以单分子作用的支链中性氨基酸转运蛋白

摘要

本发明的目的在于提供一种新的氨基酸转运蛋白及其基因，所述的氨基酸转运蛋白以单分子形式作用，并且转运以支链氨基酸为中心的中性氨基酸。本发明提供了一种能够以单分子形式发挥非钠依赖性地转运以支链氨基酸为中心的中性氨基酸或其类似物的功能的蛋白质，其由序列号2、4、6或8所示的氨基酸序列所构成，或者是由序列号2、4、6或8所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸被缺失、取代或添加的氨基酸序列所构成。本发明还提供了一种基因，所述的基因是一种由序列号1、3、5或7所示的碱基序列构成的DNA，或者由与其杂交的DNA所构成的基因，并且其编码以单分子形式发挥非钠依赖性地转运以支链氨基酸的功能的蛋白质。

权利要求

1.一种使用具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质来检测作 为被检测物质的基质或阻碍物质对于该蛋白质所具有的非钠依赖性 地转运支链中性氨基酸的功能的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种与支链中性氨基酸及其类似物的非钠依赖性转 运相关的蛋白质，以及编码该蛋白质的基因。

背景技术

细胞总是需要吸收氨基酸作为营养，而该功能是通过作为存在 于细胞膜中的蛋白质的氨基酸转运蛋白来承担。特别地，由于中性 氨基酸转运系统L承担了向细胞提供大量必要的氨基酸，因此是细 胞营养中最重要的转运结构之一，同时，在从肠道的吸收、从肾小 管的再吸收、血液·组织障壁的通过中，也具有重要的作用。此外， 还认识到，由于中性氨基酸转运系统L的基质选择性广，因此也能 转运中性氨基酸类似物或具有中性氨基酸类似结构的药物或毒物。
对于中性氨基酸转运系统L，作为本质上是受到氨基酸类似物 2-氨基双环(2，2，1)-庚烷-2-羧酸(BCH)特异性抑制的氨基酸转运 系统，通过肿瘤细胞株被首次记载，此后，使用培养细胞、膜囊标 本、切除器官标本或者体内标本进行了研究(Christensen著， Physiological Reviews，1990年第70卷第1号第43～77页)。中 性氨基酸转运系统L是非钠依赖性的转运蛋白，即，在其功能中不 需要钠离子的转运蛋白。还知道，其转运基质选择性以及转运特性 根据细胞或组织的不同而不同。
但是在现有的方法中，对于中性氨基酸及其类似物的转运的细 节以及中性氨基酸转运蛋白L对细胞的生存或增殖的作用的分析都 是很困难的，因此希望通过分离担负中性氨基酸转运系统L的功能 的中性氨基酸转运蛋白的基因，从而能够进行详细的功能分析。
作为中性氨基酸转运蛋白，已经克隆了作为钠依赖性的转运蛋 白的ASCT1以及ASCT2(金井著，Current Opinion in Cell Biology， 1997年，第9卷，第4期，第565～572页)。但是，这些转运蛋白 主要是以丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺为主要基 质的，这与中性氨基酸转运系统L的基质选择性不同。此外，所克 隆的是甘氨酸转运蛋白和脯氨酸转运蛋白，这与中性氨基酸转运系 统L也是不同的(Amara和Kuhar著，Annual Review of Neuroscience，1993年，第16卷，第73～93页)。
已经知道虽然克隆的不是转运蛋白本身、但克隆了可被认为是 氨基酸转运蛋白的活化因子的、仅具有1次跨膜结构的双型膜糖蛋 白质的rBAT和4F2hc的cDNA，并且当在爪蟾属卵母细胞中表达这些 DNA时，活化中性氨基酸以及碱性氨基酸的吸收(Palacin著，The Journal of Experimental Biology，1994年，第196卷，第123～ 137页)。
作为相当于转运系统L的转运蛋白，已经克隆了中性氨基酸转 运蛋白LAT 1(金井等著，The Journal of Biological Chemistry， 1999年，第273卷，第37期，第23629～23632页)以及LAT 2(濑 川等著，The Journal of Biological Chemistry，1999年，第274 卷，第28号，第19745～19751页)。两者都是通过与4F2hc形成 二聚体发挥作用的转运蛋白，并且两者同时都显示出对Na+的非依赖 性的转运。LAT 1显示出转运亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯基丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等大型中性氨基酸的交换 转运活性，LAT 2除了转运大型中性氨基酸之外，还转运甘氨酸、丙 氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸等小型中性氨基酸，因而具有广 泛的基质选择性，但是仅通过这两种转运系统L转运蛋白并不能说 明全身的转运系统L，并认为还存在其他未鉴定的转运系统L异形 体。
已知的转运系统L的转运蛋白LAT 1和LAT 2是SLC 7家族的 杂二聚体型蛋白质，并通过与1次跨膜型蛋白质的4F2hc连接形成 功能性的转运蛋白。在已经公开的小鼠基因组和人基因组数据库中， 对SLC 7家族中功能未鉴定的成员进行了探索，结果并未在其中进 一步发现相当于转运系统L的新的转运蛋白。因此，一般认为未鉴 定的新的转运系统L的转运蛋白可能是SLC7家族之外的蛋白质。
进而，作为中性氨基酸转运蛋白LAT 1的类似蛋白质，已经克 隆了具有转运中性氨基酸和碱性氨基酸的转运系统y+L的功能的y+ LAT 1和y+LAT 2(Torrents等著，The Journal of Biological Chemistry，1998年，第273卷，第49期，第32437～32445页)。 此外，y+LAT 1和y+LAT 2都显示出仅通过与4F2hc共存来发挥功 能。y+LAT i和y+LAT 2主要转运作为中性氨基酸的谷氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸，对中性氨基酸的基质选择性小。
进而，作为转运芳族氨基酸的中性氨基酸转运蛋白，已经克隆 了相当于转运系统T的氨基酸转运蛋白TAT 1(Jim等著，The Journal of Biological Chemistry，2001年，第276卷，第20期，第17221～ 17228页)。TAT 1非Na+依赖性地转运色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨 酸等芳族氨基酸，而亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等支链氨基酸则不 被吸收，不受转运系统L特异性的抑制药物BCH的抑制，这与氨基 酸转运系统L是不同的。
与本申请的发明相关的现有技术如下所述：
1.Christensen著，Physiological Reviews，1990年，第70 卷，第1期，第43～77页；
2.金井著，Current Opinion in Cell Biology，1997年，第 9卷，第4期，第565～572页；
3.Amara和Kuhar著，Annual Review of Neuroscience，1993 年，第16卷，第73～93页；
4.Palacin著，The Journal of Experimental Biology，1994 年，第196卷，第123～137页；
5.金井等著，The Journal of Biological Chemistry，1999 年，第273卷，第37期，第23629～23632页；
6.濑川等著，The Journal of Biological Chemistry，1999 年，第274卷，第28号，第19745～19751页；
7.Torrents等著，The Journal of Biological Chemistry， 1998年，第273卷，第49期，第32437～32445页；
8.Jim(キムそ)等著，The Journal of Biological Chemistry， 2001年，第276卷，第20期，第17221～17228页；
9.Cole等著，Genomics，1998年，第51卷，第2期，第282～ 287页。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以单分子形式非钠依赖性地转运支 链中性氨基酸、显示出转运系统L的功能的转运蛋白，以及编码该 转运蛋白的基因。至于其他的目的，通过如下描述可以进一步地了 解。

附图说明

图1表示利用注入了来源于人FLC 4细胞的mRNA及其分级的各 级分卵母细胞的亮氨酸的吸收实验的结果。
图2表示人LAT 3以及小鼠LAT 3的氨基酸序列的比较。并且 附线以表示推测的跨膜部位。此外，以#表示推测的糖链添加部位， 以*表示蛋白激酶C依赖性的磷酸化部位，以&表示酪氨酸磷酸化部 位。
图3为代替表示通过RNA印迹法解析LAT 3基因mRNA在人的各 器官组织中的表达结果的照片。
图4表示利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨酸 的实验结果。
图5表示在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨 酸的实验中所加入的盐的影响的实验结果。
图6为在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨酸 的实验中所加入的亮氨酸的浓度的影响的实验结果图。其插图为其 Eadie-Hofstee曲线。
图7表示在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨 酸的实验中，向系统添加甘氨酸以及各种L-氨基酸的影响的实验结 果。
图8表示在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨 酸的实验中，向系统添加各种D-氨基酸的影响的实验结果。
图9表示在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨 酸的实验中，向系统中加入各种氨基酸转运系统选择性的抑制药剂 的影响的实验结果。
图10表示在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮 氨酸的实验中，向系统加入各种氨基酸衍生物的影响的实验结果。
R1-CH(NH2)COOH，L-亮氨酸；R1-CH(NH2)CH2OH，L-亮氨醇； R1-CH2NH2，异戊胺；R1-CH2COOH，4-甲基戊酸；R1-CH(NH2)CH3，1，3- 二甲基正丁胺；R1-CH(NH2)CONH2，L-亮酰胺；R1-CH(NH2)COOCH3，L- 亮氨酸甲酯；R1-CH(NHCOCH3)COOH，N-乙酰基-L-亮氨酸； R1-CH(NHCH3)COOH，N-甲基-L-亮氨酸；R2-CH(NH2)COOH，L-缬氨酸； R2-CH(NH2)CH2OH，L-缬氨醇；R2-CH2NH2，异丁胺；R2-CH2COOH，异戊 酸；R3-CH(NH2)COOH，L-苯基丙氨酸；R3-CH(NH2)CH2OH，L-苯基丙氨 醇；R3-CH2NH2，2-苯基乙胺；R3-CH2COOH，3-苯基丙酸；R4-CH(NH2)COOH， L-酪氨酸；R4-CH(NH2)CH2OH，L-酪氨醇；R4-CH2NH2，酪胺；R4-CH2COOH， 3-(对羟基苯基)丙酸。
图11表示在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮 氨酸的实验中，向系统中添加各种阴离子化合物的影响的实验结果。
图12表示利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收放射 性标记的L-氨基酸和L-氨基酸的实验结果。
图13表示在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮 氨酸的实验中，pH影响的实验结果。
图14表示利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞释放14C- 亮氨酸的释放的经过时间的实验结果。□：作为对照，注入水代替 注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞的14C-亮氨酸的释放，且未向 不含Na+的吸收用溶液添加亮氨酸的情形。■：作为对照，注入水代 替注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞的14C-亮氨酸的释放，且向 不含Na+的吸收用溶液添加亮氨酸的情形。○：注入人LAT 3基因的 cRNA的卵母细胞的14C-亮氨酸的释放，且未向不含Na+的吸收用溶 液添加亮氨酸的情形。●：注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞的 14C-亮氨酸的释放，且向不含Na+的吸收用溶液添加亮氨酸的情形。 纵轴表示所释放的放射活性相对于注入卵母细胞中的放射活性的％ 值。
图15表示在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮 氨酸的实验中，N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理的影响的实验结果。
图16为在人前列腺肿瘤(A和B)和人肾肿瘤(C和D)中采用 抗LAT 3抗体对LAT 3的免疫组织化学的分析结果的照片。A和C 为：采用抗LAT 3抗体的染色图像。B和D为采用抗原肽的吸收实验。
图17为表示人LAT 3与人LAT 4的氨基酸序列的比较图。
图18为表示人LAT 4与小鼠LAT 4的氨基酸序列的比较图。附 线以表示所推测的跨膜部位。此外，以#表示推测的糖链添加部位， 以+表示cAMP依赖性的磷酸化部位，以*表示蛋白激酶C依赖性的磷 酸化部位。
图19表示利用注入人LAT 4基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨 酸的实验中，加入盐的影响的实验结果。
图20为在利用注入人LAT 4基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨 酸的实验中，向系统添加甘氨酸以及各种L-氨基酸的影响的实验结 果。
图21表示在利用注入人LAT 4基因的cRNA的卵母细胞吸收亮 氨酸的实验中，向系统添加各种D-氨基酸的影响的实验结果。
图22表示在利用注入人LAT 4基因的cRNA的卵母细胞吸收亮 氨酸的实验中，向系统中加入各种氨基酸转运系统选择性的抑制药 剂的影响的实验结果。
图23表示利用注入人LAT 4基因的cRNA的卵母细胞吸收放射 性标记的L-氨基酸和L-氨基酸的实验结果。
图24为代替通过RNA印迹法解析人的各器官组织的LAT 4基因 mRNA的表达结果的照片。
图25为代替通过RNA印迹法解析小鼠的各器官组织的LAT 4 基因mRNA的表达结果的照片。

具体实施方式

本发明人以从人肝癌细胞株FLC 4中提取的poly(A)+RNA为 材料，使用爪蟾属卵母细胞表达系统进行表达克隆，克隆出以单分 子发挥转运支链中性氨基酸的功能的转运系统L的性质的新型转运 蛋白的基因。进而，使用EST(表达序列标记)数据库对具有与之相 似的序列的其他的基因进行鉴定。在爪蟾属卵母细胞中表达这些基 因的产物，清楚其功能特性，从而完成了本发明。
