酰肼类化合物及其在用于治疗心血管疾病的药物组合物中的应用

摘要

本发明涉及通式(I)的化合物，其中R1和R2独立地选自氢原子、含1-6个碳原子的直链或支链烷基、具有1-6个碳原子和3-7个氟原子的氟代烷基，A是任选包含一个或多个杂原子的具有一个或若干个环的芳基，B为任选地被取代的苯基或任选地被取代的吡啶基。

权利要求

1、具有下列通式(IV)的化合物：

其中：

-R1和R2为相同或不同，选自氢原子、1-6个碳原子的直链或支 链低级烷基、1-9个碳原子和3-7个氟原子的氟代烷基，-Y1是碳原子以形成苯核，

-R3、R4、R5、R6和R7为相同或不同，选自：氢原子；卤素原子； 式-OH、-OR8或-OCOR9的基团，其中R8和R9代表1-6个碳原子的 直链或支链低级烷基；氨基-NH2或-N(r，r’)，其中r和r’为相同或不同， 代表直链或支链低级烷基、芳基、或其中r和r’连在一起形成大小可变 的杂环；

-X1是选自：

氧原子，并且在这种情况下，随着链-(X4)n-酰基-酰肼在该杂环的α 或β碳上的位置不同，下式(III)的基团

是2-呋喃基或3-呋喃基核，

硫原子，并且在这种情况下，随着链-(X4)n-酰基-酰肼在α或β碳上 的位置不同，下式(III)的基团

是2-噻吩或3-噻吩核，该硫原子可以带一个氧原子以形成亚砜或者带两 个氧原子以形成砜，氮原子，并且在这种情况下，随着酰基-酰肼链在该杂环的α或β碳上 的位置不同，下式(III)的基团

是2-吡咯或3-吡咯核，该氮原子可以带一个氢原子、1-6个碳原子的低 级烷基、1-6个碳原子和3-7个氟原子的氟代烷基、其中R10代表1 -6个碳原子的直链或支链烷基链或者代表芳基或芳烷基的酰基 COR10，-X2和X3为相同或不同，选自：

氢原子、1-6个碳原子的直链或支链低级烷基链、1-6个碳原子和 3-7个氟原子的氟代烷基，卤素原子，

硝基-NO2、氨基-NH2或-N(r，r’)基，其中r和r’为相同或不同，代 表直链或支链低级烷基、芳基、或大小可变的杂环，或者此外，如果该环包含氮原子，则X2和X3包括在芳香性苯或氮 杂苯型的环上，以在当X1是氧原子时形成芳香性苯并呋喃杂环、当X1 为游离的或如上所述的被取代的氮原子时形成苯并吡咯核、当X1为游离 的或如上所述的被取代的硫原子时形成苯并噻吩核、或者此外当存在环 内氮原子时形成吡啶并型核，-n是0或1，

-X4，如果存在，代表-CH2-、-OCH2-、或-CH＝CH-基团。

2、如权利要求1的化合物，其特征在于所述卤素选自氟、氯、溴和 碘。

3、如权利要求1或2的化合物，其特征在于R3是式-OR8的基团 且取代基R4、R5、R6和R7中至少两个代表氢原子。

4、如权利要求1的化合物，其特征在于选自以下组中：*N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲基]-1-苯并噻吩-2-碳酰肼，*(2Z)-3-(2-呋喃基)-N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲基]丙烯 酰肼，*N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲基]-5-甲基噻吩-2-碳酰肼，*2-呋喃甲酸(2-羟基-4，6-二甲氧基-苯亚甲基)-酰肼，*(1H-吲哚-3-基)乙酸(2-羟基-4，6-二甲氧基苯亚甲基)-酰肼，*苯并[b]噻吩-2-甲酸(3，5-二溴-2-羟基-苯亚甲基)-酰肼。

5、N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲基]-1-苯并噻吩-2-碳酰 肼。

6、如前述任一权利要求的化合物与药物学可接受的酸的盐。

7、一种药物组合物，其包含至少一种如权利要求1至5之一的化合 物作为活性物质。

8、如权利要求1-5之一的化合物在制备用于治疗和/或预防与脂质 代谢紊乱有关的疾病的药物组合物中的应用。

9、如权利要求1-5之一的化合物在制备用于治疗和/或预防心血管 疾病的药物组合物中的应用。

10、如权利要求1-5之一的化合物在制备用于治疗和/或预防选自 以下组中的疾病的药物组合物中的应用：动脉粥样硬化症、动脉再狭窄、 肥胖症、II型糖尿病、脑缺血、肝脂肪变性、高胆甾醇血症、高甘油三 酯血症、脂蛋白血紊乱、乳糜微粒血症、脂肪代谢障碍、高血糖症和动 脉粥样硬化症。

说明书

本发明涉及新型酰肼类化合物及其作为特别用于治疗或预防心血管 疾病的药物组合物中的活性物质的应用。

尽管药理学研究非常活跃以及手术领域取得了重大的成就，心血管 病、冠状意外(coronary accidents)和脑缺血(cerebral ischaemias)仍然 是工业化国家导致死亡和致残的主要原因。II型糖尿病以及与此有关的 代谢综合症、高胆固醇血症、定义为脂肪量增加的肥胖症、高甘油三酯 血症(hypertriglyceridaemia)、以及以复合脂蛋白为特征的致动脉粥样硬 化的(atherogenic)血脂异常(dyslipidaemia)构成了这些心血管疾病的 公认的危险因素。

这些病理都存在脂蛋白代谢紊乱。例如，II型糖尿病和代谢综合症 的致动脉粥样硬化的血脂异常是以甘油三酯的水平高(大于150mg/dl)、 高密度脂蛋白胆固醇水平低(HDLc低于40mg/dl)以及低密度脂蛋白胆 固醇(LDLc)水平可变(低于或高于100mg/dl)为特征。通常与肥胖 有关的高甘油三酯血症的特征在于进入脂蛋白结构中的甘油三酯急剧增 加(大于200mg/dl)。

所有这些综合症中最严重的并发症是动脉粥样血栓形成 (atherothrombosis)。动脉粥样血栓形成是一种与这些代谢紊乱有关的复 杂病态，其发展涉及若干个连续的阶段、无声无息并呈渐进式，可能开 始于生命的很早期。

