蛋白酶变体及组合物转让专利
申请号 : CN200410039660.7
文献号 : CN100593036C
文献日 : 2010-03-03
发明人 : P·K·汉森 , P·鲍迪兹 , F·米克尔森 , K·V·安德森
申请人 : 诺沃奇梅兹有限公司
摘要 :
本发明涉及通过突变许多枯草杆菌酶基因并在合适的宿主中表达突变基因而生产的酶。这些酶在任何洗涤剂中相对于它们的野生型亲本酶显示改良的洗涤性能。
权利要求 :
1.在洗涤剂中具有改良的洗涤性能的经修饰枯草杆菌酶，其在按 照BASBPN编号的位点252、255和259包含选自下组的修饰：252L、 252V、252M、252S、252K、255I、255A、255C、255S、259H和259C。
2.根据权利要求1的经修饰枯草杆菌酶，其中，按照BASBPN 编号，所述修饰选自下组：N252L、N252V、N252M、N252S、N252K、 T255A、T255C、T255S、S259H和S259C。
3.权利要求1或2的经修饰枯草杆菌酶，其包含位于选自下组中 的一个或多个其它位点处的至少一个额外突变：27、36、57、76、97、 101、104、120、123、129、131、133、167、170、194、206、218、 222、224、235和274位。
4.权利要求3的经修饰枯草杆菌酶，其中所述至少一个额外突变 选自下组：K27R、＊36D、S57P、N76D、G97N、S101G、V104A、 V104N、V104Y、H120D、N123S、P129K、P131H、A133D、A133P、 Y167A、Y167I、R170S、R170L、R170N、A194P、Q206E、N218S、 ，M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。
5.权利要求3的经修饰枯草杆菌酶，其中所述至少一个额外突变 选自下组：V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A、 N76D+V104A和突变K27R、N76D、S101G、V104A、V104N、V104Y、 N123S和T274A的其它组合。
6.权利要求1的经修饰枯草杆菌酶，其中枯草杆菌酶是I-S1亚 组枯草杆菌酶。
7.权利要求6的经修饰枯草杆菌酶，其中枯草杆菌酶选自下组： 枯草杆菌蛋白酶I168、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶DY 和枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
8.权利要求1-5中任何一项的经修饰枯草杆菌酶，其中枯草杆 菌酶选自I-S2亚组枯草杆菌酶。
9.权利要求8的经修饰枯草杆菌酶，其中枯草杆菌酶选自下组： 枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶PB92和 枯草杆菌蛋白酶YaB。
10.一种组合物，其包含权利要求1-9中任何一项的经修饰枯草 杆菌酶和表面活性剂。
11.根据权利要求10的组合物，其还含有淀粉酶、纤维素酶、脂 肪酶、角质酶、氧化还原酶或另一种蛋白酶。
说明书 :
技术领域
本发明涉及新的适用于配制洗涤组合物并在洗涤剂中显示改良的 洗涤性能的突变蛋白酶或酶变体、含有该酶的清洁和洗涤组合物、插 入到合适的宿主细胞或生物体中时编码表达该酶的突变基因；以及已 被突变基因转化并能够表达该酶变体的宿主细胞。
发明背景
在洗涤剂工业中，酶在洗涤配方中已经被应用超过30年。用于这 些制剂的酶包括：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶以及其它酶， 或者它们的混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。
数目不断增加的商业用途的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的 蛋白质工程变体，如(Novo Nordisk A/S)、 (Novo Nordisk A/S)、(Gist-Brocades N.V.)、 (Genencor国际有限公司)。
还有许多蛋白酶变体在本领域中已有描述，如EP 130756 (GENENTECH)(相应于美国再颁专利34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO 87/04461(AMGEN)；WO 87/05050 (GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985) 自然(Nature)318 375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物 学杂志(J.Mol.Biol.)193 803-813；Russell和Fersht(1987)自然328 496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(AMGEN)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER&GAMBLE公 司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAY S.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)； WO 91/00345(Novo Nordisk A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)；WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.)；和WO 96/34946(Novo Nordisk A/S)。
然而，尽管已经描述了许多有用的蛋白酶变体，许多工业用途仍 然需要新的改良的蛋白酶变体。
因此，本发明的目的是提供改良的蛋白质工程化蛋白酶变体，尤 其是用于洗涤剂工业。
发明概述
本发明深入研究了的残基N252、T255和S259的许 多种可能的组合，并且鉴定了具有增强的洗涤性能的一些变体。
进一步的细节参阅本文实施例(见下文)。
相应地，本发明第一方面涉及在洗涤剂中具有改良的洗涤性能的 枯草杆菌酶(subtilase)蛋白酶变体，该变体在位点252、255和/或259 具有修饰。
根据本发明的枯草杆菌酶变体优选地在两个位点252和255均有 修饰，更优选地在所有三个位点252、255和259都有修饰。
本发明第二方面涉及在洗涤剂中具有改良的洗涤性能的枯草杆菌 酶变体，其含有至少一种选自下组的修饰：
252L+255I
252V+255A
252M+255C+259H
252S+255E+259C
252K+255S+259C或
在上述任何变体中含有一个或多个保守修饰的变体(例如252L(疏 水性氨基酸)+255I变体的保守修饰包括如252I(疏水性氨基酸)+255I 和252V(疏水性氨基酸)+255I的变体)。
本发明第三方面涉及编码本发明枯草杆菌酶变体的分离DNA序 列。
本发明第四方面涉及含有编码本发明枯草杆菌酶变体的分离DNA 序列的表达载体。
本发明第五方面涉及转化了第四方面的表达载体的微生物宿主细 胞。
本发明还涉及本发明的枯草杆菌蛋白酶的生产方法，包括将根据 第四方面的表达载体插入到合适的微生物宿主中，培养宿主以表达需 要的枯草杆菌酶，并回收酶产品。
本发明还涉及含有本发明枯草杆菌酶变体的组合物。
最后本发明涉及突变酶在许多工业相关应用中的用途，特别是在 清洁组合物中的用途，本发明还涉及含有突变酶的清洁组合物，尤其 是含有突变枯草杆菌蛋白酶的洗涤组合物。
定义
在进一步详细论述本发明之前，先定义下列术语。
氨基酸的命名
A＝Ala＝丙氨酸
V＝Val＝缬氨酸
L＝Leu＝亮氨酸
I＝Ile＝异亮氨酸
P＝Pro＝脯氨酸
F＝Phe＝苯丙氨酸
W＝Trp＝色氨酸
M＝Met＝蛋氨酸
G＝Gly＝甘氨酸
S＝Ser＝丝氨酸
T＝Thr＝苏氨酸
C＝Cys＝半胱氨酸
Y＝Tyr＝酪氨酸
N＝Asn＝天冬酰胺
Q＝Gln＝谷氨酰胺
D＝Asp＝天冬氨酸
E＝Glu＝谷氨酸
K＝Lys＝赖氨酸
R＝Arg＝精氨酸
H＝His＝组氨酸
X＝Xaa＝任何氨基酸
核酸命名
A＝腺嘌呤
G＝鸟嘌呤
C＝胞嘧啶
T＝胸腺嘧啶(只存在于DNA中)
U＝尿嘧啶(只存在于RNA中)
变体的命名
在描述本发明产生或包括的各种酶变体时，采用以下命名法以便 简化：
原氨基酸位点取代氨基酸
根据这种命名法，在位点195由谷氨酸取代甘氨酸被记做：
Gly 195 Glu或G195E
同一位点的甘氨酸被删除记做：
Gly 195＊或G195＊
而一个额外的氨基酸残基如赖氨酸的插入记做：
Gly 195 GlyLys或G195GK
在相对于用于编号的序列存在删除的位点处的插入，用：
＊36Asp 或＊36D
表示天冬氨酸在位点36的插入。
多重突变用加号分开，即：
Arg 170 Tyr+Gly 195 Glu或R170Y+G195E
表示在位点170和195的突变，用酪氨酸和谷氨酸分别取代精氨 酸和甘氨酸。
蛋白酶
将能切开蛋白质底物中酰氨键的酶归类为蛋白酶或肽酶(可互换使 用)(参阅Walsh，1979，酶反应机制(Enzymatic Reaction Mechanisms)， W.H.Freeman and Company，旧金山，第三章)。
氨基酸位点/残基的编号
如果没有特别指出，本文使用的氨基酸编号相应于枯草杆菌酶 BPN’(BASBPN)序列。BPN’序列的进一步描述参阅Siezen等人，蛋 白质工程(Protein Engng.)4(1991)719-737和图1。
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是指能催化肽键水解，并且在其活性位点存在必需 丝氨酸残基的酶(White，Handler和Smith，1973“生化原理”(Principles of Biochemistry)，第五版，McGraw-Hill书籍公司，纽约，第271-272 页)。
细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围为20,000-45,000道尔顿。它们 被二异丙基氟磷酸盐抑制。它们水解简单的末端酯，而且与真核生物 的糜蛋白酶(也是丝氨酸蛋白酶)的活性相似。范围更窄的术语-碱性蛋 白酶(包括一个亚组)反映了一些丝氨酸蛋白酶最适pH高，从pH9.0到 11.0(参阅Priest(1977)细菌学回顾(Bacteriological Rev.)41711-753)。
