系中强烈 降低集落形成活性。
为了证明本发明的DSB修复的特异性，使用在下述与DSB的 NHEJ修复有关的必要因子之一中含有纯合功能丧失性突变的啮齿动 物细胞：包含DNA依赖性蛋白激酶的调节亚基(DNA-PKcs；V3细胞 系，相应的亲本细胞系AA8)、DNA依赖性蛋白激酶Ku70的调节亚 基(HIS P1.13-11；相应的亲本细胞系CHO-K1)、亚基Ku80(xrss5； 相应的亲本细胞系AA8)和DNA连接酶IV调节亚基XRCC4(XR-1细 胞系；相应的亲本细胞系AA8)的PIKK亚基催化结构域。在用 SCPVUTAT在体内进行的核酸酶活性试验中分析了这些细胞系，并 与指定的亲本细胞系进行比较。而且，在以10nM的浓度(灰色条)或 以75nM的浓度(黑色条)单一添加SCPVUTAT 12小时之后，或不进 行蛋白质处理(未处理，白色条)，在产克隆集落生长试验中用 SCPVUTAT检测这些NHEJ突变细胞。添加7到10天后，通过用姬 姆萨蓝染色和不同细胞浓度的定量对细胞生长进行分析。从代表性实 验获得的结果概括于图9中。DNA连接酶IV亚基XRCC4突变的细 胞对SCPVUTAT诱导的平末端DSB敏感，而且更有趣的是，在分析 的DNA-PK中包含突变包括催化亚基突变的所有细胞在集落形成试验 中也显示强烈的降低。与亲本细胞相反，在错配修复途径中包含已知 缺陷的细胞，如在编码hMLH1蛋白的基因中显示纯合突变的 HCT116，在类似分析中不显示对SCPVUTAT处理敏感性有任何增 加。在另一个例子中，DNA-PKcs(MO059J)缺陷的人恶性胶质瘤细胞 系用SCPVUTAT进行处理，并与亲本细胞系MO59K进行比较。类 似地，在用SCPVUTAT单一处理12小时(10nM，灰色条；75nM，黑色 条；未处理的，白色条)之后，对细胞生长进行定量。此外，人DNA- PKcs突变细胞还显示了SCPVUTAT处理引起的敏感性的显著差示增 加(图13A，B)。把这些细胞以不同的浓度置于多孔微量滴定平板中， 用指定的SCPVUTAT进行处理，并用姬姆萨蓝染色。多孔微量滴定 平板(例子参见图13A)使用VersaDOCR(BioRad)成像系统扫描，使用 软件包Quantify OneR对生长进行自动定量，以分析微量滴定平板(微 量滴定平板扫描软件)。获得的数据更进一步地概括成如图13所示的 直方图。与从DNA-PKcs突变的啮齿动物细胞系获得的结果一致，人 细胞系也证明了对SCPVUTAT处理的超敏性，这证实了SCPVUTAT 对DSB引入的高特异性。这些实验证明了使用的体系的可行性，包 括在半自动或全自动分析中的应用。
实施例10
用于筛选候选化合物作为DSB诱导的应激的增效剂或拮抗剂的 试验。
U2OS细胞与单独的或组合的10nM SCPVUTAT和10μM H2O2 一起孵育，而且通过FACS分析细胞周期分布。细胞与2种化合物一 起同时孵育引起差示的、高度增加的细胞周期分布变化，相应的G2 期峰从20％强烈增加到45％(图11A，比较图11D)，与之相比，单独 与10μM H2O2一起孵育时G2期没有增加(图11C)，在单独与10nM SCPVUTAT孵育的情况下，G2期从20％微弱增加到28％(图11A， 比较图11B)。根据与单一组分一起孵育的结果，与两个组分一起同时 孵育明显地显示了对细胞周期干扰的协同作用。
在一个后续的类似实验中，SCPVUTAT蛋白质与蚜栖菌素(一种 DNA嵌入剂和拓扑异构酶II抑制剂)一起孵育，没有观察到协同作 用，而且两个组分只显示累加行为。这个实施例再次证明了该试验的 简单性，其可用于检测对本发明蛋白质所致平末端DSB所诱导的细 胞应激的协同作用或拮抗作用。如上所述，该试验的优点来自于诱导 的单特异性DNA损伤，用核酸酶处理的蛋白质SC34测定系统背景的 可能性，和该试验在实际上任何细胞和细胞周期的任何阶段中的极快 速且容易的应用。这之前对能在体内诱导DSB的任何其他试剂没有 描述过。因此显示用于自由基和咖啡因(图7C)的这类试验可用于对干 扰DNA修复途径及其控制的组合物的每种类型的筛选。
实施例11
用SCPVUTAT处理诱导成神经细胞瘤中的细胞凋亡
许多分析的上皮以及间质来源的细胞在SCPVUTAT处理后不显 示凋亡，而在一些成神经细胞瘤细胞系(IMR32、LAN5、GI-LIN)和来 自临床的多种初级成神经细胞瘤细胞分离物中，诱导了显著量的细胞 凋亡。图10证明了本发明的蛋白质在这些细胞中诱导细胞凋亡的一 个实例。为了该分析，用丙锭J-对细胞进行染色之后，用FACS测定 DNA含量。凋亡细胞(A)检测为显示DNA含量低于2N的细胞。计算 的区域在对应于相应区域的每个直方图的上方标出。10nM的 SCPVUTAT在30小时内迅速地诱导了18％的凋亡(图10B)，而添加 100nM的SCPVUTAT在相同的时间内诱导了超过29％的凋亡细胞(图 10C)，相反地，核酸酶处理的SC34不诱导这种作用。这些实验证明 了成神经细胞瘤细胞中细胞凋亡的高特异性诱导，本发明的蛋白质可 用作治疗这些肿瘤类型的主要候选物。
而且，联合组织特异性传递系统，作为本发明的目标的序列可包 含作为治疗成神经细胞瘤的候选物质的足够特异性。事实上，这又合 理地暗示了本发明可用作筛选组织特异性传递序列的平台技术。
另外，如同在前面的实施例(实施例8)中已经预期的，本发明还 可以用于寻找特异性的先导化合物，或寻找能在靶细胞中，有利地在 来自肿瘤的恶性细胞中诱导特异性、差示细胞凋亡，但是在同一个体 的正常细胞中不诱导或相当低程度地诱导这种凋亡的特异性分子组 合。
实施例12
用SCPVUTAT处理之后，通过免疫显微分析对细胞周期蛋白的 细胞定位。
未处理的，或用SCPVUTAT(100nM)处理30小时，或用紫杉醇 (0.2μg/ml)处理30小时的HCT116(p53(+/+))，用3％PFA固定， 并用细胞周期蛋白B1或Cdc25C的特异性抗体进行处理。利用与 FITC标记的第二抗体偶联的抗细胞周期蛋白B1的特异性第一抗体(绿 色)，或利用与TRITC标记的第二抗体偶联的抗Cdc25C的特异性第 一抗体(红色)，用显微镜进行免疫荧光分析(参见图14)。用 SCPVUTAT处理之后，从具有4N DNA含量的细胞获得的细胞周期 标记Cdc25C和细胞周期蛋白B的胞质分布证明G2期停止，而且处 理的细胞不进展到细胞周期的M期。
