改良多聚核苷酸合成的方法和成分转让专利
申请号 : CN00815973.4
文献号 : CN100590198C
文献日 : 2010-02-17
发明人 : 杨淑伟
申请人 : 锦可贝基因技术公司
摘要 :
在合成多核苷酸中，通过保护寡核苷酸3′末端，然后用其作为引物可提高合成多聚核苷酸的灵敏度和特异性。保护多聚核苷酸的3′末端可以阻止非特异性的链延长。然后温度提高时在热稳定酶作用下去除阻断基团，从而进行模板特异性的多聚核苷酸合成。该发明同时也提供了3′末端带有阻断基团的寡核苷酸以及在高温下可去除阻断基团的热稳定酶。该发明中的组分及方法在多种DNA/RNA扩增和分析技术中非常有用，包括医学遗传研究、诊断，病原体检测，法医，及动植物遗传应用等。
权利要求 :
1.在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核苷的方法，包括：(A)把可能含有目的多聚核苷酸分子的样品与反应混合物混合，反应混合物 包括：(1)与既定目的多聚核苷酸分子配对的引物，引物的3′羟基末端受基团 保护，阻止链延伸；
(2)热稳定阻断基团去除酶，即TBGRE；所述的TBGRE为能在38℃以上温 度有效去除3’-阻断基团的天然的或者人工酶；
(3)一个热稳定多聚核苷酸聚合酶；
(4)至少一种5′核苷三磷酸，以及
(B)混合物温度提高至高于38℃时，产生的引物延伸产物。
2.根据权利要求1所述在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：还包括C步骤中引物延伸产物的变性及产生的至少一个 增加的引物延伸反应。
3.根据权利要求2所述在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：上述的引物延伸反应是聚合酶链式反应(PCR)循环中的 一部分。
4.根据权利要求3所述在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：在最后的PCR循环完成后，通过检测既定样品中的目的 核酸来检测引物延伸的产物。
5.根据权利要求1所述在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：所述的热稳定多聚核苷酸聚合酶是DNA聚合酶或者反转 录酶。
6.根据权利要求1所述在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：所述的阻断基团是3′磷酸残基，TBGRE是3′多聚核 苷酸磷酸酶。
7.根据权利要求6所述在已有的多聚核苷酸序列分子3’羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：所述的3′多聚核苷酸磷酸酶是从嗜热古细菌分离得到 的。
8.根据权利要求7所述在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：所述的嗜热古细菌是Pyrococcus furiosus。
9.根据权利要求1所述在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：所述的阻断基团是3′磷酸羟乙酸，TBGRE是3′多聚 核苷酸磷酸二酯酶。
10.一种试剂盒，包括
(1)3′羟基末端有一阻断基团的寡核苷酸引物；
(2)相应的热稳定阻断基团去除酶，即TBGRE。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中的阻断基团 是3′磷酸残基，TBGRE是3′多聚核苷酸磷酸酶。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中的阻断基团是3′ 磷酸羟乙酸，TBGRE是3′多聚核苷酸磷酸二酯酶。
13.根据权利要求1所述在已有的多聚核苷酸序列分子3′羟基末端增加一个核 苷的方法，其特征在于：TBGRE由序列如SEQ ID NO：5所示的DNA编码，其氨基 酸序列如SEQ ID NO：6所示。
14.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：TBGRE由序列如SEQ ID NO：5 所示的DNA编码。
说明书 :
技术领域
该发明涉及用于改进多聚核苷酸合成灵敏度和特异性的成分和方法。该方法 包含：在合成多聚核苷酸时，3′末端被基团保护的核苷酸作为引物，能阻止非 特异性链的延长(反应)，当温度升高时，用热稳定酶去除阻断基团，从而允许模 板特异性的多聚核苷酸合成。本发明涉及热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶及它作为 标记蛋白，同时还涉及用一个基团保护寡核苷酸引物的3′末端，以及提高从各 种样品中扩增和分析DNA/RNA的灵敏度和特异性的方法。该发明能广泛应用于包 括医学遗传研究、诊断，病原体检测，法医及动植物遗传应用等各种样品中进行 DNA/RNA扩增和分析。
技术背景
多聚核苷酸合成是一个信息转移的过程，通常需要以其它多聚核苷酸分子作 为模板。一般来说，模板依赖的多聚核苷酸合成包括多聚核苷酸模板分子的变性， 引物分子的配对及在聚合酶作用下，核糖核苷-5′三磷酸在引物3′末端的延 伸。该过程常在体外重复多次，如聚合酶链式反应(PCR)。
尽管这种信息转移的过程非常准确，但在信息转移的过程中涉及的生物分子 机制没有错误校正。这些错误在自然界中是突变的来源，而在体外反应，如PCR、 随机引物标记、DNA测序和逆转录中则会引进显著的失真。引物结合到非同源的 位点(错配)，链延伸过程中在多聚核苷酸酶作用下的错误配对都会引起错误。
各种热稳定DNA聚合酶在高至95℃仍保持稳定，如从热稳定细菌Thermus aquaticus中分离的Taq DNA和从古细菌Pyrococcus furiosus分离得到Pfu DNA 聚合酶，减少了错配，从而提高了PCR反应的灵敏度和特异性。
从Thermus thermophilus分离得到的热稳定Tth聚合酶可具有反转录酶和 DNA聚合酶的活性(Myers and Gelfand，Biochemistry 30：7662-7666(1991))， 克服了嗜温性滤过性毒菌反转录酶只能在低温下起作用及低温下不能“读”RNA 模板的二级结构的限制。在反转录过程中，可用Tth聚合酶在较高温度进行，从 而剔除RNA的二级结构，使合成全长cDNA成为可能。
在多数的PCR反应中，引物应该特异性地结合在目标序列。从而只有在温度 较高时引物才能特异性结合，但在某一PCR反应阶段中，尤其是在达到PCR所需 的温度前将各组分混合，混合物必定经历较低的温度(如室温)，在较低温度下， 引物会与非目的序列配对，或反应混合物中的其它引物分子结合，产生非特异性 延伸产物和引物二聚体，干扰来自于目的核酸的特异性产物。这些副产物会导致 较高的背景，降低扩增的效率和反应的特异性。
尽管PCR技术新近取得了进步，但仍存在高背景的DNA错配和引物寡聚化的 问题。尤其在应用PCR技术进行诊断时，目标DNA只有少数的几个挎贝(Chou et al.Nucleic Acid Res.20：1717-1723(1992))。已知由DNA聚合酶由引起非特 异性链延伸通常发生在热循环开始前，所有反应物在室温下混合，从而导致非目 的假的扩增产物。
目前，报道有三种方法可减少这些副反应。第一个方法，叫“热启动”PCR， 有各种变化形式(Chou et al.Nucleic Acid Res.20：1717-1723(1992))；D′ Aquila et al.Nucleic Acid Res.19：3749(1991))，其共同特点是所有其它试 剂加热到72℃后，才加入最后一种试剂，通常为聚合酶，这样起到防止引物错 配和寡聚化的作用。虽然这种方法确实能提高特异性，减少副产物，但在进行大 批量样品时则极不方便，反应混合物变得极容易污染及容易出错。
第二种方法(Taq启动)，在完全反应混合物中加入聚合酶的抗体与聚合酶结 合，如：可把商品名为“TaqStart”Taq DNA聚合酶抗体预先与Taq DNA聚合酶 结合。该抗体能在室温下抑制聚合酶活性(Kellogg et al.Biotechniques 16：1134-1137(1994))，一旦反应进入热循环，抗体就会因热变性而失活，释放 出活性DNA聚合酶。但是用该方法来减少非目的序列的缺点是Taq DNA聚合酶抗 体必须存放在-20℃直到使用，即试剂盒必须在控制的温度下包装和运送，从 而提高了成本。同时，每个PCR反应需要数量不少的抗体(大约1微克抗体/5U Taq)。同时，PCR产物中的抗体干扰PCR产物的进一步免疫化学分析，如ELISA。
第三种方法，经改良的Taq DNA聚合酶，称作AmpliTaq Gold，用在PCR反 应中(Birch，D.E.et al.Nature 381：445-6(1996))。AmpliTaq Gold聚合酶 在室温下无活性，在超过90℃下加热至少5分钟来恢复活性。因此，需要增加 一步95℃的预热PCR。虽然AmpliTaq Gold能在PCR循环中被激活，而不需要 预PCR加热这一步，但是，需要增加10个或更多的循环来得到相等的产量。此 外，许多研究者发现用AmpliTaq Gold很难扩增某些长度的目的序列，如从人类 基因组DNA中扩增4kb的片断。
因而生物技术和分子生物学需要一种更好的方法，减少错配和引物寡聚化 以提高多聚核苷酸合成的特异性。
同时生物技术和分子生物学领域还需要标记物来研究基因表达，调节和功能 研究。例如，在功能基因组计划中需要用来确定新发现基因的表达模式。目前， 有几种方法可以用于研究基因调控和表达，包括，β-半乳糖和荧光素酶编码序 列的融合蛋白的合成(Reviewed in T.J.Silhavy and J.R.Beckwith，Microbiol. Rev.49：398(1988)；and G.S.A.B.Stewart and P.Williams，J.Gen.Microbiol.， 138：1289(1992))。在该领域曾报道过的可作为标记物的其它蛋白是绿色荧光蛋 白(reviewed by Misteli and Spector，Nat Biotechnol. 15(10)：961-4(1997)；Cormack，Curr Opin Microbiol 1(4)：406-10(1998)).但 是这些酶温度敏感，必须在样品准备后短期内进行分析。
目前，这种应用方法或类似的酶确定某种配基及其浓度同样具有上述的缺 点，现在需要一种新的方法，该方法应用一种酶，它的活性容易测定而且温度提 高时活性不会迅速被破坏。
发明内容
该发明的成分之一是3′末端羟基被一基团保护的寡核苷酸引物。在该发明 中3′末端经修饰的引物阻止在DNA聚合酶或者反转录酶作用下的链延伸反应。 即使所有反应必须的成分包括dNTP和金属辅因子存在也不能进行链的延伸反 应。
本发明并提供了在先前存在的引物3′羟基末端增加一个核苷酸的方法：包 括(A).把含有目的多聚核苷酸序列分子样品和含有以下成分的反应混合物混合 (1)引物与既定目的序列互补，引物3′羟基末端被基团保护阻止链延伸；(2)热 稳定阻断基团去除酶，即TBGRE；(3)热稳定多聚核苷酸聚合酶，(3)至少一个核 糖核苷-5′-三磷酸(B).提高混合物温度超过38℃，从而产生引物延伸产 物。首选的例子，该方法最好加一个步骤(C)变性引物延伸产物，产生至少一个 额外的引物延伸反应。
本发明的另一成分是纯化的或者重组的热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶。只有 在足够高温下，3′多聚核苷酸磷酸酶才可以去除修饰引物3′末端的磷酸残基。 只有混合物处在足够高温下，3′磷酸残基去除后才能开始和持续链延伸反应， 从而阻止了非特异性扩增。本发明提供了从Pfu而来的重组热稳定3′多聚核苷 酸磷酸酶。
本发明同时提供从超高温古细菌P.furiosus产生重组热稳定3′多聚核苷 酸磷酸酶的方法。
本发明还包括生产来自嗜热古细菌P.furiosus.的重组热稳定3′磷酸酶作 为标记蛋白的应用。如，本发明可快速检定体外表达系统是否成功表达目的蛋白， 该方法包括(1)将编码感兴趣蛋白的DNA序列分子与编码3′磷酸酶活性的DNA 序列融合；(2)将融合基因置于到合适的表达载体上；(3)表达融合DNA分子；(4) 将表达细胞加热至70℃；(5)检测热稳定3′磷酸酶活性。
本发明并提供了在先前存在的引物3′羟基末端增加一个核苷酸的方法：包 括(A).把含有目的多聚核苷酸序列分子样品和含有以下成分的反应混合物混合 (1)引物与既定目的序列互补，引物3′羟基末端被基团保护阻止链延伸；(2)热 稳定阻断基团去除酶，即TBGRE；(3)热稳定多聚核苷酸聚合酶，(3)至少一个核 糖核苷-5′-三磷酸(B).提高混合物温度超过38℃，从而产生引物延伸产 物。首选的例子，该方法最好加一个步骤(C)变性引物延伸产物，产生至少一个 额外的引物延伸反应。
本发明的另一成分是纯化的或者重组的热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶。只有 在足够高温下，3′多聚核苷酸磷酸酶才可以去除修饰引物3′末端的磷酸残基。 只有混合物处在足够高温下，3′磷酸残基去除后才能开始和持续链延伸反应， 从而阻止了非特异性扩增。本发明提供了从Pfu而来的重组热稳定3′多聚核苷 酸磷酸酶。
本发明同时提供从超高温古细菌P.furiosus产生重组热稳定3′多聚核苷 酸磷酸酶的方法。
本发明还包括生产来自嗜热古细菌P.furiosus.的重组热稳定3′磷酸酶作 为标记蛋白的应用。如，本发明可快速检定体外表达系统是否成功表达目的蛋白， 该方法包括(1)将编码感兴趣蛋白的DNA序列分子与编码3′磷酸酶活性的DNA 序列融合；(2)将融合基因置于到合适的表达载体上；(3)表达融合DNA分子；(4) 将表达细胞加热至70℃；(5)检测热稳定3′磷酸酶活性。
附图说明
图1，阐述改进PCR特异性和灵敏度的可仿效方法的示意图。(A)在较低的 温度，DNA聚合酶(指Pol.)作用下传统引物错配至非目的序列。新合成的DNA 序列可在随后的循环中作为模板，从而引起高背景及降低目的产物的产量。(B) PCR反应中用3′末端被阻断基团修饰的引物，3′阻断基团阻止了低温下的错配 引物延伸，而热稳定基团去除酶(3′TBGRE)只有在55℃以上才能特异、有效地 去除3′阻断基团，转化修饰引物为传统引物，在聚合酶作用下进行随后的循环 中合成DNA。结合修饰引物和3′基团去除酶的功能可提高PCR和PCR相关技术 的特异性和灵敏度。左边的温度条给出反应发生的温度。
图2，从Pyrococcus furiosus克隆3′多聚核苷酸磷酸酶的编码基因，构 建pET-17bPNPs酶表达载体的流程示意图。