脂质富集的动脉斑块的形成是通常发生于几十年间的漫长过程。它 包括脂蛋白、泡沫化巨噬细胞(foamy macrophage)和钙在动脉壁上的 逐渐积累。这种斑块对西方工业化国家食用富含动物脂肪的食物的大多 数个体产生影响，然而部分由于遗传特征的原因，斑块发展和扩张的速 度在个体间存在高度的可变性。

斑块中众多泡沫化巨噬细胞的存在使之脆弱并且导致发生破裂事 件。对动脉粥样硬化斑块的破裂和血小板血栓的生成而言，它们是导致 疾病的严重并发症——冠脉与大脑梗塞和突然死亡——的急性过程。因 此，该疾病的严重性很大程度上取决于斑块的大小、其稳定性以及由于 该斑块破裂而形成血栓的方式。人们对这种现象缺乏了解并且除免疫反 应以外经常涉及慢性炎症状态。迄今为止，可采用不同的治疗方案治疗 这些疾病。

降血脂药物(Hypolipaemic agent)例如他汀类(statins)或依泽替米 贝(ezetimibe)具有认可的功效。他汀类是3-羟基-甲基戊二酰辅酶A还 原酶的抑制剂，其直接参与胆固醇合成。他汀类有效降低胆固醇水平并 将甘油三酯水平降低至更有限的程度。依泽替米贝抑制胆固醇的肠内吸 收。因此，这些分子被推荐用作LDLc水平高的大多数患者的一级和二 级预防。然而，临床试验已表明，考虑到心血管的危险性，降血脂药物 的医学好处仅仅为30-35％。它们的使用有时伴随着需要停止治疗的不 希望的不良事件。在许多情况下观察到肌肉侵犯(muscle involvement)、 肝脏毒性以及不耐性现象。

苯氧芳酸酯(fibrate)类或苯氧芳酸衍生物(fibric acid derivatives) 也被推荐用于致动脉粥样化的血脂异常。血脂异常影响患有复合脂质特 征——胆固醇水平低、甘油三酯水平高且HDLc水平低——的不同患者。 使用苯氧芳酸降低心血管事故的危险性达约40％。由于不耐性、肝脏毒 性和肌肉侵犯，其应用不幸地在很多患者中伴随有不良作用。

因动脉斑块破裂导致的血栓形成事故通常用抗血栓形成药物如乙酰 水杨酸、噻吩并吡啶或thyanopyridins来治疗。

因此，需要能够治疗心血管疾病特别是治疗动脉斑块的生长和脆弱 性(vulnerability)的新化合物。

本发明正是旨在提供用作特别是用于治疗和预防心血管疾病的药物 组合物中的活性物质的新型酰肼类化合物。

本发明的化合物对应于下列通式(I)：

其中：

-R1和R2为相同或不同，选自氢原子、1-6个碳原子的直链或支 链低级烷基、1-9个碳原子和3-7个氟原子的氟代烷基，

-A代表可能包含一个或若干个杂原子的具有一个或若干个环的芳 基，

-B代表可能被取代的苯基或可能被取代的吡啶基。

根据在双键N＝C处的酰肼官能团以及基团B和R2的含义，本发明 通式(I)的化合物可采用已知为(E)或(Z)的几何形态，要么以平衡 态存在要么优选为以单一形态(E)存在：

-形态(E)，其中基团ACONR1和B在亚胺官能团N＝C的异侧， 称之为反式(tran form)，或者

-形态(Z)，其中基团ACONR1和B在亚胺官能团N＝C的同侧， 称之为顺式(cis form)。

通式(I)的优选的化合物是那些其中B代表下式(II)的基团的化 合物：

其中Y1是碳原子以形成苯核，或者是氮原子以形成吡啶核，并且其中 R3、R4、R5、R6和R7为相同或不同，选自：氢原子；特别是氟、氯和 溴的卤素原子；式-OH、-OR8或-OCOR9的基团，其中R8和R9代表1 -6个碳原子的直链或支链低级烷基；氨基-NH2或-N(r，r’)，其中r和r’ 为相同或不同，代表直链或支链低级烷基、芳基、或其中r和r’连在一 起形成大小可变的优选为处于对位(para position)的杂环。

优选的化合物是其中R3是式-OR8的基团且取代基R4、R5、R6和 R7中至少两个代表氢原子的那些式(I)的化合物。在该化合物中，还 特别优选为其中Y1是碳原子的式(I)的化合物。

其它优选的化合物是对应于式(I’)的那些式(I)的化合物，其中 B是其中Y1是碳原子的式(II)的基团：

本发明的第一种实施方案涉及式(I)的化合物，其中A代表下式 (III)的基团：

其中：

-X1选自：

·氧原子，并且在这种情况下，随着链-(X4)n-酰基-酰肼在该杂环的 α或β碳上的位置不同，式(III)的基团是2-呋喃基或3-呋喃基核，

·硫原子，并且在这种情况下，随着链-(X4)n-酰基-酰肼在α或β碳 上的位置不同，式(III)的基团是2-噻吩或3-噻吩核，该硫原子可以带 一个氧原子以形成亚砜或者带两个氧原子以形成砜，

·氮原子，并且在这种情况下，随着酰基-酰肼链在该杂环的α或β 碳上的位置不同，式(III)的基团是2-吡咯或3-吡咯核，该氮原子可以 带一个氢原子、1-6个碳原子的低级烷基、具有1-6个碳原子和3-7 个氟原子的氟代烷基、其中R10代表1-6个碳原子的直链或支链烷基链 或者代表芳基或芳烷基的酰基COR10，

·氧原子，并且这种情况下式(III)的基团为N-氧化物，

-X2和X3为相同或不同，选自：

·氢原子、1-6个碳原子的直链或支链低级烷基链、具有1-6个 碳原子和3-7个氟原子的氟代烷基，

·卤素原子，优选为氟原子、氯原子、或溴原子，

·硝基-NO2、氨基-NH2或-N(r，r’)基，其中r和r’为相同或不同， 代表直链或支链低级烷基、芳基、或大小可变的杂环，

或者此外，如果该环包含氮原子，则X2和X3包括在芳香性苯或氮 杂苯型的环上，以在当X1是氧原子时形成芳香性苯并呋喃杂环、当X1 为游离的或如上所述的被取代的氮原子时形成苯并吡咯核、当X1为游离 的或如上所述的被取代的硫原子时形成苯并噻吩核、或者此外当存在环 内氮原子时形成吡啶并型核，