即，本发明提供了选自如下(A)～(H)的、且以单分子形式 发挥其非钠依赖性地转运支链中性氨基酸及其类似物的功能的蛋白 质。
(A)由序列号2所示的氨基酸序列所构成的蛋白质。
(B)由序列号4所示的氨基酸序列所构成的蛋白质。
(C)由序列号6所示的氨基酸序列所构成的蛋白质。
(D)由序列号8所示的氨基酸序列所构成的蛋白质。
(E)由在序列号2所示的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸被 缺失、取代或添加的氨基酸序列所构成的蛋白质。
(F)由在序列号4所示的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸被 缺失、取代或添加的氨基酸序列所构成的蛋白质。
(G)由在序列号6所示的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸被 缺失、取代或添加的氨基酸序列所构成的蛋白质。
(H)由在序列号8所示的氨基酸序列中，一个或多个氨基酸被 缺失、取代或添加的氨基酸序列所构成的蛋白质。
此外，本发明还提供了选自如下(a)～(h)的DNA、且编码以 单分子形式发挥其非钠依赖性地转运支链中性氨基酸及其类似物的 功能的蛋白质的DNA所构成的基因。
(a)由序列号1所示的碱基序列所构成的DNA。
(b)由序列号3所示的碱基序列所构成的DNA。
(b)由序列号5所示的碱基序列所构成的DNA。
(d)由序列号7所示的碱基序列所构成的DNA。
(e)在严紧条件下与由序列号1所示的碱基序列构成的DNA杂 交的DNA。
(f)在严紧条件下与由序列号3所示的碱基序列构成的DNA杂 交的DNA。
(g)在严紧条件下与由序列号5所示的碱基序列构成的DNA杂 交的DNA。
(h)在严紧条件下与由序列号7所示的碱基序列构成的DNA杂 交的DNA。
序列号2所示的氨基酸序列表示来源于人肝癌细胞株FLC 4的 以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及其类似物的功 能的氨基酸转运蛋白(人LAT 3)的氨基酸序列(559个氨基酸)。 并且，编码该转运蛋白的cDNA的碱基序列如序列号1所示。
序列号4所示的氨基酸序列表示来源于小鼠唾液腺的以单分子 形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及其类似物的功能的氨基 酸转运蛋白(小鼠LAT 3)的氨基酸序列(564个氨基酸)。并且， 编码该转运蛋白的cDNA的碱基序列如序列号3所示。
序列号6所示的氨基酸序列表示来源于人胎儿脑的以单分子形 式发挥非钢依赖性转运支链中性氨基酸及其类似物的功能的氨基酸 转运蛋白(人LAT 4)的氨基酸序列(573个氨基酸)。并且，编码 该转运蛋白的cDNA的碱基序列如序列号5所示。
序列号8所示的氨基酸序列表示来源于小鼠肾的以单分子形式 发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及其类似物的功能的氨基酸转 运蛋白(小鼠LAT 4)的氨基酸序列(568个氨基酸)。并且，编码 该转运蛋白的cDNA的碱基序列如序列号7所示。
本发明的以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及 其类似物的功能的蛋白质，即氨基酸转运蛋白LAT 3(L型氨基酸转 运蛋白3)以及LAT 4(L型氨基酸转运蛋白4)，具有选择性地转 运(吸收)亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等支链氨基酸以及以苯基丙 氨酸为中心的中性氨基酸的能力。
通过本发明的以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基 酸及其类似物的功能的氨基酸转运蛋白LAT 3的中性氨基酸的转送， 因支链氨基酸醇和苯基丙胺醇而受到强烈的抑制。此外，通过LAT 3 的中性氨基酸的转送因N-乙基马来酰亚胺而得到抑制。
本发明的以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及 其类似物的功能的氨基酸转运蛋白LAT 3在人体内，在胰脏、肝脏、 骨骼肌肉、心脏、骨髓、以及胎儿肝脏中显示出强烈表达，在肾脏、 胎盘、肺、小肠、卵巢、睾丸、前列腺、以及脾脏中也发现有弱表 达。
此外，本发明的以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨 基酸及其类似物的功能的氨基酸转运蛋白LAT 4在人体内，在胎盘、 肾脏、骨骼肌肉、脑、心脏、脾脏、肺、白血球、小肠中显示出强 烈表达，在肝脏和胸腺中有弱表达。
本发明是涉及利用以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性 氨基酸及其类似物的功能的氨基酸转运蛋白及其编码的基因的发 明。
即，本发明提供了包含编码以单分子形式发挥非钠依赖性转运 支链中性氨基酸及其类似物的功能的氨基酸转运蛋白的基因或编码 该基因中的蛋白质的质粒、包含在编码以单分子形式发挥非钠依赖 性转运支链中性氨基酸及其类似物的功能的氨基酸转运蛋白的基因 中14个碱基以上的部分序列或其互补序列的核苷酸，抗以单分子形 式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及其类似物的功能的氨基酸 转运蛋白的抗体。
本发明提供了使用以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性 氨基酸及其类似物的功能的氨基酸转运蛋白，检测作为被检测物质 的基质或者阻碍物质对该蛋白质所具有的相对于非钠依赖性转运支 链中性氨基酸及其类似物的功能的作用的方法。
进而，本发明提供了使用以单分子形式发挥非钠依赖性转运支 链中性氨基酸及其类似物的功能的氨基酸转运蛋白、其特异性抗体、 其功能促进物质或功能抑制物质，或者使用该编码转运蛋白的基因 的反义核苷酸，通过调节该蛋白质所具有的转运支链中性氨基酸及 其类似物的能力，控制正常细胞或肿瘤细胞的增殖，改变由该蛋白 质所转运的药物、毒物、或外来异物的药代动力学或改变通过该蛋 白质所转运的支链中性氨基酸的药代动力学或生物体内代谢的方 法。
作为本发明的以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基 酸及其类似物的功能的蛋白质，可以列举的有具有如后述序列表2、 4、6或8所示的氨基酸序列的蛋白质。
具有如序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质为来源于人肝癌细 胞株FLC 4的以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及 其类似物的功能的氨基酸转运蛋白(人LAT 3)。
具有如序列号4所示的氨基酸序列的蛋白质为来源于小鼠唾液 腺的以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及其类似物 的功能的氨基酸转运蛋白(小鼠LAT 3)。
具有如序列号6所示的氨基酸序列的蛋白质为来源于人胎儿脑 的以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及其类似物的 功能的氨基酸转运蛋白(人LAT 4)。
具有如序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质为来源于小鼠肾的 以单分子形式发挥非钠依赖性转运支链中性氨基酸及其类似物的功 能的氨基酸转运蛋白(小鼠LAT 4)。
作为本发明的蛋白质，除此之外，可以列举的有例如具有在如 序列号2、4、6或8所示的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、 取代或添加的氨基酸序列的蛋白质。氨基酸的缺失、取代或添加只 要是不丧失氨基酸转运活性的程度即可，在序列号2中，通常为1～ 约111个，优选1～约56个；在序列号4中，通常为1～约113个， 优选1～约57个；在序列号6中，通常为1～约115个，优选1～约 57个；在序列号8中，通常为1～约114个，优选1～约57个。这 类蛋白质，与序列号1和序列号2所示的氨基酸序列通常具有1～80 ％，优选1～90％氨基酸序列的同源性。
序列号2所示的氨基酸序列与作为在人前列腺中高表达的功能 未鉴定的序列而报道的POV1(Cole等著，Genomics，1998年，第51 卷，第2期，第282～287页)相同。而序列号为4、6或8所示的 氨基酸序列尚未被报导过，可以认为是新的。
作为编码本发明的以单分子形式发挥非钠依赖性地转运支链中 性氨基酸及其类似物的功能的蛋白质的基因，可以列举的有后续序 列表的序列编号1、3、5或7所示的碱基序列的基因。
序列号1所示的碱基序列表示来源于人肝癌细胞株FLC 4的以 单分子形式发挥非钠依赖性地转运支链中性氨基酸及其类似物的能 力的氨基酸转运蛋白(人LAT 3)的基因的全长cDNA碱基序列(约 2.5kbp)。
序列号2所示的碱基序列表示来源于小鼠唾液腺的以单分子形 式发挥非钠依赖性地转运支链中性氨基酸及其类似物的能力的氨基 酸转运蛋白(小鼠LAT 3)的基因的全长cDNA碱基序列(约2.5kbp)。
序列号3所示的碱基序列表示来源于人胎儿脑的以单分子形式 发挥非钠依赖性地转运支链中性氨基酸及其类似物的能力的氨基酸 转运蛋白(人LAT 4)的基因的全长cDNA碱基序列(约3.3kbp)。
序列号4所示的碱基序列表示来源于小鼠肾的以单分子形式发 挥非钠依赖性地转运支链中性氨基酸及其类似物的能力的氨基酸转 运蛋白(小鼠LAT 4)的基因的全长cDNA碱基序列(约3.2kbp)。
作为本发明的基因，除此之外，还可以列举的有：包含在严紧 的条件下与由序列号1、3、5或7所示的碱基序列所构成的DNA杂 交得到的DNA的基因。这样杂交得到的DNA只要是具有转运编码该 DNA的蛋白质的中性氨基酸的基因即可。这样的DNA通常与序列号1、 3、5或7所示的碱基序列具有70％以上的同源性，优选80％以上的 同源性。作为这样的DNA，包含在自然界中发现的变异型基因、人为 改变的变异型基因、来源于不同生物的相同基因等。
在本发明中，在严紧条件下的杂交通常可通过如下方法实施： 在37～42℃的温度下，在5×SSC或者与之相同盐浓度的杂交溶液中， 进行杂交约12小时，根据需要通过5×SSC或者与之相同盐浓度的 溶液等进行预洗涤，然后通过1×SSC或者与之相同盐浓度的溶液进 行洗涤。
可以通过使用适当的哺乳动物的组织或细胞作为基因源进行克 隆，并分离得到本发明的以单分子形式发挥功能的选择性地转运支 链中性氨基酸及其类似物的非钠依赖性氨基酸转运蛋白。作为哺乳 动物，除了狗、牛、马、山羊、绵羊、猴、猪、兔、大鼠以及小鼠 等非人类动物之外，还包括人。
基因的克隆与分离适合通过表达克隆法等(Expression Cloning)来实施。
例如，使用人肝癌细胞株FLC 4作为基因源，从中制备mRNA(poly (A)+RNA)。将其分级分离，将各级分导入爪蟾卵母细胞中。
针对导入了mRNA的卵母细胞，例如，以亮氨酸等为基质，测定 向细胞内的基质的转运(吸收)，通过选择显示了高吸收活性的mRNA 级分，可以浓缩LAT 3的mRNA。以该浓缩的mRNA为原料制造cDNA 文库。从该文库的cDNA，以500个克隆为一组，制备cRNA(帽化)， 将各个组分别导入卵母细胞中，以基质的吸收活性为指标，选择阳 性组，如果发现阳性组，将其进一步分成亚组，反复进行相同的操 作，可以得到包含LAT 3遗传基因的cDNA的克隆。
此外，LAT 4的cDNA的分离，更优选通过同源克隆法来实施。
例如，使用人胎儿脑或者小鼠肾作为基因源，使用其mRNA(poly (A)+RNA)，制作cDNA库。可以通过使用相当于可以通过EST (expressed sequence tag)(表达序列标记)数据库进行检索得 到的LAT 3类似序列(例如GenBankTM/EBI/DDBJ accession No. AW162917)的探针筛选cDNA库，得到包含LAT 4基因的cDNA。
关于所得到的cDNA，可以通过常规方法测定其碱基序列，分析 其翻译域，从而确定出由其编码的蛋白质，即LAT 3或LAT4的氨基 酸序列。
所得到的cDNA是以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中 性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白基因的cDNA，即，cDNA编码 的基因产物为以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基 酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白，可以通过例如如下方法加以验证。 即，将从所得到的LAT 3基因或LAT 4基因的cDNA制备的、与之互 补的RNA(cRNA)(帽化的)导入卵母细胞中进行表达，通过以适当 的支链中性氨基酸为基质的通常的测定支链中性氨基酸向细胞内的 转运(吸收)能力的吸收试验(Kanai和Hediger，Nature，第360 卷，第467～471页，1992年)，测定向细胞内的基质的吸收，从而 可以确认上述问题。
使用从所得到的LAT 3基因或LAT 4基因的cDNA制备的、与之 互补的RNA(cRNA)，通过体外翻译法(Hediger等，Biochim.Biophys. Acta，第1064卷，第360项，1991年)，合成LAT 3或LAT 4蛋白 质，通过电泳，可以检测蛋白质的大小、有无糖添加等。
此外，对于表达细胞，通过使用相同的吸收试验，可以研究LAT 3或LAT 4的特性，例如LAT 3进行促进扩散型的特性，LAT 3或LAT 4的基质选择性，pH依赖性等。
通过使用所得到的LAT 3基因或LAT 4基因的cDNA筛选由不同 的基因源制备的适当的cDNA文库或者染色体组DNA库，可以分离来 源于不同组织、不同生物的相同基因或染色体基因。
此外，使用基于所公开的本发明的基因的碱基序列(序列号1、 3、5或7所示的碱基序列，或其一部分)的信息所设计的合成引物， 通过常规的PCR(聚合酶链反应)法，可以从cDNA文库或染色体组 DNA文库分离基因。
可以通过例如《Molecular cloning》(Sambrook，J.，Fritsh， E.F.以及Manitis，T.著，Cold Spring Harbor Press出版，1998 年发行)中所述的方法制备cDNA文库或染色体组DNA文库等的DNA 文库。或者，也可以使用市售的文库。
可以通过例如使用对其编码的cDNA，通过基因重组技术生产本 发明的以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基酸的非 钠依赖性氨基酸转运蛋白(LAT 3或LAT 4)。例如，可以将编码LAT 3或LAT 4的DNA(cDNA等)结合到适当的表达载体中，将所得到的 适当的重组DNA导入宿主细胞中。作为用于生产多肽的表达系统(宿 主-载体系统)，可以列举的有例如细菌、酵母、昆虫细胞以及哺乳 类细胞的表达系统等。其中，为了得到功能蛋白质，优选使用昆虫 细胞以及哺乳类细胞。
