一种生产生物油脂和生物柴油的方法转让专利
申请号 : CN200610046091.8
文献号 : CN100590186C
文献日 : 2010-02-17
发明人 : 张卫 , 陈慧清 , 秦松 , 赵宗保 , 沈珺珺 , 杨庆利 , 金美芳
申请人 : 中国科学院大连化学物理研究所
摘要 :
本发明涉及生物能源领域，具体地说是一种生产生物油脂和生物柴油的方法，以海洋滩涂植物大米草为原料，采用酵母工程菌将大米草分步糖化发酵生产生物油脂和生物柴油。本发明是一种由海洋滩涂植物大米草经酸水解产糖后利用微生物中的酵母工程菌发酵转化为油脂或柴油的新工艺，该工艺产油率高、转化快，在变废为宝和环境保护等方面具有广阔的应用前景。
权利要求 :
1.一种生产生物油脂和生物柴油的方法，其特征在于：以海洋滩涂植 物大米草为原料，采用酵母工程菌将大米草分步糖化发酵生产生物油脂和 生物柴油；
具体过程如下，
1)糖化过程：将经干燥、粉碎后的大米草于无机浓酸水溶液中搅拌水 解；反应完毕加水稀释后用碱液中和至中性，抽滤进行固液分离，或用浓 H3PO4回调pH至6.0，抽滤去Ca3(PO4)2沉淀；浓缩水解液备用；
2)发酵过程：以10％的重量接种量将产油酵母的液体种子培养液接种 于经110～121℃灭菌后的大米草水解液中，于28℃～30℃、180～200r/min 的条件下，摇床培养48～96小时；发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量 和残糖；
3)菌体和油脂分离，得生物油脂；生物油脂进行转酯化便可得到生物 柴油；
所述步骤1)糖化过程为，
A.将大米草经过清洗、切短、烘干、粉碎并过筛获得20～60目颗粒；
B.按照固形物的重量含量为5～12.5％加入重量浓度10～80％的无机浓 酸，40～120℃水解1～4小时；
C.水解液用碱调至中性，进行固液分离，滤液浓缩作为微生物发酵液 于4℃冷藏备用；
所述步骤2)发酵过程为，
A.将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于28℃～ 30℃、180～200r/min摇床培养20～48小时；
B.以10％接种量接种于大米草水解液中，在相同的条件下摇床培养 48～96小时；
C.发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量和残糖；或用索氏脂肪测定 仪测定每株菌发酵后相应干重的含油量，然后计算得出产油率。
说明书 :
技术领域
本发明涉及生物能源领域，具体地说是一种生产生物油脂和生物柴油 的方法，以海洋滩涂植物大米草作为原料，采用酵母工程菌将大米草分步 糖化发酵的方法，把海滩的有害植物材料变为生物能源一柴油和油脂，是 一种变废为宝和环境保护相结合具有重大的经济和社会效益的新工艺技 术。
背景技术
大米草(S.anglica)，英文名common cordgrass，是互花米草(S. alterniflora)和狐米草(S.patens)的杂交种，原产英国南海岸，大米草 株高20～50cm，最高的可达100cm。根系发达，基部腋芽可长出新蘖和地 上茎，蔓延生长，耐盐、耐淹性强，能在其他植物不能生长的海滩中潮带 生长。早期，大米草被宣传报道为可抗较大风浪，具有促淤造陆，保护海 堤，提高海滩土壤肥力的作用的先锋植物和优良的牧草饲料。于是全球各 地都开始大规模引种，致使大米草在全球范围迅速蔓延，现已变为一种全 球性草害[刘建，黄建华.谨慎引进植物警惕负面影响.植物保 护，2002，28(4)：51～53.秦卫华，王智，蒋明康.互花米草对长江口两个湿地 自然保护区的入侵.杂草科学，2004，4：15～16.]