图3最后一步用Mono Q column(HR 5/5，Pharmacia Biotech)层析纯化 的P.furiosus重组3′多聚核苷酸磷酸酶用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图4，在温度依赖方法中，P.furiosus3′多聚核苷酸磷酸酶特异性地去除 寡核苷酸引物的3′磷酸残基的放射自显影图。例子7中描述的反应混合物用 16％-聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分析。3′末端有磷酸基的寡核苷酸转迁移速 度快于没有磷酸基的(箭头)。
图5，放射自显影图，引物延伸需要结合例8中的P.furiosus 3′多聚核 苷酸磷酸酶，其中5′sup.32P标记引物的3′末端被磷酸基修饰。
图6，琼脂糖凝胶电泳图，比较用修饰引物加上P.furiosus 3′多聚核苷 酸磷酸酶和用传统引物从50ng人类基因组DNA中扩增的PCR产物(用Taq和Pfu DNA聚合酶扩增2.8kbβ-球蛋白基因片段)的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1是1kb 的DNA分子量标准物，泳道2，3，4及5是传统引物扩增的PCR产物。这些泳道 的样品含有显著的非特异性产物和引物二聚体(“P-dimer)。泳道6，7，8，9 和10是经修饰的一对引物和在3′末端加上3′TBGRE(P.furiosus 3′多聚核 苷酸磷酸酶)扩增得到的PCR产物。
图7，琼脂糖凝胶电泳图，比较应用经修饰引物及TBGRE(纯化的3′多聚核 苷酸磷酸酶)和经传统引物扩增的PCR产物(用Taq聚合酶扩增115bp的HIV gag 基因)。泳道0是100bp分子量的DNA标准物(Life Technologies)。如例10所 述，泳道1，2，3，4，5和6是用一对3′经修饰的引物加上3′多聚核苷酸磷 酸酶扩增的PCR产物。泳道7，8，9，10，11和12是一对传统引物扩增的PCR产物。 所有这些PCR反应用200ng的人类基因组DNA作为模板。图上端标示了在PCR 中作为模板的HIV gag基因DNA分子。
图8，从基因推导出来的多肽(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列对比以及来自P. horikoshii的Ph 1905(SEQ ID NO：16)和来自P.abysii的Pab 1103(SEQ ID NO：17)的假设开放阅读框。(*)表示一致，(：)表示相似的。
图2，从Pyrococcus furiosus克隆3′多聚核苷酸磷酸酶的编码基因，构 建pET-17bPNPs酶表达载体的流程示意图。
图3最后一步用Mono Q column(HR 5/5，Pharmacia Biotech)层析纯化 的P.furiosus重组3′多聚核苷酸磷酸酶用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
图4，在温度依赖方法中，P.furiosus3′多聚核苷酸磷酸酶特异性地去除 寡核苷酸引物的3′磷酸残基的放射自显影图。例子7中描述的反应混合物用 16％-聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分析。3′末端有磷酸基的寡核苷酸转迁移速 度快于没有磷酸基的(箭头)。
图5，放射自显影图，引物延伸需要结合例8中的P.furiosus 3′多聚核 苷酸磷酸酶，其中5′sup.32P标记引物的3′末端被磷酸基修饰。
图6，琼脂糖凝胶电泳图，比较用修饰引物加上P.furiosus 3′多聚核苷 酸磷酸酶和用传统引物从50ng人类基因组DNA中扩增的PCR产物(用Taq和Pfu DNA聚合酶扩增2.8kbβ-球蛋白基因片段)的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1是1kb 的DNA分子量标准物，泳道2，3，4及5是传统引物扩增的PCR产物。这些泳道 的样品含有显著的非特异性产物和引物二聚体(“P-dimer)。泳道6，7，8，9 和10是经修饰的一对引物和在3′末端加上3′TBGRE(P.furiosus 3′多聚核 苷酸磷酸酶)扩增得到的PCR产物。
图7，琼脂糖凝胶电泳图，比较应用经修饰引物及TBGRE(纯化的3′多聚核 苷酸磷酸酶)和经传统引物扩增的PCR产物(用Taq聚合酶扩增115bp的HIV gag 基因)。泳道0是100bp分子量的DNA标准物(Life Technologies)。如例10所 述，泳道1，2，3，4，5和6是用一对3′经修饰的引物加上3′多聚核苷酸磷 酸酶扩增的PCR产物。泳道7，8，9，10，11和12是一对传统引物扩增的PCR产物。 所有这些PCR反应用200ng的人类基因组DNA作为模板。图上端标示了在PCR 中作为模板的HIV gag基因DNA分子。
图8，从基因推导出来的多肽(SEQ ID NO：6)的氨基酸序列对比以及来自P. horikoshii的Ph 1905(SEQ ID NO：16)和来自P.abysii的Pab 1103(SEQ ID NO：17)的假设开放阅读框。(*)表示一致，(：)表示相似的。
具体实施方式
定义
在以下的说明中，广泛利用到许多重组DNA技术术语，为了能令说明书和权 利要求书明晰且更好地理解，提供了以下术语的定义。
核苷酸：本文的“核苷酸”是指碱基-糖-磷的复合物。核苷酸是核酸(DNA 和RNA)序列的基本单体构成单位。核苷酸还包括脱氧核糖三磷酸如dATP，dITP， dUTP，dGTP，dTTP及其衍生物。如：(.alpha.S)dATP，7-脱氧-dGTP，和 7-脱氧-dATP。核苷酸在本文中还应包括双脱氧核糖三磷酸及其衍生物。例如脱 氧核糖三磷酸包括ddATP，ddCTP，ddGTP，ddITP和ddTTP，但不仅限于以上例 子。在本发明中，核苷酸包括未标记种，然后用各种技术带上可检测的标记核苷 酸。可检测的标记，例如有：放射性同位素，荧光标记，化学发光标记及酶标记。
寡核酸：指由一系列的核苷酸通过其戊糖3′位与相邻核苷酸5′位形成磷 酸骨架而共价结合在一起的序列所构成的合成的或天然的分子。
基因：指含有表达出多肽，蛋白或功能性RNA所需信息的DNA序列，包括启 动子，结构基因以及其他涉及表达蛋白或功能RNA的序列。
结构基因：指一般能被转录成mRNA的DNA序列。然后这些mRNA又能翻译成 为特异的多肽氨基酸序列。
足够纯化：“足够纯化”指的是目的纯化蛋白本质上不含有与目的蛋白所天 然结合的杂质酶的酶活性。细胞组分杂质包括，但不限于，5’磷酸酶、激酶、连 接酶、外切酶、内切酶或DNA聚合酶。
纯化：此处是指相比较于培养物中的平均水平提高酶活性，即提高每单位重 量蛋白的活性，不是指将蛋白纯化得非常均一。
引物：指单链寡核苷酸，它能通过与核苷酸单体共价结合而延伸从而扩增或 聚合成核酸分子。
模板：指双链、单链的核酸分子，它能够被扩增、合成或测序。如果是双链 DNA分子，在其被扩增，合成或测序前，先将双链变性成为一条第一链和一条第 二链将促进反应。与部分模板序列互补的引物在合适的条件与模板杂交，然后聚 合酶合成一个与模板或部分模板互补的分子。这个新合成的分子与原始模板长度 一样或短于原始模板。
整合：此处指成为核酸(e.g.DNA)分子或引物的一部分。
扩增：指在体外通过应用DNA聚合酶提高某个核酸序列的拷贝数。DNA扩增 导致核苷酸整合到DNA分子的引物上由此形成了与DNA模板互补的新DNA分子。 一个扩增反应包含了DNA复制的多个循环。例如包括PCR，一个PCR反应的5-100 变性、褪火、合成新分子的循环。
聚合酶链式反应(PCR)：包括合成一系列引物与目标DNA序列两端互补。引 物与目的DNA，热稳定的DNA聚合酶。4种脱氧核苷酸(A、T、C、G)溶液被加 热到足以使DNA互补双链分开的温度(约95℃)，然后温度降至使引物与目的DNA 两端序列结合，然后混合液再升温(约72℃)合成DNA。此温度延续一段时间后， 混合液再次达到足以解开新合成的DNA双链的温度。于是完成第一个循环，混和 液随后降温，再重复上述的过程(循环)。
热稳定：指能耐(抵抗)热变性的酶。嗜温性酶加热后可被失活，例如：T4 的核苷酸激酶的3′磷酸酶活性在75℃/min就失去。在此发明中，相比较于嗜 温性酶如T4的核苷酸激酶，热稳定的3′磷酸酶活性更能耐受热(高温)不失活。 实际上，一个热稳定酶并不是意味这种酶能无限制(完全)地耐高温，高温(热) 处理还是在某种程度上会降低酶的活性。相比较于嗜温性酶，一个热稳定酶往往 具有更高的最适温度。
异源性：指两个不同来源的DNA片段在本质上没有遗传或物理上的相关性， 异源性同时也可描述为在物理或遗传上有关联的分子，但这种关联在本质上完全 不同。
同源性：在此用于两个不同核酸序列之间的比较。为此同源性的评价可认为 是相同碱基的百分比。不包括为了获得较好的序列对比而引入的缺口。同源性比 值可用核酸杂交技术评价，众所周知，也可通过比较两个序列的精确碱基的序列 来确定。本说明书中的“充分同源序列”指的是序列(“A”)能和序列(“B”)杂 交(序列B与本发明的序列互补)。因此在A序列和B序列之间形成的双链分子 的Tm值在20℃范围内浮动，B序列和发明序列之间形成的双链分子的Tm值应该 在10℃范围内浮动。
此外，同源性实质上可理解为：A和B在严谨的条件，即温度介于50-70℃， 双倍浓度的SSC缓冲液(2倍NaCl 17.5g/l及8.8g/l柠檬酸钠)，0.1％十二烷 基硫酸钠(SDS)下杂交，然后用在相同温度下，用浓度减少的SSC缓冲液，如1 倍、1/2、1/10强度SSC(含0.1％SDS)来漂洗。然而，最适条件会有很大不同， 取决于特定杂交反应。
启动子：在转录起启子上游的一段DNA序列，包含有转录必须的调控区域。 在本发明的DNA构建中，所适用的启动子包括病毒、真菌、细菌、动物和植物启 动子，它可以选择成为组成型启动子和诱导型启动子，如果是诱导型启动子，它 会被诱导物激发而提高转录速率。相反如果是组成型的启动子，那么它的转录就 不被诱导物调控或基本不受控制。组成型启动子例如包括噬菌体的Int启动子， pBR322的内酰胺酶基因的bla启动子。原核诱导型启动子包括：噬菌体的左右 主启动子(Pr和Pl)，trp，recA，lacZ，lacI，tet，gal，trc，及tac启动 子和E.coli.。B subtilis启动子包括α-淀粉酶(Ulmanen et al.，J. Bacteriol 162：176-182(1985))和噬菌体启动子(Gryczan，T.，In：The Molecular Biology of Bacilli，Academic Press，New York(1982))。链霉菌 启动子(Ward et al.，Mol.Gen.Genet.203：468478(1986))。Glick，J.Ind. Microbiol.1：277-282(1987)；Cenatiempto，Y.，Biochimie 68：505-516 (1986)；and Gottesman，Ann.Rev.Genet.18：415-442(1984).有原核启动子 的综述。在原核细胞内表达同时要求核糖体结合位点在基因编码序列的上游。 Gold et al.，Ann.Rev.Microbiol.35：365404(1981)描述过这类核糖体结合 位点。
克隆载体：一种DNA分子，如：质粒，柯斯粒，噬菌体，它具有在宿主细胞 自我复制的能力。往往包含一个标记基因，一个或少数几个限制性内酶切识别位 点，用来插入外源DNA序列而不影响载体的基本的生物功能。
表达：指一个结构基因产生多肽或者RNA分子的过程。它包括基因转录成 mRNA以及随后翻译成蛋白。
表达载体：指DNA分子含有用于在宿主细胞中表达的基因，通常基因的表达 是在某个调控元件，包括组成型启动子和诱导型启动子，调控元件增强子的调控 之下。此外的“调控元件”是指控制及调节基因表达的DNA序列。这样一个基因 可被说成可调控地连接到一个调控元件上，意味着这个调控元件指导该基因表达 所以才连接上。
重组宿主：含有克隆载体或者表达载体的原核或真核细胞，也包括原核或真 核细胞的遗传特性被改造。
本发明“末端用阻断基团改造的寡核苷酸”是指一个合成的或天然的寡核苷 酸在其3’末端的氧原子与阻断基团共价结合。例如阻断基团是3’磷酸基和3’磷 酸羟乙酸。
阻断基团由一个热稳定用相应的热稳定酶去除，此酶称之为“热稳定的3’- 阻断基团去除酶(TBGRE)本发明的TBGRER指一种能在38℃以上温度有效去除 3’-阻断基团的天然的或者人工酶。TBGRE例子包括3′多聚核苷酸磷酸酶和3′ 多聚核苷酸磷酸二酯酶，它们能分别去除3′磷酸基和3′磷酸羟乙酸基。此外 一个熟练的技术人员知道某些氨基酸替代物被认为不影响多肽的活性(例如，用 GCG的BESTFIT程序来判断保守氨基酸替代物)。2个多肽有相似的序列就可能有 相似的功能。两个多肽间的“相似性”通过比较氨基酸序列和它们的保守氨基酸 替代物来确定。这是常见的方法，可用计算机程序如BLAST来完成。
其它本文所用的分子、细胞生物学和DNA重组上的术语应该被该领域的普通 技术人员所掌握。
提高多聚核苷酸合成的特异性及改进PCR反应灵敏度和特异性的方法
本发明通过在引物的3′羟基末端加上一个阻断基团，该基团可用相应的热 稳定3′基团去除酶去除，热稳定3′基团去除酶只有在反应开始，温度升高时 才恢复活性，从而克服了在室温下由于引物错配而引起的非目的核酸的扩增。
本发明中，提高多聚核苷酸合成的特异性和灵敏度的方法，如图1所示。(A)， 低温时，传统引物与非目的核酸发生错误配对(褪火)，然后在聚合酶作用下引 物延伸(indicated by Pol.)。新合成的DNA在较高的温度时，可作为模板，例 如在随后的PCR循环中，从而产生高的背景和低产量的目的产物。相反，(B)显 示使用3′末端有阻断基团修饰的引物时，3′阻断基团阻止较低温度下的错配 引物延伸。而在较高的温度时，TBGRE能特异、有效地去除相应的3′阻断基团， 经修饰引物转化为传统引物，在DNA聚合酶的作用下合成DNA。结合经修饰的引 物和TBGRE的作用能提高PCR及PCR相关技术的特异性和灵敏性。左边的垂直温 度条显示了这些反应发生的温度。
在本发明之前，从来没有人使用过以保护引物3′羟基末端来提高合成多聚 核苷酸分子的特异性。
本发明中的阻断基团具体来说可以是磷酸残基，而TBGRE相应是热稳定3′ 多聚核苷酸磷酸酶。本发明中的阻断基团是磷酸羟乙酸，TBGRE是热稳定3′多 聚核苷酸磷酸二酯酶。
在本发明中，3′多聚核苷酸磷酸酶在温度低于38℃时没有任何可检测的活 性，温度高于95℃时仍有活性。该种酶的最适温度范围为高于40℃，超过45℃ 较好，超过50℃仍很好，超过55℃更好，超过60℃最好。