枯草杆菌酶
丝氨酸蛋白酶的一个暂时命名为枯草杆菌酶的亚组，由Siezen等 人[蛋白质工程4(1991)719-737]提出。它们由对40多种丝氨酸蛋 白酶(以前被称作类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease))的氨基酸 序列同源分析定义。枯草杆菌蛋白酶以前被定义为由革兰氏阳性细菌 或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人的定义，它是枯 草杆菌酶的一个亚组。已经鉴定了多种枯草杆菌酶，而且许多枯草杆 菌酶的氨基酸序列已经测定。关于这些枯草杆菌酶更详细的描述和它 们的氨基酸序列参阅Siezen等人的文献和本文图1。
枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1，包括“经典的”枯草杆菌蛋白酶， 如枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶 Carlsberg(，Novo NordiskA/S)和枯草杆菌蛋白酶DY。
由Siezen等人(见上文)划分了枯草杆菌酶的另一个亚组，I-S2。I- S2亚组蛋白酶被描述成高度碱性的枯草杆菌蛋白酶，包括如枯草杆菌 蛋白酶PB92(，Gist-Brocades NV)、枯草杆菌蛋白酶309 (，Novo NordiskA/S)、枯草杆菌蛋白酶147(， Novo NordiskA/S)和碱性弹性蛋白酶YaB。
“”
由Novo NordiskA/S出售。
它是来源于迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶309，而且与BABP92 只在N87S不同(参阅本文图1)。
亲本枯草杆菌酶
术语“亲本枯草杆菌酶”指根据Siezen等人(蛋白质工程4：719- 737(1991))定义的枯草杆菌酶。进一步细节参阅上文“枯草杆菌酶”的 描述。亲本枯草杆菌酶也可以是由天然来源分离得到的枯草杆菌酶， 随后进行了修饰而同时保留了枯草杆菌酶的特征。
术语“亲本枯草杆菌酶”或者可以称作“野生型枯草杆菌酶”。
枯草杆菌酶变体的修饰
本文讨论的枯草杆菌酶变体修饰中使用的术语“修饰”被定义为 包括化学改性以及基因操作。修饰可以是在感兴趣的氨基酸位点处的 取代、删除和/或插入。
枯草杆菌酶变体
在本文中，术语枯草杆菌酶变体或突变的枯草杆菌酶指由表达突 变基因的生物体产生的枯草杆菌酶，该突变基因来源于具有原始或亲 本基因并产生相应亲本酶的亲本微生物，其中亲本基因已经被突变以 得到在合适的宿主中表达时产生突变枯草杆菌酶的突变基因。
同源枯草杆菌酶序列
本文鉴定了枯草杆菌酶中的特殊氨基酸残基用于修饰 以得到本发明的枯草杆菌酶变体。
然而，本发明并不限于这种特殊枯草杆菌酶的修饰，而是扩展到 与有同源的一级结构的其它亲本(野生型)枯草杆菌酶。
为了鉴定其它同源枯草杆菌酶，在本发明的范围内，进行了枯草 杆菌酶与以前对比的一组枯草杆菌酶的对比，并保持以前的对比不变。 进行了枯草杆菌酶中18个高度保守残基的比较。这18个高度保守残 基列于表I(关于这些保守残基的进一步细节参阅Siezen等人)。
表I 枯草杆菌酶中的18个高度保守残基
位点：保守残基
23 G
32 D
34 G
39 H
64 H
65 G
66 T
70 G
83 G
125 S
127 G
146 G
154 G
155 N
219 G
220 T
221 S
225 P
在进行了对比之后(为了实现对比，允许必要的插入和删除)，鉴定 出了合适的同源残基。然后该同源残基可以根据本发明进行修饰。
使用CLUSTALW(第1.5版，1995年4月)电脑对比程序 (J.D.Thompson，D.G.Higgins和T.J.Gibson(1994)核酸研究(Nucleic Acid Research)，22：4673-4680)，设定缺口开放罚分(GAP open penalty)10.0和缺口延伸罚分(GAP extension penalty)0.1，用 BLOSUM30蛋白质质量矩阵，使用程序中的特征对比(Profile alignments)选项进行给定枯草杆菌酶在以前对比的枯草杆菌酶组中的 对比。对于在本发明范围中的给定枯草杆菌酶，优选18个高度保守残 基100％保守。然而，在18个残基中多于或等于17的对比，或少至16 个保守残基的对比也足够用于鉴定同源残基。在枯草杆菌酶中，应当 维持催化三组合Asp32/His64/Ser221的保守性。
图1显示了以前确定的对比，还显示了在此对比中各枯草杆菌酶 对于18个高度保守残基的相同性百分比。
在此描述的基础上，鉴定适当的同源枯草杆菌酶和根据本发明可 以进行修饰的相应同源残基对于本领域技术人员是常规工作。为了说 明这一点，下文的表II显示了部分同源枯草杆菌酶和可根据本发明进 行修饰的相应合适残基。
表II 同源枯草杆菌酶及根据本发明适合于修饰的相应同源残基
位点/酶 BASBPN BYSYAB BLS309 BLS147 TVTHER 252+255 N252L+ T255I N252L+ T255I N252L+ T255I Q252L+ T255I N252L+ D255I 252+255 N252V+ T255A N252V+ T255A N252V+ T255A Q252V+ T255A N252V+ D255A 252+255+ 259 N252M+ T255C+ D259H N252M+ T255C+ N259H N252M+ T255C+ S259H Q252M+ T255C+ S259H N252M+ D255C+ G259H
显然本领域技术人员可以容易地给出包含其它同源枯草杆菌酶的 相似或更大的表格。
洗涤性能
酶在例如清洗过程中催化待清洗物体上的各种天然存在底物的降 解的能力，通常被称作它的洗涤能力(washing ability)、可洗力 (washability)、去垢力(detergency)或洗涤性能(wash performance)。 在本申请中，用术语洗涤性能表示这种特性。
分离DNA序列
术语“分离的”，当应用于DNA序列分子时，表示该DNA序列 已从其天然遗传环境中取出并且因而不含其它无关的或多余的编码序 列，而且以适合于在基因工程蛋白质生产系统中使用的形式存在。这 些分离分子是与其天然环境分开的分子，包括cDNA和基因组克隆。 本发明的分离DNA分子不含它们最初与之相关的其它基因，但是可能 包含天然存在的5’和3’非翻译区如启动子和终止子。这些相关区域的 鉴定显然是本领域的基本技术之一(参阅如Dynan和Tijan，自然 (Nature)316：774-78，1985)。术语“分离DNA序列”也可称作“克 隆DNA序列”。
分离蛋白质
当应用于蛋白质时，术语“分离的”说明该蛋白质存在于不同于 它的天然环境的条件下。在优选的形式中，分离蛋白质基本不含其它 蛋白质，尤其是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下文))。优选提供 高度纯化形式的蛋白质，即由SDS-PAGE鉴定纯度高于40％、纯度高 于60％、纯度高于80％，更优选纯度高于95％，甚至更优选纯度高 于99％。
术语“分离蛋白质”也可称作“纯化蛋白质”。
同源杂质
术语“同源杂质”指来自本发明多肽最初来源的同源细胞中的任 何杂质(如除本发明多肽外的另一种多肽)。
来源于
如本文与特殊微生物来源一起使用的术语“来源于”，指多核苷酸 和/或多肽由特殊来源、或由插入了来自该来源的基因的细胞产生。
底物
术语“底物”与蛋白酶底物有关的使用，应当被理解为其范围最 宽的形式，如含有至少一个易被枯草杆菌蛋白酶水解的肽键的化合物。
产物
术语“产物”与来源于蛋白酶酶反应的产物有关的使用在本文中 应当被理解为包括涉及枯草杆菌酶的水解反应的产物。产物可能是下 一个水解反应的底物。
图的简要描述
图1显示了许多同源枯草杆菌酶根据枯草杆菌酶中18个高度保守 的残基的对比。这18个高度保守残基以粗体标明。所有显示的枯草杆 菌酶，除了JP170外，在保守残基处100％相同。JP170在保守残基 G146处是“N”而不是“G”。
发明详述
具有改良的洗涤性能的枯草杆菌酶变体：
本发明鉴定了BLS309()的洗涤性能有所改善的变 体。
相应地，本发明的实施方案涉及枯草杆菌酶变体，其中修饰选自：
N252L+T255I
N252V+T255A
N252M+T255C+S259H
N252S+T255E+S259C
N252K+T255S+S259C或
在上述任何变体中包含一个或多个保守修饰的变体(如N252L(疏 水性氨基酸)+T255I变体的保守修饰包括如N252I(疏水性氨基 酸)+T255I和N252V(疏水性氨基酸)+T255I之类变体)。
本文测试了许多本发明的枯草杆菌酶变体，显示在洗涤剂中有改 良的洗涤性能(参阅本文实施例(见下文))。
本领域众所周知，氨基酸的相似保守氨基酸取代只会给酶的特性 带来轻微改变。
下面的表III列出了几组保守氨基酸。
表III 保守氨基酸取代
碱性的： 精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性的： 谷氨酸
天冬氨酸
极性的： 谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性的：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族的：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小的： 甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
因此，枯草杆菌酶变体如252L+255I、252I+255I和252V+255I 将具有相似的洗涤性能改良。而且，枯草杆菌酶变体如N252L+T255I、 N252I+T255I和N252V+T255I也将具有相似的洗涤性能改良。
根据本文公开的枯草杆菌酶变体，鉴定其它适当的保守取代以获 得具有改良的洗涤性能的枯草杆菌酶变体，对于本领域技术人员将是 常规工作。
在本发明的实施方案中，感兴趣的是那些属于I-S1和I-S2亚组的 枯草杆菌酶。
关于I-S1亚组，优选的亲本枯草杆菌酶选自ABSS168、BASBPN、 BSSDY和BLSCAR或它们的保留了I-S1亚组特征的功能性变体。
关于I-S2亚组，优选的亲本枯草杆菌酶选自BLS147、BLS309、 BAPB92、TVTHER和BYSYAB或它们的保留了I-S2亚组特征的功 能性变体。