我国的大米草是于1963年从英国引进，至今已有40余年的历史。首 先在江苏海滨试种，用于沿海护堤和改良土壤，同时生产饲料和造纸原料。 到1981年底我国南起广西合浦县北至辽宁锦西县共有3.6万hm2大米草。 近年来，大米草在福建、广东、江苏、山东等沿海地区疯狂扩散，其覆盖 面积越来越大，已经到了难以控制的局面，严重影响沿海的养殖业的发展。 因此给我国的沿海经济和生态带来了严重问题。大米草严重威胁我国海岸 生态安全，现已属国家公布的第一批16种外来入侵物种。
随着现代工业的发展和世界人口的激增，能源危机日趋加剧。目前， 世界各国纷纷展开新能源，特别是可再生生物能源的研究与开发。生物柴 油是最重要的可再生能源产品之一，其化学成分主要是长链脂肪酸的低碳 酯。国内外有关以稻草、秸秆为主的木质纤维素原料水解成可发酵糖，利 用微生物发酵生产油脂和生物柴油、生物乙醇等。而以大米草为原料的尚 未见报道，大米草的主要成分纤维素半纤维素约占60％，可作为一种生产生 物柴油的丰富资源，同时对这种具有灾害性的入侵物种的利用能起到变废 为宝和保护环境的作用。
我国的大米草是于1963年从英国引进，至今已有40余年的历史。首 先在江苏海滨试种，用于沿海护堤和改良土壤，同时生产饲料和造纸原料。 到1981年底我国南起广西合浦县北至辽宁锦西县共有3.6万hm2大米草。 近年来，大米草在福建、广东、江苏、山东等沿海地区疯狂扩散，其覆盖 面积越来越大，已经到了难以控制的局面，严重影响沿海的养殖业的发展。 因此给我国的沿海经济和生态带来了严重问题。大米草严重威胁我国海岸 生态安全，现已属国家公布的第一批16种外来入侵物种。
随着现代工业的发展和世界人口的激增，能源危机日趋加剧。目前， 世界各国纷纷展开新能源，特别是可再生生物能源的研究与开发。生物柴 油是最重要的可再生能源产品之一，其化学成分主要是长链脂肪酸的低碳 酯。国内外有关以稻草、秸秆为主的木质纤维素原料水解成可发酵糖，利 用微生物发酵生产油脂和生物柴油、生物乙醇等。而以大米草为原料的尚 未见报道，大米草的主要成分纤维素半纤维素约占60％，可作为一种生产生 物柴油的丰富资源，同时对这种具有灾害性的入侵物种的利用能起到变废 为宝和保护环境的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种有效的、水解时间短、糖化发酵效率高的利 用大米草分步糖化发酵生产生物油脂和生物柴油的方法。
方法原理：大米草主要是由纤维素、半纤维素组成，约占生物质干重 的60％～70％。木质纤维素的结构较复杂，细胞壁中的半纤维素和木质素通 过共价键联结成网络结构，纤维素镶嵌其中。在酸作用下半纤维素非常容 易被水解成五碳糖，纤维素的晶体结构被破坏进一步糖苷键断裂水解成六 碳糖及其他可发酵糖。而产油微生物在发酵培养基(大米草水解液)中碳 源充足而某些营养成分(特别是氮源)缺乏时，菌体细胞分裂速度锐减， 代谢活动转为以消耗碳源并以合成和积累油脂为主。在油脂积累期，微生 物基本上不再进行细胞繁殖，而是将过量的碳水化合物转化为油脂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种生产生物油脂和生物柴油的方法，以海洋滩涂植物大米草为原料， 采用酵母工程菌将大米草分步糖化发酵生产生物油脂和生物柴油。
具体过程如下：
1)糖化过程：在浓酸低温常压下大米草中的纤维素、半纤维素水解成 五、六碳糖及其它可发酵糖。
将经干燥、粉碎后的大米草于无机浓酸水溶液中在恒温水浴、机械搅 拌条件下水解；反应完毕加水稀释后用碱液中和至中性，再用循环水式真 空泵抽滤抽滤进行固液分离，或用浓H3PO4回调pH至6.0，抽滤去Ca3(PO4)2 沉淀；然后用蒽酮法测定水解液中可溶性总糖的含量，用旋转蒸发仪浓缩 水解液备用；
具体为，
A.将大米草经过清洗、切短、烘干、粉碎并过筛获得20～60目颗粒；
B.按照固形物的重量含量为5～12.5％加入重量浓度10～80％的无机浓 酸(如：硫酸)，40～120℃水解1～4小时；力求在最佳水解条件下得最大的 糖产率；
C.水解液用碱调至中性，进行固液分离，滤液浓缩作为微生物发酵液 于4℃冷藏备用。
2)发酵过程：以10％的重量接种量将产油酵母的液体种子培养液接种 于经110～121℃灭菌后的大米草水解液中，于28℃～30℃、180～200r/min 的条件下，摇床培养48～96小时；发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量 和残糖；
具体为，
A.将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于28℃～ 30℃、180～200r/min摇床培养20～48小时；