例如，DNA合成中，与DNA/RNA模板互补的寡核苷酸引物的3′末端的磷酸 残基，可阻止在逆转录酶(RT)或者DNA聚合酶作用下的引物延伸。在某个较高温 度(例如高于38℃)，热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶能去除引物3′末端的磷酸基 团，令引物在RT或者DNA聚合酶作用下延伸。引物与非特异目的序列配对(褪 火)，结合3′末端带磷酸基团的寡核苷酸引物和3′多聚核苷酸磷酸酶作用能阻 止低温下，在RT或者DNA聚合酶作用下的非目的序列的引物延伸。
本发明采用3′末端受保护的引物和TBGRE可剔除引物错配以及引物二聚 体。适合于本发明的TBGRE，在温度低于38℃以下没有任何可检测的活性。由于 在本发明中只需要使用非常少量的TBGRE，可以避免为了与DNA聚合酶分隔开来， 而把PCR试剂和抗体封装的麻烦。
之所以存在这些优点是因为可以把3′羟基末端带修饰的引物、TBGRE与热 稳定DNA聚合酶和/或者反转录酶混合在一起。在任何温度下，即使反应混合物 中含有反应所需的各种成分，包括dNTP和金属辅因子，经修饰的引物也不会在 DNA聚合酶和/或者反转录酶的作用下延伸。当温度高于38℃时，TBGRE能有效 地去除引物的3′末端的阻断基团，使之成为DNA聚合酶和/或者反转录酶合适 的引物。
目前本发明的方法不影响扩增产物处理和分析，该方法还有另外的优点是能 应用到自动化中，而这恰好是传统方法，如用胶囊储存PCR试剂，用DNA聚合酶 的抗体或者修饰DNA聚合酶所不能做到的。
因此，在使用3’带修饰引物和相应的TBGRE下，可通过调节反应混合物温度 达到或者低于38℃来控制PCR，提高温度到达所需水平来持续反应。
本发明提供了经3’-阻断基团修饰的寡核苷酸和有特异活性去除寡核苷酸分 子3’末端阻断基团而不是5’末端的TBGRE。
3′磷酸酶的纯化
从嗜热古细菌Pyrococcus furiosus(Pfu).中纯化热稳定3′多聚核苷酸 磷酸酶是本发明另一组成部分。在4-20％SDS的PAGE中，通过与标准分子量 (Protein BenchMarker，Life Technologies，Inc.Rockville，Md.)相比较， 3′多聚核苷酸磷酸酶分子量为31kD，温度高于38℃时，高于45℃效果较好， 高于50℃效果更好，它能特异有效地去除引物3′末端的磷酸基团，为DNA聚合 酶和/或者反转录酶提供合适的引物。
这种酶的一个独特性质是在74℃有最高的活性，在37℃时或以下活性很低。 因此可通过从74℃降到37℃的低温下来关闭酶的活性。
目前，已知3′多聚核苷酸磷酸酶的活性与一些参与核酸新陈代谢有关的纯 化酶，如T4多核苷酸激酶(Ri chardson，C.C.The Enzymes，edited by Boyer， P.D.，Academic Press，Inc，New York，N.Y.XIV：299-314(1981))和碱性 磷酸酶(Maunders，M.J.Methods in Molecular Biology.Edited by Burrell， M.M.，Humana Press，Inc.，Totowa，N.J.，16：331-341(1993))相关。有人 认为可能存在特殊的3′多聚核苷酸磷酸活性的酶，可能参与DNA损伤修复(Yang， S.W.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(21)：11534-9(1996))。
在本方法发明之前，没有报道过存在没有其它酶活性的特异3′多聚核苷酸 磷酸酶，如5′多聚核苷酸磷酸酶活性，DNA聚合酶活性，连接酶活性等等。本 方法的发明者首次获得纯化的3′多聚核苷酸磷酸酶。可用以下的步骤进行纯 化：
1).3′多聚核苷酸磷酸酶活性检测：可用不同的方法分析3′多聚核苷酸 磷酸酶(Jilani，A，et al.J.Bio.Chem.274(34)：24176-86(1999)；Olivares M.et al J.Bio.Chem.274(34)：23883-86(1999))。例1所描述的是首选的 方法，它能检测到许多杂质的活性，如外切酶，内切酶，5′磷酸酶，连接酶和 DNA聚合酶。
2).3′磷酸酶的分离和纯化：超声波处理Pfu细胞，硫酸铵沉淀，用几种 商业品化分离介质层析。
3).在SDS PAGE上确定3′多聚核苷酸磷酸酶的蛋白带：酶纯化过程中， 层析分离得到的各组分的蛋白质用SDS-PAGE分析，并检测相同组分里的酶活性， 如用图3所示的方法。仔细分析层析每个组分的蛋白质以及对应于酶活性的峰 值，再将SDS-PAGE中的蛋白用传统的复性方法(Yang，S.W.，Becker，F.F.， Chan，J.Y.H.J.Bio.Chem.265：18130-34(1990))验证。在SDS-PAGE中， 通过与蛋白质标准分子量相比较来确定纯化酶的相对分子量。
有3′多聚核苷酸磷酸酶活性的多肽及其DNA的编码序列
本发明提供有热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶活性的多肽，编码该多肽的核苷 酸分子，含有多聚核苷酸分子的DNA载体，含有上述分子的宿主细胞以及用上述 细胞产生重组3′多聚核苷酸磷酸酶的方法。
目前本发明中来自Pfu的3′多聚核苷酸磷酸酶基因含有846个碱基对(e.g.， SEQID NO：5)，编码281个氨基酸(SEQ ID NO：6)。用BLAST程序(Altschul S F. et al.Nucleic Acids Res.25：3389-4302(1997))在Genbank中搜索，显示 SEQ ID NO：6分别与来自Pyrococcus horikoshii OT3的假设的开放阅读框(Ph 1905)和来自Pyrococcus abyssi的ORF(Pab 1103)各有91％和88％的碱基相同。 SEQ ID NO：6和有3′多聚核苷酸磷酸酶活性的已知蛋白如T4多聚核苷酸激酶间 不存在显著的同源性(超过35％的碱基相同)。因此，很可能这两个开放阅读框(Ph 1905and Pab 1103)与SEQ ID NO：6编码相似的具有3′多聚核苷酸磷酸酶功能 的多肽。
本发明包括多肽和编码此多肽的DNA分子，以及在同一性或位置上有一或多 个氨基酸残基差别的SEQ ID NO：6的类似物、片段或者衍生物，涵盖了缺失类似 物即含有的特异氨基酸残基数目少于SEQ ID NO：6；替代类似物即一个或多个特 异残基被其它残基取代；扩增类似物即在原来多肽的的末端或者中间部位，加入 另外的残基后仍保留一些或者所有天然酶的活性。
熟练的技术人员会识别产物的类似物，片段和衍生物。目前本发明所包括的 多肽有：SEQ ID NO：6多肽，与SEQ ID NO：6至少有92％同源性的多肽(氨基酸 序列至少92％相同)，与SEQ ID NO：6至少有95％同源性的多肽(氨基酸序列至少 95％相同)，包括这类多肽的部分或片段，此多肽片段含有至少30个氨基酸或至 少50个氨基酸。众所周知两个多肽的“相似性”是通过比较两个多肽的氨基酸 序列以及它们的保守氨基酸序列来判断。可用计算机程序如BLAST来完成该种判 断。
目前本发明中的多聚核苷酸片段或部分含有至少15个核苷酸，或至少20个 核苷酸，最好是至少25个核苷酸。此多聚核苷酸片段或者部分可用于合成本发 明中的全长多聚核苷酸。
熟练的技术人员可从图8给出的序列片段来确定序列的相似性，同一性序列 和类似物设计。熟练的技术人员可通过识别图8中的判断哪些氨基酸残基是保守 的，哪些是可变的而不影响多肽的酶活性。此外，熟练的技术人员都知道某些氨 基酸替代物是被认为不影响多肽的活性的，可用GCG的BESTFIT程序来确定保 守氨基酸替代物(see e.g.determining the conserved amino acid substitutions using the BESTFIT program of the Genetic Computing Group， Madison，Wis.)。
本发明提供的核苷酸序列如SEQ ID NO：5，与已公开的核苷酸序列有部分序 列简并同源，本发明同样提供SEQ ID NO：5的DNA序列。简并的DNA序列也编码 SEQ ID NO：6的氨基酸序列，但有部分核苷酸编码序列不同。
体外表达3′多聚核苷酸磷酸酶的载体和细胞
熟练的技术人员都知道3′磷酸酶的结构基因克隆可在重组宿主细胞中表 达。为了能在体外更好地表达3′磷酸酶，常见的诱导型或组成型的启动子可在 重组宿主细胞中表达高水平的3′多聚核苷酸磷酸酶结构基因。与之类似的，技 术上常用的高拷贝数的载体可用于达到高水平的表达量。可诱导出高拷贝数的载 体有助于在重组宿主细胞中提高3′磷酸酶的表达量。
为了在原核细胞(such as，E.coli，B subtilis，Pseudomonas，etc.)中 表达结构基因，必须将结构基因连接上一个原核细胞的启动子。3′磷酸酶基因 原有的启动子可在原核宿主细胞中起作用，表达3′磷酸酶基因，因此可用于表 达3′磷酸酶基因。
为了提高本发明的3′磷酸酶在真核细胞中的表达，可使用常见的真核启动 子及真核宿主细胞。但是，最好在原核宿主细胞中表达3′磷酸酶。大量表达3 ′磷酸酶的最合适的原核宿主细胞是E.coli。
3′多聚核苷酸磷酸酶生产
本发明中的酶是通过发酵含有可表达的3′磷酸酶的重组宿主细胞而来的。 但是，本发明所使用的酶可从任何可产生本发明3′磷酸酶的菌株中分离和纯 化。同时本发明包括含有酶活性的3′磷酸酶的片段。这类片段包括蛋白水解片 段，融合到其它多肽的片段以及各种片段。
在培养基中加入各种可被含有3′磷酸酶基因的宿主细胞吸收的营养成分。 根据不同的菌株和培养基的组分选择最适的培养条件。加入抗生素以确保筛选出 含有目的基因的载体DNA。ATCC目录等(Sambrook et al.，In：Molecular Cloning， a Laboratory Manual(2.sup.nd ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))描述了培养基的配制。
首先，产生3′磷酸酶的宿主细胞可从液体培养基中分离，如用离心方法。 将收集到的微生物细胞悬浮到合适的缓冲液中，然后用超声波破细胞或者用其它 常用的方法在缓冲液中提取酶。用超声波离心或者离心去除细胞碎片后，用标准 蛋白纯化技术，如抽提、沉淀、层析、亲合层析及电泳等方法纯化3′磷酸酶。 在纯化过程采用常见的分析方法检测3′磷酸酶，(例如，Jilani，A，et al.J Bio.Chem.274(34)：24176-86(1999)；Olivares M.et al.J.Bio.Chem. 274(34)：23883-86(1999)；Yang，S.W.，Burgin，A.B.Jr.，Huizenga，B. N.，Robertson，C.A.，Yao，K.C.，and Nash，H.A.Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.93(21)：11534-9(1996))，并可用经典生化纯化方法检测这个酶。
用热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶作为标记检测基因表达
另一方面，本发明提供检测蛋白表达产物的方法：a)构建包含编码目的蛋 白和编码热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶蛋白的DNA序列的融合DNA分子；b)把 融合DNA分子插入表达载体上；c)把表达载体转化进入合适的宿主细胞；d)在 能表达融合蛋白的条件下培养细胞；最后e)分析热稳定3′磷酸酶的活性。
用热稳定3′磷酸酶作为报告基因来研究基因表达的调节
热稳定3′磷酸酶基因能用于研究基因表达调节。例如，细胞含有有源自基 因的调控元件的DNA分子，而无编码Pfu3′磷酸酶的基因，将此调控元件连接 到一段编码Pfu3′磷酸酶的DNA序列上。通过分析3′磷酸酶，可分析调控元件 的功能。细胞可从细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、线虫细胞、植物或动物细胞 中筛选。最合适的动物细胞包括，但不限于，Vero细胞，HeLa细胞，Cos细胞， CV1细胞和各种初期的哺乳动物细胞。具体来说，细菌细胞是Escherichia coli.。
用重组Pfu 3′多聚核苷酸磷酸酶来检测配体及其浓度
本发明中的3′磷酸酶还有几个潜在的用途，如非同位素方法检测蛋白和核 酸。由于3′酸磷酸酶具有高的热稳定性，所以可用于直接与蛋白或核酸探针交 联。
与众不同的是纯化的重组Pfu 3′磷酸酶或者它的活性片段可用于诊断，以 确定样品中配基的出现或者浓度。样品可以是液体或者是组织样品，例如，来自 可能带有某种特定抗原或DNA片段的病人。熟练的技术人员将发现任何可使用酶 催化系统的检测，可使用本发明的检测方法。
本发明的具体分析方法如下：(1)首先将充分纯化的3′多聚核苷酸磷酸酶 或其活性片段连接上能够特异结合到配基并能被检测的试剂中，从而获得试剂- 磷酸酶复合物；(2)将试剂-磷酸酶复合物加入到可能含有配基的待测样品中； (3)去除不结合上特定配基的试剂-磷酸酶复合物；(4)能被3′多聚核苷酸磷酸 酶催化的可检测到的试剂混合到试剂-磷酸酶混合物上；最后(6)检测被3′多聚 核苷酸磷酸酶催化的反应，其中阳性反应说明样品中存在配基。
通过把反应的总量和配基的浓度关联起来[Noya，O.and Alarcon de Noya B. Immunol Lett 63(1)：53-6(1998)；Walenga，J.M.and Fareed，J.Clin Lab Med 14(4)：709-28(1994)]，本方法同样可用于测定样品中配基的浓度。为了 测定配基的浓度，要确定实验中3′磷酸酶的活性值，可通过与已知浓度的配基 或者标准测量来确定，如斜率可通过已知配基的浓度来确定。例如，抗HIV特定 表面蛋白的抗体可与纯化的重组3′磷酸酶或片段连接。通过3′磷酸酶活性与 已知浓度的表面蛋白相比的标准曲线，可知道样品中HIV表面蛋白的浓度。
现有的方法可检测各种配基。配基可以是有抗原性质的蛋白、多肽或核酸， 如DNA或RNA。
配基是抗原或抗原类分子时，则能特异结合上这类配基的试剂可以是抗体或 这类抗体有活性的片段。试剂同样可以是能杂交或结合上特异核酸的核酸探针， 如DNA或RNA。探针可以是与cDNA或配基的基因组片段互补的寡核苷酸。
技术人员应都知道如何把酶附加到各种试剂。把酶耦联上抗体的技术，在这 些文献中都有介绍(Kennedy et al.，Clin.Chim.Acta 70：1(1976))。这类耦 联中用到的试剂包括戊二醛，p-甲苯二异氰酸盐，各种碳化二亚胺试剂，p-苯醌 -m-高碘酸盐，N，N’-o-费尼伦蓝等等。此外可用本发明中的多种功能的多肽。
通过以下的例子阐述本发明。该发明不限于以下例子中特定条件或细节。本 说明书，任何或所有可获得的公开发表文献都可作为参考。
例1
3′多聚核苷酸磷酸酶活性检测
化学合成3′磷酸基修饰的寡核苷酸(Midland Certified Reaget Company， Midland，Tex.)。寡核苷酸序列组成如下：