该结果不同于用紫杉醇获得的结果，在后者中普遍的核定位表明 停止于细胞周期的M期。
两种标记蛋白质的特异性分布的变化组成了G2/M过渡的标志，- 即，胞质分布，其对应于失活的细胞周期蛋白B激酶，与对应于活性 细胞周期蛋白B激酶的核定位形成对照，细胞周期随后进展到后 期，-而且利用磷酸酶Cdc25C进行脱磷酸化相继激活cdc2/细胞周期 蛋白B激酶(从Cdc25C释放14-3-3蛋白质并随后激活磷酸酶之后)。 事实上，这种途径取代了细胞周期该阶段中的限速步骤。
序列表
<110>国际遗传工程和生物技术中心
<120>嵌合多肽及其用途
<130>3916
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1020
<212>DNA
<213>普通变形菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1020)
<223>1...471：PvuII 472...483：接头 484...951：PvuII
952...999：TAT 1000...1020：6his
<400>1
atg agc cac cca gat cta aat aaa tta tta gag ctt tgg ccg cat ata 48
Met Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile
1 5 10 15
cag gaa tat caa gac tta gca tta aaa cat gga ata aat gat att ttt 96
Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Asn Asp Ile Phe
20 25 30
caa gat aat ggt gga aag ttg ctt caa gtc ctt cta att aca gga tta 144
Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu
35 40 45
aca gta cta cca gga cga gaa ggt aat gat gct gta gat aac gca gga 192
Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Asn Ala Gly
50 55 60
caa gaa tac gag tta aaa tca ata aac ata gac ctc act aaa ggt ttt 240
Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe
65 70 75 80
tca act cac cac cac atg aat cct gta att att gca aaa tat aga caa 288
Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln
85 90 95
gta cct tgg att ttt gcc ata tac cgt ggt atc gca ata gaa gct ata 336
Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile
100 105 110
tac aga tta gag cca aaa gat cta gaa ttt tac tat gat aaa tgg gaa 384
Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu
115 120 125
agg aaa tgg tat tca gat ggg cat aaa gat att aac aac cct aaa ata 432
Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile
130 135 140
cct gta aaa tat gta atg gaa cat ggg aca aag att tac gga tcc gga 480
Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Gly
145 150 155 160
gga agt cac cca gat cta aat aaa tta tta gag ctt tgg ccg cat ata 528
Gly Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile
165 170 175
cag gaa tat caa gac tta gca tta aaa cat gga ata aat gat att ttt 576
Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Asn Asp Ile Phe
180 185 190
caa gat aat ggt gga aag ttg ctt caa gtc ctt cta att aca gga tta 624
Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu
195 200 205
aca gta cta cca gga cga gaa ggt aat gat gct gta gat aac gca gga 672
Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Asn Ala Gly
210 215 220
caa gaa tac gag tta aaa tca ata aac ata gac ctc act aaa ggt ttt 720
Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe
225 230 235 240
tca act cac cac cac atg aat cct gta att att gca aaa tat aga caa 768
Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln
245 250 255