B.以10％接种量接种于发酵培养基(经110～121℃灭菌后的大米草水 解液)中，在相同的条件下摇床培养48～96小时；(此发酵条件对后期油 脂的形成起到关键作用)
C.发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量和残糖；或用索氏脂肪测定 仪测定每株菌发酵后相应干重的含油量，然后计算得出产油率。
3)菌体和油脂分离，得生物油脂；生物油脂进行转酯化便可得到生物 柴油。
本发明具有如下优点：
1.工艺简单。本发明从大米草分步糖化发酵的角度出发，以无机酸(如： 硫酸)对大米草中的纤维素、半纤维素进行水解，再利用产油微生物发酵 将碳水化合物转化为油脂；实现了大米草分步糖化发酵生产生物油脂和生 物柴油的过程。
2.糖化率高，糖的回收率和利用率高。本发明选用购买的圆红冬孢酵 母产油菌株进行摇瓶发酵实验，能较好地利用大米草水解液里的主要单糖 (葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)转化为油脂贮存在体内，菌体油脂含量高达 47.9％；发酵结束得到油脂，油脂经转酯化就可得到柴油的主要成分；以10％ 接种量接种于发酵培养基中，摇床培养96小时，发酵结束得到7.75％生物 柴油(按大米草原料干基计算)。
3.生产成本低，经济效益好。本发明是一种由海洋滩涂植物大米草经 酸水解产糖后利用微生物中的酵母工程菌发酵转化为油脂或柴油的新工 艺，该工艺产油率高、转化快，在变废为宝和环境保护等方面具有广阔的 应用前景。
4.社会效益显著。本发明方法对大米草浓酸水解提取可发酵糖，并通 过产油微生物发酵将碳水化合物转化为油脂，再进行转酯化变可得生物柴 油，能缓解化石燃料短缺所带来的能源危机。
方法原理：大米草主要是由纤维素、半纤维素组成，约占生物质干重 的60％～70％。木质纤维素的结构较复杂，细胞壁中的半纤维素和木质素通 过共价键联结成网络结构，纤维素镶嵌其中。在酸作用下半纤维素非常容 易被水解成五碳糖，纤维素的晶体结构被破坏进一步糖苷键断裂水解成六 碳糖及其他可发酵糖。而产油微生物在发酵培养基(大米草水解液)中碳 源充足而某些营养成分(特别是氮源)缺乏时，菌体细胞分裂速度锐减， 代谢活动转为以消耗碳源并以合成和积累油脂为主。在油脂积累期，微生 物基本上不再进行细胞繁殖，而是将过量的碳水化合物转化为油脂。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种生产生物油脂和生物柴油的方法，以海洋滩涂植物大米草为原料， 采用酵母工程菌将大米草分步糖化发酵生产生物油脂和生物柴油。
具体过程如下：
1)糖化过程：在浓酸低温常压下大米草中的纤维素、半纤维素水解成 五、六碳糖及其它可发酵糖。
将经干燥、粉碎后的大米草于无机浓酸水溶液中在恒温水浴、机械搅 拌条件下水解；反应完毕加水稀释后用碱液中和至中性，再用循环水式真 空泵抽滤抽滤进行固液分离，或用浓H3PO4回调pH至6.0，抽滤去Ca3(PO4)2 沉淀；然后用蒽酮法测定水解液中可溶性总糖的含量，用旋转蒸发仪浓缩 水解液备用；
具体为，
A.将大米草经过清洗、切短、烘干、粉碎并过筛获得20～60目颗粒；
B.按照固形物的重量含量为5～12.5％加入重量浓度10～80％的无机浓 酸(如：硫酸)，40～120℃水解1～4小时；力求在最佳水解条件下得最大的 糖产率；
C.水解液用碱调至中性，进行固液分离，滤液浓缩作为微生物发酵液 于4℃冷藏备用。
2)发酵过程：以10％的重量接种量将产油酵母的液体种子培养液接种 于经110～121℃灭菌后的大米草水解液中，于28℃～30℃、180～200r/min 的条件下，摇床培养48～96小时；发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量 和残糖；
具体为，
A.将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于28℃～ 30℃、180～200r/min摇床培养20～48小时；
B.以10％接种量接种于发酵培养基(经110～121℃灭菌后的大米草水 解液)中，在相同的条件下摇床培养48～96小时；(此发酵条件对后期油 脂的形成起到关键作用)
C.发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量和残糖；或用索氏脂肪测定 仪测定每株菌发酵后相应干重的含油量，然后计算得出产油率。
3)菌体和油脂分离，得生物油脂；生物油脂进行转酯化便可得到生物 柴油。
本发明具有如下优点：
1.工艺简单。本发明从大米草分步糖化发酵的角度出发，以无机酸(如： 硫酸)对大米草中的纤维素、半纤维素进行水解，再利用产油微生物发酵 将碳水化合物转化为油脂；实现了大米草分步糖化发酵生产生物油脂和生 物柴油的过程。