5’-GCT GCTCTGTGCATCCGAGTGG-p-3’(SEQ ID No：7)
用没有3′多聚核苷酸磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶把32P标记在寡核苷酸 5′末端(Yang，S.W.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93(21)：11534-9(1996))。带有32P标记寡核苷酸与纯化的3′多聚核苷酸磷酸酶 混合在1×PCR反应缓冲液(10Mm Tris-HCl，pH8.3，50mM MgCl2)72℃5分钟。 加入DNA测序缓冲液，90℃加热2分钟，样品用12％的聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶 电泳分析。图4为用PhophorImager(Molecular Dynamics)定量的样品放射自显 影图。1单位的3′磷酸酶定义为能5分钟内去除5μmol多聚核苷酸的3′末端 磷酸基。
例2
从Pfu中分离和提纯3′磷酸酶
100克湿重的Pfu细胞(从Md，巴尔的摩，马里兰州大学的海洋生物技术中 心购买)悬浮在冰浴的裂解液中，20mM Tris-HCl，Ph7.5，1mM EDTA，1mM DTT， 0.2M NaCl，10mM巯基乙醇及2mM苯甲基硫磺氟化物。然后用超声波裂解细胞， Sorvall GS-3 rotor 8,200rpm离心10分钟。上清加入0.05vol的10％聚乙烯 亚胺溶液，混匀离心后用硫酸铵(饱和度45-80％)分馏。接着用磷酸纤维素柱 (P-11；Whatman，Inc.；activity eluted.apprxeq.0.6M NaCl)，Source 15S (Pharmacia；activity eluted.apprxeq.0.2M NaCl)，双链DNA-纤维素(Sigma； activity eluted.apprxeq.0.15M NaCl)，Mono S column(Pharmacia；activity eluted.apprxeq.0.35M NaCl)及肝素琼脂糖，Mono Q柱(Pharmacia；activity eluted.apprxeq.0.25M NaCl)层析，最后在Mono Q柱(Pharmacia)收集酶。3 ′磷酸酶在SDS-PAGE的位置用从SDS-PAGE中割下蛋白带，然后复性的方法来确 定(Yang，S.W.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(21)：11534-9 (1996))。
在4-20％SDS-PAGE中与标准蛋白分子量标准(Life Technologies，In)比 较，纯化的3′磷酸酶相对的分子量大约31KD。
例3
3′磷酸酶N末端的缩氨酸测序
部分已纯化的3′多聚核苷酸磷酸酶加入到7％SDS-Tricine PAGE中。SDS凝 胶中的蛋白质在转移缓冲液(0.5.times.TBE(pH 8.4)，20％methanol，0.5mM EDTA)中，电转移到PVDF膜上(Immobolin-P from Millipore)，0.5A电泳，转 移1小时。膜用考马斯亮蓝R-250染色10分钟，用100％甲醇脱色两次。切除膜 上相应于3′多聚核苷酸磷酸酶的条带。其氨基酸测序用耶鲁大学商业设备来完 成。从N末端开始以单个字母列出26个氨基酸的序列：
FKIDRLRFGTAGIPLSTPKPSTIAGI(SEQ ID NO：1).
例4
从Pfu基因组中克隆编码3’磷酸酶的基因
图2为3′磷酸酶基因克隆过程，简要阐述如下：用BLAST程序(Altschul SF. et al.Nucleic Acids Res.25：3389-4302(1997))以N末端氨基酸序列(SEQ ID NO：1)查找Genebank。查找出两段氨基酸序列有96％相似的序列。其中一段识别 序列为部分的假设的Pyrococus horikoshii OT3的开放阅读框(Ph 1950)，另一 序列为Pyrococus abyssi的部分的假设开放阅读框(Pab 1103)。两个开放阅读 框都含有C末端的23个氨基酸的相同氨基酸片段：
ISESPNIEGDAILMKKKWEELKI(SEQ ID NO：2)
SEQ ID NO：1和已知有3′磷酸酶活性的蛋白之间没有显著的同源性(超过35％的 一致性)。
为了克隆热稳定3′磷酸酶基因，本发明的发明者基于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，设计和化学合成了一对引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)：
引物1：
5’-GGAATTCGACATATGTTTAAAATAGACAGGCTAAGATTTGG(SEQ ID NO：3)
引物2：
5’-GGTACCTTAAATTTTTAGCTCTTCCCACTTTTT(SEQ ID NO：4)
限制内切酶分别识别引物1和2的5′端的Nde I和Kpn I。根据制造商 (Stratagene Inc.，Calif.)的说明，这些引物在含有Pfu基因组DNA作为模板 和Pfu DNA聚合酶的PCR混合物中使用。合成的DNA片段用1％的琼脂糖凝胶电 泳纯化。用经典方法(Sambrook et al.in：Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2.sup.nd Ed.)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))钝化3′末端，去除5′末端的磷酸基团后，把片段连接 到质粒载体pUC19上。含有DNA片段的质粒(pUC19-PNP酶)从E.coli DH5α的 单克隆菌株中提取，其片段的序列(SEQ ID NO：5)可用经典方法(PE Applied Biosystems)来测定。从已知序列推测氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。来自Pfu菌株 的3′磷酸酶基因由846个碱基，编码281个氨基酸组成。比较上述提到的另外 两个推测的ORF，本发明的Pfu 3′磷酸酶氨基酸序列与Ph 1905和Pab 1103 比较分别有91％和88％的相似性(见图8)。因此这两个ORF很可能编码与SEQ ID NO：6相似的，有热稳定3′磷酸酶功能的多肽。
例5
重组表达载体的构建
为表达和纯化重组3′磷酸酶，用Nde I和Kpn I消化质粒 DNA(pUC19-PNPtase)。含有3′磷酸酶基因的DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳纯化， 然后连接到E.coli表达载体pET-17b(Novagen，Calif.)上生成 pET-17b-PNPtase。连接反应混合物被转化到E.coli DH5α细胞。通过PCR方 法，用引物1和引物2筛选出正确的克隆。用上述方法再次检测pET-17b-PNPtase 中的3′磷酸酶基因的序列。
例6
表达和纯化源自Pfu的重组3′多聚核苷酸磷酸酶
用例5中的重组表达载体(pET-17b-PNPtase)转化到Escherichia coli(BL21(DE3))。转化产物在LB培养基中培养。在收集细菌细胞前三个小时， 用异丙基硫代-β-D-吡喃乳糖苷(IPTG)]]进行诱导处理。离心从培养液中回收 细菌细胞。用缓冲液悬浮细胞并用超声波裂解细胞。细胞抽提液加热到76℃， 20分钟。冰水中冷却10分钟，聚乙烯亚胺加入到抽提液中。回收上清，用以上 所述的硫酸铵(饱和度45-80％)方法沉淀，沉淀随后重悬于buffer R(20mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，0.2M NaCl，10mM巯基乙醇)中。
短暂离心后用羟磷灰石(BioRad)柱层析，3′磷酸酶用梯度为1mM到400mM 的磷酸基的缓冲液R洗提。含有3′磷酸酶的成分用上述的Mono S and Mono Q column再处理。图3显示的纯化的3′磷酸酶，不含有影响PCR反应(数据没有 列出)的外切酶活性、DNA连接酶活性和多核苷酸激酶或者5′多聚核苷酸磷酸酶 活性。
例7
重组3′磷酸酶特异去除寡核苷酸3′末端的磷酸基团。
用上述没有3′多聚核苷酸磷酸酶活性的T4多聚核苷酸激酶在3′端有磷酸 基团的寡核苷酸(SEQ ID No.7)的5′端标记sup.32P(Yang，S.W.，et al.Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(21)：11534-9(1996))。在最适温度，把sup.32 P标记的底物和纯化的重组3′磷酸酶混合在1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl.sub.2)5分钟。加入DNA测序缓冲液后加热至 90℃，2分钟。样品用12％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分析。
例8
在Taq和Pfu DNA聚合酶作用下，依赖于热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶的 经修饰的寡核苷酸引物延伸反应。
用sup.32P标记的3′末端有磷酸阻断基团的寡核苷酸引物(SEQ ID No：7) 与互补模板5’-AACCTCGTAACCTTCGGTACACTCGGATGCACAGAGCAGC-3’(SEQ ID NO：8) 配对，加入或者不加入纯化的重组3′多聚核苷酸磷酸酶到Taq/Pfu聚合酶中， 68℃混合分别30秒和10分钟。样品加入DNA测序缓冲液，90℃加热2分钟，然 后用12％的聚丙烯酰胺凝胶-7M尿素电泳分析。
当纯化的重组酶与经修饰的寡核苷酸引物混合在PCR反应物时，该种酶能特 异地去除引物的3′末端的磷酸基而不影响5′端(见图4)。相比之下，从Tth 而来的热稳定碱性磷酸酶，因为同时具有3′和5′磷酸酶的活性，所以不能用 于本发明以提高DNA扩增的特异性和灵敏度。5′磷酸酶的活性会破坏脱氧核苷 三磷酸((dNTP包括dATP，dTTP，dCTP及dGTP)，dNTP是PCR反应中热稳定DNA 聚合酶合成DNA的底物。
如图4所示，纯化酶在55℃到80℃温度范围内有最大的活性，这同样也是 所有用PCR方法或相关技术扩增DNA的热稳定DNA聚合酶的最适温度范围。
在本实验反应混合物内没有3′多聚核苷酸磷酸酶时，3′末端经磷酸基团修 饰的引物能在68℃稳定10分钟(图5，泳道4和5)。这两个泳道没有任何延伸 产物，说明3′磷酸基团修饰的引物在68℃稳定，能遏制Pfu DNA聚合酶3′外 切酶活性，Taq和Pfu DNA聚合酶作用下的引物的延伸。但是，在同样的反应混 合物中，含有纯化的重组3′多聚核苷酸磷酸酶及大约20pmol(常规PCR用量) 的修饰引物，68℃下不到30秒就开始延伸(图5，泳道2和3)。该结果说明3′ 多聚核苷酸磷酸酶能非常有效地去除引物3′端的磷酸基，因此所有的经修饰引 物可以转化为传统引物开始循环而不必额外的的暂停。进一步的研究说明，3′ 末端磷酸基修饰的引物可在室温下，没有3′磷酸酶的完全PCR混合物中保存几 个星期，68℃保存5天(数据没有列出)。
例9
用带修饰引物和3′磷酸酶提高PCR扩增DNA片段的特异性。
为了扩增人类β球蛋白基因的DNA片段，从人类β球蛋白基因中筛选一对引 物(Collins，F.S.and Weissman，S.M.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 31：315-462(1984))，并化学合成含有或不含有3′末端磷酸基团的引物，预期 扩增长约2.8kb的PCR产物。
Primer 3：5’-GCT GCTCTGTGCATCCGAGTGG-p-3’(SEQ ID NO：7)及
Primer 4：5’-CCAGGATTTTTGATGGGACACG-p-3’(SEQ ID NO：9)
PCR混合物(10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl.sub.2， 200.mu.M dNTP)加入纯化的重组3′多聚核苷酸磷酸酶及Taq DNA聚合酶或者 Pfu DNA聚合酶，同时用一系列稀释梯度的人类基因组DNA作为模板。PCR反应 参数：94℃，2分钟；55℃，15秒，72℃，3分钟共30循环；94℃，15秒。琼脂糖 凝胶电泳分析PCR产物。对照实验除了没有添加3′磷酸酶及使用与修饰引物序 列相同的传统引物之外，其它PCR条件相同。
Primer 5：5’-GCTGCTCTGTGCATCCGAGTGG-3’(SEQ ID NO：10)及
Primer 6：5’-CCAGGATTTTTGATGGGACACG-3’(SEQ ID NO：11).
结果见图6
例10
用修饰引物和3′多聚核苷酸磷酸酶进行PCR，提高扩增DNA片段的特异性。
一对传统寡核苷酸引物分别互补到gag基因序列1551-1578和1638-1665 上，分别命名SK38和SK39，用于扩增115bp的DNA片段来直接检测外周血单 核细胞的HIV-1(Ou，C.Y.et al，Science 239(4837)：295-7(1988))。HIV-1 的gag基因插入质粒载体pUC19上构建作为模板的pUC19-gag。在SK38和SK39 引物3′末端化学合成磷酸基因：
Primer 7：5’-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-p-3’(SEQ ID NO：12)和
Primer 8：5’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-p-3’(SEQ ID NO：13)
PCR反应中，在Taq DNA聚合酶作用下，纯化的重组3′磷酸酶及引物7和 8用于扩增115bp的DNA片段。例9描述了PCR反应混合物含有一系列稀释梯度 的gag基因模板(pUC19-gag)和200ng的人类基因组DNA作为非特异模板。PCR 反应参数如下：94℃，2分钟；55℃，15秒，72℃，3分钟，44循环；94℃，15 秒。反应产物用琼脂糖凝胶电泳分析。对照实验是在相同的PCR反应中不加3′ 磷酸酶并加入传统的SK38和SK39引物：
Primer 9：5’-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3’(SEQ ID No.14)和
Primer 10：5’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3’(SEQ ID No.15).