gta cct tgg att ttt gcc ata tac cgt ggt atc gca ata gaa gct ata 816
Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile
260 265 270
tac aga tta gag cca aaa gat cta gaa ttt tac tat gat aaa tgg gaa 864
Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu
275 280 285
agg aaa tgg tat tca gat ggg cat aaa gat att aac aac cct aaa ata 912
Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile
290 295 300
cct gta aaa tat gta atg gaa cat ggg aca aag att tac gga tct tac 960
Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Tyr
305 310 315 320
ggc cgc aag aaa cgt cgc cag cgt cgc cgt ggt gga tca cac cat cat 1008
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser His His His
325 330 335
cat cac cac taa 1020
His His His
<210>2
<211>339
<212>PRT
<213>普通变形菌
<400>2
Met Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile
1 5 10 15
Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Asn Asp Ile Phe
20 25 30
Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu
35 40 45
Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Asn Ala Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe
65 70 75 80
Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln
85 90 95
Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile
100 105 110
Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu
115 120 125
Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile
130 135 140
Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser His Pro Asp Leu Asn Lys Leu Leu Glu Leu Trp Pro His Ile
165 170 175
Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Ala Leu Lys His Gly Ile Asn Asp Ile Phe
180 185 190
Gln Asp Asn Gly Gly Lys Leu Leu Gln Val Leu Leu Ile Thr Gly Leu
195 200 205
Thr Val Leu Pro Gly Arg Glu Gly Asn Asp Ala Val Asp Asn Ala Gly
210 215 220
Gln Glu Tyr Glu Leu Lys Ser Ile Asn Ile Asp Leu Thr Lys Gly Phe
225 230 235 240
Ser Thr His His His Met Asn Pro Val Ile Ile Ala Lys Tyr Arg Gln
245 250 255
Val Pro Trp Ile Phe Ala Ile Tyr Arg Gly Ile Ala Ile Glu Ala Ile
260 265 270
Tyr Arg Leu Glu Pro Lys Asp Leu Glu Phe Tyr Tyr Asp Lys Trp Glu
275 280 285
Arg Lys Trp Tyr Ser Asp Gly His Lys Asp Ile Asn Asn Pro Lys Ile
290 295 300
Pro Val Lys Tyr Val Met Glu His Gly Thr Lys Ile Tyr Gly Ser Tyr
305 310 315 320
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser His His His
325 330 335
His His His
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>人免疫缺陷病毒
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(48)
<223>4..36对应于Tat蛋白的残基47-57的传递体
<400>3
gga tct tac ggc cgc aag aaa cgt cgc cag cgt cgc cgt ggt gga tca 48
Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly ser
1 5 10 15
<210>4
<211>16
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒
<400>4
Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Ser
1 5 10 15