2.糖化率高，糖的回收率和利用率高。本发明选用购买的圆红冬孢酵 母产油菌株进行摇瓶发酵实验，能较好地利用大米草水解液里的主要单糖 (葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)转化为油脂贮存在体内，菌体油脂含量高达 47.9％；发酵结束得到油脂，油脂经转酯化就可得到柴油的主要成分；以10％ 接种量接种于发酵培养基中，摇床培养96小时，发酵结束得到7.75％生物 柴油(按大米草原料干基计算)。
3.生产成本低，经济效益好。本发明是一种由海洋滩涂植物大米草经 酸水解产糖后利用微生物中的酵母工程菌发酵转化为油脂或柴油的新工 艺，该工艺产油率高、转化快，在变废为宝和环境保护等方面具有广阔的 应用前景。
4.社会效益显著。本发明方法对大米草浓酸水解提取可发酵糖，并通 过产油微生物发酵将碳水化合物转化为油脂，再进行转酯化变可得生物柴 油，能缓解化石燃料短缺所带来的能源危机。
附图说明
图1为本发明用大米草分步糖化发酵生产生物油脂和生物柴油的工艺 流程图。
具体实施方式
实施例1
原料大米草于2005年9月底采集于江苏沿海，其主要成分含量为：半 纤维素：23.28％，纤维素：35.18％。
1)将大米草清洗、切短、烘干、粉碎并过筛取小于20目的部分；按 照固液比1∶10的比例(质量∶体积)加入重量浓度60％的硫酸，50℃水浴 并搅拌1小时；
2)反应完毕后将其用水稀释，并加入适量的Ca(OH)2调至中性，进行 固液分离，采用蒽酮比色法测可溶性总糖含量；
3)将所得到的滤液浓缩作为微生物发酵液；
4)将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于28℃、 180r/min摇床培养20～24小时；以(固体为重量、液体为体积的固液比) 10％接种量接种于微生物发酵液(经121℃灭菌后的大米草水解液)中，在 相同的条件下摇床培养96小时；
所述产油菌株为圆红冬孢酵母As2.1389，购自中国普通微生物菌种保 藏中心；(其中As2.1389是1992年中国微生物菌种保藏管理委员会主编的 微生物菌种资料中的编号，该资料在2003年又出了增刊改名为中国普通微 生物菌种保藏中心)
培养基：a)菌种保藏培养基(1L)：酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g， 琼脂粉16～30g；
b)YEPD培养基(g/L)组成：葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15， pH 5.8～6.0；固体培养基在YEPD基础上加入15g琼脂粉；
液体种子培养基(g/L)组成：葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～ 0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH 5.8～6.0；
限氮发酵培养基(g/L)组成：葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母 粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH 5.8～6.0；
以上培养基均在110～121℃下饱和蒸汽灭菌15min；
5)发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量和残糖；
6)利用萃取方法进行菌体和油脂的分离；转酯化便可得到生物柴油， 每100克干大米草约产生物柴油7.75克。
实施例2
原料大米草是于2005年5月采集于浙江沿海，其主要成分含量为： 半纤维素：27.99％，纤维素：25.30％。
1)将大米草清洗、切短、烘干、粉碎并过筛取20～40目的部分；按照 固液比1∶10的比例(质量∶体积)
)加入重量浓度50％的硫酸，80℃水浴并搅拌4小时；
2)反应完毕后将其用水稀释，并加入适量的Ba(OH)2调至中性，进行 固液分离，采用蒽酮比色法测可溶性总糖含量；
3)将所得到的滤液浓缩作为微生物发酵液；
4)将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于30℃、 200r/min摇床培养40～48小时；以重量体积比10％接种量接种于微生物发 酵液(经110℃灭菌后的大米草水解液)中，在相同的条件下摇床培养48 小时；
所述产油菌株与实施例1相同；
培养基：a)菌种保藏培养基(1L)：酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g， 琼脂粉16～30g；
b)YEPD培养基(g/L)组成：葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15， pH 5.8～6.0；固体培养基在YEPD基础上加入15g琼脂粉；