结果见图7。
序列表
<110>锦可贝基因技术公司(Genecopoeia Inc.，)
<120>改良多聚核苷酸合成的方法和成分
<140>00815973.4
<141>1999-09-22
<150>US09/404,258
<151>1999-09-22
<160>17
<210>1
<211>26
<212>PRT
<213>激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400>1
Phe Lys Ile Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly Ile Pro Leu Ser
1 5 10 15
Thr Pro Lys Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ile
20 25
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400>2
Ile Ser Glu Ser Pro Asn Ile Glu Gly Asp Ala Ile Leu Met Lys Lys
1 5 10 15
Lys Trp Glu Glu Leu Lys Ile
20
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>3
ggaattcgac atatgtttaa aatagacagg ctaagatttg g 41
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>4
ggtaccttaa atttttagct cttcccactt ttt 33
<210>5
<211>846
<212>DNA
<213>激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400>SEQUENCE：5
atgtttaaaa tagacaggct aagatttgga actgctggaa tacctctttc tactccaaaa 60
ccttctacaa tagctggaat tgaaagggtt agagagcttg gactagatgc catggagctt 120
gaatttgtga gaggagtaaa tataaggccc gaactggcaa agaaaataaa atacgtagca 180
aaaaagaacg acgttgtttt aacagcgcat gccccatact acataaactt aaacgccaaa 240
gagaaggaaa aagtggaaag tagcaaaagg agaattattc agagtgcaga aaggctatat 300
gaggcaggag gatggagcgt agtttttcat gctggctatt acttgaaaga acatccagaa 360
aaggtttatc agaaaattga aagcacacta aaggatatag agagagaatt aaaggacagg 420
ggaatagaag tctggctgag acctgagttg acgggaaagc cgacccaatt tggagatctg 480
aaagaattaa ttaaattaag tcaaaaccta gagcttgttc ttcccgcaat agactttgcc 540
catgcccatg cgaggaataa gggaaagtgt aactctgaag aagagtggag agagatgcta 600
gctttaattg aaaacgagct tgggagagag gcattagata acatgcatat tcacataagt 660
ggaattgaat acacagaaaa gggagaaaag aggcatctca atctagagga gagcgatctt 720
aaatgggaag atctactcaa agttctcaaa gaatttaaag ttaagggcgt tgtaataagt 780
gagagcccca atatagaagg ggatgctctg cttatgaaga aaaagtggga agagctaaaa 840
atttaa 846
<210>6
<211>281
<212>PRT
<213>激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400>6
Met Phe Lys Ile Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly Ile Pro Leu
1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ile Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly Val Asn Ile
35 40 45
Arg Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Lys Tyr Val Ala Lys Lys Asn Asp
50 55 60
Val Val Leu Thr Ala His Ala Pro Tyr Tyr Ile Asn Leu Asn Ala Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Lys Val Glu Ser Ser Lys Arg Arg Ile Ile Gln Ser Ala
85 90 95
Glu Arg Leu Tyr Glu Ala Gly Gly Trp Ser Val Val Phe His Ala Gly
100 105 110
Tyr Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Lys Val Tyr Gln Lys Ile Glu Ser
115 120 125
Thr Leu Lys Asp Ile Glu Arg Glu Leu Lys Asp Arg Gly Ile Glu Val
130 135 140
Trp Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gly Lys Pro Thr Gln Phe Gly Asp Leu
145 150 155 160
Lys Glu Leu Ile Lys Leu Ser Gln Asn Leu Glu Leu Val Leu Pro Ala
165 170 175
Ile Asp Phe Ala His Ala His Ala Arg Asn Lys Gly Lys Cys Asn Ser
180 185 190
Glu Glu Glu Trp Arg Glu Met Leu Ala Leu Ile Glu Asn Glu Leu Gly
195 200 205
Arg Glu Ala Leu Asp Asn Met His Ile His Ile Ser Gly Ile Glu Tyr
210 215 220
Thr Glu Lys Gly Glu Lys Arg His Leu Asn Leu Glu Glu Ser Asp Leu
225 230 235 240
Lys Trp Glu Asp Leu Leu Lys Val Leu Lys Glu Phe Lys Val Lys Gly
245 250 255
Val Val Ile Ser Glu Ser Pro Asn Ile Glu Gly Asp Ala Leu Leu Met
260 265 270
Lys Lys Lys Trp Glu Glu Leu Lys Ile
275 280
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列，3’被磷酸盐修饰的寡核苷酸
<400>7
gctgctctgt gcatccgagt gg 22
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列，寡核苷酸引物
<400>8
aacctcgtaa ccttcggtac actcggatgc acagagcagc 40
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>9
ccaggatttt tgatgggaca cg 22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>10
gctgctctgt gcatccgagt gg 22
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>11
ccaggatttt tgatgggaca cg 22
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>12
ataatccacc tatcccagta ggagaaat 28
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>13
tttggtcctt gtcttatgtc cagaatgc 28
<210>14
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>14
ataatccacc tatcccagta ggagaaat 28
<210>15
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>15
tttggtcctt gtcttatgtc cagaatgc 28
<210>16
<211>281
<212>PRT
<213>激烈火球菌(Pyrococcus horikoshii)
<400>16
Met Phe Lys Ile Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly Ile Pro Ile
1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ile Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly Ile Asn Ile
35 40 45
Lys Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Lys Tyr Val Ala Glu Lys Asn Asp
50 55 60
Ile Val Leu Thr Ala His Ala Pro Tyr Tyr Ile Asn Leu Asn Ala Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Lys Val Glu Ala Ser Lys Arg Arg Ile Ile Gln Ser Ala
85 90 95
Glu Arg Leu Tyr Glu Ala Gly Gly Trp Ser Val Val Phe His Ala Gly
100 105 110
Tyr Tyr Leu Lys Gln Pro Lys Glu Ser Val Tyr Gln Lys Ile Leu Ser
115 120 125
Ala Leu Lys Glu Ile Gln Lys Glu Leu Met Asp Lys Gly Ile Lys Val
130 135 140
Trp Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gly Lys Pro Thr Gln Phe Gly Asp Leu
145 150 155 160
Lys Glu Leu Val Lys Leu Ser Gln Glu Leu Glu Leu Val Leu Pro Ala
165 170 175
Ile Asp Phe Ala His Ala His Ala Arg Asn Lys Gly Lys Cys Asn Thr
180 185 190
Glu Glu Glu Trp Arg Glu Met Leu Ala Leu Ile Glu Asn Glu Leu Gly
195 200 205
Arg Glu Ala Leu Asp Asn Met His Ile His Ile Ser Gly Ile Glu Tyr
210 215 220
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Arg His Leu Asn Leu Glu Glu Ser Asp Leu
225 230 235 240
Lys Trp Glu Asp Leu Leu Lys Val Leu Lys Glu Phe Arg Val Lys Gly
245 250 255
Val Ile Ile Ser Glu Ser Pro Asn Ile Glu Gly Asp Ala Ile Leu Met
260 265 270
Lys Lys Lys Trp Glu Glu Leu Lys Ile
275 280
<210>17
<211>281
<212>PRT
<213>激烈火球菌Pyrococcus abyssi
<400>17
Met Phe Lys Ile Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly Ile Pro Ile
1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ile Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly Ile Asn Ile
35 40 45
Lys Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Lys His Val Ala Lys Lys Asn Asp
50 55 60
Val Val Leu Thr Ala His Ala Pro Tyr Tyr Ile Asn Leu Asn Ala Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Lys Val Glu Ala Ser Lys Arg Arg Ile Ile Gln Ser Ala
85 90 95
Glu Arg Leu Tyr Glu Ala Gly Gly Trp Ser Leu Val Phe His Ala Gly
100 105 110
Tyr Tyr Leu Lys Gln Pro Pro Glu Leu Val Tyr Glu Arg Ile Lys Ser
115 120 125
Glu Leu Lys Asp Ile Glu Lys Glu Leu Leu Asp Arg Gly Ile Lys Val
130 135 140
Trp Ile Arg Pro Glu Leu Thr Gly Lys Pro Thr Gln Phe Gly Asn Leu
145 150 155 160
Met Glu Leu Ile Arg Leu Ser Gln Asp Leu Glu Leu Val Leu Pro Ala
165 170 175
Ile Asp Phe Ala His Ala His Ala Arg Asn Lys Gly Lys Cys Asn Ser
180 185 190
Glu Glu Glu Trp Arg Glu Met Leu Thr Leu Ile Glu Lys Glu Leu Gly
195 200 205
Arg Glu Ala Leu Asp Asn Met His Ile His Ile Ser Gly Ile Glu Tyr
210 215 220
Ser Asp Lys Gly Glu Lys Arg His Leu Asn Leu Gln Glu Ser Asp Met
225 230 235 240
Arg Trp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Leu Lys Glu Phe Lys Val Lys Gly
245 250 255
Val Val Ile Ser Glu Ser Pro Asn Ile Glu Gly Asp Ala Ile Leu Met
260 265 270
Lys Lys Lys Trp Glu Glu Leu Lys Ile
275 280
在以下的说明中，广泛利用到许多重组DNA技术术语，为了能令说明书和权 利要求书明晰且更好地理解，提供了以下术语的定义。
核苷酸：本文的“核苷酸”是指碱基-糖-磷的复合物。核苷酸是核酸(DNA 和RNA)序列的基本单体构成单位。核苷酸还包括脱氧核糖三磷酸如dATP，dITP， dUTP，dGTP，dTTP及其衍生物。如：(.alpha.S)dATP，7-脱氧-dGTP，和 7-脱氧-dATP。核苷酸在本文中还应包括双脱氧核糖三磷酸及其衍生物。例如脱 氧核糖三磷酸包括ddATP，ddCTP，ddGTP，ddITP和ddTTP，但不仅限于以上例 子。在本发明中，核苷酸包括未标记种，然后用各种技术带上可检测的标记核苷 酸。可检测的标记，例如有：放射性同位素，荧光标记，化学发光标记及酶标记。
寡核酸：指由一系列的核苷酸通过其戊糖3′位与相邻核苷酸5′位形成磷 酸骨架而共价结合在一起的序列所构成的合成的或天然的分子。
基因：指含有表达出多肽，蛋白或功能性RNA所需信息的DNA序列，包括启 动子，结构基因以及其他涉及表达蛋白或功能RNA的序列。
结构基因：指一般能被转录成mRNA的DNA序列。然后这些mRNA又能翻译成 为特异的多肽氨基酸序列。
足够纯化：“足够纯化”指的是目的纯化蛋白本质上不含有与目的蛋白所天 然结合的杂质酶的酶活性。细胞组分杂质包括，但不限于，5’磷酸酶、激酶、连 接酶、外切酶、内切酶或DNA聚合酶。