例如，在通过哺乳类细胞表达多肽的情形中，将编码以单分子 形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸 转运蛋白LAT 3或LAT 4的DNA插入到适当的表达载体(例如腺病 毒类介质、逆转录酶病毒类介质、乳头瘤病毒介质、囊状病毒介质、 SV 40类介质等)中的启动子(例如细胞肥大病毒启动子、SV 40启 动子、LTR启动子、延伸1a启动子等)的下游构造表达载体。接着， 使用所得到的表达载体转化适当的动物细胞，使用适当的培养基培 养基因转化体，从而能够生产目标产物多肽。作为宿主的哺乳动物 细胞，可以列举的有猴COS-7细胞、中国大田鼠CHO细胞、人HeLa 细胞、或者小鼠S2细胞等的细胞株等。
作为编码以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基 酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3或LAT 4的DNA，可以使用具 有例如序列号为1、3、5或7所示的碱基序列的cDNA，但并不限于 上述cDNA，也可以通过设计对应于氨基酸序列的DNA、形成编码多 肽的DNA的形式来使用。这时，已知编码每个氨基酸的密码子分别 具有1～6种，可以任意选择所使用的密码子，例如通过考虑在表达 中使用的宿主的密码子使用频率，可以设计出表达效率更高的序列。 可以通过化学合成DNA、与上述cDNA的片段化结合、部分改变碱基 序列得到具有所设计的碱基序列的DNA。人为地进行碱基序列的部分 改变、变异导入，可以通过利用由编码所希望的改变的合成寡聚核 苷酸所构成的引物的定点诱变法(site specific mutagenesis) “Mark，D.F.等，Proceedings of National Academy of Sciences， 第81卷，第5662项(1984年)”等来加以实施。
通过使用本发明的以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链 中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白或者与之具有免疫学等同 性的多肽，可以得到其抗体。抗体可以用于以单分子形式发挥功能 的选择性地转运支链中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白的检 测与精制等之中。可以通过使用本发明的以单分子形式发挥功能的 选择性地转运支链中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白、其片 段、或具有其部分序列的合成多肽等作为抗原来制备抗体。可以通 过在宿主细胞(例如大鼠或兔等)中接种抗原，回收免疫血清，使 用常规方法制造多克隆抗体，可以利用常规的杂交瘤法等技术来制 造单克隆抗体。
本发明的以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基 酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3或LAT 4、其基因及其表达细 胞，可以用于关于在存在LAT 3或LAT 4的细胞膜、或推测可能存 在LAT 3或LAT 4的部位的透过率的体外试验。此外，本发明的以 单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基酸的非钠依赖性 氨基酸转运蛋白LAT 3或LAT 4、其基因及其表达细胞，可以用于开 发可有效透过LAT 3或LAT 4的细胞膜、或推测可能存在LAT 3或 LAT 4的部位的化合物。进而，本发明的以单分子形式发挥功能的选 择性地转运支链中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3或 LAT 4、其基因及其表达细胞，可以用于在LAT 3或LAT 4的细胞膜、 或推测可能存在LAT 3或LAT 4的部位的药物间相互作用的体外试 验。
通过抑制本发明的以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链 中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3或LAT 4，可以抑制 表达LAT 3或LAT 4的细胞膜、和推测可能存在LAT 3或LAT 4的 部位的特定化合物的透过。此外，本发明的以单分子形式发挥功能 的选择性地转运支链中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3或LAT 4、其基因及其表达细胞，可以用于开发对通过LAT 3或LAT 4转运的化合物的、细胞膜通过、和推测可能存在LAT 3或LAT 4 的部位的通过进行限制的药物(LAT 3或LAT 4的特异性抑制剂等)。
本发明的以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基 酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3或LAT 4、其基因及其表达细 胞，可以用于通过抑制LAT 3或LAT 4的、高水平表达LAT 3或LAT 4的细胞的增殖抑制效果的体外试验。为了达到抑制LAT 3或LAT 4 的目的，可以使用该抑制药物、或者反义寡聚DNA或特异性抗体。
此外，通过使用本发明的以单分子形式发挥功能的选择性地转 运支链中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3或LAT 4、其 基因及其表达细胞，可以用于抑制肿瘤细胞等高水平表达LAT 3或 LAT 4的细胞的增殖，并可以用于开发具有LAT 3或LAT 4的功能抑 制药物或功能抑制作用的单克隆抗体。
并且，日本专利申请特愿2003-062379号说明书中所记载的内 容全文包括在本申请说明书中。
实施例
下面，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但是本发明并 不限于这些实施例。
并且，在下述实施例中，除非特别的说明，各种操作都是通过 《Molecular cloning》(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.以及Manitis， T.著，Cold Spring Harbor Press出版，1998年发行)中所述的方 法进行的，或者，在使用市售药剂或试剂盒时，按照说明书来使用。
实施例1：以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基 酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3的人cDNA的克隆
(1)来源于人肝癌细胞株FLC 4的表达克隆
根据金井等人的方法(Kanai和Hediger，Nature，第360卷， 第467～471页，1992年)，使用表达克隆法，并按照如下步骤进行。
使用凝胶电泳分离来源于人肝癌细胞株FLC 4的poly(A)+RNA 400μg。
将通过分离得到的各个级分注入爪蟾属卵母细胞中，培养3天。
对于注入了RNA的卵母细胞，使用亮氨酸为基质，根据金井等 的方法(Kanai和Hediger，Nature，第360卷，第467～471页， 1992年)，按照如下步骤进行基质的吸收实验。使用包含14C-L-亮 氨酸(100μM)的不含Na+的吸收液[100mM氯化胆碱、2mM氯化钾、 1.8mM氯化钙、1mM氯化镁、5mM HEPES、pH 7.4]作为基质将卵 母细胞培养30分钟，通过计算细胞内吸收的放射强度来测定基质的 吸收率。并且，在该系统中，注入了来源于人肝癌细胞株FLC 4的 poly(A)+RNA(mRNA)的卵母细胞，与作为对照的注入了水的卵母 细胞相比，可以发现亮氨酸的吸收增强(图1)。
在通过分级分离得到的各个RNA级分中，注入了RNA的卵母细 胞选择显示出最高亮氨酸吸收率的级分(图1)。对于该级分的poly (A)+RNA(2.2～2.7kb)，使用cDNA合成及质粒克隆用试剂盒(商 品名：Superscript Plasmid System，ギブコ公司制造)，制备cDNA 文库。这些DNA结合到质粒pSPORT1(ギブコ公司制造)的限制酶 Sal I和Not I的识别位点中，将所得到的重组质粒DNA导入大肠杆 菌DH10B株的感受态细胞(商品名：Electro Max DH10B Competent Cell，ギブコ公司制造)中。在硝基纤维素膜上培养所得到的转化 体，平均每1个板得到约500个克隆。从这些克隆制备质粒DNA， 使用限制酶Not I将其切断。使用所得到的DNA，通过体外转录，得 到帽化的cRNA。
将所得到的cRNA(约50ng)注入到卵母细胞中。对于这些卵 母细胞，和上述一样，通过进行亮氨酸吸收实验进行阳性克隆的筛 选。在筛选时，在针对所收集的组测量从多个克隆所提取的DNA，确 认某个组中有亮氨酸吸收时，将其进一步分成多个组，进行进一步 的筛选。
对于所得到的克隆，即，包含人支链氨基酸转运蛋白LAT 3的 cDNA的克隆，通过使用用于测定碱基序列的合成引物的染色终止剂 循环测序法(Applied Biosystems公司制造)，确定cDNA的碱基序 列。
这样，可以得到人LAT 3基因的碱基序列。此外，通过常规方 法解析cDNA的碱基序列，确定cDNA的翻译域以及对其编码的LAT 3 的氨基酸序列。
该序列如后述序列表的序列号2所示。
人LAT 3与作为在人前列腺中高表达的功能未鉴定的序列报告 的POV1(Cole等著，Genomics，1998年，第51卷，第2期，第282～ 287页)显示相同的氨基酸序列。
通过TopPred 2算法(Gunnar von Heijne，J.Mol.Biol.， 225卷，487～494页(1992年))，解析LAT 3的氨基酸序列的结 果，如图2所示，推断有12个跨膜结构域(membrane-spanning domain)。此外，可以认为：在第1跨膜部位与第2跨膜部位之间 的细胞外圈中存在糖添加部位；在第6跨膜部位与第7跨膜部位之 间的长细胞内圈中存在2个蛋白激酶C依赖性磷酸化部位和1个酪 氨酸磷酸化部位；在第8跨膜部位与第9跨膜部位之间的细胞内圈 中，存在1个蛋白激酶C依赖性磷酸化部位(图2)。
(2)人的各种组织的LAT 3基因的表达(通过RNA印迹法进行 解析)
使用32P-dCTP标记相当于人LAT 3基因的第1790～1936个碱基 的cDNA片断，将其用作探针，相对于包含从人的各种组织提取的 poly(A)+RNA的多组织RNA印迹(Multiple Tissue Northern Blots (Human，Clotech公司制造))，按照如下步骤进行RNA印迹杂交。 在42℃的温度下，在包含使用32P-dCTP标记的LAT 3基因的cDNA 片断的杂交液中，对该过滤膜进行杂交1晚。在65℃温度下，使用 包含0.1％SDS的0.1×SSC将滤膜洗涤干净。
RNA印迹的结果(图3)显示，在胰脏、肝脏、骨骼肌肉、心脏、 骨髓、以及胎儿肝脏中显示出强烈表达，在肾脏、胎盘、肺、小肠、 卵巢、睾丸、前列腺、以及脾脏中也发现有弱表达。
实施例2：以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基 酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3的小鼠cDNA的鉴定
从IMAGE(Intergrated and Molecular Analysis of Genomes and their Expression)购入可以通过使用人LAT 3的翻译域的碱基序 列的EST(表达序列标记)数据库进行检索得到的、相当于与人LAT 3类似的来源于小鼠唾液腺的碱基序列(GenBankTM/EBI/DDBJ accession No.BG 865268)的cDNA克隆(IMAGE克隆：I.D.：4910149)， 使用用于碱基序列确定的合成引物，通过染色终止剂循环杂交法 (Applied Biosystems公司)，测定cDNA的全长的碱基序列。此外， 通过常规方法解析cDNA的碱基序列，确定cDNA的翻译域以及对其 编码的蛋白质的氨基酸序列。
该序列如后述序列表的序列号4所示。
小鼠LAT 3和人LAT 3的氨基酸序列的比较如图2所示。小鼠 LAT 3和人LAT 3的氨基酸序列具有82％的相同性。
实施例3：以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基 酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 3的特征
(1)人LAT 3对爪蟾属卵母细胞的功能表达
使用限制酶Not I切断含有人LAT 3的cDNA的表达质粒载体 pSPORT 1，使用T7RNA聚合酶制备cRNA(与cDNA互补的RNA)。
通过在卵母细胞中注入25ng人LAT 3基因cRNA进行表达，培 养3天。
亮氨酸的吸收实验是按照上述实施例(1)所述的方法，按照如 下步骤进行的。即，使用包含14C-L-亮氨酸(100μM)的不含Na+ 的吸收液(参阅实施例1(1))，培养注入了人LAT 3基因的cRNA 的卵母细胞、或者作为对照的注入了水的卵母细胞10分钟，测定在 细胞内的放射能量的吸收。
其结果(图4)表明，和作为对照的注入了水的卵母细胞相比， 在表达LAT 3的卵母细胞中可以得到较大的亮氨酸的吸收。已知的 转运系统L转运蛋白LAT 1和LAT 2，为了进行其功能表达，需要与 1次跨膜型辅助因子4F2hc共存，而LAT 3则不需要4F2hc，可以单 独发挥功能。
(2)人LAT 3的转运活性的盐依赖性
在使用注入了人LAT 3基因cRNA的卵母细胞的亮氨酸吸收实验 中，研究加入到培养基中的盐的影响。亮氨酸的吸收实验是使用注 入了入LAT 3基因cRNA的卵母细胞，按照上述实施例3(1)所述的 方法进行的。
吸收用溶液，在观察到钠离子的影响的情况下，使用不含Na+ 的吸收用溶液代替标准的吸收用溶液。在观察到氯离子的影响的情 况下，使用不含Cl-的吸收用溶液代替标准的吸收用溶液(使用葡糖 酸盐代替标准吸收用溶液的Cl-)。
其结果(图5)表明，即使使用胆碱代替细胞外的钠，即使将细 胞外的氯离子改变为葡糖酸盐，也不对亮氨酸的吸收产生任何影响。 由此表明，LAT 3是一种对钠离子和氯离子非依赖性地发挥作用的转 运蛋白。
(3)人LAT 3的动力学试验
进行选择性地转运支链中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋 白LAT 3的动力学试验。通过研究由于基质亮氨酸的浓度的不同而 导致的吸收率的变化，进行LAT 3的动力学试验。
亮氨酸的吸收实验是在亮氨酸的浓度为1、3、10、30、60、100、 200、400、1000、2000、3000μM的条件下，使用注入了人LAT 3 基因cRNA的卵母细胞，根据上述实施例3(1)所述的方法进行的。 其结果(图6)表明，亮氨酸的吸收显示为依赖于浓度的饱和性吸收， 从而确认是通过转运蛋白转运的。此外，还可以看出通过LAT 3的 亮氨酸的转送是由高亲和性成分和低亲和性成分组成的(图6的插 图)。
(4)人LAT 3的基质选择性(由于加入氨基酸或其类似物的阻 碍实验)
在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨酸的实验 中，研究向系统添加各种氨基酸及其类似物的影响。
亮氨酸的吸收实验是使用注入了人LAT 3基因cRNA的卵母细胞， 根据上述实施例3(1)所述的方法进行的。但是，使用不含Na+的 吸收用溶液，在10mM的各种化合物(非标记)的存在或不存在的 条件下，测定14C-亮氨酸(100μM)的吸收。