液体种子培养基(g/L)组成：葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～ 0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH 5.8～6.0；
限氮发酵培养基(g/L)组成：葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母 粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH 5.8～6.0；
以上培养基均在110～121℃下饱和蒸汽灭菌15min；
5)发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量和残糖；
6)利用萃取方法进行菌体和油脂的分离；转酯化便可得到生物柴油， 每100克干大米草约产生物柴油5.65克。
实施例3
采用的菌种为：1、圆红冬孢酵母As2.1515；2、粘红酵母As2.703；3、 粘红酵母As2.704；购自中国普通微生物菌种保藏中心。
培养基：a)菌种保藏培养基(1L)：酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g， 琼脂粉16～30g；
b)YEPD培养基(g/L)组成：葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15， pH 5.8～6.0；固体培养基在YEPD基础上加入15g琼脂粉；
液体种子培养基(g/L)组成：葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～ 0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH 5.8～6.0；
限氮发酵培养基(g/L)组成：葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母 粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH 5.8～6.0；
以上培养基均在110～121℃下饱和蒸汽灭菌15min。产油微生物的摇 瓶发酵培养：将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于 28℃～30℃、180～200r/min摇床培养20～48小时。
将采自连云港的大米草适当清洗，将烘箱预热至110℃～115℃，然 后将大米草样品置入烘箱于105℃恒温8小时，用粉碎机粉碎大米草样品 至粒径30目左右，H2SO4浓度按1∶10(质量∶体积)加入，在110℃下水 解3h。抽滤除去大米草残渣后，水解液用石灰乳过中和至pH10.0，抽滤去 CaSO4沉淀后用浓H3PO4回调pH至6.0，抽滤去Ca3(PO4)2沉淀，所得 水解液于4℃冷藏备用。
将购自中国普通微生物菌种保藏中心的上述三株菌分别保藏斜面种和 甘油种。斜面菌种一环，分别接入液体种子培养基中，500mL三角瓶装液量 100mL，共三瓶，于30℃下、摇床转速200rPmin下培养48h。然后于500mL 摇瓶中加入95mL大米草水解液，接入5mL液体种子，在180-200rPmin，30 ℃下发酵。所得发酵液反复离心去上清，将离心所得菌体用蒸馏水吸打离 心3次，然后放入直径9厘米培养皿小于2mm厚分装，于-20℃的冰箱冷 冻60分钟，待样品冻好后，置入低温冷冻干燥机冷冻干燥过夜(第一天下 午5点放入第二天8点取出)。将干燥好的样品于索氏脂肪测定仪分菌株 直接测定油脂产出量，所得结果如下：
表1.称取烘干后的大米草20g(在1L酸液中水解)进行操作的结果：
编号 菌体干重(g) 菌体产油量(g) 产油率 1 0.45 0.038 8.44 2 1.45 0.150 10.3 3 1.52 0.561 37.3
实施例4
将采自连云港烘好的大米草样品粉碎至粒径30目，按固液比1∶10(质 量∶体积)加入10％的H2SO4，在110℃下水解3h。抽滤除去大米草残渣 后，水解液用石灰乳过中和至pH10.0，抽滤去CaSO4沉淀后用浓H3PO4回 调pH至6.0，抽滤去Ca3(PO4)2沉淀，所得水解液于4℃冷藏备用。