纯化：此处是指相比较于培养物中的平均水平提高酶活性，即提高每单位重 量蛋白的活性，不是指将蛋白纯化得非常均一。
引物：指单链寡核苷酸，它能通过与核苷酸单体共价结合而延伸从而扩增或 聚合成核酸分子。
模板：指双链、单链的核酸分子，它能够被扩增、合成或测序。如果是双链 DNA分子，在其被扩增，合成或测序前，先将双链变性成为一条第一链和一条第 二链将促进反应。与部分模板序列互补的引物在合适的条件与模板杂交，然后聚 合酶合成一个与模板或部分模板互补的分子。这个新合成的分子与原始模板长度 一样或短于原始模板。
整合：此处指成为核酸(e.g.DNA)分子或引物的一部分。
扩增：指在体外通过应用DNA聚合酶提高某个核酸序列的拷贝数。DNA扩增 导致核苷酸整合到DNA分子的引物上由此形成了与DNA模板互补的新DNA分子。 一个扩增反应包含了DNA复制的多个循环。例如包括PCR，一个PCR反应的5-100 变性、褪火、合成新分子的循环。
聚合酶链式反应(PCR)：包括合成一系列引物与目标DNA序列两端互补。引 物与目的DNA，热稳定的DNA聚合酶。4种脱氧核苷酸(A、T、C、G)溶液被加 热到足以使DNA互补双链分开的温度(约95℃)，然后温度降至使引物与目的DNA 两端序列结合，然后混合液再升温(约72℃)合成DNA。此温度延续一段时间后， 混合液再次达到足以解开新合成的DNA双链的温度。于是完成第一个循环，混和 液随后降温，再重复上述的过程(循环)。
热稳定：指能耐(抵抗)热变性的酶。嗜温性酶加热后可被失活，例如：T4 的核苷酸激酶的3′磷酸酶活性在75℃/min就失去。在此发明中，相比较于嗜 温性酶如T4的核苷酸激酶，热稳定的3′磷酸酶活性更能耐受热(高温)不失活。 实际上，一个热稳定酶并不是意味这种酶能无限制(完全)地耐高温，高温(热) 处理还是在某种程度上会降低酶的活性。相比较于嗜温性酶，一个热稳定酶往往 具有更高的最适温度。
异源性：指两个不同来源的DNA片段在本质上没有遗传或物理上的相关性， 异源性同时也可描述为在物理或遗传上有关联的分子，但这种关联在本质上完全 不同。
同源性：在此用于两个不同核酸序列之间的比较。为此同源性的评价可认为 是相同碱基的百分比。不包括为了获得较好的序列对比而引入的缺口。同源性比 值可用核酸杂交技术评价，众所周知，也可通过比较两个序列的精确碱基的序列 来确定。本说明书中的“充分同源序列”指的是序列(“A”)能和序列(“B”)杂 交(序列B与本发明的序列互补)。因此在A序列和B序列之间形成的双链分子 的Tm值在20℃范围内浮动，B序列和发明序列之间形成的双链分子的Tm值应该 在10℃范围内浮动。
此外，同源性实质上可理解为：A和B在严谨的条件，即温度介于50-70℃， 双倍浓度的SSC缓冲液(2倍NaCl 17.5g/l及8.8g/l柠檬酸钠)，0.1％十二烷 基硫酸钠(SDS)下杂交，然后用在相同温度下，用浓度减少的SSC缓冲液，如1 倍、1/2、1/10强度SSC(含0.1％SDS)来漂洗。然而，最适条件会有很大不同， 取决于特定杂交反应。
启动子：在转录起启子上游的一段DNA序列，包含有转录必须的调控区域。 在本发明的DNA构建中，所适用的启动子包括病毒、真菌、细菌、动物和植物启 动子，它可以选择成为组成型启动子和诱导型启动子，如果是诱导型启动子，它 会被诱导物激发而提高转录速率。相反如果是组成型的启动子，那么它的转录就 不被诱导物调控或基本不受控制。组成型启动子例如包括噬菌体的Int启动子， pBR322的内酰胺酶基因的bla启动子。原核诱导型启动子包括：噬菌体的左右 主启动子(Pr和Pl)，trp，recA，lacZ，lacI，tet，gal，trc，及tac启动 子和E.coli.。B subtilis启动子包括α-淀粉酶(Ulmanen et al.，J. Bacteriol 162：176-182(1985))和噬菌体启动子(Gryczan，T.，In：The Molecular Biology of Bacilli，Academic Press，New York(1982))。链霉菌 启动子(Ward et al.，Mol.Gen.Genet.203：468478(1986))。Glick，J.Ind. Microbiol.1：277-282(1987)；Cenatiempto，Y.，Biochimie 68：505-516 (1986)；and Gottesman，Ann.Rev.Genet.18：415-442(1984).有原核启动子 的综述。在原核细胞内表达同时要求核糖体结合位点在基因编码序列的上游。 Gold et al.，Ann.Rev.Microbiol.35：365404(1981)描述过这类核糖体结合 位点。
克隆载体：一种DNA分子，如：质粒，柯斯粒，噬菌体，它具有在宿主细胞 自我复制的能力。往往包含一个标记基因，一个或少数几个限制性内酶切识别位 点，用来插入外源DNA序列而不影响载体的基本的生物功能。
表达：指一个结构基因产生多肽或者RNA分子的过程。它包括基因转录成 mRNA以及随后翻译成蛋白。
表达载体：指DNA分子含有用于在宿主细胞中表达的基因，通常基因的表达 是在某个调控元件，包括组成型启动子和诱导型启动子，调控元件增强子的调控 之下。此外的“调控元件”是指控制及调节基因表达的DNA序列。这样一个基因 可被说成可调控地连接到一个调控元件上，意味着这个调控元件指导该基因表达 所以才连接上。
重组宿主：含有克隆载体或者表达载体的原核或真核细胞，也包括原核或真 核细胞的遗传特性被改造。
本发明“末端用阻断基团改造的寡核苷酸”是指一个合成的或天然的寡核苷 酸在其3’末端的氧原子与阻断基团共价结合。例如阻断基团是3’磷酸基和3’磷 酸羟乙酸。
阻断基团由一个热稳定用相应的热稳定酶去除，此酶称之为“热稳定的3’- 阻断基团去除酶(TBGRE)本发明的TBGRER指一种能在38℃以上温度有效去除 3’-阻断基团的天然的或者人工酶。TBGRE例子包括3′多聚核苷酸磷酸酶和3′ 多聚核苷酸磷酸二酯酶，它们能分别去除3′磷酸基和3′磷酸羟乙酸基。此外 一个熟练的技术人员知道某些氨基酸替代物被认为不影响多肽的活性(例如，用 GCG的BESTFIT程序来判断保守氨基酸替代物)。2个多肽有相似的序列就可能有 相似的功能。两个多肽间的“相似性”通过比较氨基酸序列和它们的保守氨基酸 替代物来确定。这是常见的方法，可用计算机程序如BLAST来完成。
其它本文所用的分子、细胞生物学和DNA重组上的术语应该被该领域的普通 技术人员所掌握。
提高多聚核苷酸合成的特异性及改进PCR反应灵敏度和特异性的方法
本发明通过在引物的3′羟基末端加上一个阻断基团，该基团可用相应的热 稳定3′基团去除酶去除，热稳定3′基团去除酶只有在反应开始，温度升高时 才恢复活性，从而克服了在室温下由于引物错配而引起的非目的核酸的扩增。
本发明中，提高多聚核苷酸合成的特异性和灵敏度的方法，如图1所示。(A)， 低温时，传统引物与非目的核酸发生错误配对(褪火)，然后在聚合酶作用下引 物延伸(indicated by Pol.)。新合成的DNA在较高的温度时，可作为模板，例 如在随后的PCR循环中，从而产生高的背景和低产量的目的产物。相反，(B)显 示使用3′末端有阻断基团修饰的引物时，3′阻断基团阻止较低温度下的错配 引物延伸。而在较高的温度时，TBGRE能特异、有效地去除相应的3′阻断基团， 经修饰引物转化为传统引物，在DNA聚合酶的作用下合成DNA。结合经修饰的引 物和TBGRE的作用能提高PCR及PCR相关技术的特异性和灵敏性。左边的垂直温 度条显示了这些反应发生的温度。
在本发明之前，从来没有人使用过以保护引物3′羟基末端来提高合成多聚 核苷酸分子的特异性。
本发明中的阻断基团具体来说可以是磷酸残基，而TBGRE相应是热稳定3′ 多聚核苷酸磷酸酶。本发明中的阻断基团是磷酸羟乙酸，TBGRE是热稳定3′多 聚核苷酸磷酸二酯酶。
在本发明中，3′多聚核苷酸磷酸酶在温度低于38℃时没有任何可检测的活 性，温度高于95℃时仍有活性。该种酶的最适温度范围为高于40℃，超过45℃ 较好，超过50℃仍很好，超过55℃更好，超过60℃最好。
例如，DNA合成中，与DNA/RNA模板互补的寡核苷酸引物的3′末端的磷酸 残基，可阻止在逆转录酶(RT)或者DNA聚合酶作用下的引物延伸。在某个较高温 度(例如高于38℃)，热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶能去除引物3′末端的磷酸基 团，令引物在RT或者DNA聚合酶作用下延伸。引物与非特异目的序列配对(褪 火)，结合3′末端带磷酸基团的寡核苷酸引物和3′多聚核苷酸磷酸酶作用能阻 止低温下，在RT或者DNA聚合酶作用下的非目的序列的引物延伸。
本发明采用3′末端受保护的引物和TBGRE可剔除引物错配以及引物二聚 体。适合于本发明的TBGRE，在温度低于38℃以下没有任何可检测的活性。由于 在本发明中只需要使用非常少量的TBGRE，可以避免为了与DNA聚合酶分隔开来， 而把PCR试剂和抗体封装的麻烦。
之所以存在这些优点是因为可以把3′羟基末端带修饰的引物、TBGRE与热 稳定DNA聚合酶和/或者反转录酶混合在一起。在任何温度下，即使反应混合物 中含有反应所需的各种成分，包括dNTP和金属辅因子，经修饰的引物也不会在 DNA聚合酶和/或者反转录酶的作用下延伸。当温度高于38℃时，TBGRE能有效 地去除引物的3′末端的阻断基团，使之成为DNA聚合酶和/或者反转录酶合适 的引物。
目前本发明的方法不影响扩增产物处理和分析，该方法还有另外的优点是能 应用到自动化中，而这恰好是传统方法，如用胶囊储存PCR试剂，用DNA聚合酶 的抗体或者修饰DNA聚合酶所不能做到的。
因此，在使用3’带修饰引物和相应的TBGRE下，可通过调节反应混合物温度 达到或者低于38℃来控制PCR，提高温度到达所需水平来持续反应。
本发明提供了经3’-阻断基团修饰的寡核苷酸和有特异活性去除寡核苷酸分 子3’末端阻断基团而不是5’末端的TBGRE。
3′磷酸酶的纯化
从嗜热古细菌Pyrococcus furiosus(Pfu).中纯化热稳定3′多聚核苷酸 磷酸酶是本发明另一组成部分。在4-20％SDS的PAGE中，通过与标准分子量 (Protein BenchMarker，Life Technologies，Inc.Rockville，Md.)相比较， 3′多聚核苷酸磷酸酶分子量为31kD，温度高于38℃时，高于45℃效果较好， 高于50℃效果更好，它能特异有效地去除引物3′末端的磷酸基团，为DNA聚合 酶和/或者反转录酶提供合适的引物。
这种酶的一个独特性质是在74℃有最高的活性，在37℃时或以下活性很低。 因此可通过从74℃降到37℃的低温下来关闭酶的活性。
目前，已知3′多聚核苷酸磷酸酶的活性与一些参与核酸新陈代谢有关的纯 化酶，如T4多核苷酸激酶(Ri chardson，C.C.The Enzymes，edited by Boyer， P.D.，Academic Press，Inc，New York，N.Y.XIV：299-314(1981))和碱性 磷酸酶(Maunders，M.J.Methods in Molecular Biology.Edited by Burrell， M.M.，Humana Press，Inc.，Totowa，N.J.，16：331-341(1993))相关。有人 认为可能存在特殊的3′多聚核苷酸磷酸活性的酶，可能参与DNA损伤修复(Yang， S.W.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(21)：11534-9(1996))。
在本方法发明之前，没有报道过存在没有其它酶活性的特异3′多聚核苷酸 磷酸酶，如5′多聚核苷酸磷酸酶活性，DNA聚合酶活性，连接酶活性等等。本 方法的发明者首次获得纯化的3′多聚核苷酸磷酸酶。可用以下的步骤进行纯 化：
1).3′多聚核苷酸磷酸酶活性检测：可用不同的方法分析3′多聚核苷酸 磷酸酶(Jilani，A，et al.J.Bio.Chem.274(34)：24176-86(1999)；Olivares M.et al J.Bio.Chem.274(34)：23883-86(1999))。例1所描述的是首选的 方法，它能检测到许多杂质的活性，如外切酶，内切酶，5′磷酸酶，连接酶和 DNA聚合酶。
2).3′磷酸酶的分离和纯化：超声波处理Pfu细胞，硫酸铵沉淀，用几种 商业品化分离介质层析。
3).在SDS PAGE上确定3′多聚核苷酸磷酸酶的蛋白带：酶纯化过程中， 层析分离得到的各组分的蛋白质用SDS-PAGE分析，并检测相同组分里的酶活性， 如用图3所示的方法。仔细分析层析每个组分的蛋白质以及对应于酶活性的峰 值，再将SDS-PAGE中的蛋白用传统的复性方法(Yang，S.W.，Becker，F.F.， Chan，J.Y.H.J.Bio.Chem.265：18130-34(1990))验证。在SDS-PAGE中， 通过与蛋白质标准分子量相比较来确定纯化酶的相对分子量。
有3′多聚核苷酸磷酸酶活性的多肽及其DNA的编码序列
本发明提供有热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶活性的多肽，编码该多肽的核苷 酸分子，含有多聚核苷酸分子的DNA载体，含有上述分子的宿主细胞以及用上述 细胞产生重组3′多聚核苷酸磷酸酶的方法。
目前本发明中来自Pfu的3′多聚核苷酸磷酸酶基因含有846个碱基对(e.g.， SEQID NO：5)，编码281个氨基酸(SEQ ID NO：6)。用BLAST程序(Altschul S F. et al.Nucleic Acids Res.25：3389-4302(1997))在Genbank中搜索，显示 SEQ ID NO：6分别与来自Pyrococcus horikoshii OT3的假设的开放阅读框(Ph 1905)和来自Pyrococcus abyssi的ORF(Pab 1103)各有91％和88％的碱基相同。 SEQ ID NO：6和有3′多聚核苷酸磷酸酶活性的已知蛋白如T4多聚核苷酸激酶间 不存在显著的同源性(超过35％的碱基相同)。因此，很可能这两个开放阅读框(Ph 1905and Pab 1103)与SEQ ID NO：6编码相似的具有3′多聚核苷酸磷酸酶功能 的多肽。
本发明包括多肽和编码此多肽的DNA分子，以及在同一性或位置上有一或多 个氨基酸残基差别的SEQ ID NO：6的类似物、片段或者衍生物，涵盖了缺失类似 物即含有的特异氨基酸残基数目少于SEQ ID NO：6；替代类似物即一个或多个特 异残基被其它残基取代；扩增类似物即在原来多肽的的末端或者中间部位，加入 另外的残基后仍保留一些或者所有天然酶的活性。
熟练的技术人员会识别产物的类似物，片段和衍生物。目前本发明所包括的 多肽有：SEQ ID NO：6多肽，与SEQ ID NO：6至少有92％同源性的多肽(氨基酸 序列至少92％相同)，与SEQ ID NO：6至少有95％同源性的多肽(氨基酸序列至少 95％相同)，包括这类多肽的部分或片段，此多肽片段含有至少30个氨基酸或至 少50个氨基酸。众所周知两个多肽的“相似性”是通过比较两个多肽的氨基酸 序列以及它们的保守氨基酸序列来判断。可用计算机程序如BLAST来完成该种判 断。
目前本发明中的多聚核苷酸片段或部分含有至少15个核苷酸，或至少20个 核苷酸，最好是至少25个核苷酸。此多聚核苷酸片段或者部分可用于合成本发 明中的全长多聚核苷酸。
熟练的技术人员可从图8给出的序列片段来确定序列的相似性，同一性序列 和类似物设计。熟练的技术人员可通过识别图8中的判断哪些氨基酸残基是保守 的，哪些是可变的而不影响多肽的酶活性。此外，熟练的技术人员都知道某些氨 基酸替代物是被认为不影响多肽的活性的，可用GCG的BESTFIT程序来确定保 守氨基酸替代物(see e.g.determining the conserved amino acid substitutions using the BESTFIT program of the Genetic Computing Group， Madison，Wis.)。
本发明提供的核苷酸序列如SEQ ID NO：5，与已公开的核苷酸序列有部分序 列简并同源，本发明同样提供SEQ ID NO：5的DNA序列。简并的DNA序列也编码 SEQ ID NO：6的氨基酸序列，但有部分核苷酸编码序列不同。
体外表达3′多聚核苷酸磷酸酶的载体和细胞
熟练的技术人员都知道3′磷酸酶的结构基因克隆可在重组宿主细胞中表 达。为了能在体外更好地表达3′磷酸酶，常见的诱导型或组成型的启动子可在 重组宿主细胞中表达高水平的3′多聚核苷酸磷酸酶结构基因。与之类似的，技 术上常用的高拷贝数的载体可用于达到高水平的表达量。可诱导出高拷贝数的载 体有助于在重组宿主细胞中提高3′磷酸酶的表达量。
为了在原核细胞(such as，E.coli，B subtilis，Pseudomonas，etc.)中 表达结构基因，必须将结构基因连接上一个原核细胞的启动子。3′磷酸酶基因 原有的启动子可在原核宿主细胞中起作用，表达3′磷酸酶基因，因此可用于表 达3′磷酸酶基因。
为了提高本发明的3′磷酸酶在真核细胞中的表达，可使用常见的真核启动 子及真核宿主细胞。但是，最好在原核宿主细胞中表达3′磷酸酶。大量表达3 ′磷酸酶的最合适的原核宿主细胞是E.coli。
3′多聚核苷酸磷酸酶生产
本发明中的酶是通过发酵含有可表达的3′磷酸酶的重组宿主细胞而来的。 但是，本发明所使用的酶可从任何可产生本发明3′磷酸酶的菌株中分离和纯 化。同时本发明包括含有酶活性的3′磷酸酶的片段。这类片段包括蛋白水解片 段，融合到其它多肽的片段以及各种片段。
在培养基中加入各种可被含有3′磷酸酶基因的宿主细胞吸收的营养成分。 根据不同的菌株和培养基的组分选择最适的培养条件。加入抗生素以确保筛选出 含有目的基因的载体DNA。ATCC目录等(Sambrook et al.，In：Molecular Cloning， a Laboratory Manual(2.sup.nd ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))描述了培养基的配制。