其结果(图7)显示，通过异亮氨酸、缬氨酸、苯基丙氨酸、甲硫 氨酸，可以观察到强烈的顺式(cis-)阻碍效果。酸性氨基酸(天 冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)以及脯氨酸， 对通过LAT 3的14C-亮氨酸的吸收没有影响。
在D-氨基酸中，利用D-亮氨酸，可以得到通过LAT 3的14C-亮 氨酸的吸收的较强烈的抑制效果(图8)。
对作为转运系统特异性抑制药物BCH(2-氨基双环-(2，2，1)- 庚烷-2-羧酸)、AIB(α-氨基异丁酸)、MeAIB(α-(氨基甲基) 异丁酸)的效果进行了研究，通过LAT 3的14C-亮氨酸的吸收受到转 运系统特异性抑制药物BCH的强烈抑制，从而显示LAT 3是转运系 统L转运蛋白(图9)。
通过LAT 3的14C-亮氨酸的吸收受到亮氨醇的强烈抑制(图10)。 此外，缬氨醇、苯基丙氨醇也显示出较强的14C-亮氨酸的吸收抑制效 果(图10)。异戊基核纤层蛋白、1，3-二甲基-正丁胺、亮氨酸甲酯、 N-乙酰基亮氨酸、异丁胺、苯基乙胺也具有明显的抑制效果(图10)。
针对通过LAT 3的14C-亮氨酸的吸收，研究了各种阴离子性化 合物的影响。其结果(图11)显示，通过赭曲霉毒素A、吲哚美辛 可以观察到强烈的抑制效果。此外，羟苯磺胺和水杨酸也显示出较 微弱的抑制效果。
(5)人LAT 3的基质选择性(以各种氨基酸及其类似物作为基 质的吸收试验)
以各种氨基酸及其类似物作为基质，研究了利用LAT 3的吸收。
各种氨基酸及其类似物的吸收试验是使用注入了人LAT 3基因 cRNA的卵母细胞，根据上述实施例3(1)所述的方法进行的。但是， 作为基质，使用转化为14C-亮氨酸，进行放射标记了的各种化合物。
其结果(图12)表明，在使用L-亮氨酸(14C化合物)、L-异 亮氨酸(14C化合物)、L-缬氨酸(14C化合物)、L-苯基丙氨酸(14C 化合物)为基质的情形中，可以确认对卵母细胞具有较大的吸收。 此外，在以L-甲硫氨酸(14C化合物)、L-酪氨酸(14C化合物)、 L-脯氨酸(14C化合物)为基质的情形中，可以确认对卵母细胞具有 明显的吸收。在使用D-亮氨酸(14C化合物)为基质的情形中，也可 以确认对卵母细胞具有明显的吸收。赭曲霉毒素A可以强烈抑制通 过LAT 3的14C-亮氨酸的吸收，因此，赭曲霉毒素A(14C化合物) 不能通过LAT 3转送。
(6)人LAT 3的转送活性的pH依赖性
在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨酸的实验 中，研究了pH的影响。
亮氨酸的吸收试验是使用注入了人LAT 3基因cRNA的卵母细胞， 根据上述实施例3(1)所述的方法进行的。
其结果表明，在亮氨酸吸收中，在pH为7.0～8.5时显示出稳 定的值，可以认为生理学的pH是该转运蛋白的最合适的pH(图13)。
(7)通过人LAT 3的氨基酸的释放试验
在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞中，研究了通过预 负荷的14C-亮氨酸的LAT 3释放的影响。
在注入了LAT 3基因的cRNA的卵母细胞中注入100nl的400 μM 14C-亮氨酸(2nCi)，在冰冷的不含亮氨酸的不含Na+的吸收 溶液洗涤干净之后，转移到室温(18℃～22℃)的添加或未添加的 亮氨酸(1mM)的不含Na+的吸收用溶液中，测定细胞外释放出的 14C-亮氨酸的量。此外，作为对照，在用于代替注入了LAT 3基因的 cRNA的卵母细胞的水的卵母细胞中，同样地注入100nl的400μM 14C-亮氨酸(2nCi)，同样地测量细胞外释放出的14C-亮氨酸的量。
其结果表明，即使在人LAT 3中未在细胞外添加亮氨酸的情形， 也可以观察到14C-亮氨酸的明显的释放，虽然其释放通过在细胞外添 加亮氨酸仅有轻微的上升，但是没有较大的变化(图14)。与此相 反，在用于代替注入了LAT 3基因的cRNA的卵母细胞的水的卵母细 胞中，无论有无向细胞外添加亮氨酸，都没有观察到14C-亮氨酸的明 显的释放(图14)。因此，LAT 3虽然残留有包含轻微的交换转运 模式的可能性，但是主要可以得出LAT 3为促进扩散型转运的转运 蛋白的结论。
(8)N-乙基马来酰亚胺的影响
在利用注入人LAT 3基因的cRNA的卵母细胞中，研究了N-乙基 马来酰亚胺对于14C-亮氨酸的吸收的影响。
使用包含14C-L-亮氨酸(100μM)的不含Na+的吸收用溶液(参 阅实施例3(2))，对注入了人LAT 3基因cRNA的卵母细胞、注入 了人LAT 3基因cRNA与4F2hc基因cRNA的卵母细胞、或者作为对 照注入了水的卵母细胞培养10分钟，根据实施例3(1)所述的方法 测定向细胞内的放射能量的吸收。这时，研究了进行15分钟的5mM 的N-乙基马来酰亚胺的前处理、以及在吸收用溶液中的有无含有5 mM的N-乙基马来酰亚胺对14C-亮氨酸的吸收量的影响。
其结果表明，通过N-乙基马来酰亚胺的前处理，利用LAT 3的 14C-L-亮氨酸的吸收几乎完全被抑制(图15)。该N-乙基马来酰亚 胺的效果与吸收用溶液中的N-乙基马来酰亚胺的存在的有无无关。 与此相反，利用LAT 1的14C-L-亮氨酸吸收，不受到N-乙基马来酰 亚胺的影响(图15)。
(9)人前列腺癌以及人肾癌的LAT 3的表达
按照常规方法，使用吸附纯化LAT 3抗血清(2μg/ml)对人前 列腺癌和人肾癌外科手术摘除标本的石蜡切片进行处理，通过联苯 胺显色。此外，为了研究染色的特异性，可以进行在200g/ml的 抗原肽的存在下通过吸附纯化抗LAT 3抗血清(2μg/ml)进行处理 的实验。
其结果表明，对于人前列腺癌(图16A)和人肾癌(图16C)， 可以观察到与肿瘤细胞抑制的LAT 3的染色。在抗原肽的存在下使 LAT 3抗体作用的情形中未检测到该染色，显示出染色的特异性(图 16B和D)。
(10)小鼠LAT 3功能的确认
使用Not I将实施例2所得到的小鼠LAT 3的cDNA切断，并使 用SP6RNA聚合酶制备了cRNA。测定在卵母细胞中表达了小鼠LAT 3 基因的cRNA的14C-亮氨酸的吸收。
通过在卵母细胞中注入了25ng小鼠LAT 3基因的cRNA进行表 达，并培养3天。对于注入了小鼠LAT 3基因的cRNA的卵母细胞， 使用亮氨酸为基质，按照实施例3(1)进行基质的吸收实验。
其结果表明，亮氨酸的吸收，和人LAT 3一样，在表达小鼠LAT 3的卵母细胞中，和作为对照的注入了水的卵母细胞相比，可以观察 到较大的亮氨酸的吸收。进而，小鼠LAT 3和人LAT 3一样都显示 出基质选择性。
实施例4：以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨 基酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 4的人及小鼠cDNA的鉴定
(1)LAT4的cDNA的鉴定
从IMAGE(Intergrated and Molecular Analysis of Genomes and their Expression)购入可以通过使用人LAT 3的翻译域的碱基序 列的EST(表达序列标记)数据库进行检索得到的、相当于与人LAT 3类似的来源于人胎儿脑的碱基序列(GenBankTM/EBI/DDBJ accession No.AW 162917)的cDNA克隆(IMAGE克隆：I.D.：2783525)， 以及相当于与人LAT 3类似的来源于小鼠肾的碱基序列 (GenBankTM/EBI/DDBJ accession No.AW 106550)的cDNA克隆 (IMAGE克隆：I.D.：2235970)，使用用于碱基序列确定的合成引 物，通过染色终止剂循环杂交法(Applied Biosystems公司)，确 定cDNA的全长的碱基序列。此外，通过常规方法解析cDNA的碱基 序列，确定cDNA的翻译域以及对其编码的蛋白质的氨基酸序列。
该人序列如后述序列表的序列号3所示，小鼠序列如后述序列 表的序列号4所示。
人LAT 3和人LAT 4的氨基酸序列的比较如图17所示。人LAT 3 和人LAT 4的氨基酸序列具有58％的相同性。
人LAT3和小鼠LAT 4的氨基酸序列的比较如图18所示。人LAT 3和小鼠LAT 4的氨基酸序列具有90％的相同性。
(2)入以及小鼠的各种组织的LAT 4基因的表达(通过RNA印 迹法进行解析)
使用32P-dCTP标记相当于人LAT 4基因的第307-1012个碱基的 cDNA片断，将其用作探针，相对于包含从人的各种组织提取的poly (A)+RNA的多组织RNA印迹(Multiple Tissue Northern Blots (Human，Clotech公司制造))，按照如下步骤进行RNA印迹杂交。 在42℃的温度下，在包含使用32P-dCTP标记的LAT 4基因的cDNA 片断的杂交液中，对该过滤膜进行1晚杂交。在65℃温度下，使用 包含0.1％SDS的0.1×SSC洗涤干净。
RNA印迹的结果(图24)显示，在胎盘、肾脏、骨骼肌肉中显 示出强烈表达，在白血球、脑、心脏、脾脏、小肠、肺、以及大肠 中也发现有弱表达，在胸腺及肝脏中发现有更弱的表达。
使用32P-dCTP标记相当于小鼠LAT 4基因的第122-525个碱基 的cDNA片断，将其用作探针，相对于从小鼠的各种组织提取的RNA， 按照如下步骤进行RNA印迹法。使用1％琼脂糖/甲醛凝胶对3μg的 poly(A)+RNA进行电泳，然后转移到硝基纤维素膜中。在42℃的 温度下，在包含使用32P-dCTP标记的小鼠LAT 4的cDNA片断的杂交 液中，对该过滤膜进行杂交1夜。在65℃温度下，使用包含0.1％ SDS的0.1×SSC洗涤干净。
RNA印迹的结果(图25)显示，在肾脏、胎盘、脑、小肠中显 示出强烈表达。
实施例5：以单分子形式发挥功能的选择性地转运支链中性氨基 酸的非钠依赖性氨基酸转运蛋白LAT 4的特征
(1)小鼠LAT 4对爪蟾属卵母细胞的功能表达
使用限制酶XbaI切断表达小鼠LAT 4的cDNA的质粒载体 pcDNA3.1(+)，使用T7RNA聚合酶制备cRNA(与cDNA互补的RNA)。
通过在卵母细胞中注入25ng小鼠LAT 4基因cRNA进行表达， 培养3天。
亮氨酸的吸收实验是按照上述实施例3(1)所述的方法，按照 如下步骤进行的。即，使用包含14C-L-亮氨酸(100μM)的不含Na +的吸收液(参阅实施例3(1))，培养注入了小鼠LAT 4基因的 cRNA的卵母细胞、或者作为对照的注入了水的卵母细胞10分钟，测 定在细胞内的放射能量的吸收。
其结果显示，和作为对照的注入了水的卵母细胞相比，在表达 LAT 4的卵母细胞中可以得到较大的亮氨酸的吸收。和LAT 3一样， 与已知的转运系统L转运蛋白LAT 1和LAT 2不同，LAT 4不需要 4F2hc，可以单独发挥功能。
(2)小鼠LAT 4的转运活性的盐依赖性
在使用注入了小鼠LAT 4的cRNA的卵母细胞的亮氨酸吸收实验 中，研究加入到培养基中的盐的影响。亮氨酸的吸收实验是使用注 入了小鼠LAT 4基因cRNA的卵母细胞，按照上述实施例3(1)所述 的方法进行的。
在观察到钠离子的影响的情况下，吸收用溶液使用不含Na+的 吸收用溶液代替标准的吸收用溶液。在观察到氯离子的影响的情况 下，吸收用溶液使用不含Cl-的吸收用溶液代替标准的吸收用溶液 (使用葡糖酸盐代替标准吸收用溶液的Cl-)。
其结果(图19)表明，即使使用胆碱代替细胞外的钠，即使将 细胞外的氯离子改变为葡糖酸盐，也不对亮氨酸的吸收产生任何影 响。由此表明，LAT 4是一种对钠离子和氯离子非依赖性地发挥作用 的转运蛋白。
(3)小鼠LAT 4的动力学试验
进行了选择性地转运支链中性氨基酸的非钠依赖性氨基酸转运 蛋白LAT 4的动力学试验。通过研究由于基质亮氨酸的浓度的不同 而导致的吸收率的变化，进行LAT 4的动力学试验。
亮氨酸的吸收试验是在亮氨酸的浓度为0.01、0.03、0.1、0.3、 1、3、10mM的条件下，使用注入了小鼠LAT 4基因cRNA的卵母细胞， 根据上述实施例3(1)所述的方法进行的。其结果表明，亮氨酸的 吸收显示为依赖于浓度的饱和性吸收，从而确认是通过转运蛋白转 运的。此外，还可以看出通过LAT 4的亮氨酸的转送是由高亲和性 成分和低亲和性成分组成的，与通过LAT 3的亮氨酸的转送一样。
(4)小鼠LAT 4的基质选择性(由于加入氨基酸或其类似物的 阻碍试验)
在利用注入小鼠LAT 4基因的cRNA的卵母细胞吸收亮氨酸的实 验中，研究了向系统添加各种氨基酸及其类似物的影响。
亮氨酸的吸收实验是使用注入了小鼠LAT 4基因cRNA的卵母细 胞，根据上述实施例3(1)所述的方法进行的。但是，使用不含Na +的吸收用溶液，在10mM的各种化合物(非标记)的存在或不存在 的条件下，测定14C-亮氨酸(100μM)的吸收。
其结果(图20)显示，通过异亮氨酸、缬氨酸、苯基丙氨酸、 甲硫氨酸，可以观察到强烈的顺式(cis-)阻碍效果。酸性氨基酸 (天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)以及脯氨 酸，对通过LAT 4的14C-亮氨酸的吸收没有影响。
在D-氨基酸中，利用D-亮氨酸、D-组氨酸、D-甲硫氨酸，可以 得到通过LAT4的14C-亮氨酸的吸收的较强烈的抑制效果(图21)。
对作为转运系统特异性抑制药物BCH(2-氨基双环-(2，2，1)- 庚烷-2-羧酸)、AIB(α-氨基异丁酸)、MeAIB(α-(氨基甲基) 异丁酸)的效果进行了研究，通过LAT 4的14C-亮氨酸的吸收受到转 运系统特异性抑制药物BCH的强烈抑制，从而显示LAT 4是转运系 统L转运蛋白。
(5)小鼠LAT 4的基质选择性(以各种氨基酸及其类似物作为 基质的吸收试验)
以各种氨基酸及其类似物作为基质，研究利用LAT 4的吸收。
各种氨基酸及其类似物的吸收实验是使用注入了小鼠LAT 4基 因cRNA的卵母细胞，根据上述实施例3(1)所述的方法进行的。但 是，作为基质，使用转化为14C-亮氨酸，进行放射标记了的各种化合 物。
其结果(图23)表明，在使用L-亮氨酸(14C化合物)、L-异 亮氨酸(14C化合物)、L-缬氨酸(14C化合物)、L-苯基丙氨酸(14C 化合物)、L-甲硫氨酸(14C化合物)为基质的情形中，可以确认对 卵母细胞具有较大的吸收。在使用D-亮氨酸(14C化合物)为基质的 情形中，也可以确认对卵母细胞具有明显的吸收。
(6)人LAT 4的功能的确认
使用Xho I将实施例4所得到的人LAT 4的cDNA切断，并使用 T3RNA聚合酶制备cRNA。测定在卵母细胞中表达了人LAT 4基因的 cRNA的14C-亮氨酸的吸收。
通过在卵母细胞中注入了25ng人LAT 4基因的cRNA进行表达， 并培养3天。对于注入了人LAT 4基因的cRNA的卵母细胞，使用亮 氨酸为基质，按照实施例3(1)进行基质的吸收实验。
其结果表明，亮氨酸的吸收，和小鼠LAT 4一样，在表达人LAT 4的卵母细胞中，和作为对照的注入了水的卵母细胞相比，可以观察 到较大的亮氨酸的吸收。进而，人LAT 4和小鼠LAT 4一样都显示 出基质选择性。
工业实用性
本发明的以单分子形式发挥功能的支链中性氨基酸转运蛋白， 能够在体外研究在该转运蛋白的表达部位中的支链氨基酸以及包含 药物或外来异物的氨基酸类似物的药代动力学，并能够基于此在体 外推测这些化合物的药代动力学。进而，可以认为可用于开发充分 有效地通过该转运蛋白的表达部位的药物。此外，本发明的以单分 子形式发挥功能的支链中性氨基酸转运蛋白还可通过调节转运具有 该转运蛋白的支链中性氨基酸及其类似物的能力，从而能够用于开 发调节氨基酸代谢的方法和控制正常细胞和肿瘤细胞的细胞增殖的 方法。此外，该转运蛋白还可作为肿瘤抗原，用作区分肿瘤细胞和 正常细胞的手段。
序列表
<110>Human Cell Systems，Inc.