本发明还包括上述位点处的任何一个或多个修饰与对亲本酶氨基 酸序列的任何其它修饰的组合。尤其包括与本领域所知的用以改良酶 特性的其它修饰的组合。本领域描述了许多具有不同改良特性的枯草 杆菌酶变体，其中一部分在本文“发明背景”部分中提及(见上文)。那 些参考文献在本文公开，作为鉴定可以有利地与本发明枯草杆菌酶变 体相组合的枯草杆菌酶变体的参考。
这些组合包括位点：222(改善氧化稳定性)和218(改善热稳定性)， Ca结合位点的取代使酶稳定，如位点76，和现有技术已知的许多其 它修饰。
在进一步的实施方案中，本发明的枯草杆菌酶变体可以有利地与 下列任何位点处的一个或多个修饰组合：
27、36、57、76、97、101、104、120、123、167、170、206、218、 222、224、235和274。
特别地，下面的BLS309和BAPB92变体被认为适合于组合：
K27R，＊36D，S57P，N76D，G97N，S101G，V104A，V104N，V104Y，H120D，
N123S，Y167A，Y167I，R170S，R170L，R170N，Q206E，N218S，M222S，
M222A，T224S，K235L和T274A.
另外，包括V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或 N76D+V104A变异或者这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、 N123S、T274A、N76D、V104A)的其它组合的任何变异与任何一个或 多个上文提及的修饰组合的变体具有改良的特性。
此外，本发明主要方面的枯草杆菌酶变体优选与129、131、133 和194中任何位点处的一个或多个修饰(更优选129K、131H、133P、 133D和194P修饰，最优选P129K、P131H、A133P、A133D和A194P 修饰)组合。那些修饰中的任何一种都可能使本发明的枯草杆菌酶变体 的表达水平更高。
在枯草杆菌酶基因中产生突变
用于克隆本发明的枯草杆菌酶和用于将突变引入基因(如枯草杆菌 酶基因)的许多方法在本领域中是众所周知。
通常，可以使用克隆基因和在该基因中引入突变(随机和/或定点) 的标准方法得到本发明的枯草杆菌酶变体。关于合适的技术的进一步 描述参阅本文实施例(见下文)和(Sambrook等人(1989)分子克隆：实验 室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；F.M.Ausubel等人(主编)“分 子生物学的最新方法”，John Wiley and Sons，1995；C.R.Harwood 和S.M.Cutting(主编)“芽孢杆菌的分子生物学方法”，John Wiley and Sons，(1990)；和WO 96/34946)。
表达载体
含有编码本发明酶的DNA构建体的重组表达载体可以是能够方便 地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于它将要导入 的宿主细胞。由此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外实体 形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。或者，载体 可以是这样一种类型，当它被导入到宿主细胞中时，会部分或全部整 合到宿主细胞基因组中，并与整合的染色体一起复制。
载体优选是表达载体，其中编码本发明酶的DNA序列可操作地连 接了DNA转录所需的附加片段。一般来说，表达载体来源于质粒或病 毒DNA，或者可以含有二者的元件。术语“可操作地连接”指的是诸 片段的排列方式使得它们能够行使与预期用途(如转录由启动子起始并 贯穿编码酶的DNA序列)一致的功能。
启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列， 可以来源于与宿主细胞同源或异源的编码蛋白质的基因。
适用于细菌宿主细胞的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽 糖源淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀 粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌木糖苷酶基 因的启动子，或者λ噬菌体PR或PL启动子，或者大肠杆菌lac、trp 或tac启动子。
如果需要，编码本发明酶的DNA序列还可以可操作地连接合适的 终止子。
本发明的重组载体还可以含有使载体能够在所选宿主细胞中复制 的DNA序列。
载体还可以含有选择标记，如其产物补偿宿主细胞缺陷的基因， 或者编码对卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等抗生素 或对重金属或除草剂的抗性的基因。
为了将本发明的酶导入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中 提供分泌信号序列(也称作前导序列、前体序列或前序列)。分泌信号序 列以正确的阅读框架与编码酶的DNA序列连接。分泌信号序列通常位 于编码酶的DNA序列的5’端。分泌信号序列可以是通常与酶有关的 序列或可以来自编码另一个分泌蛋白的基因。
用于分别连接编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选终止子和 /或分泌信号序列，或用适当的PCR扩增方案将这些序列装配起来， 和将它们插入含有复制或整合所需信息的合适载体的方法，是本领域 技术人员众所周知的(参阅如Sambrook等人，出处同上)。
宿主细胞
导入宿主细胞的编码本发明酶的DNA序列可以是与所选宿主同源 或异源的序列。如果与宿主细胞同源，即由宿主细胞天然产生的，通 常将它可操作地连接另一个启动子序列，或者如果可行的话，则连接 另一个分泌信号序列和/或终止子序列(非天然的)。术语“同源”意指 包括编码所选宿主生物天然的酶的DNA序列。术语“异源”意指包括 宿主细胞天然不表达的DNA序列。因此，DNA序列可以来自另一种 生物体，或者可以是合成序列。
待导入本发明DNA构建体或重组载体的宿主细胞可以是能够产生 本发明酶的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
经过培养能够产生本发明酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性 细菌，如芽孢杆菌属的菌株，诸如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟 缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀 粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽 孢杆菌或苏云金芽孢杆菌菌株，或链霉菌属的菌株，诸如浅青紫链霉 菌或鼠灰链霉菌，或者革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌。细菌的转化可 以通过原生质体转化、电穿孔、接合或通过感受态细胞以已知的方式 进行(参阅Sambrook等人，见上文)。
当在细菌诸如大肠杆菌中进行表达时，酶可以保留在细胞质中， 通常以不溶性颗粒存在(称为包涵体)，或可以被细菌分泌序列引导到周 质空间。在前一种情况中，裂解细胞，回收颗粒，变性，然后稀释变 性剂使酶重新折叠。在后一种情况中，酶可以从周质空间回收，如用 超声波或渗透休克破碎细胞，以释放周质空间的成分，并回收酶。
当在革兰氏阳性细菌诸如芽孢杆菌或链霉菌菌株中进行表达时， 酶可以保留在细胞质中，或可以被细菌分泌序列引导到细胞外培养基 中。在后一种情况中，酶可以如下文所述从培养基中回收。
生产枯草杆菌酶的方法
本发明提供了生产本发明分离酶的方法，其中将转化了编码该酶 的DNA序列的合适宿主细胞在允许酶产生的条件下培养，并从培养液 中回收产生的酶。
当含有编码酶的DNA序列的表达载体被转化到异源宿主细胞中 时，有可能异源重组产生本发明的酶。
由此有可能得到高度纯化的枯草杆菌酶组合物，其特征为不含同 源杂质。
在本文中，同源杂质指由本发明的酶最初来源的同源细胞产生的 任何杂质(如不同于本发明的酶的其它多肽)。
用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适合于所选宿主细胞生长 的任何常规培养基。可以很方便地将表达的枯草杆菌酶分泌到培养基 中，并通过众所周知的方法从中回收，所述方法包括经离心或过滤将 细胞与培养基分开、经盐(如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质成分， 随后通过如离子交换层析、亲和层析等层析方法纯化。
本发明的枯草杆菌酶变体的用途
本发明的枯草杆菌酶变体可以用于许多工业用途，尤其是用于洗 涤剂工业中。
本发明还涉及含有本发明的枯草杆菌酶变体的酶组合物。
下文描述了关于优选的工业应用的概述和相应的优选酶组合物。
此概述并非旨在完全列出本发明枯草杆菌酶变体的所有适当应 用。本发明的枯草杆菌酶变体可应用于本领域内已知使用蛋白酶、尤 其是枯草杆菌酶的其它工业应用中。
含有突变酶的洗涤组合物
本发明包括本发明的突变酶在清洁和洗涤组合物中的用途以及含 有突变枯草杆菌蛋白酶的这种组合物。这些清洁和洗涤组合物在本领 域中有很好的描述，关于合适的清洁和洗涤组合物的进一步描述参阅 WO 96/34946、WO 97/07202和WO 95/30011。
还可以参考本文的实施例，显示本发明的许多枯草杆菌酶变体改 良的洗涤性能。
洗涤剂的公开内容和实例
本发明的洗涤组合物中含有表面活性剂体系，其中表面活性剂可 以选自非离子型和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性型和/或两性离 子型和/或半极性型表面活性剂。
表面活性剂一般以0.1-60％重量的量存在。
优选将表面活性剂配制成与组合物中存在的酶组分相容。在液体 或凝胶组合物中，最优选将表面活性剂配制成能促进或至少是不降低 这些组合物中的任何酶的稳定性。
根据本发明使用的优选体系包括本文中所述的作为表面活性剂的 一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。
烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯缩合物适合用作本发明 表面活性剂体系的非离子表面活性剂，其中优选聚氧乙烯缩合物。这 些化合物包括具有含约6-14个碳原子，优选约8-14个碳原子直链或 支链构型之烷基的烷基酚与烯化氧的缩合产物。在优选的实施方案中， 环氧乙烷存在的量等于每摩尔烷基酚约2-25摩尔，更优选约3-15摩 尔的环氧乙烷。这类市售的非离子表面活性剂包括：由GAF Corporation销售的IgepalTM CO-630；和均由Rohm & Haas Company 销售的TritonTM X-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂通常 被称之为烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合物适合用作本发明的 非离子表面活性剂。该脂族醇的烷基链可以是直链或支链的、伯或仲 的，并且通常含有约8-22个碳原子。优选的是具有含约8-20个碳原 子，更优选约10-18个碳原子烷基的醇与每摩尔醇约2-10摩尔环氧乙 烷的缩合产物。所述的缩合产物中每摩尔醇有约2-7摩尔的环氧乙烷， 最优选2-5摩尔的环氧乙烷。可从市场上购得的这类非离子表面活性 剂的例子包括：由Union Carbide Corporation销售的TergitolTM 15- S-9(C11-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)和TergitolTM 24-L-6 NMW(C12-C14伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)；和 由Shell Chemical Company销售的NeodolTM 45-9(C14-C15直链醇与9 摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM 23-3(C12-C13直链醇与3.0摩尔 环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM 45-7(C14-C15直链醇与7摩尔环氧乙 烷的缩合产物)、NeodolTM 45-5(C14-C15直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩 合产物)；由Procter & Gamble Company销售的KyroTM EOB(C13-C15 醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)；和由Hoechst销售的Genapol LA050(C12-C14醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)。这些产物的HLB的 优选范围是8-11，最优选8-10。
也可用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是在 US4565647中公开的烷基多糖，该多糖具有含约6-30，优选约10-16 个碳原子的疏水基团和含约1.3-10，优选约1.3-3，最优选约1.3-2.7个 糖单元的多糖如多糖苷亲水基团。可以使用任何含有5或6个碳原子 的还原糖，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分代替葡萄糖 基部分(任选地，在2-，3-，4-等位连接疏水基团从而得到与葡萄糖苷 或半乳糖苷不同的葡萄糖或半乳糖)。该糖间键可以在，例如，附加糖 单元的1位和前一糖单元的2-，3-，4-，和/或6-位之间。
优选的烷基多糖苷具有下式：
R2O(CnH2nO)t(糖基)x
其中R2选自：烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基、和其 混合形式，其中烷基含有约10-18，优选约12-14个碳原子；n是2或 3，优选2；t是0-约10，优选0；x是约1.3-10，优选约1.3-3，最优 选约1.3-2.7。该糖基优选是从葡萄糖衍生的。为了制备这些化合物， 先形成醇或烷基多乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应，从而形 成葡糖苷(在1-位连接)。然后另外的糖基单元在其1-位置与前面的糖 基单元2-，3-，4-，和/或6-位置，优选主要在2-位之间连接。
环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基之间的缩合 产物也适合用作本发明的附加非离子表面活性剂体系。这些化合物的 疏水部分的分子量优选为约1500-1800并显示出水不溶性。将聚氧乙 烯部分加成到该疏水部分会增加整个分子的水溶性，在聚氧乙烯含量 不超过该缩合产物总重量的约50％(相当于与多达约40摩尔的环氧乙 烷缩合)时，仍能保持该产品的液体性质。这类化合物的例子包括某些 可从市场上购得的由BASF销售的PluronicTM表面活性剂。
也适合用作本发明非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂是 环氧乙烷与从环氧丙烷和乙二胺反应得到的产物的缩合产物。这些产 物的疏水部分由乙二胺和过量环氧丙烷的反应产物组成，并且分子量 一般是约2500-3000。该疏水部分与环氧乙烷缩合，缩合程度为该缩合 产物含有约40-80％重量的聚氧乙烯并且分子量为约5000-11000。这 类非离子表面活性剂的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售 的TetronicTM化合物。
优选用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是：烷基酚 的聚氧乙烯缩合物、伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合产物、 烷基多糖、和其混合物。最优选的是具有3-15个乙氧基的C8-C14烷基 酚乙氧基化物和具有2-10个乙氧基的C8-C18(优选平均为C10)醇乙氧基 化物、和其混合物。
非常优选的非离子表面活性剂是下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活 性剂：
其中R1是H，或R1是C1-4烃基、2-羟基乙基、2-羟基丙基或其混 合形式，R2是C5-31烃基，Z是具有直链烃基链、至少3个羟基直接连 接到该链上的多羟基烃基，或其烷氧基化的衍生物。优选地，R1是甲 基，R2是直链C11-15烷基或C16-18烷基或链烯基链，例如椰油烷基，或 其混合形式，Z是在还原性胺化反应中从还原糖如葡萄糖、果糖、麦 芽糖或乳糖衍生的。
非常优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化的硫酸盐表面活 性剂。其例子是式RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R是未取代 的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羟基烷基，优选C12-C20烷基 或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单 元，m大于0，一般为约0.5-6，更优选约0.5-3，M是H或阳离子， 该阳离子可以是：例如金属阳离子(如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取 代铵阳离子。本文也涵盖烷基乙氧基化硫酸盐以及烷基丙氧基化硫酸 盐。取代铵阳离子的具体例子包括：甲基、二甲基、三甲基铵阳离子 和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和从烷基胺如乙胺、 二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些阳离子等。举例说明的表面活 性剂是：C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸盐(C12-C18E(1.0)M)、C12- C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸盐(C12-C18E(2.25)M)、C12-C18烷基聚 乙氧基化物(3.0)硫酸盐(C12-C18E(3.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0) 硫酸盐(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地选自钠和钾。
适用的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括按照 “美国油类化学家协会杂志”(The Journal of the American Oil Chemists Society)，52(1975)，第323-329页用气态SO3磺化的C8-C20 羧酸(即脂肪酸)的直链酯。合适的原料包括从牛脂、棕榈油等衍生的天 然脂类物质。
优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂(尤其是用于洗衣用途的)包括下面 结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂：
其中R3是C8-C20烃基，优选烷基，或其组合，R4是C1-C6烃基， 优选烷基，或其组合，M是与烷基酯磺酸根形成水溶性盐的阳离子。 合适的成盐阳离子包括金属阳离子(如钠、钾和锂)和取代或未取代的铵 阳离子(例如单乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。优选地，R3是C10-C16 烷基，R4是甲基、乙基或异丙基。特别优选的是甲基酯磺酸盐，其中 R3是C10-C16烷基。
其它合适的阴离子表面活性剂包括：烷基硫酸盐表面活性剂，它 们是式ROSO3M的水溶性盐或酸，其中R优选是C10-C24烃基，优选 具有C10-C20烷基部分的烷基或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基 烷基，M是H或阳离子，例如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)，或者铵 或取代铵(如甲基、二甲基和三甲基铵阳离子，和季铵阳离子例如四甲 基铵和二甲基哌啶鎓阳离子，和从烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺 和其混合形式衍生的季铵阳离子)等。一般地，对于较低的洗涤温度(例 如低于约50℃)，C12-C16烷基链是优选的，而对于较高的洗涤温度(例 如高于约50℃)，C16-C18烷基链是优选的。