-n是0或1，

-X4，如果存在，代表-CH2-、-OCH2-、或-CH＝CH-基团。

其中B是式(II)的基团且A是式(III)的基团的式(I)的化合物 对应于下式(IV)的化合物：

其中Y1、X1、X2、X3、R1和R2具有与上述相同的含义，并且R3 -R7为相同或不同，选自：氢原子；特别是氟、氯和溴的卤素原子；式 -OH、-OR8或-OCOR9的基团，其中R8和R9代表1-6个碳原子的直 链或支链低级烷基；氨基-NH2或-N(r，r’)，其中r和r’为相同或不同，代 表直链或支链低级烷基、芳基、或其中r和r’连在一起形成大小可变的 优选为处于对位的杂环，

-n是0或1，

-X4，如果存在，代表-CH2-、-OCH2-、或-CH＝CH-基团。

优选的化合物是那些其中R3为式-OR8的基团且R4、R5、R6和R7 中至少两个代表氢原子的式(IV)的化合物。在该化合物中，还特别优 选为其中Y1是碳原子的式(IV)的化合物。

在式(IV)的化合物中，本发明特别涉及下列化合物：

*N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲基]-1-苯并噻吩-2-碳酰肼 (carbohydrazide)(指定为：CGP02-01)，

*(2E)-3-(2-呋喃基)-N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲基]丙 烯酰肼(acrylohydrazide)(指定为：CGP02-02)，

*N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲基]-5-甲基噻吩-2-碳酰肼 (指定为：CGP02-03)，

*2-呋喃甲酸(2-羟基-4，6-二甲氧基-苯亚甲基)-酰肼(指定为： CGP02-07)，

*(1H-吲哚-3-基)乙酸(2-羟基-4，6-二甲氧基苯亚甲基)-酰肼(指定为： CGP02-08)，

*苯并[b]噻吩-2-甲酸(3，5-二溴-2-羟基-苯亚甲基)-酰肼(指定为： CGP02-18)。

在这些之中特别优选为N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲 基]-1-苯并噻吩-2-碳酰肼(指定为：CGP02-01)。

本发明的第二种实施方案涉及式(I)的化合物，其中A代表下式 (V)的基团；

其中：

-n是0或1，

-X4，如果存在，代表-CH2-、-OCH2-、或-CH＝CH-基团，

-R11和R12为相同或不同，位于与-X4-的键或者当n为0时位于与 -CO-的键的邻位、间位或对位，选自：1-6个碳原子的直链或支链低级 烷基或芳烷基、或具有1-6个碳原子和3-7个氟原子的氟代烷基、-OH 或其中R13代表1-6个碳原子的直链或支链低级烷基的-OR13、卤素特 别是氟，并且特别是在这种情况下，当R11和R12为氟原子时，它们在 与-X4-或剩下的基团-CO-的键的任一侧成邻位，

其中R12代表氢原子且R11代表-SO2NH2氨磺酰型基团，位于与-X4- 或剩下的基团-CO-的键的对位，

或者此外，R11代表氢原子且R12代表-O苯基，位于与-X4-或剩下 的基团-CO-的键的邻位。

其中B是式(II)的基团且A是式(V)的基团的式(I)的化合物， 对应于下式(VI)：

其中Y1、X4、R1、R2、R11和R12具有与上述相同的含义，并且R3、 R4、R5、R6和R7为相同或不同，选自：氢原子、卤素原子和氢原子、 特别是氟、氯和溴的卤素原子、式-OH、-OR8或-OCOR9的基团，其中 R8和R9代表1-6个碳原子的直链或支链低级烷基、氨基-NH2或-N(r， r’)，其中r和r’为相同或不同，代表直链或支链低级烷基、芳基、或其 中r和r’连在一起形成大小可变的优选为处于对位的杂环。

优选的化合物是那些其中R3为式-OR8的基团且R4、R5、R6和R7 中至少两个代表氢原子的式(VI)的化合物。在该化合物中，还特别优 选为其中Y1是碳原子的式(VI)的化合物。

在式(VI)的化合物中，本发明特别涉及下列化合物：

*(4-二甲基氨基-N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基)亚甲基]苯并酰 肼(指定为：CGP02-04)，

*2-苯乙基苯甲酸(2-羟基-4，6-二甲氧基-苯亚甲基)-酰肼(指定为： CGP02-05)，

*N-[3-2-羟基-4，6-二甲氧基-苯亚甲基-酰肼羰基)-苯基]-丙酰胺(指 定为：CGP02-06)，

*(3-氯-苯氧基)-乙酸(2-羟基-4，6-二甲氧基苯亚甲基)-酰肼(指定为： CGP02-09)，

*2-苯氧基-苯甲酸(2-羟基-4，6-二甲氧基苯亚甲基)-酰肼(指定为： CGP02-11)，

*2，6-二氟苯甲酸(2-羟基-4，6-二甲氧基苯亚甲基)-酰肼(指定为： CGP02-13)，

*4-三氟甲基苯甲酸(2-羟基-4，6-二甲氧基-苯亚甲基)-酰肼(指定为： CGP02-16)，

*3，4-二甲氧基苯甲酸(4-二乙基氨基-2-羟基-苯亚甲基)-酰肼(指定 为：CGP02-17)。

本发明的第三种实施方案涉及式(I)的化合物，其中A代表下式 (VII)的基团：

其中：

-R15选自氢原子、特别是氟、氯或溴的卤素原子、式-OH、-OR16 的基团，其中R16代表1-6个碳原子的直链或支链低级烷基、或者具 有1-6个碳原子和3-7个氟原子的氟代烷基，特别是三氟甲基CF3， R15位于3-氧基-3，4-二氢-苯并噻嗪-基二环芳香部分的四个剩下的自由 位点之一，并且

-R14代表1-6个碳原子的直链或支链烷基，特别是环丙基。

其中B是式(II)的基团且A是式(VII)的基团的式(I)的化合 物对应于下式(VIII)：

其中Y1、R1、R2、R14和R15具有与上述相同的含义，并且R3-R7 为相同或不同，选自：氢原子；特别是氟、氯和溴的卤素原子；式-OH、 -OR8或-OCOR9的基团，其中R8和R9代表1-6个碳原子的直链或支 链低级烷基；氨基-NH2或-N(r，r’)，其中r和r’为相同或不同，代表直链 或支链低级烷基、芳基、或其中r和r’连在一起形成大小可变的优选为 处于对位的杂环。