<120>以单分子形式发挥功能的支链中性氨基酸转运蛋白
<130>JA905237
<150>JP2003-062379
<151>2003-03-07
<160>8
<170>专利版本3.1
<210>1
<211>2525
<212>DNA
<213>现代人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(257)..(1936)
<223>
<220>
<221>
<223>LAT3
<400>1
gcttcgcaga cctctggcgc ccggcgggtt cccagttccc ccgcttcttc cgaggagaca     60
gcggaggcga ggccaccggg ctgtcaggct gaagctccgt ggcggccggg tcctgcacgc    120
agagaagacc ccagcgccgg cgcggctcag ggctgggccc acgggactcc ggacgcgccg    180
cgaaagcgtt gcgctcccgg aggcgtccgc agctgctggc tgctcatttg ccggtgaccg    240
gaggctcggg gccagc atg gcc ccc acg ctg caa cag gcg tac cgg agg cgc    292
                  Met Ala Pro Thr Leu Gln Gln Ala Tyr Arg Arg Arg
                  1               5                   10
tgg tgg atg gcc tgc acg gct gtg ctg gag aac ctc ttc ttc tct gct      340
Trp Trp Met Ala Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Phe Phe Ser Ala
        15                  20                  25
gta ctc ctg ggc tgg ggc tcc ctg ttg atc att ctg aag aac gag ggc      388
Val Leu Leu Gly Trp Gly Ser Leu Leu Ile Ile Leu Lys Asn Glu Gly
    30                  35                  40
ttc tat tcc agc acg tgc cca gct gag agc agc acc aac acc acc cag      436
Phe Tyr Ser Ser Thr Cys Pro Ala Glu Ser Ser Thr Asn Thr Thr Gln
45                  50                  55                  60
gat gag cag cgc agg tgg cca ggc tgt gac cag cag gac gag atg ctc    484
Asp Glu Gln Arg Arg Trp Pro Gly Cys Asp Gln Gln Asp Glu Met Leu
                65                  70                  75
aac ctg ggc ttc acc att ggt tcc ttc gtg ctc agc gcc acc acc ctg    532
Asn Leu Gly Phe Thr Ile Gly Ser Phe Val Leu Ser Ala Thr Thr Leu
            80                  85                  90
cca ctg ggg atc ctc atg gac cgc ttt ggc ccc cga ccc gtg cgg ctg    580
Pro Leu Gly Ile Leu Met Asp Arg Phe Gly Pro Arg Pro Val Arg Leu
        95                  100                 105
gtt ggc agt gcc tgc ttc act gcg tcc tgc acc ctc atg gcc ctg gcc    628
Val Gly Ser Ala Cys Phe Thr Ala Ser Cys Thr Leu Met Ala Leu Ala
    110                 115                 120
tcc cgg gac gtg gaa gct ctg tct ccg ttg ata ttc ctg gcg ctg tcc    676
Ser Arg Asp Val Glu Ala Leu Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ser
125                 130                 135                 140
ctg aat ggc ttt ggt ggc atc tgc cta acg ttc act tca ctc acg ctg    724
Leu Asn Gly Phe Gly Gly Ile Cys Leu Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu
                145                 150                 155
ccc aac atg ttt ggg aac ctg cgc tcc acg tta atg gcc ctc atg att    772
Pro Asn Met Phe Gly Asn Leu Arg Ser Thr Leu Met Ala Leu Met Ile
            160                 165                 170
ggc tct tac gcc tct tct gcc att acg ttc cca gga atc aag ctg atc    820
Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile
        175                 180                 185
tac gat gcc ggt gtg gcc ttc gtg gtc atc atg ttc acc tgg tct ggc    868
Tyr Asp Ala Gly Val Ala Phe Val Val Ile Met Phe Thr Trp Ser Gly
    190                 195                 200
ctg gcc tgc ctt atc ttt ctg aac tgc acc ctc aac tgg ccc atc gaa    916
Leu Ala Cys Leu Ile Phe Leu Asn Cys Thr Leu Asn Trp Pro Ile Glu
205                 210                 215                 220
gcc ttt cct gcc cct gag gaa gtc aat tac acg aag aag atc aag ctg    964
Ala Phe Pro Ala Pro Glu Glu Val Asn Tyr Thr Lys Lys Ile Lys Leu
                225                 230                 235
agt ggg ctg gcc ctg gac cac aag gtg aca ggt gac ctc ttc tac acc   1012
Ser Gly Leu Ala Leu Asp His Lys Val Thr Gly Asp Leu Phe Tyr Thr
            240                 245                 250
cat gtg acc acc atg ggc cag agg ctc agc cag aag gcc ccc agc ctg   1060
His Val Thr Thr Met Gly Gln Arg Leu Ser Gln Lys Ala Pro Ser Leu
        255                 260                 265
gag gac ggt tcg gat gcc ttc atg tca ccc cag gat gtt cgg ggc acc   1108
Glu Asp Gly Ser Asp Ala Phe Met Ser Pro Gln Asp Val Arg Gly Thr
    270                 275                 280
tca gaa aac ctt cct gag agg tct gtc ccc tta cgc aag agc ctc tgc   1156
Ser Glu Asn Leu Pro Glu Arg Ser Val Pro Leu Arg Lys Ser Leu Cys
285                 290                 295                 300
tcc ccc act ttc ctg tgg agc ctc ctc acc atg ggc atg acc cag ctg    1204
Ser Pro Thr Phe Leu Trp Ser Leu Leu Thr Met Gly Met Thr Gln Leu
                305                 310                 315
cgg atc atc ttc tac atg gct gct gtg aac aag atg ctg gag tac ctt    1252
Arg Ile Ile Phe Tyr Met Ala Ala Val Asn Lys Met Leu Glu Tyr Leu
            320                 325                 330
gtg act ggt ggc cag gag cat gag aca aat gaa cag caa caa aag gtg    1300
Val Thr Gly Gly Gln Glu His Glu Thr Asn Glu Gln Gln Gln Lys Val
        335                 340                 345
gca gag aca gtt ggg ttc tac tcc tcc gtc ttc ggg gcc atg cag ctg    1348
Ala Glu Thr Val Gly Phe Tyr Ser Ser Val Phe Gly Ala Met Gln Leu
    350                 355                 360
ttg tgc ctt ctc acc tgc ccc ctc att ggc tac atc atg gac tgg cgg    1396
Leu Cys Leu Leu Thr Cys Pro Leu Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp Arg
365                 370                 375                 380
atc aag gac tgc gtg gac gcc cca act cag ggc act gtc ctc gga gat    1444
Ile Lys Asp Cys Val Asp Ala Pro Thr Gln Gly Thr Val Leu Gly Asp
                385                 390                 395
gcc agg gac ggg gtt gct acc aaa tcc atc aga cca cgc tac tgc aag    1492
Ala Arg Asp Gly Val Ala Thr Lys Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Cys Lys
            400                 405                 410
atc caa aag ctc acc aat gcc atc agt gcc ttc acc ctg acc aac ctg    1540
Ile Gln Lys Leu Thr Asn Ala Ile Ser Ala Phe Thr Leu Thr Asn Leu
        415                 420                 425
ctg ctt gtg ggt ttt ggc atc acc tgt ctc atc aac aac tta cac ctc    1588
Leu Leu Val Gly Phe Gly Ile Thr Cys Leu Ile Asn Asn Leu His Leu
    430                 435                 440
cag ttt gtg acc ttt gtc ctg cac acc att gtt cga ggt ttc ttc cac    1636
Gln Phe Val Thr Phe Val Leu His Thr Ile Val Arg Gly Phe Phe His
445                 450                 455                 460
tca gcc tgt ggg agt ctc tat gct gca gtg ttc cca tcc aac cac ttt    1684
Ser Ala Cys Gly Ser Leu Tyr Ala Ala Val Phe Pro Ser Asn His Phe
                465                 470                 475
ggg acg ctg aca ggc ctg cag tcc ctc atc agt gct gtg ttc gcc ttg    1732
Gly Thr Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ala Val Phe Ala Leu
            480                 485                 490
ctt cag cag cca ctt ttc atg gcg atg gtg gga ccc ctg aaa gga gag    1780
Leu Gln Gln Pro Leu Phe Met Ala Met Val Gly Pro Leu Lys Gly Glu    
        495                 500                 505
ccc ttc tgg gtg aat ctg ggc ctc ctg cta ttc tca ctc ctg gga ttc    1828
Pro Phe Trp Val Asn Leu Gly Leu Leu Leu Phe Ser Leu Leu Gly Phe
    510                 515                 520
ctg ttg cct tcc tac ctc ttc tat tac cgt gcc cgg ctc cag cag gag      1876
Leu Leu Pro Ser Tyr Leu Phe Tyr Tyr Arg Ala Arg Leu Gln Gln Glu
525                 530                 535                 540
tac gcc gcc aat ggg atg ggc cca ctg aag gtg ctt agc ggc tct gag      1924
Tyr Ala Ala Asn Gly Met Gly Pro Leu Lys Val Leu Ser Gly Ser Glu
                545                 550                 555
gtg acc gca tag acttctcaga ccaagggacc tggatgacag gcaatcaagg          1976
Val Thr Ala
cctgagcaac caaaaggagt gccccatatg gcttttctac ctgtaacatg cacatagagc    2036
catggccgta gatttataaa taccaagaga agttctattt ttgtaaagac tgcaaaaagg    2096
aggaaaaaaa accttcaaaa acgcccccta agtcaacgct ccattgactg aagacagtcc    2156
ctatcctaga ggggttgagc tttcttcctc cttgggttgg aggagaccag ggtgcctctt    2216
atctccttct agcggtctgc ctcctggtac ctcttggggg gatcggcaaa caggctaccc    2276
ctgaggtccc atgtgccatg agtgtgcaca catgcatgtg tctgtgtatg tgtgaatgtg    2336
agagagacac agccctcctt tcagaaggaa aggggcctga ggtgccagct gtgtcctggg    2396
ttaggggttg ggggtcggcc ccttccaggg ccaggagggc aggttccctc tctggtgctg    2456
ctgcttgcaa gtcttagagg aaataaaaag ggaagtgaga gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    2516
aaaaaaaaa                                               2525
<210>2
<211>559
<212>PRT
<213>现代人
<220>
<221>
<223>LAT3
<400>2
Met Ala Pro Thr Leu Gln Gln Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala
1               5                   10                  15
Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Phe Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly
            20                  25                  30
Trp Gly Ser Leu Leu Ile Ile Leu Lys Asn Glu Gly Phe Tyr Ser Ser
        35                  40                  45
Thr Cys Pro Ala Glu Ser Ser Thr Asn Thr Thr Glu Asp Glu Gln Arg
    50                  55                  60
Arg Trp Pro Gly Cys Asp Gln Gln Asp Glu Met Leu Asn Leu Gly Phe
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gly Ser Phe Val Leu Ser Ala Thr Thr Leu Pro Leu Gly Ile
                85                  90                  95
Leu Met Asp Arg Phe Gly Pro Arg Pro Val Arg Leu Val Gly Ser Ala
            100                 105                 110
Cys Phe Thr Ala Ser Cys Thr Leu Met Ala Leu Ala Ser Arg Asp Val
        115                 120                 125
Glu Ala Leu Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ser Leu Asn Gly Phe
    130                 135                 140
Gly Gly Ile Cys Leu Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe
145                 150                 155                 160
Gly Asn Leu Arg Ser Thr Leu Met Ala Leu Met Ile Gly Ser Tyr Ala
                165                 170                 175
Ser Ser Ala Ile Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Ala Gly
            180                 185                 190
Val Ala Phe Val Val Ile Met Phe Thr Trp Ser Gly Leu Ala Cys Leu
        195                 200                 205
Ile Phe Leu Asn Cys Thr Leu Asn Trp Pro Ile Glu Ala Phe Pro Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Glu Val Asn Tyr Thr Lys Lys Ile Lys Leu Ser Gly Leu Ala
225                 230                 235                 240
Leu Asp His Lys Val Thr Gly Asp Leu Phe Tyr Thr His Val Thr Thr
                245                 250                 255
Met Gly Gln Arg Leu Ser Gln Lys Ala Pro Ser Leu Glu Asp Gly Ser
            260                 265                 270
Asp Ala Phe Met Ser Pro Gln Asp Val Arg Gly Thr Ser Glu Asn Leu
        275                 280                 285
Pro Glu Arg Ser Val Pro Leu Arg Lys Ser Leu Cys Ser Pro Thr Phe
    290                 295                 300
Leu Trp Ser Leu Leu Thr Met Gly Met Thr Gln Leu Arg Ile Ile Phe
305                 310                 315                 320
Tyr Met Ala Ala Val Asn Lys Met Leu Glu Tyr Leu Val Thr Gly Gly
                325                 330                 335
Gln Glu His Glu Thr Asn Glu Gln Gln Gln Lys Val Ala Glu Thr Val
            340                 345                 350
Gly Phe Tyr Ser Ser Val Phe Gly Ala Met Gln Leu Leu Cys Leu Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Pro Leu Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp Arg Ile Lys Asp Cys
    370                 375                 380
Val Asp Ala Pro Thr Gln Gly Thr Val Leu Gly Asp Ala Arg Asp Gly
385                 390                 395                 400
Val Ala Thr Lys Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Cys Lys Ile Gln Lys Leu
                405                 410                 415
Thr Asn Ala Ile Ser Ala Phe Thr Leu Thr Asn Leu Leu Leu Val Gly
            420                 425                 430
Phe Gly Ile Thr Cys Leu Ile Asn Asn Leu His Leu Gln Phe Val Thr
        435                 440                 445
Phe Val Leu His Thr Ile Val Arg Gly Phe Phe His Ser Ala Cys Gly
    450                 455                 460
Ser Leu Tyr Ala Ala Val Phe Pro Ser Asn His Phe Gly Thr Leu Thr
465                 470                 475                 480
Gly Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ala Val Phe Ala Leu Leu Gln Gln Pro
                485                 490                 495
Leu Phe Met Ala Met Val Gly Pro Leu Lys Gly Glu Pro Phe Trp Val
            500                 505                 510
Asn Leu Gly Leu Leu Leu Phe Ser Leu Leu Gly Phe Leu Leu Pro Ser
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Tyr Leu Phe Tyr Tyr Arg Ala Arg Leu Gln Gln Glu Tyr Ala Ala Asn
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Gly Met Gly Pro Leu Lys Val Leu Ser Gly Ser Glu Val Thr Ala
545                 550                 555
<210>3
<211>2519
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(257)..(1951)
<223>
<220>
<221>
<223>LAT3
<400>3
ggcttcacct atctgtggcg ccaggacggt tcccagatcc actgcttctt tcgagggcgc     60
agacgaggtg agaccggcgg ttccgaggcc cgctgggtct ggcacgcagg gaagacaccc    120
cgcgtggatg cgatttggaa ttgggatcct gggtctcagg agatccggag tgtggaagcg  180
ccggggagac tctgtgttac tccgggtgtc aacagctgcg ggaggcaagt ttgtcgggga  240
cagagtctcg gccacc atg gct ccc acg ctg aag cag gcg tac cgc agg cgc  292