其它对洗涤目的有用的阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的 衣物洗涤组合物中。它们可以包括：皂的盐(包括，例如钠、钾、铵、 和取代的铵如单、二和三乙醇胺盐)、C8-C22伯或仲烷烃磺酸盐、C8-C24 烯烃磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物的磺化制备的磺化多羧 酸(例如在英国专利说明书号1082179中所述的)、C8-C24烷基聚二醇醚 硫酸盐(含有多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘 油磺酸盐、脂肪油基甘油硫酸盐、烷基酚氧乙烯醚硫酸盐、石蜡烃磺 酸盐、烷基磷酸盐、羟乙磺酸盐如酰基羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、 烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸的单酯(特别是饱和和 不饱和C12-C18单酯)和磺基琥珀酸的二酯(特别是饱和和不饱和C6-C12 二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖的硫酸盐例如烷基多葡糖苷(下面所述 的非离子型非硫酸化的化合物)的硫酸盐、支链伯烷基硫酸盐、和烷基 多乙氧基羧酸盐例如那些式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的盐，其中 R是C8-C22烷基，k是1-10的整数，M是形成水溶性盐的阳离子。树 脂酸及氢化的树脂酸也是合适的，例如松香、氢化松香，以及存在于 或衍生于松浆油的树脂酸和氢化树脂酸。
烷基苯磺酸盐是非常优选的。特别优选的是线性(直链)烷基苯磺酸 盐(LAS)，其中该烷基优选含有10-18个碳原子。
其它例子描述于“表面活性剂与去污剂”(Surface Active Agents and Detergents)(第I和II卷，Schwartz，Perry and Berch)中。各种 这样的表面活性剂也一般性地公开于US3929678中(第23栏58行-第 29栏23行，该文献引入本文作为参考)。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约1-40％， 优选约3-20％重量的上述阴离子表面活性剂。
本发明的衣物洗涤组合物也可以含有阳离子、两性、两性离子和 半极性表面活性剂，以及上文中并未述及的非离子和/或阴离子表面活 性剂。
适用于本发明衣物洗涤组合物中的阳离子洗涤表面活性剂是具有 一个长链烃基的那些表面活性剂。这样的阳离子表面活性剂的例子包 括铵表面活性剂例如烷基三甲基铵卤化物，和具有下式的那些表面活 性剂：
[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-
其中R2是在烷基链中具有约8-18个碳原子的烷基或烷基苄基， 每个R3选自：-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、- CH2CH2CH2-、和其混合形式；每个R4选自：C1-C4烷基、C1-C4羟基 烷基、由两个R4连接在一起形成的苄基环结构、- CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是己糖或分子量低于 约1000的己糖聚合物，并且当y不是0时是氢)；R5与R4所述相同或 是烷基链，其中R2+R5的总碳原子数不大于约18；每个y是0-约10， 且该y值的和是0至约15；X是任何相容的阴离子。
非常优选的阳离子表面活性剂是具有下式的、在本发明组合物中 有用的水溶性季铵盐化合物：
R1R2R3R4N+X-(i)
其中R1是C8-C16烷基，每个R2、R3和R4各自独立地是C1-C4烷 基、C1-C4羟基烷基、苄基和-(C2H4O)xH(其中x的值为2-5)，X是阴 离子。R2、R3、R4中不多于1个是苄基。
R1的优选烷基链长度是C12-C15，当该烷基是从椰油或棕榈仁脂衍 生的链长度的混合物，或是通过烯烃合成或OXO醇合成而合成衍生 的时尤为如此。
用于R2、R3和R4的优选基团是甲基和羟基乙基，阴离子X可以 选自：卤素离子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根离子。
用于本文中的合适的式(I)季铵化合物的例子是：
氯化或溴化椰油基三甲基铵；
氯化或溴化椰油基甲基二羟基乙基铵；
氯化癸基三乙基铵；
氯化或溴化癸基二甲基羟基乙基铵；
氯化或溴化C12-15二甲基羟基乙基铵；
氯化或溴化椰油基二甲基羟基乙基铵；
甲基硫酸肉豆蔻基三甲基铵；
氯化或溴化月桂基二甲基苄基铵；
氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4铵；
胆碱酯(式(i)的化合物，其中R1是
烷基，R2、R3、R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。
其它在本文中有用的阳离子表面活性剂也描述于US4228044和 EP000224中。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-25％， 优选约1-8％重量的上述阳离子表面活性剂。
两性表面活性剂也适用于本发明的衣物洗涤组合物中。这些表面 活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲或叔胺的 脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链或支链的。其中1个脂族取代 基含有至少约8个碳原子，一般约8-18个碳原子，并且至少一个脂族 取代基含有阴离子型水增溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。见 US3929678(第19栏18-35行)的两性表面活性剂的例子。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％ 重量，优选约1-10％重量的上述两性表面活性剂。
两性离子表面活性剂也适用于本发明的衣物洗涤组合物中。这些 表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的衍生物，杂环的仲或叔胺的 衍生物，或者季铵、季鏻或叔锍化合物的衍生物。见US3929678(第19 栏38行-22栏48行)的两性离子表面活性剂的例子。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％ 重量，优选约1-10％重量的上述两性离子表面活性剂。
半极性非离子表面活性剂是一特殊类型的非离子表面活性剂，它 们包括：含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个 碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化胺；含有1个约10- 18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基 的2个部分的水溶性氧化膦；和含有1个约10-18个碳原子的烷基部 分和1个选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的部分的水溶性 亚砜。
半极性非离子表面活性剂包括具有下式的氧化胺表面活性剂：
其中R3是含有约8-22个碳原子的烷基、羟基烷基、或烷基苯基， 或其混合形式；R4是含有约2-3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其 混合形式；x是0-约3；每个R5是含有约1-3个碳原子的烷基或羟基 烷基，或含有约1-3个氧乙烯基团的多氧乙烯基。R5基团可以彼此连 接，例如通过氧或氮原子，从而形成环结构。
特别地，这些氧化胺表面活性剂包括氧化C10-C18烷基二甲基胺和 氧化C8-C12烷氧基乙基二羟基乙基胺。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％ 重量，优选约1-10％重量的上述半极性非离子表面活性剂。
助洗剂体系
本发明的组合物还可含有助洗剂体系。任何常规助洗剂体系都适 用于本文中，其包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸、诸 如乙二胺四乙酸盐的材料、金属离子螯合剂例如氨基多磷酸盐特别是 乙二胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。尽管由于明显的 环境原因并不优选，但本文中也可以使用磷酸盐助洗剂。
合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合的硅铝 酸盐材料，更具体地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、 HS或MAP。
另一种合适的无机助洗剂材料是层状硅酸盐例如SKS- 6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na2Si2O5)组成的结晶层状硅酸盐。
合适的含有1个羧基的多羧酸盐包括：乳酸、乙醇酸和其醚衍生 物的水溶性盐，如在比利时专利号831368、821369和821370中所公 开的。含有2个羧基的多羧酸盐包括：琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基) 二乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐， 以及在德国专利2446686和2446687及US3935257中所述的醚羧酸 盐，和在比利时专利号840623中所述的亚硫酰基羧酸盐。含有3个羧 基的多羧酸盐具体地包括水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐(aconitrate)和柠 康酸盐以及琥珀酸盐衍生物，例如，在英国专利号1379241中所述的 羧基甲氧基琥珀酸盐，在荷兰申请7205873中所述的乳氧琥珀酸盐 (lactoxysuccinate)，和氧多羧酸盐材料例如在英国专利号1387447中 所述的2-氧杂-1，1，3-丙三羧酸盐.