首先，产生3′磷酸酶的宿主细胞可从液体培养基中分离，如用离心方法。 将收集到的微生物细胞悬浮到合适的缓冲液中，然后用超声波破细胞或者用其它 常用的方法在缓冲液中提取酶。用超声波离心或者离心去除细胞碎片后，用标准 蛋白纯化技术，如抽提、沉淀、层析、亲合层析及电泳等方法纯化3′磷酸酶。 在纯化过程采用常见的分析方法检测3′磷酸酶，(例如，Jilani，A，et al.J Bio.Chem.274(34)：24176-86(1999)；Olivares M.et al.J.Bio.Chem. 274(34)：23883-86(1999)；Yang，S.W.，Burgin，A.B.Jr.，Huizenga，B. N.，Robertson，C.A.，Yao，K.C.，and Nash，H.A.Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.93(21)：11534-9(1996))，并可用经典生化纯化方法检测这个酶。
用热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶作为标记检测基因表达
另一方面，本发明提供检测蛋白表达产物的方法：a)构建包含编码目的蛋 白和编码热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶蛋白的DNA序列的融合DNA分子；b)把 融合DNA分子插入表达载体上；c)把表达载体转化进入合适的宿主细胞；d)在 能表达融合蛋白的条件下培养细胞；最后e)分析热稳定3′磷酸酶的活性。
用热稳定3′磷酸酶作为报告基因来研究基因表达的调节
热稳定3′磷酸酶基因能用于研究基因表达调节。例如，细胞含有有源自基 因的调控元件的DNA分子，而无编码Pfu3′磷酸酶的基因，将此调控元件连接 到一段编码Pfu3′磷酸酶的DNA序列上。通过分析3′磷酸酶，可分析调控元件 的功能。细胞可从细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、线虫细胞、植物或动物细胞 中筛选。最合适的动物细胞包括，但不限于，Vero细胞，HeLa细胞，Cos细胞， CV1细胞和各种初期的哺乳动物细胞。具体来说，细菌细胞是Escherichia coli.。
用重组Pfu 3′多聚核苷酸磷酸酶来检测配体及其浓度
本发明中的3′磷酸酶还有几个潜在的用途，如非同位素方法检测蛋白和核 酸。由于3′酸磷酸酶具有高的热稳定性，所以可用于直接与蛋白或核酸探针交 联。
与众不同的是纯化的重组Pfu 3′磷酸酶或者它的活性片段可用于诊断，以 确定样品中配基的出现或者浓度。样品可以是液体或者是组织样品，例如，来自 可能带有某种特定抗原或DNA片段的病人。熟练的技术人员将发现任何可使用酶 催化系统的检测，可使用本发明的检测方法。
本发明的具体分析方法如下：(1)首先将充分纯化的3′多聚核苷酸磷酸酶 或其活性片段连接上能够特异结合到配基并能被检测的试剂中，从而获得试剂- 磷酸酶复合物；(2)将试剂-磷酸酶复合物加入到可能含有配基的待测样品中； (3)去除不结合上特定配基的试剂-磷酸酶复合物；(4)能被3′多聚核苷酸磷酸 酶催化的可检测到的试剂混合到试剂-磷酸酶混合物上；最后(6)检测被3′多聚 核苷酸磷酸酶催化的反应，其中阳性反应说明样品中存在配基。
通过把反应的总量和配基的浓度关联起来[Noya，O.and Alarcon de Noya B. Immunol Lett 63(1)：53-6(1998)；Walenga，J.M.and Fareed，J.Clin Lab Med 14(4)：709-28(1994)]，本方法同样可用于测定样品中配基的浓度。为了 测定配基的浓度，要确定实验中3′磷酸酶的活性值，可通过与已知浓度的配基 或者标准测量来确定，如斜率可通过已知配基的浓度来确定。例如，抗HIV特定 表面蛋白的抗体可与纯化的重组3′磷酸酶或片段连接。通过3′磷酸酶活性与 已知浓度的表面蛋白相比的标准曲线，可知道样品中HIV表面蛋白的浓度。
现有的方法可检测各种配基。配基可以是有抗原性质的蛋白、多肽或核酸， 如DNA或RNA。
配基是抗原或抗原类分子时，则能特异结合上这类配基的试剂可以是抗体或 这类抗体有活性的片段。试剂同样可以是能杂交或结合上特异核酸的核酸探针， 如DNA或RNA。探针可以是与cDNA或配基的基因组片段互补的寡核苷酸。
技术人员应都知道如何把酶附加到各种试剂。把酶耦联上抗体的技术，在这 些文献中都有介绍(Kennedy et al.，Clin.Chim.Acta 70：1(1976))。这类耦 联中用到的试剂包括戊二醛，p-甲苯二异氰酸盐，各种碳化二亚胺试剂，p-苯醌 -m-高碘酸盐，N，N’-o-费尼伦蓝等等。此外可用本发明中的多种功能的多肽。
通过以下的例子阐述本发明。该发明不限于以下例子中特定条件或细节。本 说明书，任何或所有可获得的公开发表文献都可作为参考。
例1
3′多聚核苷酸磷酸酶活性检测
化学合成3′磷酸基修饰的寡核苷酸(Midland Certified Reaget Company， Midland，Tex.)。寡核苷酸序列组成如下：
5’-GCT GCTCTGTGCATCCGAGTGG-p-3’(SEQ ID No：7)
用没有3′多聚核苷酸磷酸酶活性的T4多核苷酸激酶把32P标记在寡核苷酸 5′末端(Yang，S.W.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 93(21)：11534-9(1996))。带有32P标记寡核苷酸与纯化的3′多聚核苷酸磷酸酶 混合在1×PCR反应缓冲液(10Mm Tris-HCl，pH8.3，50mM MgCl2)72℃5分钟。 加入DNA测序缓冲液，90℃加热2分钟，样品用12％的聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶 电泳分析。图4为用PhophorImager(Molecular Dynamics)定量的样品放射自显 影图。1单位的3′磷酸酶定义为能5分钟内去除5μmol多聚核苷酸的3′末端 磷酸基。
例2
从Pfu中分离和提纯3′磷酸酶
100克湿重的Pfu细胞(从Md，巴尔的摩，马里兰州大学的海洋生物技术中 心购买)悬浮在冰浴的裂解液中，20mM Tris-HCl，Ph7.5，1mM EDTA，1mM DTT， 0.2M NaCl，10mM巯基乙醇及2mM苯甲基硫磺氟化物。然后用超声波裂解细胞， Sorvall GS-3 rotor 8,200rpm离心10分钟。上清加入0.05vol的10％聚乙烯 亚胺溶液，混匀离心后用硫酸铵(饱和度45-80％)分馏。接着用磷酸纤维素柱 (P-11；Whatman，Inc.；activity eluted.apprxeq.0.6M NaCl)，Source 15S (Pharmacia；activity eluted.apprxeq.0.2M NaCl)，双链DNA-纤维素(Sigma； activity eluted.apprxeq.0.15M NaCl)，Mono S column(Pharmacia；activity eluted.apprxeq.0.35M NaCl)及肝素琼脂糖，Mono Q柱(Pharmacia；activity eluted.apprxeq.0.25M NaCl)层析，最后在Mono Q柱(Pharmacia)收集酶。3 ′磷酸酶在SDS-PAGE的位置用从SDS-PAGE中割下蛋白带，然后复性的方法来确 定(Yang，S.W.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(21)：11534-9 (1996))。
在4-20％SDS-PAGE中与标准蛋白分子量标准(Life Technologies，In)比 较，纯化的3′磷酸酶相对的分子量大约31KD。
例3
3′磷酸酶N末端的缩氨酸测序
部分已纯化的3′多聚核苷酸磷酸酶加入到7％SDS-Tricine PAGE中。SDS凝 胶中的蛋白质在转移缓冲液(0.5.times.TBE(pH 8.4)，20％methanol，0.5mM EDTA)中，电转移到PVDF膜上(Immobolin-P from Millipore)，0.5A电泳，转 移1小时。膜用考马斯亮蓝R-250染色10分钟，用100％甲醇脱色两次。切除膜 上相应于3′多聚核苷酸磷酸酶的条带。其氨基酸测序用耶鲁大学商业设备来完 成。从N末端开始以单个字母列出26个氨基酸的序列：
FKIDRLRFGTAGIPLSTPKPSTIAGI(SEQ ID NO：1).
例4
从Pfu基因组中克隆编码3’磷酸酶的基因
图2为3′磷酸酶基因克隆过程，简要阐述如下：用BLAST程序(Altschul SF. et al.Nucleic Acids Res.25：3389-4302(1997))以N末端氨基酸序列(SEQ ID NO：1)查找Genebank。查找出两段氨基酸序列有96％相似的序列。其中一段识别 序列为部分的假设的Pyrococus horikoshii OT3的开放阅读框(Ph 1950)，另一 序列为Pyrococus abyssi的部分的假设开放阅读框(Pab 1103)。两个开放阅读 框都含有C末端的23个氨基酸的相同氨基酸片段：
ISESPNIEGDAILMKKKWEELKI(SEQ ID NO：2)
SEQ ID NO：1和已知有3′磷酸酶活性的蛋白之间没有显著的同源性(超过35％的 一致性)。
为了克隆热稳定3′磷酸酶基因，本发明的发明者基于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，设计和化学合成了一对引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)：
引物1：
5’-GGAATTCGACATATGTTTAAAATAGACAGGCTAAGATTTGG(SEQ ID NO：3)
引物2：
5’-GGTACCTTAAATTTTTAGCTCTTCCCACTTTTT(SEQ ID NO：4)
限制内切酶分别识别引物1和2的5′端的Nde I和Kpn I。根据制造商 (Stratagene Inc.，Calif.)的说明，这些引物在含有Pfu基因组DNA作为模板 和Pfu DNA聚合酶的PCR混合物中使用。合成的DNA片段用1％的琼脂糖凝胶电 泳纯化。用经典方法(Sambrook et al.in：Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2.sup.nd Ed.)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))钝化3′末端，去除5′末端的磷酸基团后，把片段连接 到质粒载体pUC19上。含有DNA片段的质粒(pUC19-PNP酶)从E.coli DH5α的 单克隆菌株中提取，其片段的序列(SEQ ID NO：5)可用经典方法(PE Applied Biosystems)来测定。从已知序列推测氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。来自Pfu菌株 的3′磷酸酶基因由846个碱基，编码281个氨基酸组成。比较上述提到的另外 两个推测的ORF，本发明的Pfu 3′磷酸酶氨基酸序列与Ph 1905和Pab 1103 比较分别有91％和88％的相似性(见图8)。因此这两个ORF很可能编码与SEQ ID NO：6相似的，有热稳定3′磷酸酶功能的多肽。
例5
重组表达载体的构建
为表达和纯化重组3′磷酸酶，用Nde I和Kpn I消化质粒 DNA(pUC19-PNPtase)。含有3′磷酸酶基因的DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳纯化， 然后连接到E.coli表达载体pET-17b(Novagen，Calif.)上生成 pET-17b-PNPtase。连接反应混合物被转化到E.coli DH5α细胞。通过PCR方 法，用引物1和引物2筛选出正确的克隆。用上述方法再次检测pET-17b-PNPtase 中的3′磷酸酶基因的序列。
例6
表达和纯化源自Pfu的重组3′多聚核苷酸磷酸酶
用例5中的重组表达载体(pET-17b-PNPtase)转化到Escherichia coli(BL21(DE3))。转化产物在LB培养基中培养。在收集细菌细胞前三个小时， 用异丙基硫代-β-D-吡喃乳糖苷(IPTG)]]进行诱导处理。离心从培养液中回收 细菌细胞。用缓冲液悬浮细胞并用超声波裂解细胞。细胞抽提液加热到76℃， 20分钟。冰水中冷却10分钟，聚乙烯亚胺加入到抽提液中。回收上清，用以上 所述的硫酸铵(饱和度45-80％)方法沉淀，沉淀随后重悬于buffer R(20mM Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，0.2M NaCl，10mM巯基乙醇)中。
短暂离心后用羟磷灰石(BioRad)柱层析，3′磷酸酶用梯度为1mM到400mM 的磷酸基的缓冲液R洗提。含有3′磷酸酶的成分用上述的Mono S and Mono Q column再处理。图3显示的纯化的3′磷酸酶，不含有影响PCR反应(数据没有 列出)的外切酶活性、DNA连接酶活性和多核苷酸激酶或者5′多聚核苷酸磷酸酶 活性。
例7
重组3′磷酸酶特异去除寡核苷酸3′末端的磷酸基团。
用上述没有3′多聚核苷酸磷酸酶活性的T4多聚核苷酸激酶在3′端有磷酸 基团的寡核苷酸(SEQ ID No.7)的5′端标记sup.32P(Yang，S.W.，et al.Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.93(21)：11534-9(1996))。在最适温度，把sup.32 P标记的底物和纯化的重组3′磷酸酶混合在1×PCR缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl.sub.2)5分钟。加入DNA测序缓冲液后加热至 90℃，2分钟。样品用12％聚丙烯酰胺-7M尿素凝胶电泳分析。
例8
在Taq和Pfu DNA聚合酶作用下，依赖于热稳定3′多聚核苷酸磷酸酶的 经修饰的寡核苷酸引物延伸反应。
用sup.32P标记的3′末端有磷酸阻断基团的寡核苷酸引物(SEQ ID No：7) 与互补模板5’-AACCTCGTAACCTTCGGTACACTCGGATGCACAGAGCAGC-3’(SEQ ID NO：8) 配对，加入或者不加入纯化的重组3′多聚核苷酸磷酸酶到Taq/Pfu聚合酶中， 68℃混合分别30秒和10分钟。样品加入DNA测序缓冲液，90℃加热2分钟，然 后用12％的聚丙烯酰胺凝胶-7M尿素电泳分析。
当纯化的重组酶与经修饰的寡核苷酸引物混合在PCR反应物时，该种酶能特 异地去除引物的3′末端的磷酸基而不影响5′端(见图4)。相比之下，从Tth 而来的热稳定碱性磷酸酶，因为同时具有3′和5′磷酸酶的活性，所以不能用 于本发明以提高DNA扩增的特异性和灵敏度。5′磷酸酶的活性会破坏脱氧核苷 三磷酸((dNTP包括dATP，dTTP，dCTP及dGTP)，dNTP是PCR反应中热稳定DNA 聚合酶合成DNA的底物。
如图4所示，纯化酶在55℃到80℃温度范围内有最大的活性，这同样也是 所有用PCR方法或相关技术扩增DNA的热稳定DNA聚合酶的最适温度范围。
在本实验反应混合物内没有3′多聚核苷酸磷酸酶时，3′末端经磷酸基团修 饰的引物能在68℃稳定10分钟(图5，泳道4和5)。这两个泳道没有任何延伸 产物，说明3′磷酸基团修饰的引物在68℃稳定，能遏制Pfu DNA聚合酶3′外 切酶活性，Taq和Pfu DNA聚合酶作用下的引物的延伸。但是，在同样的反应混 合物中，含有纯化的重组3′多聚核苷酸磷酸酶及大约20pmol(常规PCR用量) 的修饰引物，68℃下不到30秒就开始延伸(图5，泳道2和3)。该结果说明3′ 多聚核苷酸磷酸酶能非常有效地去除引物3′端的磷酸基，因此所有的经修饰引 物可以转化为传统引物开始循环而不必额外的的暂停。进一步的研究说明，3′ 末端磷酸基修饰的引物可在室温下，没有3′磷酸酶的完全PCR混合物中保存几 个星期，68℃保存5天(数据没有列出)。
例9
用带修饰引物和3′磷酸酶提高PCR扩增DNA片段的特异性。
为了扩增人类β球蛋白基因的DNA片段，从人类β球蛋白基因中筛选一对引 物(Collins，F.S.and Weissman，S.M.Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 31：315-462(1984))，并化学合成含有或不含有3′末端磷酸基团的引物，预期 扩增长约2.8kb的PCR产物。
Primer 3：5’-GCT GCTCTGTGCATCCGAGTGG-p-3’(SEQ ID NO：7)及
Primer 4：5’-CCAGGATTTTTGATGGGACACG-p-3’(SEQ ID NO：9)
PCR混合物(10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl.sub.2， 200.mu.M dNTP)加入纯化的重组3′多聚核苷酸磷酸酶及Taq DNA聚合酶或者 Pfu DNA聚合酶，同时用一系列稀释梯度的人类基因组DNA作为模板。PCR反应 参数：94℃，2分钟；55℃，15秒，72℃，3分钟共30循环；94℃，15秒。琼脂糖 凝胶电泳分析PCR产物。对照实验除了没有添加3′磷酸酶及使用与修饰引物序 列相同的传统引物之外，其它PCR条件相同。
Primer 5：5’-GCTGCTCTGTGCATCCGAGTGG-3’(SEQ ID NO：10)及
Primer 6：5’-CCAGGATTTTTGATGGGACACG-3’(SEQ ID NO：11).