                  Met Ala Pro Thr Leu Lys Gln Ala Tyr Arg Arg Arg
                  1               5                   10
tgg tgg atg gct tgc acc gct gtg gtg gag aac ctc ttc ttc tcc gcg    340
Trp Trp Met Ala Cys Thr Ala Val Val Glu Asn Leu Phe Phe Ser Ala
        15                  20                  25
gtg ctc ctg ggc tgg gcc tcc ctg ctg atc atg ctc aag aag gaa ggc    388
Val Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Lys Glu Gly
    30                  35                  40
ttc tat tcc agc ctg tgc cca gct gag aac agg acc aat acc acc caa    436
Phe Tyr Ser Ser Leu Cys Pro Ala Glu Asn Arg Thr Asn Thr Thr Gln
45                  50                  55                  60
gat gaa cag cat cag tgg aca agc tgt gac cag cag gaa aag atg ctc    484
Asp Glu Gln His Gln Trp Thr Ser Cys Asp Gln Gln Glu Lys Met Leu
                65                  70                  75
aac ctg ggt ttc acc att ggc tcc ttc ctg ctg agt gct acc aca ctg    532
Asn Leu Gly Phe Thr Ile Gly Ser Phe Leu Leu Ser Ala Thr Thr Leu
            80                  85                  90
cct ctg gga att ctc atg gac cgc ttt ggg ccc agg cct ctt cga ctg    580
Pro Leu Gly Ile Leu Met Asp Arg Phe Gly Pro Arg Pro Leu Arg Leu
        95                  100                 105
gtg ggc agt gcc tgc ttt gcc gca tcc tgc act cta atg gcc ttg gcc    628
Val Gly Ser Ala Cys Phe Ala Ala Ser Cys Thr Leu Met Ala Leu Ala
    110                 115                 120
tcc agg gac act gaa gtt ttg tct cca ttg ata ttc ctg gca ctg tcc    676
Ser Arg Asp Thr Glu Val Leu Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ser
125                 130                 135                 140
ttg aat gga ttt gct ggc atc tgc tta acg ttt acc tca ctc acg ctg    724
Leu Asn Gly Phe Ala Gly Ile Cys Leu Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu
                145                 150                 155
ccc aac atg ttt ggg aat ttg cga tcc act ttc atg gcc ctc atg att    772
Pro Asn Met Phe Gly Asn Leu Arg Ser Thr Phe Met Ala Leu Met Ile
            160                 165                 170
ggc tcc tat gcg tct tct gcc atc acg ttc cct gga atc aag ctg atc    820
Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile
        175                 180                 185
tac gat gcc gga gtc ccc ttc act gtc atc atg ttc aca tgg tct ggc    868
Tyr Asp Ala Gly Val Pro Phe Thr Val Ile Met Phe Thr Trp Ser Gly
    190                 195                 200
ctg gcc tgt ctc atc ttt ttg aac tgt gct ctc aac tgg cct gca gaa    916
Leu Ala Cys Leu Ile Phe Leu Asn Cys Ala Leu Asn Trp Pro Ala Glu
205                 210                 215                 220
gcc ttt cct gcc cct gag gaa gtt gac tac acg aag aag atc aaa ctc     964
Ala Phe Pro Ala Pro Glu Glu Val Asp Tyr Thr Lys Lys Ile Lys Leu
                225                 230                 235
att ggg tta gcc ttg gac cac aag gtc aca ggt gac cgc ttc tac acc    1012
Ile Gly Leu Ala Leu Asp His Lys Val Thr Gly Asp Arg Phe Tyr Thr
            240                 245                 250
cat gta acc att gtg ggt cag cgg ctg agt cag aag tcc ccc agc ctg    1060
His Val Thr Ile Val Gly Gln Arg Leu Ser Gln Lys Ser Pro Ser Leu
        255                 260                 265
gag gag ggc gct gac gcc ttt att tca tcc ccg gat atc cct ggt acc    1108
Glu Glu Gly Ala Asp Ala Phe Ile Ser Ser Pro Asp Ile Pro Gly Thr
    270                 275                 280
tca gag gag act cct gaa aag tct gtc cct ttt cgc aag agc ctc tgc    1156
Ser Glu Glu Thr Pro Glu Lys Ser Val Pro Phe Arg Lys Ser Leu Cys
285                 290                 295                 300
tcc ccc att ttc ctg tgg agc ctt gtc acc atg ggc atg acc cag ctt    1204
Ser Pro Ile Phe Leu Trp Ser Leu Val Thr Met Gly Met Thr Gln Leu
                305                 310                 315
cgg gtc atc ttc tat atg ggt gct atg aac aag atc ctg gag ttc att    1252
Arg Val Ile Phe Tyr Met Gly Ala Met Asn Lys Ile Leu Glu Phe Ile
            320                 325                 330
gtg act ggt ggc aag gaa cgt gag aca aat gag cag aga cag aag gtg    1300
Val Thr Gly Gly Lys Glu Arg Glu Thr Asn Glu Gln Arg Gln Lys Val
        335                 340                 345
gag gag aca gtt gag ttc tac tct tcc atc ttt gga gtc atg cag ctg    1348
Glu Glu Thr Val Glu Phe Tyr Ser Ser Ile Phe Gly Val Met Gln Leu
    350                 355                 360
ttg tgt ctt ctc acc tgc ccc ctc att ggc tac atc atg gac tgg cgc    1396
Leu Cys Leu Leu Thr Cys Pro Leu Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp Arg
365                 370                 375                 380
atc aag gac tgt gtg gat gct cca acg gag ggc acc ctg aat gag aat    1444
Ile Lys Asp Cys Val Asp Ala Pro Thr Glu Gly Thr Leu Asn Glu Asn
                385                 390                 395
gct tcc ttt gga gat gcc aga gat ggg gct agc acc aag ttc act aga    1492
Ala Ser Phe Gly Asp Ala Arg Asp Gly Ala Ser Thr Lys Phe Thr Arg
            400                 405                 410
cca cgc tac cgc aag gta caa aag ctc acc aat gcc atc aat gcc ttc    1540
Pro Arg Tyr Arg Lys Val Gln Lys Leu Thr Asn Ala Ile Asn Ala Phe
        415                 420                 425
acc ctg acc aac atc ctg ctt gtg ggt ttc ggc atc gcc tgc ctc atc    1588
Thr Leu Thr Asn Ile Leu Leu Val Gly Phe Gly Ile Ala Cys Leu Ile
    430                 435                 440
aag aac tta cac ctg cag ttg ctg gcc ttt gtc ctg cat acc ata gtt    1636
Lys Asn Leu His Leu Gln Leu Leu Ala Phe Val Leu His Thr Ile Val
445                 450                 455                 460
cgc ggt ttc ttc cac tca gcc tgt gga ggt ctc tac gct gct gtg ttc    1684
Arg Gly Phe Phe His Ser Ala Cys Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Val Phe
                465                 470                 475
ccg tcc aat cat ttt ggg aca ctg aca ggt ctt cag tct ctc atc agt    1732
Pro Ser Asn His Phe Gly Thr Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Ile Ser
            480                 485                 490
gcc gtg ttt gct ctg ctg caa cag cta ctc ttc atg gcc atg gtg gga    1780
Ala Val Phe Ala Leu Leu Gln Gln Leu Leu Phe Met Ala Met Val Gly
        495                 500                 505
ccc ctg cat gga gat ccc ttc tgg gtg aac ctg ggc ctc cta ctt ctc    1828
Pro Leu His Gly Asp Pro Phe Trp Val Asn Leu Gly Leu Leu Leu Leu
    510                 515                 520
tcg ttc ctg gga ttt ctc cta cct tcc tac ctc tac tac tac cgg tct    1876
Ser Phe Leu Gly Phe Leu Leu Pro Ser Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Arg Ser
525                 530                 535                 540
cgc ctg cag aga gag tat gcc acc aat ttg gta gac cca cag aag gtg    1924
Arg Leu Gln Arg Glu Tyr Ala Thr Asn Leu Val Asp Pro Gln Lys Val
                545                 550                 555
ctc aat act tcg aag gtg gct aca tag actcctgagg ccaagagact            1971
Leu Asn Thr Ser Lys Val Ala Thr
            560
tggaggacag gcagtcaagg cctgataaac cgaagggaat ggcctgtggc tttctacctg    2031
catcgtgttc atagagccgg gttctgtgga tttataaata ctaagagttc tatttttgta    2091
gggacttgca aaaaaggaaa caaacagaac aaaaccccca aaccaaaaac agcccttaaa    2151
aaactccccc caaccaagct atccatcaac tgaagacagt gcccgttcca gtggtattgg    2211
gccatcgtct ttgaaaagaa agtgtggggc tgccctttct ccacacttgg cctaggagcc    2271
tctgtggagt tgccttctga aaactcatgg gatcagtgaa cagaccacac taagattcca    2331
gccgccaagt gtgcacacat atatgttacg cacatgcata ttgcatcctt tcctgcagga    2391
gaaggactga ggggctggct gtatccagga tggggtgtgg gggctggagg gcgggttccc    2451
tccctgatgc tgtttcttac aggtcttaga ggaaataaaa agggaaatga aaaaaaaaaa    2511
aaaaaaaa                                                             2519
<210>4
<211>564
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>
<223>LAT3
<400>4
Met Ala Pro Thr Leu Lys Gln Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala
1               5                   10                  15
Cys Thr Ala Val Val Glu Asn Leu Phe Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly
            20                  25                  30
Trp Ala Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Lys Glu Gly Phe Tyr Ser Ser
        35                  40                  45
Leu Cys Pro Ala Glu Asn Arg Thr Asn Thr Thr Gln Asp Glu Gln His
    50                  55                  60
Gln Trp Thr Ser Cys Asp Gln Gln Glu Lys Met Leu Asn Leu Gly Phe
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gly Ser Phe Leu Leu Ser Ala Thr Thr Leu Pro Leu Gly Ile
                85                  90                  95
Leu Met Asp Arg Phe Gly Pro Arg Pro Leu Arg Leu Val Gly Ser Ala
            100                 105                 110
Cys Phe Ala Ala Ser Cys Thr Leu Met Ala Leu Ala Ser Arg Asp Thr
        115                 120                 125
Glu Val Leu Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ser Leu Asn Gly Phe
    130                 135                 140
Ala Gly Ile Cys Leu Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe
145                 150                 155                 160
Gly Asn Leu Arg Ser Thr Phe Met Ala Leu Met Ile Gly Ser Tyr Ala
                165                 170                 175
Ser Ser Ala Ile Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Ala Gly
            180                 185                 190
Val Pro Phe Thr Val Ile Met Phe Thr Trp Ser Gly Leu Ala Cys Leu
        195                 200                 205
Ile Phe Leu Asn Cys Ala Leu Asn Trp Pro Ala Glu Ala Phe Pro Ala
    210                 215                 220
Pro Glu Glu Val Asp Tyr Thr Lys Lys Ile Lys Leu Ile Gly Leu Ala
225                 230                 235                 240
Leu Asp His Lys Val Thr Gly Asp Arg Phe Tyr Thr His Val Thr Ile
                245                 250                 255
Val Gly Gln Arg Leu Ser Gln Lys Ser Pro Ser Leu Glu Glu Gly Ala
            260                 265                 270
Asp Ala Phe Ile Ser Ser Pro Asp Ile Pro Gly Thr Ser Glu Glu Thr
        275                 280                 285
Pro Glu Lys Ser Val Pro Phe Arg Lys Ser Leu Cys Ser Pro Ile Phe
    290                 295                 300
Leu Trp Ser Leu Val Thr Met Gly Met Thr Gln Leu Arg Val Ile Phe
305                 310                 315                 320
Tyr Met Gly Ala Met Asn Lys Ile Leu Glu Phe Ile Val Thr Gly Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Arg Glu Thr Asn Glu Gln Arg Gln Lys Val Glu Glu Thr Val
            340                 345                 350
Glu Phe Tyr Ser Ser Ile Phe Gly Val Met Gln Leu Leu Cys Leu Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Pro Leu Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp Arg Ile Lys Asp Cys
    370                 375                 380
Val Asp Ala Pro Thr Glu Gly Thr Leu Asn Glu Asn Ala Ser Phe Gly
385                 390                 395                 400
Asp Ala Arg Asp Gly Ala Ser Thr Lys Phe Thr Arg Pro Arg Tyr Arg
                405                 410                 415
Lys Val Gln Lys Leu Thr Asn Ala Ile Asn Ala Phe Thr Leu Thr Asn
            420                 425                 430
Ile Leu Leu Val Gly Phe Gly Ile Ala Cys Leu Ile Lys Asn Leu His
        435                 440                 445
Leu Gln Leu Leu Ala Phe Val Leu His Thr Ile Val Arg Gly Phe Phe
    450                 455                 460
His Ser Ala Cys Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Val Phe Pro Ser Asn His
465                 470                 475                 480
Phe Gly Thr Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ala Val Phe Ala
                485                 490                 495
Leu Leu Gln Gln Leu Leu Phe Met Ala Met Val Gly Pro Leu His Gly
            500                 505                 510
Asp Pro Phe Trp Val Asn Leu Gly Leu Leu Leu Leu Ser Phe Leu Gly
        515                 520                 525
Phe Leu Leu Pro Ser Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Arg Ser Arg Leu Gln Arg
    530                 535                 540
Glu Tyr Ala Thr Asn Leu Val Asp Pro Gln Lys Val Leu Asn Thr Ser
545                 550                 555                 560
Lys Val Ala Thr
<210>5
<211>3271
<212>DNA
<213>现代人
<220>
<221>CDS
<222>(308)..(2029)
<223>
<220>
<221>
<223>LAT4
<400>5
gtcagggtcc ctgggagagg cagccctcgg atctgcccct gcccacctca cgctgcgttc   60
catgctggcc ccaggcgatg tcagtcctgc tgcaggccag gactagttcc acggccctga  120
gcatgcgtta gccccttctt gcctccatgc ctcagtttac ctcggagtga gctgcgggag  180
acgtctccct gcctggccgg ggcggctctg tcgtagcgga gggcagcggt acgagccggc  240
cgcgggctcg gggtgtccca ggtggtgcag agccggagcc ggagccggag ccgcgccgcg  300
ccgcacc atg gcg ccc acc ctg gcc act gcc cat cgg cgc cgc tgg tgg    349
        Met Ala Pro Thr Leu Ala Thr Ala His Arg Arg Arg Trp Trp
        1               5                   10
atg gcc tgc acg gcc gtg ctg gag aac ctc ctc ttc tcg gca gtc ctc    397
Met Ala Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Leu Phe Ser Ala Val Leu
15                  20                  25                  30
ctg ggc tgg ggc tcg ctg ctc atc atg ctc aag tca gag ggc ttt tac    445
Leu Gly Trp Gly Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Ser Glu Gly Phe Tyr