优选的化合物是那些其中R3为式-OR8的基团且取代基R4、R5、 R6和R7中至少两个代表氢原子的式(VIII)的化合物。在该化合物中， 还特别优选为其中Y1是碳原子的式(VIII)的化合物。

在式(VIII)的化合物中，本发明特别涉及下列化合物：

*2-环丙基喹啉-4-甲酸(2-羟基-4，6-二甲氧基-苯亚甲基)-酰肼(指定 为：CGP02-14)。

优选的化合物是那些式(I)的化合物，其中R14位于喹啉基团的2 位且A代表下式(VII’)：

其中R14和R15具有与上述相同的含义。

其中B是式(II)的基团且A是式(VII’)的基团的式(I)的化合 物对应于下式(VIII’)：

其中Y1、R1、R2、R14和R15具有与上述相同的含义，并且R3、R4、 R5、R6和R7为相同或不同，选自：氢原子；特别是氟、氯和溴的卤素 原子；式-OH、-OR8或-OCOR9的基团，其中R8和R9代表1-6个碳 原子的直链或支链低级烷基；氨基-NH2或-N(r，r’)，其中r和r’为相同或 不同，代表直链或支链低级烷基、芳基、或其中r和r’连在一起形成大 小可变的优选为处于对位的杂环。

优选的化合物是那些其中R3为式-OR8的基团且取代基R4、R5、 R6和R7中至少两个代表氢原子的式(VIII’)的化合物。在该化合物中， 还特别优选为其中Y1是碳原子的式(VIII’)的化合物。

本发明的第四种实施方案涉及式(I)的化合物，其中A代表下式 (IX)的基团：

其中：

-X1和X4具有与上述相同的含义，

-n是0或1，

-RI7选自：

*氢原子、1-6个碳原子的直链或支链低级烷基、1-6个碳原子和 3-7个氟原子的氟代烷基，

*卤素原子，优选为氟原子、氯原子或溴原子，

*OR’基团，其中R’为1-6个碳原子的直链或支链低级烷基、1-6 个碳原子和3-7个氟原子的氟代烷基。

其中B是式(II)的基团且A是式(IX)的基团的式(I)的化合物 对应于下式(X)：

其中Y1、R1、R2、R17、X1、X4和n具有与上述相同的含义，并且R3、 R4、R5、R6和R7为相同或不同，选自：氢原子；特别是氟、氯和溴的 卤素原子；式-OH、-OR8或-OCOR9的基团，其中R8和R9代表1-6 个碳原子的直链或支链低级烷基；氨基-NH2或-N(r，r’)，其中r和r’为相 同或不同，代表直链或支链低级烷基、芳基、或其中r和r’连在一起形 成大小可变的优选为处于对位的杂环。

优选的化合物是那些其中R3为式-OR8的基团且取代基R4、R5、 R6和R7中至少两个代表氢原子的式(X)的化合物。在该化合物中， 还特别优选为其中Y1是碳原子的式(X)的化合物。

在可能时，本发明还涉及上述化合物与生理上耐受的药物类型的酸 形成的盐。

作为生理学可接受的药物盐的实例，可以非限定的方式提及：乙酸 盐、盐酸盐、肉桂酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、氢 氟酸盐、丙二酸盐、甲基磺酸盐、草酸盐、苦味酸盐、马来酸盐、乳酸 盐、烟酸盐、苯乙酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐和酒石酸盐(tartric acid)、 铵盐、二乙胺盐、哌嗪盐、烟酰胺盐、脲盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、 锌盐、锂盐、甲基氨基盐、二甲基氨基盐、三甲基氨基盐和三(羟甲基) 氨基甲烷盐。

本发明涉及用于人或动物的包含至少一种如上所述的化合物或其药 物学可接受的盐作为活性物质的药物组合物。

当然，这些化合物可有效用于治疗动脉粥样硬化症和动脉再狭窄。 它们具有降低因腹部脂肪堆积引起的重量增加、减少总胆固醇和游离胆 固醇水平的增加和甘油三酯在动脉壁的沉积，并减少巨噬细胞在粥样斑 块的聚集的特性。这些化合物尤其具有通过抑制细胞内脂囊泡的聚集来 抑制泡沫化巨噬细胞的生成的特性。因此，扩展来看，这些化合物通过 阻断脂囊泡在细胞如肝细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞的聚集 能够治疗肥胖症、II型糖尿病、脑缺血和肝脂肪变性。

因此，这些化合物在用于治疗和可能地预防所有与脂质代谢有关的 疾病的方法或药物组合物中可有效用作活性物质。在这方面，除与以下 这些功能紊乱有关的病症：动脉粥样硬化症、肥胖症、II型糖尿病或胰 岛素抵抗(insulin resistance)、心力衰竭和脑缺血(中风)以外，还可提 及高胆甾醇血症、高甘油三酯血症、脂蛋白血紊乱(dyslipoproteinaemia)、 乳糜微粒血症(chylomicronaemia)、脂肪代谢障碍和高血糖症。

此外，由于这些化合物具有减轻动脉壁狭窄的特性，它们在用于治 疗和可能地预防再狭窄的方法或药物组合物中可有效用作活性物质。

本发明的药物组合物包含足量的至少一种如上所述的化合物。

基于体内获得并记载在下列实施例部分的结果，本发明的组合物可 以若干剂量的每天每公斤体重0.01-500毫克的一种或若干种本发明化合 物给药以作为治疗的一部分。

本发明的药物组合物的制剂是通常在制药领域使用的类型。

作为实例，这些可包括药物介质(vector)如盐或电解液、抗坏血酸 (scorbic acid)的盐、水或缓冲溶液、胶体溶液、基于纤维素的物质、 聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、蛋白质或可以溶解或可使活性化合物发挥 治疗作用的其它任何物质。

本发明的组合物可以可注射的形式给药或者经口服或非胃肠道途径 给药、以喷雾剂形式通过经鼻途径给药、经直肠或阴道途径给药、通过 植入贮库或分配器(dispenser)或者其它用于制药领域的药物形式给药。

这些组合物的可注射形式可以是含水或油性混悬剂。这些混悬剂可 以根据本领域中应用的任何方法通过利用无毒溶剂或稀释剂例如1，3-丁 二醇来配制。在可接受的溶剂中，可使用水、缓冲溶液、Ringer溶液、 或等渗盐溶液。其它可接受的稀释剂可以由合成的甘油单酯或双酯、长 链醇、或分散剂如羧甲基纤维素或用于配制药物混悬剂的任何其他稀释 剂或乳化剂来配制。