结果见图6
例10
用修饰引物和3′多聚核苷酸磷酸酶进行PCR，提高扩增DNA片段的特异性。
一对传统寡核苷酸引物分别互补到gag基因序列1551-1578和1638-1665 上，分别命名SK38和SK39，用于扩增115bp的DNA片段来直接检测外周血单 核细胞的HIV-1(Ou，C.Y.et al，Science 239(4837)：295-7(1988))。HIV-1 的gag基因插入质粒载体pUC19上构建作为模板的pUC19-gag。在SK38和SK39 引物3′末端化学合成磷酸基因：
Primer 7：5’-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-p-3’(SEQ ID NO：12)和
Primer 8：5’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-p-3’(SEQ ID NO：13)
PCR反应中，在Taq DNA聚合酶作用下，纯化的重组3′磷酸酶及引物7和 8用于扩增115bp的DNA片段。例9描述了PCR反应混合物含有一系列稀释梯度 的gag基因模板(pUC19-gag)和200ng的人类基因组DNA作为非特异模板。PCR 反应参数如下：94℃，2分钟；55℃，15秒，72℃，3分钟，44循环；94℃，15 秒。反应产物用琼脂糖凝胶电泳分析。对照实验是在相同的PCR反应中不加3′ 磷酸酶并加入传统的SK38和SK39引物：
Primer 9：5’-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3’(SEQ ID No.14)和
Primer 10：5’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3’(SEQ ID No.15).
结果见图7。
序列表
<110>锦可贝基因技术公司(Genecopoeia Inc.，)
<120>改良多聚核苷酸合成的方法和成分
<140>00815973.4
<141>1999-09-22
<150>US09/404,258
<151>1999-09-22
<160>17
<210>1
<211>26
<212>PRT
<213>激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400>1
Phe Lys Ile Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly Ile Pro Leu Ser
1 5 10 15
Thr Pro Lys Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ile
20 25
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400>2
Ile Ser Glu Ser Pro Asn Ile Glu Gly Asp Ala Ile Leu Met Lys Lys
1 5 10 15
Lys Trp Glu Glu Leu Lys Ile
20
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>3
ggaattcgac atatgtttaa aatagacagg ctaagatttg g 41
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>4
ggtaccttaa atttttagct cttcccactt ttt 33
<210>5
<211>846
<212>DNA
<213>激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400>SEQUENCE：5
atgtttaaaa tagacaggct aagatttgga actgctggaa tacctctttc tactccaaaa 60
ccttctacaa tagctggaat tgaaagggtt agagagcttg gactagatgc catggagctt 120
gaatttgtga gaggagtaaa tataaggccc gaactggcaa agaaaataaa atacgtagca 180
aaaaagaacg acgttgtttt aacagcgcat gccccatact acataaactt aaacgccaaa 240
gagaaggaaa aagtggaaag tagcaaaagg agaattattc agagtgcaga aaggctatat 300
gaggcaggag gatggagcgt agtttttcat gctggctatt acttgaaaga acatccagaa 360
aaggtttatc agaaaattga aagcacacta aaggatatag agagagaatt aaaggacagg 420
ggaatagaag tctggctgag acctgagttg acgggaaagc cgacccaatt tggagatctg 480
aaagaattaa ttaaattaag tcaaaaccta gagcttgttc ttcccgcaat agactttgcc 540
catgcccatg cgaggaataa gggaaagtgt aactctgaag aagagtggag agagatgcta 600
gctttaattg aaaacgagct tgggagagag gcattagata acatgcatat tcacataagt 660
ggaattgaat acacagaaaa gggagaaaag aggcatctca atctagagga gagcgatctt 720
aaatgggaag atctactcaa agttctcaaa gaatttaaag ttaagggcgt tgtaataagt 780
gagagcccca atatagaagg ggatgctctg cttatgaaga aaaagtggga agagctaaaa 840
atttaa 846
<210>6
<211>281
<212>PRT
<213>激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
<400>6
Met Phe Lys Ile Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly Ile Pro Leu
1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ile Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly Val Asn Ile
35 40 45
Arg Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Lys Tyr Val Ala Lys Lys Asn Asp
50 55 60
Val Val Leu Thr Ala His Ala Pro Tyr Tyr Ile Asn Leu Asn Ala Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Lys Val Glu Ser Ser Lys Arg Arg Ile Ile Gln Ser Ala
85 90 95
Glu Arg Leu Tyr Glu Ala Gly Gly Trp Ser Val Val Phe His Ala Gly
100 105 110
Tyr Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Lys Val Tyr Gln Lys Ile Glu Ser
115 120 125
Thr Leu Lys Asp Ile Glu Arg Glu Leu Lys Asp Arg Gly Ile Glu Val
130 135 140
Trp Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gly Lys Pro Thr Gln Phe Gly Asp Leu
145 150 155 160
Lys Glu Leu Ile Lys Leu Ser Gln Asn Leu Glu Leu Val Leu Pro Ala
165 170 175
Ile Asp Phe Ala His Ala His Ala Arg Asn Lys Gly Lys Cys Asn Ser
180 185 190
Glu Glu Glu Trp Arg Glu Met Leu Ala Leu Ile Glu Asn Glu Leu Gly
195 200 205
Arg Glu Ala Leu Asp Asn Met His Ile His Ile Ser Gly Ile Glu Tyr
210 215 220
Thr Glu Lys Gly Glu Lys Arg His Leu Asn Leu Glu Glu Ser Asp Leu
225 230 235 240
Lys Trp Glu Asp Leu Leu Lys Val Leu Lys Glu Phe Lys Val Lys Gly
245 250 255
Val Val Ile Ser Glu Ser Pro Asn Ile Glu Gly Asp Ala Leu Leu Met
260 265 270
Lys Lys Lys Trp Glu Glu Leu Lys Ile
275 280
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列，3’被磷酸盐修饰的寡核苷酸
<400>7
gctgctctgt gcatccgagt gg 22
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列，寡核苷酸引物
<400>8
aacctcgtaa ccttcggtac actcggatgc acagagcagc 40
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>9
ccaggatttt tgatgggaca cg 22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>10
gctgctctgt gcatccgagt gg 22
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>11
ccaggatttt tgatgggaca cg 22
<210>12
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>12
ataatccacc tatcccagta ggagaaat 28
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>13
tttggtcctt gtcttatgtc cagaatgc 28
<210>14
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>14
ataatccacc tatcccagta ggagaaat 28
<210>15
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列：引物
<400>15
tttggtcctt gtcttatgtc cagaatgc 28
<210>16
<211>281
<212>PRT
<213>激烈火球菌(Pyrococcus horikoshii)
<400>16
Met Phe Lys Ile Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly Ile Pro Ile
1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ile Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly Ile Asn Ile
35 40 45
Lys Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Lys Tyr Val Ala Glu Lys Asn Asp
50 55 60
Ile Val Leu Thr Ala His Ala Pro Tyr Tyr Ile Asn Leu Asn Ala Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Lys Val Glu Ala Ser Lys Arg Arg Ile Ile Gln Ser Ala
85 90 95
Glu Arg Leu Tyr Glu Ala Gly Gly Trp Ser Val Val Phe His Ala Gly
100 105 110
Tyr Tyr Leu Lys Gln Pro Lys Glu Ser Val Tyr Gln Lys Ile Leu Ser
115 120 125
Ala Leu Lys Glu Ile Gln Lys Glu Leu Met Asp Lys Gly Ile Lys Val
130 135 140
Trp Leu Arg Pro Glu Leu Thr Gly Lys Pro Thr Gln Phe Gly Asp Leu
145 150 155 160
Lys Glu Leu Val Lys Leu Ser Gln Glu Leu Glu Leu Val Leu Pro Ala
165 170 175
Ile Asp Phe Ala His Ala His Ala Arg Asn Lys Gly Lys Cys Asn Thr
180 185 190
Glu Glu Glu Trp Arg Glu Met Leu Ala Leu Ile Glu Asn Glu Leu Gly
195 200 205
Arg Glu Ala Leu Asp Asn Met His Ile His Ile Ser Gly Ile Glu Tyr
210 215 220
Gly Glu Lys Gly Glu Lys Arg His Leu Asn Leu Glu Glu Ser Asp Leu
225 230 235 240
Lys Trp Glu Asp Leu Leu Lys Val Leu Lys Glu Phe Arg Val Lys Gly
245 250 255
Val Ile Ile Ser Glu Ser Pro Asn Ile Glu Gly Asp Ala Ile Leu Met
260 265 270
Lys Lys Lys Trp Glu Glu Leu Lys Ile
275 280
<210>17
<211>281
<212>PRT
<213>激烈火球菌Pyrococcus abyssi
<400>17
Met Phe Lys Ile Asp Arg Leu Arg Phe Gly Thr Ala Gly Ile Pro Ile
1 5 10 15
Ser Thr Pro Lys Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ile Glu Arg Val Arg Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Asp Ala Met Glu Leu Glu Phe Val Arg Gly Ile Asn Ile
35 40 45
Lys Pro Glu Leu Ala Lys Lys Ile Lys His Val Ala Lys Lys Asn Asp
50 55 60
Val Val Leu Thr Ala His Ala Pro Tyr Tyr Ile Asn Leu Asn Ala Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Lys Val Glu Ala Ser Lys Arg Arg Ile Ile Gln Ser Ala
85 90 95
Glu Arg Leu Tyr Glu Ala Gly Gly Trp Ser Leu Val Phe His Ala Gly
100 105 110
Tyr Tyr Leu Lys Gln Pro Pro Glu Leu Val Tyr Glu Arg Ile Lys Ser
115 120 125
Glu Leu Lys Asp Ile Glu Lys Glu Leu Leu Asp Arg Gly Ile Lys Val
130 135 140
Trp Ile Arg Pro Glu Leu Thr Gly Lys Pro Thr Gln Phe Gly Asn Leu
145 150 155 160
Met Glu Leu Ile Arg Leu Ser Gln Asp Leu Glu Leu Val Leu Pro Ala
165 170 175
Ile Asp Phe Ala His Ala His Ala Arg Asn Lys Gly Lys Cys Asn Ser
180 185 190
Glu Glu Glu Trp Arg Glu Met Leu Thr Leu Ile Glu Lys Glu Leu Gly
195 200 205
Arg Glu Ala Leu Asp Asn Met His Ile His Ile Ser Gly Ile Glu Tyr
210 215 220
Ser Asp Lys Gly Glu Lys Arg His Leu Asn Leu Gln Glu Ser Asp Met
225 230 235 240
Arg Trp Glu Glu Leu Leu Lys Thr Leu Lys Glu Phe Lys Val Lys Gly
245 250 255
Val Val Ile Ser Glu Ser Pro Asn Ile Glu Gly Asp Ala Ile Leu Met
260 265 270
Lys Lys Lys Trp Glu Glu Leu Lys Ile
275 280