采用的菌株与实施例3相同，将保好的斜面菌种一环分别接入液体种 子培养基中，500mL三角瓶装液量100mL，共三瓶，于30℃下、摇床转 速200rPmin下培养48h。然后于500mL摇瓶中加入95mL大米草水解液， 接入5mL液体种子，在180-200rPmin，30℃下发酵。所得发酵液反复离心 去上清，将离心所得菌体用蒸馏水吸打离心3次，然后放入直径9厘米培 养皿小于2mm厚分装，放入烘箱，105℃恒温烘烤8小时，将干燥好的样 品分菌株用索氏提取仪测定油脂含量，测定方法为将烘干菌体用滤纸包装， 然后于烘箱105度烘5小时，然后称量滤纸包的重量，将纸包放入索氏提 取器浸提7小时以上，然后将纸包取出放入烘箱105度恒温30分钟以上， 再称量纸包的重量，将两次称量数据相减即为菌体所含生物油脂的重量：
表2.称取烘干后的大米草18g(在1L酸液中水解)进行操作的结果：
编号 菌体干重 包装后重量 浸提后重量 产油率 1 0.6380 1.5338 1.5971 9.92 2 1.3271 2.3273 2.4349 8.11 3 1.2372 2.0527 2.5060 36.64
表3.称取烘干后的大米草25g(在1L酸液中水解)进行操作的结果：
编号 菌体干重 包装后重量 浸提后重量 产油率 1 0.5620 1.6994 1.7765 13.7 2 0.4124 1.4891 1.5280 9.43 3 0.7026 2.0935 2.3902 42.23
由此可见，大米草样品干重为25g时，菌体产油量最高。
现有技术中的所有产油酵母菌株均可以应用本发明方法，利用大米草 分步糖化发酵进行生产生物油脂和生物柴油的操作，例如：
常见的产油酵母有：浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、弯隐 球酵母(Cryptococcus albi2dun)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces)、茁 芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)、产油油脂酵母(Lipomy sli2pofer)、胶粘红酵母(Rhodotorula giutinis)、类酵母红冬饱 (Rhodosporidium toru2 loides)；
在中国生物工程杂志2005。25(12)：39～44中，李永红等对10株酵 母菌利用不同单糖为碳源条件下菌体内积累油脂的能力进行了初步考察。 试验结果表明，所有实验菌株都能同化多种单糖，其中L.starkeyi AS 2.1390、R.toruloides AS 2.1389和L.sta rkey i AS 2.1608表现 出对碳源利用的广谱性，能转化五碳糖木糖和阿拉伯糖并在菌体内积累油 脂，油脂含量最高达到26％。脂肪酸组成分析结果表明，菌油富含饱和及低度 不饱和长链脂肪酸，其中棕榈酸、油酸和亚油酸三者之和占总脂肪酸组成的 90％以上，脂肪酸组成分布类似于常见的植物油。这些结果对利用产油微生 物转化木质纤维素水解混合糖获取油脂资源的研究具有重要意义。
2003年施安辉、周波通过对粘红酵母GRL513生产油脂最佳小型工艺 发酵条件的探讨发现，最终油脂产量可达菌体干重的67.12％；
生物加工过程(杂志名)，微生物油脂的研究进展及展望(文章题目) 2005年vol.3，No.1薛飞燕，张栩，谭天伟(作者)；
微生物学通报(杂志名)2000年27(2)酵母诱变获高产菌株Lipomyces Starkeyi HL。
原料大米草于2005年9月底采集于江苏沿海，其主要成分含量为：半 纤维素：23.28％，纤维素：35.18％。
1)将大米草清洗、切短、烘干、粉碎并过筛取小于20目的部分；按 照固液比1∶10的比例(质量∶体积)加入重量浓度60％的硫酸，50℃水浴 并搅拌1小时；
2)反应完毕后将其用水稀释，并加入适量的Ca(OH)2调至中性，进行 固液分离，采用蒽酮比色法测可溶性总糖含量；
3)将所得到的滤液浓缩作为微生物发酵液；
4)将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于28℃、 180r/min摇床培养20～24小时；以(固体为重量、液体为体积的固液比) 10％接种量接种于微生物发酵液(经121℃灭菌后的大米草水解液)中，在 相同的条件下摇床培养96小时；
所述产油菌株为圆红冬孢酵母As2.1389，购自中国普通微生物菌种保 藏中心；(其中As2.1389是1992年中国微生物菌种保藏管理委员会主编的 微生物菌种资料中的编号，该资料在2003年又出了增刊改名为中国普通微 生物菌种保藏中心)
培养基：a)菌种保藏培养基(1L)：酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g， 琼脂粉16～30g；
b)YEPD培养基(g/L)组成：葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15， pH 5.8～6.0；固体培养基在YEPD基础上加入15g琼脂粉；