含有4个羧基的多羧酸盐包括：在英国专利号1261829中公开的 氧联二琥珀酸盐、1，1，2，2-乙四羧酸盐、1，1，3，3-丙四羧酸盐和1，1，2，3- 丙四羧酸盐。含有磺基取代基的多羧酸盐包括：在英国专利号1398421 和1398422和US3936448中公开的磺基琥珀酸盐衍生物、和在英国专 利号1082179中所述的磺化的热解柠檬酸盐，而英国专利号1439000 中公开了含有膦取代基的多羧酸盐。
脂环和杂环多羧酸盐包括：环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸盐、环戊二烯 五羧酸盐(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氢呋喃-顺， 顺，顺-四羧酸盐、2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2，2，5，5-四氢呋喃-四羧酸 盐、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸盐和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖 醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸盐包括：苯六甲酸、1，2，4，5，-苯四 酸和在英国专利号1425343中公开的苯二甲酸衍生物。
在上面的多羧酸盐中，优选的多羧酸盐是每分子含有最多达3个 羧基的羟基羧酸盐，更具体地是柠檬酸盐。
用于本发明组合物中的优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐 助洗剂例如沸石A或层状硅酸盐(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸螯 合剂例如柠檬酸。
包括在本发明洗涤组合物中的合适的螯合剂包括：乙二胺-N，N’- 二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐，或其混合物。 优选的EDDS化合物是游离酸形式的和其钠或镁盐。这样的优选EDDS 钠盐的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。这样的优选EDDS镁盐的例 子包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐是最优选包括在本发明组合物中 的。
优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A和水 溶性羧酸螯合剂例如柠檬酸的混合物。
可以形成用于粒状组合物的助洗剂体系中一部分的其它助洗剂材 料包括：无机材料例如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，和有机材 料例如有机膦酸盐、氨基多亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐。
其它合适的水溶性有机盐是均聚和共聚的酸或其盐，其中该聚羧 酸包括两两之间被不多于2个碳原子分开的至少两个羧基。
这类聚合物公开于GB-A-1596756中。这样的盐的例子是MW 2000-5000的聚丙烯酸盐和其与马来酸酐的共聚物，这样的共聚物具有 20000-70000，特别是约40000的分子量。
洗涤助洗剂盐的量通常为组合物重量的5-80％。用于液体洗涤剂 的助洗剂的优选量是5-30％。
酶
除了本发明的酶制剂外，优选洗涤组合物还含有提供清洗性能和/ 或织物护理益处的其它酶。
这样的酶包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过 氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
蛋白酶：可以使用适用于碱性溶液的其它任何蛋白酶。合适的蛋 白酶包括动物、植物或微生物来源的。微生物来源是优选的。包括化 学或基因修饰的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生 物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶， 尤其是从芽孢杆菌衍生的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌 蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草 杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06270中)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子 是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO 89/06270中的镰孢属蛋 白酶。
优选的市售蛋白酶包括：由Novo Nordisk A/S(Denmark)以商品 名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase销售的那些， 由Genencor International以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、 Properase、Purafect、和Purafect OXP销售的那些，和由Solvay Enzymes以商品名Opticlean和Optimase销售的那些。按组合物重量 计，可以以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优 选0.01-0.2％酶蛋白的量将蛋白酶掺入到本发明的组合物中。
脂肪酶：可以使用任何适用于碱性溶液的脂肪酶。合适的脂肪酶 包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因工程修饰的突变体。
有用的脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如描述 于EP 258068和EP305216中的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如 描述于EP 238023中的，假丝酵母属脂肪酶例如C.antarctica脂肪酶， 例如描述于EP214761中的C.antarctica脂肪酶A或B，假单胞菌属 脂肪酶例如描述于EP 218272中的产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌脂 肪酶、例如描述于EP 331376中的洋葱假单胞菌脂肪酶、例如公开于 GB1372034中的司徒茨氏假单胞菌脂肪酶，荧光假单胞菌脂肪酶，芽 孢杆菌脂肪酶例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophsica acta 1131，253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌脂肪酶(WO 91/16422)。
此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等在1991 年《基因》103，61-67上描述的沙门氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪 酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化学杂志，106，383-388)，和各种根 霉属脂肪酶例如德列马根霉脂肪酶(Hass，M.J.等，(1991)，Gene 109， 117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，Biosci.Biotech. Biochem.56，716-719)和米根霉脂肪酶。
其它类型的脂类分解酶，如角质酶也是有用的，例如WO88/09867 所述来自门多萨假单胞菌的角质酶，来自Fusarium solani pisi的角质 酶(如WO90/09446所述)。
特别合适的脂肪酶是下面这些脂肪酶：例如M1 vLipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Genecor)，LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S)，和Lipase P“Amano”(Amano Pharmacetical Co.Ltd.)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将脂肪酶掺入到本发明的洗 涤组合物中。
淀粉酶：可以使用适用于碱性溶液的任何淀粉酶(α和/或β)。合 适的淀粉酶包括细菌和真菌来源的那些。包括化学或基因工程修饰的 突变体。淀粉酶包括：例如，在GB1296839中详细描述的从地衣芽孢 杆菌的特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是DuramylTM、 TermamylTM、FungamylTM和BANTM(从Novo Nordisk A/S得到)和 RapidaseTM和Maxamyl PTM(从Genencor得到)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将淀粉酶掺入到本发明的洗 涤组合物中。
纤维素酶：可以使用适用于碱性溶液的任何纤维素酶。合适的纤 维素酶包括细菌和真菌来源的那些。包括化学或基因工程修饰的突变 体。合适的纤维素酶公开于US4435307(其中公开了从Humicola insolens生产的真菌纤维素酶)，WO96/34108和WO96/34092(其中公 开了来自芽孢杆菌的细菌嗜碱性纤维素酶BCE103)，WO94/21801、 US5,475,101和US5,419,778(其中公开了木霉的EGIII纤维素酶)中。 特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶。这样的纤维素 酶的例子是描述于欧洲专利申请0495257中的纤维素酶。市售的纤维 素酶包括从一株Humicola insolens生产的CelluzymeTM(Novo Nordisk A/S)以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将纤维素酶掺入到本发明的 洗涤组合物中。
过氧化物酶/氧化酶：过氧化物酶与过氧化氢或其源(例如过碳酸 盐、过硼酸盐或过硫酸盐)一起使用。氧化酶与氧一起使用。两种类型 的酶均可用于“溶液漂白”，即在洗涤液中一起洗涤，优选与例如WO 94/12621和WO 95/01426中所述的增强剂一起洗涤所述织物时，防止 染料从染色织物转移到另一织物上。合适的过氧化物酶/氧化酶包括植 物、细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因工程修饰的突变体。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将过氧化物酶和/或氧化酶 掺入到本发明的洗涤组合物中。
