一种制备β-淀粉样多肽1-42纯品的方法转让专利
申请号 : CN200810043145.4
文献号 : CN100593025C
文献日 : 2010-03-03
发明人 : 徐红岩 , 任丽萍 , 李冬冬
申请人 : 吉尔生化(上海)有限公司
摘要 :
权利要求 :
1、一种制备β-淀粉样多肽1-42纯品的方法，采用高效液相色谱方法，其 特征是：包括以下步骤：a、β-淀粉样多肽1-42粗品溶解在乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤， 取滤液待用；
b、以高效液相色谱仪对过滤后粗品进行制备：通过制备色谱柱，采用紫外 检测器对样品进行监测，分段收集需要的目标产物，制备色谱条件为：色谱柱：PLRP-S，10-15μm，21.2×250mm(I.D)，所述的色谱柱内装填聚 苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料流动相：A：浓度为0.1-0.2％三氟乙酸的水溶液， B：浓度为0.1-0.2％三氟乙酸的乙腈溶液时间 A B0.01min 90-70％ 10-30％25min 10-30％ 70-90％30min 90-70％ 10-30％流速：15ml/min
波长：220nm；
c、以分析高效液相色谱仪对收集到的目标产物进行检测，将含量95％以上部 分合并为合格产品；
d、将合格产品进行浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格 即为最终产品。
2、根据权利要求1所述的一种制备β-淀粉样多肽1-42纯品的方法，其特 征是：乙腈水溶液配置时体积比：乙腈∶水＝30-50∶70-50。
3、根据权利要求1所述的一种制备β-淀粉样多肽1-42纯品的方法，其特 征是：步骤b中的流动相梯度选择0到25分钟A∶B由90-70∶10-30到 10-30∶90-70。
说明书 :
技术领域：
本发明涉及一种多肽的制备方法，特别涉及一种利用高效液相色谱制备β- 淀粉样多肽1-42纯品的方法。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer’sDisease，AD)是一种发病率高、危害极大的中枢 神经系统退行性疾病，主要临床症状是智力进行性减退，特征性病理学改变是老 年斑，神经元纤维缠结，以海马、皮层区域为主的神经元数目减少。β-淀粉样 多肽1-42(Amyloidβ1-42peptide，简称Aβ42)是存在于阿尔茨海默病患者脑组 织中的特异病理改变之物，同时它在AD患者的脑积液及血浆中有所改变。研究表 明Amyloidβ1-42peptide在脑内的沉积是阿尔茨海默病的主要原因，因此纯品 Amyloidβ1-42peptide对阿尔茨海默病的病理研究有非常重要的作用。
目前对Amyloidβ1-42peptide粗品的制备方法报道的很少，而使用高效液 相色谱方法进行制备的报道仅有一篇(Vydac Advance，1997)，且要求有柱温箱， 使用的流动相体系比较繁琐，不利于用于生产工艺。
发明内容：
本发明的目的是提供一种用高效液相色谱方法制备Amyloidβ1-42peptide 纯品的方法。以解决现有高效液相色谱方法进行制备存在的设备要求高、使用的 流动相体系比较繁琐的技术问题。
本发明的技术方案如下：
一种制备β-淀粉样多肽1-42纯品的方法，采用高效液相色谱方法。包括以 下步骤：
1、β-淀粉样多肽1-42粗品溶解在乙腈水溶液中，超声处理，滤膜过滤， 取滤液待用。
2、以高效液相色谱仪对过滤后粗品进行制备：通过制备色谱柱，采用紫外 检测器对样品进行监测，分段收集需要的目标产物，制备色谱条件为： 色谱柱：PLRP-S(刚性聚合物填料)，10-15μm，21.2×250mm(I.D)，
流动相：A：100％水/0.1-0.2％三氟乙酸
B：100％乙腈/0.1-0.2％三氟乙酸
时间(min) A B
0.01 90-70％ 10-30％
25 10-30％ 70-90％
30 90-70％ 10-30％
流速：15ml/min
波长：220nm
3、以分析高效液相色谱仪对收集到的目标产物进行检测，将含量95％以上部 分合并为合格产品。
4、将合格产品进行浓缩、冷冻干燥，得到白色絮状粉末产品，经检测合格 即为最终产品。
按照本发明，所述的Amyloidβ1-42peptide的高效液相色谱制备方法，色 谱柱是使用聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料。
本发明所述的流动相体系为水、乙腈体系，加入0.1-0.2％三氟乙酸作为离子 对试剂。
本发明所用的样品溶解条件为体积比：乙腈∶水＝30-50∶70-50。
本发明所述的样品上样量为21.2mm内径的制备柱每针上样品100-200mg。