液体种子培养基(g/L)组成：葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～ 0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH 5.8～6.0；
限氮发酵培养基(g/L)组成：葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母 粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH 5.8～6.0；
以上培养基均在110～121℃下饱和蒸汽灭菌15min；
5)发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量和残糖；
6)利用萃取方法进行菌体和油脂的分离；转酯化便可得到生物柴油， 每100克干大米草约产生物柴油7.75克。
实施例2
原料大米草是于2005年5月采集于浙江沿海，其主要成分含量为： 半纤维素：27.99％，纤维素：25.30％。
1)将大米草清洗、切短、烘干、粉碎并过筛取20～40目的部分；按照 固液比1∶10的比例(质量∶体积)
)加入重量浓度50％的硫酸，80℃水浴并搅拌4小时；
2)反应完毕后将其用水稀释，并加入适量的Ba(OH)2调至中性，进行 固液分离，采用蒽酮比色法测可溶性总糖含量；
3)将所得到的滤液浓缩作为微生物发酵液；
4)将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于30℃、 200r/min摇床培养40～48小时；以重量体积比10％接种量接种于微生物发 酵液(经110℃灭菌后的大米草水解液)中，在相同的条件下摇床培养48 小时；
所述产油菌株与实施例1相同；
培养基：a)菌种保藏培养基(1L)：酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g， 琼脂粉16～30g；
b)YEPD培养基(g/L)组成：葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15， pH 5.8～6.0；固体培养基在YEPD基础上加入15g琼脂粉；
液体种子培养基(g/L)组成：葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～ 0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH 5.8～6.0；
限氮发酵培养基(g/L)组成：葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母 粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH 5.8～6.0；
以上培养基均在110～121℃下饱和蒸汽灭菌15min；
5)发酵结束后测定菌体的生物量、油脂量和残糖；
6)利用萃取方法进行菌体和油脂的分离；转酯化便可得到生物柴油， 每100克干大米草约产生物柴油5.65克。
实施例3
采用的菌种为：1、圆红冬孢酵母As2.1515；2、粘红酵母As2.703；3、 粘红酵母As2.704；购自中国普通微生物菌种保藏中心。
培养基：a)菌种保藏培养基(1L)：酵母粉2～14g，胰蛋白胨10～20g， 琼脂粉16～30g；
b)YEPD培养基(g/L)组成：葡萄糖10～30，酵母粉5～16，蛋白胨8～15， pH 5.8～6.0；固体培养基在YEPD基础上加入15g琼脂粉；
液体种子培养基(g/L)组成：葡萄糖16～28，(NH4)2SO42～8，酵母粉0.1～ 0.6，KH2PO40.5～3，MgSO4·7H2O0.1～0.6，pH 5.8～6.0；
限氮发酵培养基(g/L)组成：葡萄糖50～90，(NH4)2SO41.0～4.0，酵母 粉0.1～0.6，KH2PO40.5～3.0，MgSO4·7H2O0.2～.08，pH 5.8～6.0；
以上培养基均在110～121℃下饱和蒸汽灭菌15min。产油微生物的摇 瓶发酵培养：将新鲜斜面上长好的产油菌株接种于液体种子培养基中，于 28℃～30℃、180～200r/min摇床培养20～48小时。
将采自连云港的大米草适当清洗，将烘箱预热至110℃～115℃，然 后将大米草样品置入烘箱于105℃恒温8小时，用粉碎机粉碎大米草样品 至粒径30目左右，H2SO4浓度按1∶10(质量∶体积)加入，在110℃下水 解3h。抽滤除去大米草残渣后，水解液用石灰乳过中和至pH10.0，抽滤去 CaSO4沉淀后用浓H3PO4回调pH至6.0，抽滤去Ca3(PO4)2沉淀，所得 水解液于4℃冷藏备用。