经口服途径给药的本发明的药物组合物可以采用胶囊、片剂或含水 混悬剂的形式或采用乳剂的形式。这些制剂可能包含旨在削弱或改善味 道的化学化合物。

本发明的药物组合物可以通过将产品与无刺激性的、非过敏性的、 在室温下为固体而在直肠温度下为液体以释放活性化合物的赋形剂相混 合从而采用栓剂的形式给药。例如这种制剂可以使用蜂蜡、聚乙二醇或 可可脂。

这些药物组合物还可以包含一种或若干种本发明化合物与一种或若 干种其他治疗性分子的组合。这些分子可以是如降低胆固醇合成的降血 脂药物如“他汀类”、血管紧张素II转化酶抑制剂如氯沙坦、抗钙剂 (anticalcium agent)、抗血栓形成剂、β-受体阻断药、过氧化物酶体增生 物激活受体(PPAR类)类的成员的抑制剂、甘油三酯合成或代谢抑制剂 例如非诺贝特，能够增加胰岛素抵抗的物质如曲格列酮或砒格列酮，以 及一般而言能够改善本发明所述化合物的药理性能的任何其他分子。

本发明还涉及本发明的化合物在制备本发明的药物组合物中的应 用。

本发明还涉及式(I)的化合物和包含至少一种如上所述的化合物作 为活性物质的药物组合物的制备。

式(I)的化合物可以由本领域专业人员已知的方法来制备。就此而 言，本发明记载了如上述路线以及下列操作方法实例中阐释的通用合成 路线，其中起始化合物是通过购买获得或者可以根据本领域专业人员已 知的以及常规有机化学书(M.B.Smith &J.March，Ed.John Wiley & Sons， “Advanced Organic Chemistry”，A.R.Katritzky，Ed.Pergamon，“Handbook of Heterocyclic Chemistry”以及J.A.Joule和K.Mills，Ed.Blackwell Science，“Heterocyclic Chemistry”)中记载的常规方法来合成。

据指，本发明并不限制于特定的合成路线，而是延伸至允许生成式 (I)的化合物的其它方法。因此，举例而言，式(I)的化合物可以在液 相或固体介质上的平行相中进行制备。下面给出的方法是非限制性的并 且其它任何允许生成被取代的亚胺N＝C类的双键的方法都可以用来制 备本发明的化合物。

在上述路线中，R1、R2、A和B具有与上述相同的含义。

根据上述路线，本发明式(I)的化合物一方面是直接由式 A-CO-NR1-NH2代表的称为碳-酰肼的起始原料和式R2-CO-B代表的醛 或酮之间的缩合反应来制备，其中一方面基团A和R1以及另一方面基 团B和R2分别具有式(II)-(VIII)所述的含义。所使用的这些起始 原料可购买并且可以从化学公司如Maybridge(英国)或Pfaltz-Bauer(美 国)以订购方式(working to order)获得，其中公司的选择并不是唯一 的。

该缩合反应优选地在惰性气氛下，在0℃-50℃之间、优选为在室 温下，在叔胺有机碱、优选为Hünig二异丙基乙胺DIET碱的存在下， 在非质子两极溶剂、优选为无水二甲基甲酰胺DMF或在乙醇中回流6- 8小时来实施。该反应进程的监测是通过HPLC分析来实施，这使得能 够控制反应时间，优选为低于24小时。

本发明的其它优势和特征将通过下列的实施例变得显而易见，并且 其中将参照附图进行说明，其中：

-图1表示剂量递增的化合物CGP02-01对以荧光剂Cyanine 3标记 的脂蛋白存在下培养的巨噬细胞中脂囊泡的聚集的影响。剂量响应曲线 表明CI50为5×10-7M。

-图2显示在以化合物CGP02-01处理后的ApoE阴性小鼠中通过减 少腹部脂肪量来减少体重的增加。将该小鼠以每天20μg剂量的化合物 CGP02-01处理41天。对照小鼠和处理小鼠均以无任何胆固醇过量的正 常膳食方案饲养。

-图3表示化合物CGP02-01对ApoE阴性小鼠中血浆游离胆固醇 水平增加的影响。小鼠是以与图2中所述相同的方法处理。

-图4显示以化合物CGP02-01处理或未处理的ApoE阴性小鼠中的 甘油三酯水平的变化。

-图6显示以化合物CGP02-01处理或未处理的ApoE阴性小鼠中的 粥样斑块的改变。应注意在未处理小鼠的损伤处除了许多泡沫化巨噬细 胞以外还存在炎症情况，而在经处理的小鼠的主动脉中除了没有炎症反 应以外这些巨噬细胞也显著减少。

-图7显示通过化合物CGP 02-02和CGP 02-03抑制泡沫化细胞的 生成。将分化的THP1细胞在以Cyanine 3标记的氧化脂蛋白(3μg/ml oxLDL)的存在下在37℃培养25小时。将该细胞以不同浓度的化合物 CGP 02-02和CGP 02-03处理。条件为图1中所述的那些。

-图8表示在处理3周后，经口服途径给药(50mg/kg)的化合物 CGP 02-01对接受富含果糖(10％)的膳食方案的大鼠模型(n＝12)的总 胆固醇的血浆浓度(g/L)的影响。在该动物模型中注射相同剂量的二甲 双胍作为标准参比物。

-图9阐释接受富含胆固醇的膳食方案并以化合物CGP 02-01处理3 个月的ApoE-/-小鼠中血浆甘油三酯水平(g/L)的变化。

-图10显示在处理3周后，经口服途径给药(50mg/kg)的化合物 CGP 02-01对接受富含果糖的膳食方案的大鼠模型(n＝12)的甘油三酯 的血浆水平(g/L)的影响。随后通过加入化合物CGP 02-01将该方案维 持3周。单独分析每只大鼠。在该动物模型中以相同剂量的二甲双胍给 药以用作标准参比物。

-图11表示经IP途径注射的化合物CGP 02-01对接受富含胆固醇的 膳食方案的ApoE-/-小鼠的胰岛素血浆水平(ng/mL)的影响。该小鼠被 处理3个月。

-图12显示在处理3周后，经口服途径给药(50mg/kg)的化合物 CGP 02-01对接受富含果糖(10％)的膳食方案的大鼠模型(n＝12)胰岛 素的血浆水平(ng/mL)的影响。每日以含有10％果糖的膳食饲养大鼠3 周。随后通过加入化合物CGP 02-01将该方案维持3周。单独分析每只 大鼠。在该动物模型中以相同剂量的二甲双胍给药以用作标准参比物。