在本文中包括上述酶的混合物，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶 和/或纤维素酶的混合物。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将本发明的酶或掺入到洗涤 组合物中的其它任何酶掺入到本发明的洗涤组合物中。
漂白剂
可以包括在本发明洗涤组合物中的附加的任选洗涤组分包括漂白 剂，例如粒径为400-800微米的PB1、PB4和过碳酸盐。这些漂白剂 组分可以包括一种或多种氧漂白剂，并且根据所选择的漂白剂，可包 括一种或多种漂白活化剂。当存在氧漂白化合物时，其存在的量一般 是约1-25％。通常，在非液体配方例如粒状洗涤剂中，漂白化合物是 任选加入的组分。
用于本文中的漂白剂组分可以是任何在洗涤组合物中有用的漂白 剂，包括氧漂白剂以及本领域已知的其它漂白剂。
适合于本发明的漂白剂可以是活化的或未活化的漂白剂。
一类可以使用的氧漂白剂包括过羧酸漂白剂和其盐。这类试剂的 合适的例子包括：单过氧邻苯二甲酸镁六水合物，间氯过苯甲酸、4- 壬氨基-4-氧代过氧丁酸和双过氧十二烷双酸的镁盐。这样的漂白剂公 开于US4483781、US740446、EP0133354和US4412934中。非常优 选的漂白剂也包括如在US4634551所述的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。
另一类可以使用的漂白剂包括卤素漂白剂。例如，次卤酸盐漂白 剂的例子包括三氯异氰脲酸，以及二氯异氰脲酸的钠和钾盐，和N-氯 代和N-溴代烷烃磺基酰胺。这样的材料通常以最终产品重量的0.5-10 ％、优选1-5％的量加入。
可以将过氧化氢释放剂与漂白活化剂一起使用，该漂白活化剂是： 例如四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS，描述于 US4412934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐(ISONOBS，描述于 EP120591中)或五乙酰基葡萄糖(PAG)；将它们过水解后能形成过氧酸 作为活性漂白物质，导致改进的漂白作用。另外，非常合适的是这些 漂白活化剂：C8(6-辛酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐、C9(6-壬酰胺基己酰 基)羟苯磺酸盐和C10(6-癸酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐或其混合物。还合 适的活化剂是酰化的柠檬酸酯，例如在欧洲专利申请号91870207.7所 公开的。
可用于本发明清洗组合物中的有用的漂白剂，包括过氧酸和含有 漂白活化剂和过氧漂白化合物的漂白体系描述于专利申请USSN 08/136626中。
通过在洗涤和/或漂洗过程的开始或期间加入能够生成过氧化氢的 酶体系(即酶和其底物)，也可以存在过氧化氢。这样的酶体系公开于欧 洲专利申请EP0537381中。
除了氧漂白剂以外的漂白剂也是本领域已知的，并且可以在本文 中使用。特别重要的一类非氧漂白剂包括光活化漂白剂，例如磺化的 锌和/或铝酞菁。这些材料可以在洗涤期间沉积在被洗物上.当存在氧 时用光照射，例如通过将衣服挂出在日光中干燥时，该磺化的锌酞菁 被活化，结果该被洗物被漂白。优选的锌酞菁和光活化漂白方法描述 于US4033718中。洗涤组合物一般含有约0.025-1.25％重量的磺化锌 酞菁。
漂白剂也可以包括锰催化剂。锰催化剂可以是例如在“低温漂白 的有效锰催化剂(Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching)”，自然369，1994，pp.637-639中所述的一种化合物。
抑泡剂
另一个任选的组分是抑泡剂，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。 硅氧烷通常可以用烷基化的聚硅氧烷材料来表示，而硅石一般以细分 散形式使用，例如二氧化硅气凝胶和干凝胶和各种类型的疏水二氧化 硅。这些材料可以作为颗粒加入，其中抑泡剂有利地可释放地掺入到 水溶性或水分散性的、基本上无表面活性的洗涤剂不可渗透的载体中。 另外，可以将抑泡剂溶解或分散在液体载体中并通过喷雾在一种或多 种其它组分上来涂覆。
优选的硅氧烷抑泡剂公开于US3933672中。其它特别有用的抑泡 剂是德国专利申请DTOS2646126中所述的自乳化硅氧烷抑泡剂。这 样的化合物的例子是可从Dow Corning购得的DC-544，它是硅氧烷- 二元醇共聚物。特别优选的抑泡剂是含有硅油和2-烷基-链烷醇混合物 的抑泡剂体系。合适的2-烷基-链烷醇是以商品名Isofol 12R购得的2- 丁基-辛醇。
这样的抑泡剂体系公开于欧洲专利申请EPO593841中。
特别优选的硅氧烷泡沫控制剂描述于欧洲专利申请92201649.8 中。所述的组合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的无孔硅石例 如AerosilR。
按组合物重量计，通常以0.001-2％，优选0.01-1％的量使用上述 的抑泡剂。
其它组分
可以在洗涤组合物中使用的其它组分有例如污垢悬浮剂、污垢除 去剂、荧光增白剂、磨料、杀菌剂、变色抑制剂、着色剂和/或包覆或 未包覆的香料。
特别合适的包覆材料是由多糖基质和多羟基化合物组成的水溶性 胶囊，如在GB 1464616中所述的。
其它合适的水溶性包覆材料包括从取代二羧酸的未凝胶化淀粉酸 酯衍生的糊精，例如在US3455838中所述的.这些酸酯糊精优选是从 诸如蜡质玉米、蜡质高粱、西米、木著和马铃薯的淀粉制备的。所述 的包覆材料的合适例子包括由National Starch制造的N-Lok。该N-Lok 包覆材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖组成。该淀粉是通过加上单官能 取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。
适合于本文中的防再污染剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物，例 如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，和均聚或共聚的聚羧 酸或其盐。这类聚合物包括上述作为助洗剂提到的聚丙烯酸盐和马来 酸酐-丙烯酸共聚物，以及马来酸酐与乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸 的共聚物，其中马来酸酐至少构成共聚物的20％摩尔。按组合物重量 计，这些材料通常以组合物重量的0.5-10％，更优选0.75-8％，最优 选1-6％的量使用。
优选的荧光增白剂是阴离子性的，其例子是：4，4’-双-(2-双乙醇氨 基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠盐、4，4’-双-(2-吗啉 代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2，4-二苯胺 基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4’，4”-双-(2，4-二苯胺基-s-三 嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基 氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(4-苯基-2，1，3-三唑 -2-基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨 基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、2(芪基-4”-(萘并-1’，2’：4，5)- 1，2，3-三唑-2”-磺酸钠和4，4’-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特别是分子量为1000-10000， 更具体是2000-8000和最优选是约4000的那些。以0.20-5％重量，更 优选0.25-2.5％重量的量使用这些聚合物材料。这些聚合物和上述均聚 或共聚的聚羧酸盐对于存在过渡金属杂质时改进白度维持性，织物灰 分沉积和对粘土、蛋白质性和可氧化性污垢的清洗性能是重要的。
在本发明组合物中有用的污垢除去剂是对苯二甲酸与乙二醇和/或 丙二醇单元各种对比的常规共聚物或三元共聚物。这样的聚合物的例 子公开于US4116885和US4711730及EP0272033中。根据EP0272033 特别优选的聚合物具有下式：
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75
其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)，T是(pOOC6H4CO)。
还非常有用的是作为二甲基对苯二甲酸酯、二甲基磺基间苯二酸 酯、乙二醇和1，2-丙二醇无规共聚物的改性聚酯，该端基主要由磺基 苯甲酸酯组成，还有一小部分是乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯。目的 是“主要”得到在两端由磺基苯甲酸基团封端的聚合物，本文中是绝 大多数本文所述共聚物是由磺基苯甲酸基团封端的。然而，某些共聚 物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯组 成，其“次要”地由这样的物质组成。
本文中选择的聚酯含有约46％重量的二甲基对苯二甲酸，约16％ 重量的1，2-丙二醇，约10％重量的乙二醇，约13％重量的二甲基磺基 苯甲酸和约15％重量的磺基间苯二酸，并且其分子量为约3000。该聚 酯和其制备方法详细地叙述于EP311342中。
柔软剂
可以将织物柔软剂加入到本发明的衣物洗涤组合物中。这些试剂 在类型上可以是无机或有机的。无机柔软剂的例子是在GB-A-1400898 和US5019292中公开的绿土粘土。有机的织物柔软剂包括如在GB-A- 1514276和EP 0011340中公开的水不溶性叔胺，其与单C12-C14季胺 盐的混合物(公开于EP-B 0026528中)，和如在EP 0242919中所公开 的二长链酰胺。织物柔软剂体系的其它有用有机组分包括高分子量的 聚氧乙烯材料，如在EP 0299575和0313146中所公开的。
绿土粘土的含量一般在5-15％重量的范围，更优选8-12％重量， 作为干混合组分材料加入到配方的其余部分中。以0.5-5％重量，一般 1-3％重量的量加入有机织物柔软剂，例如水不溶性叔胺或二长链酰胺 材料，而以0.1-2％重量，一般0.15-1.5％重量的量加入高分子量聚氧 乙烯材料和水溶性阳离子材料。尽管在某些情况下作为干混颗粒加入 它们可以更方便，但一般将这些材料加到该组合物的喷雾干燥组分上， 或者作为熔融的液体将它们喷雾到组合物的其它固体组分上.