                35                  40                  45
tcc tac ctg tgt acc gag cca gag aat gtc acc aat ggc aca gtg ggc    493
Ser Tyr Leu Cys Thr Glu Pro Glu Asn Val Thr Asn Gly Thr Val  Gly
            50                  55                  60
ggc aca gca gag ccg ggg cac gag gag gtg agc tgg atg aac ggc tgg    541
Gly Thr Ala Glu Pro Gly His Glu Glu Val Ser Trp Met Asn Gly Trp
        65                  70                  75
ctc agc tgc cag gcc cag gac gag atg cta aat ttg gcc ttc act gtg    589
Leu Ser Cys Gln Ala Gln Asp Glu Met Leu Asn Leu Ala Phe Thr Val
    80                  85                  90
ggc tcc ttt ctg ctc agt gcc atc acc ctg ccc ctg ggt atc gtc atg    637
Gly Ser Phe Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Pro Leu Gly Ile Val Met
95                  100                 105                 110
gac aag tat ggc ccg agg aag ctc agg ctg ctg ggc agc gcc tgc ttc    685
Asp Lys Tyr Gly Pro Arg Lys Leu Arg Leu Leu Gly Ser Ala Cys Phe
                115                 120                 125
gcg gtt tcc tgc ttg ctg att gcg tac gga gca agt aaa cca aac gct    733
Ala Val Ser Cys Leu Leu Ile Ala Tyr Gly Ala Ser Lys Pro Asn Ala
            130                 135                 140
ctc tcc gtg ctc atc ttc atc gcc ctg gct ctg aat ggc ttt ggt ggg    781
Leu Ser Val Leu Ile Phe Ile Ala Leu Ala Leu Asn Gly Phe Gly Gly
        145                 150                 155
atg tgt atg acc ttc acc tca tta aca ctg ccc aac atg ttc ggc gac    829
Met Cys Met Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe Gly Asp
    160                 165                 170
ctt cgg tcc acg ttt att gcc ttg atg att ggg tcc tac gcc tcc tcg    877
Leu Arg Ser Thr Phe Ile Ala Leu Met Ile Gly Ser Tyr Ala Ser Ser
175                 180                 185                 190
gca gtc acc ttt cca gga atc aag ctc atc tat gat gct ggt gtc tcc    925
Ala Val Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Ala Gly Val Ser
                195                 200                 205
ttc atc gtc gtc ctc gtg gtc tgg gcc ggc tgc tcc ggg ctg gtt ttc    973
Phe Ile Val Val Leu Val Val Trp Ala Gly Cys Ser Gly Leu Val Phe
            210                 215                 220
ctc aac tgc ttc ttt aac tgg ccc ctt gag ccc ttc ccg ggg ccg gag    1021
Leu Asn Cys Phe Phe Asn Trp Pro Leu Glu Pro Phe Pro Gly Pro Glu
        225                 230                 235
gac atg gac tac tcg gtg aag atc aag ttc agc tgg ctg ggc ttt gac    1069
Asp Met Asp Tyr Ser Val Lys Ile Lys Phe Ser Trp Leu Gly Phe Asp
    240                 245                 250
cac aag atc aca ggg aag cag ttc tac aag cag gtg acc acg gtg ggc    1117
His Lys Ile Thr Gly Lys Gln Phe Tyr Lys Gln Val Thr Thr Val Gly
255                 260                 265                 270
cgg cgc ctg agt gtg ggc agc tcc atg agg agt gcc aag gag cag gtg    1165
Arg Arg Leu Ser Val Gly Ser Ser Met Arg Ser Ala Lys Glu Gln Val
                275                 280                 285
gcg ctg cag gag ggc cac aag ctg tgc ctg tcc acc gtc gac ctg gag    1213
Ala Leu Gln Glu Gly His Lys Leu Cys Leu Ser Thr Val Asp Leu Glu
            290                 295                 300
gtg aag tgc cag ccg gat gcc gca gtg gcc ccc tcc ttc atg cac agc    1261
Val Lys Cys Gln Pro Asp Ala Ala Val Ala Pro Ser Phe Met His Ser
        305                 310                 315
gtg ttc agc ccc atc ctg ctg ctc agc ctg gtc acc atg tgc gtc acg    1309
Val Phe Ser Pro Ile Leu Leu Leu Ser Leu Val Thr Met Cys Val Thr
    320                 325                 330
cag ctg cgg ctc atc ttc tac atg ggg gct atg aac aac atc ctc aag    1357
Gln Leu Arg Leu Ile Phe Tyr Met Gly Ala Met Asn Asn Ile Leu Lys
335                 340                 345                 350
ttc ctg gtc agc ggc gac cag aag aca gtg atg gcc acg gtt ggc ctc    1405
Phe Leu Val Ser Gly Asp Gln Lys Thr Val Met Ala Thr Val Gly Leu
                355                 360                 365
tac acc tcc atc ttc ggc gtg ctc cag ctg ctg tgc ctg ctg acg gcc    1453
Tyr Thr Ser Ile Phe Gly Val Leu Gln Leu Leu Cys Leu Leu Thr Ala
            370                 375                 380
ccc gtc att ggc tac atc atg gac tgg agg ctg aag gag tgt gaa gac    1501
Pro Val Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp Arg Leu Lys Glu Cys Glu Asp
        385                 390                 395
gcc tcc gag gag ccc gag gag aaa gac gcc aac caa ggc gag aag aaa    1549
Ala Ser Glu Glu Pro Glu Glu Lys Asp Ala Asn Gln Gly Glu Lys Lys
    400                 405                 410
aag aag aag cgg gac cgg cag atc cag aag atc act aat gcc atg cgg    1597
Lys Lys Lys Arg Asp Arg Gln Ile Gln Lys Ile Thr Asn Ala Met Arg
415                 420                 425                 430
gcc ttc gcc ttc acc aac ctg ctg ctc gtg ggc ttt ggg gtg acc tgc    1645
Ala Phe Ala Phe Thr Asn Leu Leu Leu Val Gly Phe Gly Val Thr Cys
                435                 440                 445
ctc att ccc aac ctg cct ctc cag atc ctc tcc ttc atc ctg cac aca    1693
Leu Ile Pro Asn Leu Pro Leu Gln Ile Leu Ser Phe Ile Leu His Thr
            450                 455                 460
atc gtg cga gga ttc atc cac tcc gct gtc ggg ggc ctg tac gct gcc    1741
Ile Val Arg Gly Phe Ile His Ser Ala Val Gly Gly Leu Tyr Ala Ala
        465                 470                 475
gtg tac ccc tcc acc cag ttc ggc agc ctc acg gga ctg cag tct ctg    1789
Val Tyr Pro Ser Thr Gln Phe Gly Ser Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu
    480                 485                 490
atc agc gcg ctc ttc gcc ctt ctg cag cag ccg ctg ttt ctg gcc atg    1837
Ile Ser Ala Leu Phe Ala Leu Leu Gln Gln Pro Leu Phe Leu Ala Met
495                 500                 505                 510
atg ggt cct ctc cag gga gac cct ctg tgg gtg aac gtg ggg ctg ctc    1885
Met Gly Pro Leu Gln Gly Asp Pro Leu Trp Val Asn Val Gly Leu Leu
                515                 520                 525
ctt ctc agc ctg ctg ggc ttc tgc ctc ccg ctc tac ctg atc tgc tac    1933
Leu Leu Ser Leu Leu Gly Phe Cys Leu Pro Leu Tyr Leu Ile Cys Tyr
            530                 535                 540
cgg cgc cag ctg gag cgg cag ctg cag cag agg cag gag gat gac aaa    1981
Arg Arg Gln Leu Glu Arg Gln Leu Gln Gln Arg Gln Glu Asp Asp Lys
        545                 550                 555
ctc ttc ctc aaa atc aac ggc tcg tcc aac cag gag gcc ttc gtg tag    2029
Leu Phe Leu Lys Ile Asn Gly Ser Ser Asn Gln Glu Ala Phe Val
    560                 565                 570
tggctgccgc ctcggaactg cggtctcctg cctgtgcttc agtgactgac ccctgtcctg    2089
cccctccaga gtaccccacg cacccccagg accttcgccg tctccgtgcc agcgttcacg    2149
ctccctcccg gggccctgcc tcggagctct gtggtggaag gacgggagag ggccccggac    2209
acgcgagttt tctcctgccg aacgcagggg ctgccctgac tttgctctgc cgccccccgg    2269
ggacccgggg cctggggtct ctgtggtgcc tgcagcagga gccaggaacg cccggcaggc    2329
aggcgctctc ccgccagtgt ctggattctg cctcttgcca aagcagaggg ggctgccatc    2389
ccctgcctgc cacctgcccc tcggctgcat gcccacagcc atacctgcct gaggacaaag    2449
gcttgcactg tctcgcctgc gcctggcccc caccccctcc ccggccagcc tgaggctgcc    2509
tgaggaagga aggacccgct tcctgttgtc ggtgctaatt cctttgtaat tccagccccc    2569
tgtcgcctgt ccagggcctg cccacccgtt ggaggccggt ggagaagccc cacctggctt    2629
atgccctgga gagggtttag cgggctgggt ggacccctcg cctcctcccc gagggccaat    2689
gccgcggaca cgttttcact gtcaccctcg ttctgtctgc cacctgaagg gaatttgagg    2749
accgccgcca gggcaccccg tacatacaca cagctgcttt tgtggaggtg gacgaaaggc    2809
tgtggccggc agacgtggag gtccaggccg gggtggggac gtgggtgggt ccgaggggtg    2869
tgtggggtcg gggtgggctc taggagttag cccttatccc cactgaccag gcgggagccg  2929
ccaggcctgc agctgggcca gtgcccagga gccatcctgg cgtggggcca ggagcttgtc  2989
caaggccaca ggcccacagc accccctgcc ggcgggctcc gtggggccct ggagctgatg  3049
acgggggagg cccgtccgcc tggcccacca acccgcccac cttgactgcc cccagaagtg  3109
tgtcttgaga cctcctgggc gtgcttagag gggtgagttg tgtttggatt tttagttatt  3169
ttctcttcag ttttattaga cttctttttt ataaagcaat aaatccattt tcctccgggt  3229
aagggatgcc ccttctggca tatcaaaaaa aaaaaaaaaa aa                     3271
<210>6
<211>573
<212>PRT
<213>现代人
<220>
<221>
<223>LAT4
<400>6
Met Ala Pro Thr Leu Ala Thr Ala His Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala
1               5                   10                  15
Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Leu Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly
            20                  25                  30
Trp Gly Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Ser Glu Gly Phe Tyr Ser Tyr
        35                  40                  45
Leu Cys Thr Glu Pro Glu Asn Val Thr Asn Gly Thr Val Gly Gly Thr
    50                  55                  60
Ala Glu Pro Gly His Glu Glu Val Ser Trp Met Asn Gly Trp Leu Ser
65                  70                  75                  80
Cys Gln Ala Gln Asp Glu Met Leu Asn Leu Ala Phe Thr Val Gly Ser
                85                  90                  95
Phe Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Pro Leu Gly Ile Val Met Asp Lys
            100                 105                 110
Tyr Gly Pro Arg Lys Leu Arg Leu Leu Gly Ser Ala Cys Phe Ala Val
        115                 120                 125
Ser Cys Leu Leu Ile Ala Tyr Gly Ala Ser Lys Pro Asn Ala Leu Ser
    130                 135                 140
Val Leu Ile Phe Ile Ala Leu Ala Leu Asn Gly Phe Gly Gly Met Cys
145                 150                 155                 160
Met Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe Gly Asp Leu Arg
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Ile Ala Leu Met Ile Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Val
            180                 185                 190
Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Ala Gly Val Ser Phe Ile
        195                 200                 205
Val Val Leu Val Val Trp Ala Gly Cys Ser Gly Leu Val Phe Leu Asn
    210                 215                 220
Cys Phe Phe Asn Trp Pro Leu Glu Pro Phe Pro Gly Pro Glu Asp Met
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Ser Val Lys Ile Lys Phe Ser Trp Leu Gly Phe Asp His Lys
                245                 250                 255
Ile Thr Gly Lys Gln Phe Tyr Lys Gln Val Thr Thr Val Gly Arg Arg
            260                 265                 270
Leu Ser Val Gly Ser Ser Met Arg Ser Ala Lys Glu Gln Val Ala Leu
        275                 280                 285
Gln Glu Gly His Lys Leu Cys Leu Ser Thr Val Asp Leu Glu Val Lys
    290                 295                 300
Cys Gln Pro Asp Ala Ala Val Ala Pro Ser Phe Met His Ser Val Phe
305                 310                 315                 320
Ser Pro Ile Leu Leu Leu Ser Leu Val Thr Met Cys Val Thr Gln Leu
                325                 330                 335
Arg Leu Ile Phe Tyr Met Gly Ala Met Asn Asn Ile Leu Lys Phe Leu
            340                 345                 350
Val Ser Gly Asp Gln Lys Thr Val Met Ala Thr Val Gly Leu Tyr Thr
        355                 360                 365
Ser Ile Phe Gly Val Leu Gln Leu Leu Cys Leu Leu Thr Ala Pro Val
    370                 375                 380
Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp Arg Leu Lys Glu Cys Glu Asp Ala Ser
385                 390                 395                 400
Glu Glu Pro Glu Glu Lys Asp Ala Asn Gln Gly Glu Lys Lys Lys Lys
                405                 410                 415
Lys Arg Asp Arg Gln Ile Gln Lys Ile Thr Asn Ala Met Arg Ala Phe
            420                 425                 430
Ala Phe Thr Asn Leu Leu Leu Val Gly Phe Gly Val Thr Cys Leu Ile
        435                 440                 445
Pro Asn Leu Pro Leu Gln Ile Leu Ser Phe Ile Leu His Thr Ile Val
    450                 455                 460
Arg Gly Phe Ile His Ser Ala Val Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Val Tyr
465                 470                 475                 480
Pro Ser Thr Gln Phe Gly Ser Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Ile Ser
                485                 490                 495
Ala Leu Phe Ala Leu Leu Gln Gln Pro Leu Phe Leu Ala Met Met Gly
            500                 505                 510
Pro Leu Gln Gly Asp Pro Leu Trp Val Asn Val Gly Leu Leu Leu Leu
        515                 520                 525
Ser Leu Leu Gly Phe Cys Leu Pro Leu Tyr Leu Ile Cys Tyr Arg Arg
    533                 535                 540
Gln Leu Glu Arg Gln Leu Gln Gln Arg Gln Glu Asp Asp Lys Leu Phe
545                 550                 555                 560
Leu Lys Ile Asn Gly Ser Ser Asn Gln Glu Ala Phe Val
                565                 570
<210>7
<211>3236
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(123)..(1829)
<223>
<220>
<221>
<223>LAT4
<400>7
agaaaaggcg ccgggcgggc ccgatacaca ctggtaggag ccgggtgagc tggactccca     60
ggatccgggt ctcagacgag ggtgtctgca gaaccggagc ccgaccaccg ccacaccgca    120
cc atg gcg ccc acc ctg gcc act gcc cat cgg cgc cgc tgg tgg atg       167
   Met Ala Pro Thr Leu Ala Thr Ala His Arg Arg Arg Trp Trp Met
   1               5                   10                  15