-图13显示经IP途径以不同剂量注射的化合物CGP 02-01对接受 富含胆固醇的膳食方案的ApoE-/-小鼠的腹部肥胖的影响。该小鼠被处 理3个月。

-图14显示经IP途径以不同剂量注射的化合物CGP 02-01对接受 富含胆固醇的膳食方案的ApoE-/-小鼠的主动脉壁的甘油三酯的沉积的 影响。该小鼠被处理3个月。

-图15显示当ApoE-/-小鼠接受正常膳食方案、或富含胆固醇的膳 食方案时，它们发展成由冠状微血管的微血栓所表现的冠状缺血(图A)。 当化合物CGP 02-01被注射入这些小鼠中时，这些心脏损伤显著降低(图 B)。

-图16阐释化合物CGP 02-01对接受正常膳食方案(图A)和富含 胆固醇的方案(图B)的ApoE-/-小鼠的冠状损伤的剂量作用。

-图17阐释化合物CGP 02-01对接受富含果糖(10％)的膳食方案 的大鼠的血糖(glycaemia)增加的影响。将该方案维持21天。果糖膳食 期之后通过口服途径给药该化合物。该图阐释了该化合物的稳定化作用。

-图18阐释了化合物CGP 02-01对接受富含果糖(10％)的膳食方 案的大鼠的葡萄糖耐受性的有利作用。该化合物是经口服途径给药，并 且在第14天之后，额外给药单剂量2g/kg的葡萄糖。在该血糖休克 (glycaemic shock)之后的30、60和120分钟测定血糖。

实施例1：CGP02-01的合成

将市售的溶于28ml无水DMF中的510.08mg酸[苯并(b)噻吩]-2- 甲酸酰肼装入配有磁力搅拌的干燥三颈瓶(tricol flask)中。加入256μl DIEA(二乙基异丙基胺)后，将该溶液于环境温度下搅拌5分钟。向该 浅黄色溶液中加入538.27mg 4，6-二甲氧基水杨基(dimethosysalicyl)- 醛并将中间体于环境温度下搅拌24小时。反应过程用HPLC分析进行监 测直到起始原料被完全消耗。蒸干溶剂后将得到的固体残余物在CH3CN 中重结晶并用乙醚洗涤。得到纯品N’-[(1E)-(2-羟基-4，6-二甲氧基苯基) 亚甲基]-1-苯并噻吩-2-碳酰肼，为黄色固体(743.6mg，收率＝71％)。

理化性质：

分子量：356.40g/mol

熔点：205.4℃

LC-MS纯度：100％(M+1＝357.33)

HPLC纯度：95.8％(保留时间：20min，UV检测：200-400nm)

NMR 1H(DMSO-d6；400MHz)：δ(ppm)3.799(s，3H，OCH3)，3.862(s， 3H，OCH3)，6.16(s，1H，Ar)，6.17(s，1H，Ar)7.495(m，2H，Ar)，8.02(dd，1H， J＝7.2Hz和1.3Hz，8.07(dd，1H，Ar，J＝7.2Hz和1.4Hz)，8.231(s，1H， CH＝C)，8.861(s，1H，CH＝N)，12.26(s，1H，CH＝N)，12.26(s，1H，OH)， 12.348(s，1H，N-NH-CO)。

NMR C13(DMSO-d6，400MHz)：δ(ppm)55.438(OCH3)，55.948 (OCH3)，90.524(CH，Ar)，93.843(CH，Ar)，122.846(CH，Ar)，125.097(CH， Ar)，124.439(2CH，Ar)，125.684(CH-C)，126.577(CH＝N)，145.980 (CO-NH＝N)。

IR-FT(KBr 0.05％)：3445.66(Ar-OH)，1630.21(-CO-NH＝N)，1600.27 (-NH-N＝C-)cm-1。

元素分析：C18H16N2O4S+0.5H2O

  ％C   ％H   ％N   ％S   理论值   59.17   4.69   7.67   8.77   实测值   59.40   4.66   7.83   8.79

实施例2：细胞培养

为确定分子CGP02-01所属类型的分子对细胞内囊泡中的脂质的 结合和聚集的影响，可使用若干株永久细胞(permanent cells)。这些细 胞可以并入脂蛋白、改良例如氧化或乙酰化的脂蛋白、甘油三酯或乳 糜微滴。这些细胞能够将自身转化为泡沫化细胞并因此可以呈现致动 脉粥样硬化表型。举例而言，可使用THP1、U937、KG1细胞或者能 够被激活并分化为巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞或脂肪 细胞的其它任何细胞，并随后在含有脂蛋白的介质的存在下培养。

也可以使用为表达结合脂蛋白或脂肪酸的特定膜受体而被基因改 造的其它类型的细胞。这些膜受体可以组成清除剂分子家族的一部分， 包含蛋白如SRAI、SRAII、SRBI、CD36或者脂肪酸受体族(FABP) 的成员。

举例而言，可以更明确地提及在10-7M浓度的佛波醇12-肉豆蔻 酸-13-醋酸酯(PMA)作用下分化的THP1细胞类的细胞，它们被用于 测定在存在或不存在化合物CGP02-01时泡沫化巨噬细胞形成过程中 所观察到的脂囊泡的生成和累积。

将细胞在96孔板中以每ml含1、2或5×105个细胞的密度，在 RPMI-1640培养基或在含有1％、2％、5％或10％的胎牛血清(FCS)、 100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、200mM的L-谷氨酰胺的MEM 培养基中，在37℃的CO2培养箱中培养。所述培养基可以每两天进行 更换。

在本实施例中，脂囊泡在细胞内的累积是使用含有Oil Red O型的 用于使囊泡可视化的荧光标记物的溶液、在PBS培养基中用低聚甲醛 固定(fixation)之后，利用THP1细胞进行测定。富含囊泡的细胞的 图像是利用配有CCD照相机以及分析所必需的软件的显微镜来分析。

THP-1细胞(5×105细胞/ml)(ECACC)是在含有10％的胎牛血清 (FCS)、200mM的L-谷氨酰胺、100单位/ml的青霉素、以及100μg/ml 的链霉素(Invitrogen-Life Technologies)的RPMI-1640培养基中，在 37℃的5％CO2培养箱中维持和培养。培养基每2-3天进行更换。