本发明的有益效果：解决了现有Amyloidβ1-42peptide的纯品制备方法使 用的流动相都比较繁琐，而且要使用柱温箱，增加了仪器的生产成本，也不利于 放大生产的技术问题，本发明所述的制备方法，使用的流动相是在高效液相色谱 中非常常用的试剂，除了高效液相色谱仪不再需要别的仪器，既节省成本又能够 简单、快速地得到需要的纯品。
附图说明：
图1为PLRP-S填料色谱柱的粗品色谱图；
图2为C18键合相填料色谱柱的粗品色谱图；
图3为三氟乙酸乙腈由30％到50％的制备色谱图；
图4为三氟乙酸乙腈由10-30％到90-70％的制备色谱图；
图5为合格产品的检测色谱图。
具体实施方式：β-淀粉样多肽1-42粗品的溶解，过滤：称取100-200mgβ-淀 粉样多肽1-42粗品溶于10ml的乙腈水溶液中，乙腈水溶液由30-50％乙腈与 70-50％水的混配，超声处理，待样品完全澄清，用0.45μ有机相滤膜(上海亚 东核级树脂有限公司)过滤，取滤液待用。
色谱条件：
北京创新通恒科技有限公司的LC3000制备型高液相色谱仪(高压双泵，紫 外检测器)，CXTH-3000色谱工作站。流动相：A：浓度为0.1-0.2％三氟乙酸的水 溶液，B：浓度为0.1-0.2％三氟乙酸的乙腈溶液，0到25分钟A∶B由90-70∶10-30 到10-30∶90-70；流速：15ml/min；波长：220nm；色谱柱：PLRP-S，10-15μm，21.2 ×250mm(I.D)；进样量：100-200mg/10ml。
色谱条件的选择
1.1色谱柱的选择
Amyloidβ1-42peptide的性质及序列使它在色谱柱中极易造成峰形扩散， 出现在色谱图中找不到目标峰的现象，而且我们需要的目标峰并不是色谱图中的 主峰，因此我们的色谱条件必须使目标峰尽可能的明显，这样才能很好的收集到 需要的目标物。分别对以硅胶为基质的C18键合相填料和以聚苯乙烯-聚乙烯基 苯为基质的聚合物树脂填料进行比较分析，发现聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的 聚合物树脂填料(Varian公司的PLRP-S柱)做样的峰形虽有扩散，但有明显的 峰形，能收到合格的产品(见图1)，而另一种C18键合相填料已找不到需要的 目标峰的位置，峰形完全扩散，无法收到目标物(见图2)，故选择聚苯乙烯-聚 乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料作为色谱柱的填料。
1.2流动相的选择
分别选用制备多肽常用的乙腈、水加三氟乙酸体系及乙腈、醋酸胺缓冲液体 系，发现两种体系分离效果基本一样，没有什么区别，故选用更易配制的乙腈、 水加三氟乙酸体系。
1.3梯度的选择
分别用极宽的梯度乙腈由10-30％到90-70％和较窄的梯度乙腈由30％到50％来 做样，发现窄梯度下样品扩散厉害，不能形成一个明显的峰(见图3)，根本无 法判断目标峰的具体保留时间，因此收不到合格的产品，而用宽梯度做样，可以 形成一个明显的目标峰(见图4)，能够很容易的收到需要的目标产物，经检测 产品也能合格(见图5)，故选用宽梯度做为色谱条件。
上样量的选择：
样品的溶解性不太好，以流动相试剂水和乙腈溶解(比例为乙腈∶水 ＝30-50∶70-50)，根据制备柱内径及长度(21.2×250mm(I.D))分别上不同的样 品量，结果发现，100-200mg的上样量比较合适，样品量太低虽然峰形更好些但 从制备成本上考虑不合算，成倍太高，而样品量太高分离度降低了，收不到合格 的，故经过不同上样量的实验发现100-200mg是这根柱子(21.2×250mm(I.D)) 的最佳上样量。
样品含量的检测：
以分析高效液相色谱仪对收集到的产品进行含量检测，检测器为紫外检测 器，色谱柱为PLRP-S，5μm，4.6×250mm(I.D)，流动相A：浓度为0.1-0.2％三 氟乙酸的水溶液，B：浓度为0.1-0.2％三氟乙酸的乙腈溶液，0到25分钟A∶B由 90-70∶10-30到10-30∶90-70，流速：1.0ml/min，波长：220nm，进样量：20μl。由于 样品的峰形扩散极为严重，只能以这种宽梯度来进行分析检测，否则就不能形成 一个明显的峰而变成一个很宽的鼓包从而无法判断产品是否合格。最终冻干的成 品也以此法进行检测。
实施例1：上样量为100mg，流动相：A：浓度为0.1％三氟乙酸的水溶液， B：浓度为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，样品溶解条件为体积比：乙腈∶水＝30∶ 70，0到25分钟A∶B由90∶10到10∶90，其余同上。
实施例2，上样量为150mg，流动相：A：浓度为0.15％三氟乙酸的水溶液， B：浓度为0.15％三氟乙酸的乙腈溶液，样品溶解条件为体积比：乙腈∶水＝40∶ 60，0到25分钟A∶B由80∶20到20∶80，其余同上。
实施例3，上样量为200mg，流动相：A：浓度为0.2％三氟乙酸的水溶液， B：浓度为0.2％三氟乙酸的乙腈溶液，样品溶解条件为体积比：乙腈∶水＝50∶ 50，0到25分钟A∶B由70∶30到30∶70，其余同上。