gcc tgc acc gct gtg ttg gaa aac ctc ctt ttc tcc gca gtc ctc ctg      215
Ala Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Leu Phe Ser Ala Val Leu Leu
                20                  25                  30
ggc tgg ggt tcg ctg ctc atc atg ctc aag tcc gag ggc ttt tac tcc      263
Gly Trp Gly Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Ser Glu Gly Phe Tyr Ser
            35                  40                  45
tac ctg tgt acg aag cca gag aat gtc act aac agc acg gtc ggg ggc    311
Tyr Leu Cys Thr Lys Pro Glu Asn Val Thr Asn Ser Thr Val Gly Gly
        50                  55                  60
agc gca gag ccg gaa ccc gag gag ttg agc ctg gtg aat ggc tgg ctc    359
Ser Ala Glu Pro Glu Pro Glu Glu Leu Ser Leu Val Asn Gly Trp Leu
    65                  70                  75
agc tgt aag gcc cag gat gag att ctg aat ttg gcc ttc acc gtg ggc    407
Ser Cys Lys Ala Gln Asp Glu Ile Leu Asn Leu Ala Phe Thr Val Gly
80                  85                  90                  95
tcc ttc ctg ctc agt gcc atc acc ctg cct ctg ggc atc atc atg gac    455
Ser Phe Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Pro Leu Gly Ile Ile Met Asp
                100                 105                 110
aag tat ggt cca agg aag ctc agg ctg ctg ggc agt gct tgc ttt gct    503
Lys Tyr Gly Pro Arg Lys Leu Arg Leu Leu Gly Ser Ala Cys Phe Ala
            115                 120                 125
gtc tcc tgc ttg ctg att gca tat gga gca agt aac cca gac tcg ctc    551
Val Ser Cys Leu Leu Ile Ala Tyr Gly Ala Ser Asn Pro Asp Ser Leu
        130                 135                 140
tct gtg ctc atc ttt atc gcc ttg gct ctg aac ggc ttt ggg ggg atg    599
Ser Val Let Ile Phe Ile Ala Leu Ala Leu Asn Gly Phe Gly Gly Met
    145                 150                 155
tgc atg acg ttc act tcg tta aca ctg ccc aat atg ttc ggc gac ctt    647
Cys Met Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe Gly Asp Leu
160                 165                 170                 175
cgg tcc aca ttt att gcc ttg atg att gga tcc tac gct tcc tca gca    695
Arg Ser Thr Phe Ile Ala Leu Met Ile Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala
                180                 185                 190
gtt acc ttc cca gga ata aag ctc atc tac gac gct ggc gcc tcc ttc    743
Val Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Ala Gly Ala Ser Phe
            195                 200                 205
att ggc atc cta gtg gtc tgg gct ggc tgc tct ggc ctg gtt ttt ttc    791
Ile Gly Ile Leu Val Val Trp Ala Gly Cys Ser Gly Leu Val Phe Phe
        210                 215                 220
aac tgt ttc ttc aac tgg cca ctc gag ccc ttc cca ggc tca gag gac    839
Asn Cys Phe Phe Asn Trp Pro Leu Glu Pro Phe Pro Gly Ser Glu Asp
    225                 230                 235
atg gac tac tcg gtg aag atc aag ttc agc tgg cta ggc ttt gac cac    887
Met Asp Tyr Ser Val Lys Ile Lys Phe Ser Trp Leu Gly Phe Asp His
240                 245                 250                 255
aag atc aca ggg aag cag ttc tac aag cag gtg acc aca gtg ggg cgc    935
Lys Ile Thr Gly Lys Gln Phe Tyr Lys Gln Val Thr Thr Val Gly Arg
                260                 265                 270
cgt ctg agc gtg ggc agc tct atg cgg act gcc aag gag caa gcc gcc    983
Arg Leu Ser Val Gly Ser Ser Met Arg Thr Ala Lys Glu Gln Ala Ala
            275                 280                 285
ctg cag gag ggc cac aag ctg tgt ctg tcc act gtg gac ctg gag gtg    1031
Leu Gln Glu Gly His Lys Leu Cys Leu Ser Thr Val Asp Leu Glu Val
        290                 295                 300
aag tgc cag cct gat gct gca gcg gcc cca tcg ttt atg cac agt gtg    1079
Lys Cys Gln Pro Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser Phe Met His Ser Val
    305                 310                 315
ttc agc ccc ctc ctg gtg ctc agc ctg gtc acc atg tgt gtc aca cag    1127
Phe Ser Pro Leu Leu Val Leu Ser Leu Val Thr Met Cys Val Thr Gln
320                 325                 330                 335
ctg cga ctt atc ttc tac atg ggg gct atg aac agc atc ctt gag ttc    1175
Leu Arg Leu Ile Phe Tyr Met Gly Ala Met Asn Ser Ile Leu Glu Phe
                340                 345                 350
ctg gtc agg ggg gac cag aag aca gtt gcc ctc tat acc tcc atc ttt    1223
Leu Val Arg Gly Asp Gln Lys Thr Val Ala Leu Tyr Thr Ser Ile Phe
            355                 360                 365
ggc gca ctc cag ctg ctc tgc ctg ctg aca gct cct gtc atc ggc tac    1271
Gly Ala Leu Gln Leu Leu Cys Leu Leu Thr Ala Pro Val Ile Gly Tyr
        370                 375                 380
atc atg gac tgg aag ctg aaa gag tgt gaa gat act tca gag gag cct    1319
Ile Met Asp Trp Lys Leu Lys Glu Cys Glu Asp Thr Ser Glu Glu Pro
    385                 390                 395
gag gag gaa gaa ggc act caa ggt gaa aag aag cag aaa cga gac agg    1367
Glu Glu Glu Glu Gly Thr Gln Gly Glu Lys Lys Gln Lys Arg Asp Arg
400                 405                 410                 415
cag att cag aaa gtc acg aat gcc atg cgg gcc ttc gcc ttt aca aac    1415
Gln Ile Gln Lys Val Thr Asn Ala Met Arg Ala Phe Ala Phe Thr Asn
                420                 425                 430
gtg ctg ctt gtg ggt ttt ggg gtg acc tgc ctc att ccc aac ctg cct    1463
Val Leu Leu Val Gly Phe Gly Val Thr Cys Leu Ile Pro Asn Leu Pro
            435                 440                 445
cta cag atc ttc tcc ttc gtc ctg cac aca att gtg cga gga ttc atc    1511
Leu Gln Ile Phe Ser Phe Val Leu His Thr Ile Val Arg Gly Phe Ile
        450                 455                 460
cac tct gcc gta ggg ggc cta tac gct gcc gtg tac ccc tcc aca cag    1559
His Ser Ala Val Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Val Tyr Pro Ser Thr Gln
    465                 470                 475
ttt ggt agc ctc act gga ctg cag tcc ctg gtc agt gcg ctc ttt gct    1607
Phe Gly Ser Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Val Ser Ala Leu Phe Ala
480                 485                 490                 495
ctc ctg cag cag ccg ctg tat ctg gcc atg atg ggt cct ctg gga gga    1655
Leu Leu Gln Gln Pro Leu Tyr Leu Ala Met Met Gly Pro Leu Gly Gly
                500                 505                 510
gac cct ctg tgg gtg aac gtg ggt ctg ctc gcc atg agc atg ctg ggc    1703
Asp Pro Leu Trp Val Asn Val Gly Leu Leu Ala Met Ser Met Leu Gly
            515                 520                 525
ttc tgc ctg ccc ctt tac ctc atc tgc tac cgg cgc cag ctg gag agg    1751
Phe Cys Leu Pro Leu Tyr Leu Ile Cys Tyr Arg Arg Gln Leu Glu Arg
        530                 535                 540
cag ctg cag cag aag agg gaa gac agc aag ctg ttc ctt aag atc aat    1799
Gln Leu Gln Gln Lys Arg Glu Asp Ser Lys Leu Phe Leu Lys Ile Asn
    545                 550                 555
ggc tca tcc aac cgg gag gct ttc gtg tag tgcccaccca ccgcctcagt      1849
Gly Ser Ser Asn Arg Glu Ala Phe Val
560                 565
tgtggcctcc tgcctgtgct tcagtgactg actgcagtca tctccccacc ccagaggacc    1909
tcatgctctc cctggatcct gcccttcacc acactggagc ccatacttcc tcagaaccac    1969
ctggccctgc cgtggagtgc tggtgtggag ggacaggaga gggcctggga caagtgaacc    2029
tcccactgcc agaagctggg ctgccctggc ctagctgtca ccccaggggc tctgaagtct    2089
cccgatctcc atggggcttg tacctggagc caaggggacc ttttcagcga gcatttcttt    2149
ctttttattt tttctttctc tttctcactg atcggattct gcctcttgcc aaagcagagg    2209
ggcctgccat cctccagcac actacctgtc cctgagctgc acgcccacca accacgccca    2269
cctgaggaca aaggcttgcg ctgtctgcac tccccttgct tggcccctta cctcccctgg    2329
ccagtctggc tgcctgagga aggaaggacc cgcttcctgt tgttggtgct aacccctttg    2389
tcatcccaac acccccctgc ccgtggctag tctctggccc ctcttttcct tgaaagcctg    2449
agaagaagcc ccccctgtct caggctgggg aaggagtgga gggcagacta tttacacaaa    2509
gcctcaagag ccctgggcca ggcttcttcc tccggagcca gagcagtgtc tctctgctgg    2569
cacgctttgt tccagtctgc aacctgaagg gaactaaggg gacaccacaa gggcaccctc    2629
ccatccaccc acagctgttt ttctggggtg gaaataaggc tgtgactaga catgaggagc    2689
caagcctaaa tagggaagag gattagtgag taacccgagg ggtgtgtgtt tatgtggtac    2749
gtgtgtgtgc atgtgtgtat atggtaggag gctagcccca ggggctgctt ttatcagagt    2809
ggaccagacc agaagccagc cagccctaca gcaggctcaa aataggagtc agccttgctt    2869
tatgatgggg acctgtgtgt atcggtgtga tcacagtgcc ccctgctggc agactcacat    2929
caggggactg gaacggttca tgtagtagaa gcctagccgg cctgcctggc tcactaaccc    2989
accttgcctt gacaacccct agaaaccctg cctgagacct cttggggtgc caagaggggt    3049
acattggttt ttaagtttat ggttttctct tgttttatca tgattctttt tatgaagcaa    3109
taaatccatt tccctgttgg taatggatgc ccctcctcac gtatcagcta attactgtat    3169
gtgcctattt tatatttgag aggagagaca gggcaaaagg gtctgccagg aaaaaaaaaa    3229
aaaaaaa                                                              3236
<210>8
<211>568
<212>PRT
<213>小鼠
<220>
<221>
<223>LAT4
<400>8
Met Ala Pro Thr Leu Ala Thr Ala His Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala
1               5                   10                  15
Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Leu Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly
            20                  25                  30
Trp Gly Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Ser Glu Gly Phe Tyr Ser Tyr
        35                  40                  45
Leu Cys Thr Lys Pro Glu Asn Val Thr Asn Ser Thr Val Gly Gly Ser
    50                  55                  60
Ala Glu Pro Glu Pro Glu Glu Leu Ser Leu Val Asn Gly Trp Leu Ser
65                  70                  75                  80
Cys Lys Ala Gln Asp Glu Ile Leu Asn Leu Ala Phe Thr Val Gly Ser
                85                  90                  95
Phe Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Pro Leu Gly Ile Ile Met Asp Lys
            100                 105                 110
Tyr Gly Pro Arg Lys Leu Arg Leu Leu Gly Ser Ala Cys Phe Ala Val
        115                 120                 125
Ser Cys Leu Leu Ile Ala Tyr Gly Ala Ser Asn Pro Asp Ser Leu Ser
    130                 135                 140
Val Leu Ile Phe Ile Ala Leu Ala Leu Asn Gly Phe Gly Gly Met Cys
145                 150                 155                 160
Met Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe Gly Asp Leu Arg
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Ile Ala Leu Met Ile Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Val
            180                 185                 190
Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Ala Gly Ala Ser Phe Ile
        195                 200                 205
Gly Ile Leu Val Val Trp Ala Gly Cys Ser Gly Leu Val Phe Phe Asn
    210                 215                 220
Cys Phe Phe Asn Trp Pro Leu Glu Pro Phe Pro Gly Ser Glu Asp Met
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Ser Val Lys Ile Lys Phe Ser Trp Leu Gly Phe Asp His Lys
                245                 250                 255
Ile Thr Gly Lys Gln Phe Tyr Lys Gln Val Thr Thr Val Gly Arg Arg
            260                 265                 270
Leu Ser Val Gly Ser Ser Met Arg Thr Ala Lys Glu Gln Ala Ala Leu
        275                 280                 285
Gln Glu Gly His Lys Leu Cys Leu Ser Thr Val Asp Leu Glu Val Lys
    290                 295                 300
Cys Gln Pro Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser Phe Met His Ser Val Phe
305                 310                 315                 320
Ser Pro Leu Leu Val Leu Ser Leu Val Thr Met Cys Val Thr Gln Leu
                325                 330                 335
Arg Leu Ile Phe Tyr Met Gly Ala Met Asn Ser Ile Leu Glu Phe Leu
            340                 345                 350
Val Arg Gly Asp Gln Lys Thr Val Ala Leu Tyr Thr Ser Ile Phe Gly
        355                 360                 365
Ala Leu Gln Leu Leu Cys Leu Leu Thr Ala Pro Val Ile Gly Tyr Ile
    370                 375                 380
Met Asp Trp Lys Leu Lys Glu Cys Glu Asp Thr Ser Glu Glu Pro Glu
385                 390                 395                 400
Glu Glu Glu Gly Thr Gln Gly Glu Lys Lys Gln Lys Arg Asp Arg Gln
                405                 410                 415
Ile Gln Lys Val Thr Asn Ala Met Arg Ala Phe Ala Phe Thr Asn Val
            420                 425                 430
Leu Leu Val Gly Phe Gly Val Thr Cys Leu Ile Pro Asn Leu Pro Leu
        435                 440                 445
Gln Ile Phe Ser Phe Val Leu His Thr Ile Val Arg Gly Phe Ile His
    450                 455                 460
Ser Ala Val Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Val Tyr Pro Ser Thr Gln Phe
465                 470                 475                 480
Gly Ser Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Val Ser Ala Leu Phe Ala Leu
                485                 490                 495
Leu Gln Gln Pro Leu Tyr Leu Ala Met Met Gly Pro Leu Gly Gly Asp
            500                 505                 510
Pro Leu Trp Val Asn Val Gly Leu Leu Ala Met Ser Met Leu Gly Phe
        515                 520                 525
Cys Leu Pro Leu Tyr Leu Ile Cys Tyr Arg Arg Gln Leu Glu Arg Gln
    530                 535                 540
Leu Gln Gln Lys Arg Glu Asp Ser Lys Leu Phe Leu Lys Ile Asn Gly
545                 550                 555                 560
Ser Ser Asn Arg Glu Ala Phe Val
                565