为了诱导THP-1的分化，将1.25×105个细胞/孔置于96孔培养板 的孔中，在其包含10-7的佛波醇12-肉豆蔻酸-13-醋酸酯(Sigma)培养 的基中，在37℃，5％CO2中24小时。随后将分化的THP-1用LDLox 加上Cyanine 3(1.5μg/ml)在分子CGP02-01(浓度介于10-5M和 3.16×10-10M之间)存在或不存在下，在37℃，5％CO2中温育24小时。 用4％低聚甲醛对细胞固定之后，将细胞核用Hoechst 33342(10μg/ml) 在环境温度下标记20分钟。经两次洗涤后，用配有CCD照相机的荧 光显微镜获取与Cyanine 3和Hoechst 33342有关的16幅图像/孔的信 号。用MetaMorph软件(Universal Imaging)对每个图像进行分析和定 量。

下列表1报道了通过表达清除剂CD 36的细胞所观测的对以 Cyanine 3标记的脂蛋白的结合和脂蛋白脂囊泡形式的累积的抑制百分 率。该细胞在组成这类分子并由分子CGP02-01所代表的各分子存在 下，以2.5μM的各分子相同的最终浓度来温育。

表1

  分子  以(％)表示的对LDLox累积的抑制   CGP02-01  76   CGP02-02  64   CGP02-03  82   CGP02-04  61   CGP02-05  77   CGP02-06  71   CGP02-07  63   CGP02-08  58   CGP02-09  53   CGP02-10  52   CGP02-11  44   CGP02-12  43   CGP02-13  68   CGP02-14  81   CGP02-15  40   CGP02-16  77   CGP02-17  88   CGP02-18  78

附件1中的表格除了与上述表1相关的代号以及在浓度25mM时 对THP1细胞的24小时抑制百分率以外还给出了本发明化合物的结构。

这种类型优选的化合物之一是化合物CGP 02-01。当分化的类型的 THP1巨噬细胞在1μM浓度的这种化合物存在下培养时，观察到对脂 囊泡累积的重大抑制(图1)。这种抑制作用取决于产品CGP 02-01的 浓度(图1)。

尽管化合物CGP 02-01已被选作参考产物，同一类型的其它化合 物显示出相同的活性并能够阻断细胞内脂质的累积。图7阐释了构成 相同类型的分子的一部分的化合物CGP 02-02和CGP 02-03的抑制活 性。

实施例3：动脉粥样硬化小鼠的治疗。

可以使用不同种类的动物来研究脂质代谢的改变、动脉损伤的生成 以及粥样斑块的发展。这些动物可购买获得。有可能使用小鼠、大鼠、 高脂兔(HWWL)或大型动物如猪或猴。也可以使用基因改造的动物， 如ApoE-/-、LDL-R-/-和ApoAI-/-小鼠。

使用了两种动物模型。

第一，使用了缺失编码Apo脂蛋白E的基因的(ApoE-/-)小鼠。 这些小鼠代表研究早期动脉粥样硬化和富含泡沫化巨噬细胞的斑块的发 展的优选模型。使缺失ApoE基因的雄性C57BL/6J小鼠纯合子接受正常 膳食方案直至八周龄。随后使这些小鼠(n＝8每组)自由进食并且持续 12周接受不富含胆固醇或脂肪的膳食方案，或者含有来自牛奶的1.5g/kg 胆固醇和200g/kg脂肪的经富集方案。未处理的小鼠每日经腹膜内注射 含10％DMSO的溶液。经处理的小鼠腹膜内注射含2或20μg(即 0.1mg/kg/day或1mg/kg/day)化合物CGP 02-01的相同溶液。在采集用 于进行生化分析的血样，处死小鼠。

第二，利用参比大鼠-果糖模型研究化合物CGP 02-01的活性。使 Wistar大鼠组(n＝12)接受3周含有10％果糖的膳食方案。在这些条件 下，大鼠发展出代谢综合症包括高血糖症、高胰岛素血症 (hyperinsulinaemia)、高胆固醇血症以及高甘油三酯血症。随后通过强 伺法使各组大鼠接受50mg/kg溶于在于甲基纤维素中制备的2％吐温溶 液中的化合物CGP 02-01。在1、2和3周对血样进行生化分析。独立组 的大鼠在相同条件下用以50mg/kg剂量的盐酸二甲双胍进行处理。在该 代谢综合症模型中二甲双胍用作参比物。

实施例4：血浆中游离胆固醇的测量。

游离的胆固醇可以通过酶促法来测量。游离的胆固醇经胆固醇氧化 酶氧化为δ-4-胆甾烯酮并同时产生过氧化氢。随后过氧化氢使得DHESA 和氨基安替比林氧化缩合产生蓝色。之后通过蓝色的吸光率来测定游离 胆固醇的量。样品用包含EDTA和肝素的柠檬酸盐缓冲液回收。这项试 验可以由试剂盒的形式购买实现。当ApoE-/-小鼠接受正常的未经富集 的膳食方案并以化合物CGP 02-01(1mg/kg)处理时，未酯化的胆固醇的 血浆水平显著下降。在未处理的动物中在3个月期间观测到的变化平均 为136±19g/L。对处理相同时间的动物所观测的变化为105±6g/L，即 22.7％的作用(p＜0.05)。

实施例5：血浆中总胆固醇的测定

循环中的总胆固醇可以利用可购买获得的试剂盒通过酶促分析来测 定。这项试验可以利用如胆固醇-酯酶/胆固醇氧化酶/产色过氧化物 酶类的酶序列。总之，全部的酯化的胆固醇通过胆固醇酯酶的作用转化 为游离的胆固醇和脂肪酸。之后通过在胆固醇氧化酶和过氧化物酶存在 下形成醌亚胺(quinoneimine)来测定未酯化的胆固醇。醌亚胺显色的强 度与样品中存在的胆固醇的量成比例。

下表2显示在接受富含胆固醇的膳食方案并以化合物CGP 02-01处 理的ApoE-/-小鼠中HDL和总胆固醇的血浆水平的变化。当ApoE-/-小 鼠以CGP 02-01(1mg/kg)处理3个月时，其总胆固醇血浆水平比未处 理的动物的下降更显著。当小鼠接受富含胆固醇的膳食方案时，其总胆 固醇水平从7.27±0.55g/L的值下降到6.86±0.65g/L的值，即相差5.6％。 观测到的这项作用取决于CGP 02-01剂量。