将购自中国普通微生物菌种保藏中心的上述三株菌分别保藏斜面种和 甘油种。斜面菌种一环，分别接入液体种子培养基中，500mL三角瓶装液量 100mL，共三瓶，于30℃下、摇床转速200rPmin下培养48h。然后于500mL 摇瓶中加入95mL大米草水解液，接入5mL液体种子，在180-200rPmin，30 ℃下发酵。所得发酵液反复离心去上清，将离心所得菌体用蒸馏水吸打离 心3次，然后放入直径9厘米培养皿小于2mm厚分装，于-20℃的冰箱冷 冻60分钟，待样品冻好后，置入低温冷冻干燥机冷冻干燥过夜(第一天下 午5点放入第二天8点取出)。将干燥好的样品于索氏脂肪测定仪分菌株 直接测定油脂产出量，所得结果如下：
表1.称取烘干后的大米草20g(在1L酸液中水解)进行操作的结果：
编号 菌体干重(g) 菌体产油量(g) 产油率 1 0.45 0.038 8.44 2 1.45 0.150 10.3 3 1.52 0.561 37.3
实施例4
将采自连云港烘好的大米草样品粉碎至粒径30目，按固液比1∶10(质 量∶体积)加入10％的H2SO4，在110℃下水解3h。抽滤除去大米草残渣 后，水解液用石灰乳过中和至pH10.0，抽滤去CaSO4沉淀后用浓H3PO4回 调pH至6.0，抽滤去Ca3(PO4)2沉淀，所得水解液于4℃冷藏备用。
采用的菌株与实施例3相同，将保好的斜面菌种一环分别接入液体种 子培养基中，500mL三角瓶装液量100mL，共三瓶，于30℃下、摇床转 速200rPmin下培养48h。然后于500mL摇瓶中加入95mL大米草水解液， 接入5mL液体种子，在180-200rPmin，30℃下发酵。所得发酵液反复离心 去上清，将离心所得菌体用蒸馏水吸打离心3次，然后放入直径9厘米培 养皿小于2mm厚分装，放入烘箱，105℃恒温烘烤8小时，将干燥好的样 品分菌株用索氏提取仪测定油脂含量，测定方法为将烘干菌体用滤纸包装， 然后于烘箱105度烘5小时，然后称量滤纸包的重量，将纸包放入索氏提 取器浸提7小时以上，然后将纸包取出放入烘箱105度恒温30分钟以上， 再称量纸包的重量，将两次称量数据相减即为菌体所含生物油脂的重量：
表2.称取烘干后的大米草18g(在1L酸液中水解)进行操作的结果：
编号 菌体干重 包装后重量 浸提后重量 产油率 1 0.6380 1.5338 1.5971 9.92 2 1.3271 2.3273 2.4349 8.11 3 1.2372 2.0527 2.5060 36.64
表3.称取烘干后的大米草25g(在1L酸液中水解)进行操作的结果：
编号 菌体干重 包装后重量 浸提后重量 产油率 1 0.5620 1.6994 1.7765 13.7 2 0.4124 1.4891 1.5280 9.43 3 0.7026 2.0935 2.3902 42.23
由此可见，大米草样品干重为25g时，菌体产油量最高。
现有技术中的所有产油酵母菌株均可以应用本发明方法，利用大米草 分步糖化发酵进行生产生物油脂和生物柴油的操作，例如：
常见的产油酵母有：浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)、弯隐 球酵母(Cryptococcus albi2dun)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces)、茁 芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)、产油油脂酵母(Lipomy sli2pofer)、胶粘红酵母(Rhodotorula giutinis)、类酵母红冬饱 (Rhodosporidium toru2 loides)；
在中国生物工程杂志2005。25(12)：39～44中，李永红等对10株酵 母菌利用不同单糖为碳源条件下菌体内积累油脂的能力进行了初步考察。 试验结果表明，所有实验菌株都能同化多种单糖，其中L.starkeyi AS 2.1390、R.toruloides AS 2.1389和L.sta rkey i AS 2.1608表现 出对碳源利用的广谱性，能转化五碳糖木糖和阿拉伯糖并在菌体内积累油 脂，油脂含量最高达到26％。脂肪酸组成分析结果表明，菌油富含饱和及低度 不饱和长链脂肪酸，其中棕榈酸、油酸和亚油酸三者之和占总脂肪酸组成的 90％以上，脂肪酸组成分布类似于常见的植物油。这些结果对利用产油微生 物转化木质纤维素水解混合糖获取油脂资源的研究具有重要意义。
2003年施安辉、周波通过对粘红酵母GRL513生产油脂最佳小型工艺 发酵条件的探讨发现，最终油脂产量可达菌体干重的67.12％；
生物加工过程(杂志名)，微生物油脂的研究进展及展望(文章题目) 2005年vol.3，No.1薛飞燕，张栩，谭天伟(作者)；
微生物学通报(杂志名)2000年27(2)酵母诱变获高产菌株Lipomyces Starkeyi HL。