表2

  血浆HDL水平(g/L)   血浆总胆固醇水平(g/L)   未处理   0.11±0.05   7.27±0.55   0.4mg/kg   0.15±0.06   8.08±0.62   1mg/kg   0.15±0.05   6.86±0.65

在接受富含果糖的膳食方案、经口服途径(50mg/kg)处理的大鼠 模型中，在处理3周后，化合物CGP 02-01致使总胆固醇水平非常显著 地降低(p＜0.01)，从0.79±0.05g/L的值降低到0.36±0.03g/L的值， 即降低54.5％(p＜0.01)。在相同条件下经口服途径给药(50mg/kg)的 二甲双胍导致总胆固醇降低16％，平均值为0.66±0.02g/L(图12)。

实施例6：循环的甘油三酯的测定。

血清甘油三酯的分析可以利用可购买获得的试剂盒酶促地实施。例 如可以利用购自Biomérieux的试剂盒(ref.61.238)。总之，用脂肪酶处 理甘油三酯以生成脂肪酸。在ATP存在下，甘油经甘油激酶转化为甘油 3磷酸酯。之后在产生氧化的水(H2O2)过程中，该甘油3磷酸酯转化 为二羟基丙酮，氧化的水(H2O2)可以通过在对氯苯酚、氨基-4-安替比 林和过氧化物酶的存在下的醌亚胺的形成来检测。之后在505nm处测定 醌亚胺显色强度。这种显色与样品中存在的甘油三酯的量成比例。

当ApoE-/-小鼠接受富含胆固醇和脂肪的膳食方案并以化合物CGP 02-01(1mg/kg)处理3个月时，其血浆甘油三酯水平发生改变并且该变 化在经处理的小鼠中比未处理的小鼠中大两倍。该变化由未处理小鼠的 -0.67±0.54g/L降低到经处理的小鼠的-1.49±0.57g/L(p＜0.01)(图9)。

当化合物CGP 02-01经口服途径对接受富含果糖的膳食方案的大鼠 给药时，其血浆甘油三酯水平从1.39±0.13g/L降低到0.47±0.07g/L， 即66.2％的差异(p＜0.01)。在相同的条件下，二甲双胍没有任何作用， 平均值为1.21±0.08g/L(figure 10)。

实施例7：血浆中胰岛素的测定

血浆中胰岛素的测定可以利用可购买获得的包含小鼠或大鼠的特异 性抗胰岛素抗体的试剂盒通过放射免疫测定法来实施。例如可以利用大 鼠/小鼠ELISA试剂盒，Linco research(ref.EZRMI-13K)。

当以0.1或1mg/kg的化合物CGP 02-01处理接受富含胆固醇的膳食 方案的ApoE-/-小鼠时，观测到血浆胰岛素水平显著下降(p＜0.01)，其 值从1.17±0.2ng/mL降低至0.95±0.16的值，即18.8％的差异(图11)

以相同的方式，化合物CGP 02-01导致接受富含果糖的膳食方案的 大鼠的胰岛素水平由1.85±0.04的值降低至1.64±0.03的值，即11.3％ 的差异。在相同的条件下，二甲双胍导致胰岛素水平降低16.2％。(图 12)。

实施例8：血浆HDL水平的测定

血浆HDL水平是通过经检验并可信赖的商业方法来测定，其利用高 密度脂蛋白分离试剂并通过测量与这些高分子量脂蛋白有关的胆固醇水 平(例如Biomérieux试剂盒ref.61533)。

当接受富含胆固醇和脂肪酸的膳食方案的小鼠以化合物CGP 02-01 处理时，其血浆HDL水平从0.11±0.005g/L增加至0.15±0.005g/L， 即，38.2％的差异。

实施例9：腹部脂肪量的测定

在用化合物CGP 02-01以0.1mg/kg和1mg/kg剂量处理3个月后， 将接受富含胆固醇和脂肪的膳食方案的ApoE小鼠处死。经剥离、干燥 回收腹部脂肪量并以干重表示。

对于恒定的体重增加，化合物CGP 02-01导致腹部脂肪量显著降低 (p＜0.01)。当小鼠经1mg/kg该化合物处理时，腹部脂肪量从760±231 mg的值降低到393±78mg的值，即降低48.3％(图13)。这种作用取 决于CGP 02-01的剂量。

实施例10：甘油三酯在主动脉的沉积

在主动脉壁累积的甘油三酯是通过下列方法来测定：将动物的主动 脉在剥离后用生理盐水冲洗。将外膜的脂质质量经剥离除去并将内膜中 膜脱水。测定甘油三酯水平并以每单位组织干重的甘油三酯重量来表示。

当用1mg/kg剂量的化合物CGP 02-01处理ApoE-/-小鼠三个月时， 沉积在主动脉壁的甘油三酯从185±33μg/mg(干重)的平均值(n＝8) 降低至131±42μg/mg(干重)的值。这种作用取决于所注射的剂量。 0.1mg/kg的注射量引起156±31μg/mg的中间变异(intermediate variation)。图14阐释了这种结果。

实施例11：主动脉损伤的分析

将小鼠的主动脉用低聚甲醛固定并切成10μm的切片用于损伤的组 织学分析(图6)。

实施例12：冠脉缺血的分析

将接受正常膳食方案或富含胆固醇的膳食方案的ApoE-/-小鼠处死 后，用肉眼观察这些动物的心脏。观察缺血损伤的比率(图15)并以存 在或不存在损伤来定量(图16)。

实施例13：糖尿病大鼠模型中血浆葡萄糖水平的测定

利用可购买获得的试剂盒通过己糖激酶法来测定血糖。例如可使用 Biomérieux试剂盒(ref.：61 269/61 270)。

当大鼠接受富含果糖的膳食方案时，其血糖随时间而增加，并从6.4 ±0.15mmol/L的平均值(n＝12)增加至10.65±0.24mmol/L的平均值(图 14)。经口服途径处理21天后，化合物CGP 02-01稳定了该血糖的增加 (图17)。

实施例14：高血糖试验期间保护作用的测定

使大鼠(n＝12)接受富含果糖的膳食方案(10％)21天。在第14 天之后，在经口服途径给药的化合物CGP 02-01的存在或不存在下，通 过给药2g/kg的葡萄糖来诱导高血糖冲击。随后测定血浆葡萄糖水平。 图18阐释了该产品针对诱导的高血糖症的保护作用。