聚合染料转移抑制剂
按照本发明的洗涤组合物还包括0.001-10％重量，优选0.01-2％ 重量，更优选0.05-1％重量的聚合染料转移抑制剂。一般将所述的聚 合染料转移抑制剂加入到洗涤组合物中以便抑制染料从有色织物转移 到与其一起洗涤的织物上。在染料于洗涤中附着到其它物品上之前， 这些聚合物会络合或吸附从染色织物洗涤下来的短效染料。
特别合适的聚合染料转移抑制剂是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基 吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯 基鎓唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。
加入这样的聚合物也增强了本发明酶的性能。
本发明的洗涤组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状或粒状形式。
可以按例如US4106991和US4661452(两者均是Novo Industri A/S 的专利)中所公开的生产无尘的颗粒，并且该颗粒可以任选地用本领域 已知的方法涂覆。蜡质涂覆材料的例子是平均分子量为1000-20000的 聚(氧乙烯)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧 基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中该醇含有12-20个碳原子并且 其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二- 及三-甘油酯。在GB1483591中给出了适合于流化床技术涂覆的成膜 涂覆材料的例子。
本发明的粒状组合物也可以是“致密形式”的，即它们具有比常 规的粒状洗涤剂相对高的密度，即550-950g/l；在这样的情况下，本 发明的粒状洗涤组合物将含有比常规颗粒洗涤剂更少量的“无机填料 盐”；一般的填料盐是碱土金属的硫酸盐和氯化物，一般是硫酸钠；“致 密”的洗涤剂一般包括不多于10％的填料盐。本发明的液体组合物也 可以是“浓缩形式”的，在这样的情况下，本发明的液体洗涤组合物 将比常规的液体洗涤剂含有较低量的水。按组合物重量计，浓缩的液 体洗涤剂的水含量一般低于30％，更优选低于20％，最优选低于10 ％。
例如，可以将本发明的组合物配制为手洗或机洗衣物洗涤组合物， 包括洗衣添加剂组合物和适用于脏织物预处理的组合物，漂洗加入的 织物柔软剂组合物，和用于普通家庭硬表面清洗和碗碟洗涤的组合物。
下面的实例旨在举例说明本发明的组合物，而不对本发明范围作 任何限制。
在洗涤组合物中，缩写组分符号具有下面的意义：
LAS ：直链C12烷基苯磺酸钠
TAS ：牛脂烷基硫酸钠
XYAS ：C1X-C1Y烷基硫酸钠
SS ：式2-丁基辛酸的仲皂表面活性剂
25EY ：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C12-C15的
直链伯醇
45EY ：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C14-C15的
直链伯醇
XYEZS ：每摩尔与平均Z摩尔环氧乙烷缩合的C1x-C1Y烷
基硫酸钠
非离子 ：由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404销售
的、平均乙氧基化程度为3.8和平均丙氧基化程
度为4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪
醇
CFAA ：C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TFAA ：C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
硅酸盐 ：无定型硅酸钠(SiO2∶Na2O比＝2.0)
NaSKS-6 ：式d-Na2Si2O5的结晶层状硅酸盐
碳酸盐 ：无水碳酸钠
磷酸盐 ：三聚磷酸钠
MA/AA ：1∶4的马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约
80000
聚丙烯酸酯 ：BASF GmbH以商品名PA30销售的平均分子量
为约8000的聚丙烯酸酯均聚物
沸石A ：式Na12(AlO2SiO2)12.27H2O的水合硅铝酸钠，主
要粒径为1-10微米
柠檬酸盐 ：柠檬酸三钠二水合物
柠檬酸 ：柠檬酸
过硼酸盐 ：无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式为
NaBO2.H2O2
PB4 ：无水过硼酸钠四水合物
过碳酸盐 ：经验式为2Na2CO3.3H2O2的无水过碳酸钠漂白
剂
TAED ：四乙酰基乙二胺
CMC ：羧甲基纤维素钠
DETPMP ：由Monsanto以商品名Dequest 2060销售的二
乙三胺五(亚甲基膦酸)
PVP ：聚乙烯吡咯烷酮聚合物
EDDS ：钠盐形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]异构体
抑泡剂 ：25％熔点为50℃的石蜡，17％的疏水性二氧化
硅，58％的石蜡油
颗粒抑泡剂 ：颗粒形式的12％硅氧烷/二氧化硅，18％的硬脂
醇，70％的淀粉
硫酸盐 ：无水硫酸钠
HMWPEO ：高分子量聚氧乙烯
TAE 25 ：牛脂醇乙氧基化物(25)
洗涤剂实施例I
可以按如下所示制备本发明粒状织物清洗组合物：
线性C12烷基苯磺酸钠 6.5
硫酸钠 15.0
沸石A 26.0
次氮基三醋酸钠 5.0
本发明的酶 0.1
PVP 0.5
TAED 3.0
硼酸 4.0
过硼酸盐 18.0
苯酚磺酸盐 0.1
次要组份至 100
洗涤剂实施例II
可以按如下所示制备本发明的致密粒状织物清洗组合物(密度 800g/l)：
45AS 8.0
25E3S 2.0
25E5 3.0
25E3 3.0
TFAA 2.5
沸石A 17.0
NaSKS-6 12.0
柠檬酸 3.0
碳酸盐 7.0
MA/AA 5.0
CMC 0.4
本发明的酶 0.1
TAED 6.0
过碳酸盐 22.0
EDDS 0.3
粒状抑泡剂 3.5
水/次要组份 至100％
洗涤剂实施例III
按如下所示制备在洗涤彩色织物中特别有用的本发明粒状织物清 洗组合物：
LAS 10.7 -
TAS 2.4 -
TFAA - 4.0
45AS 3.1 10.0
45E7 4.0 -
25E3S - 3.0
68E11 1.8 -
25E5 - 8.0
柠檬酸 15.0 7.0
碳酸盐 - 10
柠檬酸 2.5 3.0
沸石A 32.1 25.0
NaSKS-6 - 9.0
MA/AA 5.0 5.0
DETPMP 0.2 0.8
本发明的酶 0.10 0.05
硅酸盐 2.5 -
硫酸盐 5.2 3.0
PVP 0.5 -
聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/- 0.2
乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮
的共聚物
过硼酸盐 1.0 -
苯酚磺酸盐 0.2 -
水/次要组份 至 100％
洗涤剂实施例IV
可按如下所示制备本发明具有“通过洗涤进行软化”的能力的粒 状织物清洗组合物：
45AS - 10.0
LAS 7.6 -
68AS 1.3 -
45E7 4.0 -
25E3 - 5.0
氯化椰油烷基二甲基羟乙基铵 1.4 1.0
柠檬酸盐 5.0 3.0
NaSKS-6 - 11.0
沸石A 15.0 15.0
MA/AA 4.0 4.0
DETPMP 0.4 0.4
过硼酸盐 15.0 -
过碳酸盐 - 15.0
TAED 5.0 5.0
绿土粘土 10.0 10.0
HMWPEO - 0.1
本发明的酶 0.10 0.05
硅酸盐 3.0 5.0
碳酸盐 10.0 10.0
粒状抑泡剂 1.0 4.0
CMC 0.2 0.1
水/次要组份 至 100％
洗涤剂实施例V
可按如下制备本发明的重垢液体织物清洗组合物：
I II
酸形式的LAS - 25.0
柠檬酸 5.0 2.0
酸形式的25AS 8.0 -
酸形式的25AE2S 3.0 -
25AE7 8.0 -
CFAA 5 -
DETPMP 1.0 1.0
脂肪酸 8 -
油酸 - 1.0
乙醇 4.0 6.0
丙二醇 2.0 6.0
本发明的酶 0.10 0.05
氯化椰油烷基二甲基羟乙基铵 - 3.0
绿土粘土 - 5.0
PVP 2.0 -
水/次要组份 至 100％
在皮革工业中的应用
本发明的枯草杆菌酶可以用于皮革工业，尤其用于皮的脱毛。
在该应用中，本发明的枯草杆菌酶变体优选在还含有另一种蛋白 酶的酶组合物中使用。
关于合适的其它蛋白酶的更详细的描述参阅关于适用于洗涤组合 物中的酶的部分(见上文)。
在毛纺工业中的应用
本发明的枯草杆菌酶可以用于毛纺工业，尤其是用于含毛衣物的 洗涤。
在该应用中，本发明的枯草杆菌酶变体优选在还含有另一种蛋白 酶的酶组合物中使用。
关于适当的其它蛋白酶的更详细描述参阅关于适用于洗涤组合物 中的酶的部分(见上文)。
本发明在下列实施例中有更详细的描述，这些实施例并不以任何 方式意图限制本发明要求的范围。
材料和方法
菌株：
枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen等人，1990)。
迟缓芽孢杆菌309和147是迟缓芽孢杆菌的特殊菌株，保藏于 NCIB，编号NCIB 10309和10147，而且描述于美国专利号3,723,250 中，该专利文献本文引用作为参考。
大肠杆菌MC1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生 物学杂志138 179-207)，用常规方法制成r-，m+，其还描述于美国专 利申请号039,298。
质粒
pJS3：大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，含有编码枯草杆菌酶 309的合成基因(由Jacob Schiodt等人描述于“蛋白质和多肽通讯” (Protein and Peptide letters)3：39-44(1996))。
pSX222：枯草芽孢杆菌表达载体(描述于WO 96/34946)。
常用分子生物学方法
除非特别指出，DNA操作和转化用分子生物学的标准方法进行 (Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉 港，纽约；F.M.Ausubel等人(主编)“分子生物学通用方法”(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons，1995； C.R.Harwood和S.M.Cutting(主编)“芽孢杆菌的分子生物学方法” (Molecular Biological Methods for Bacillus)，John Wiley and Sons， 1990)。
用于DNA操作的酶根据供应商的说明书使用。
用于基因操作的酶
除非特别指出，所有用于DNA操作的酶，如限制性内切酶、连接 酶等等，均购自New England Biolabs，Inc.。
蛋白水解活性
在本发明中蛋白水解活性以“千诺氏蛋白酶单位”(Kilo NOVO Protease Units，KNPU)表示。活性是相对于标准酶()测定 的，而且测定是建立在标准条件下(即50℃，pH8.3，反应时间9分钟， 测量时间3分钟)蛋白水解酶消化二甲基酪蛋白(DMC)溶液的基础之上 的。可以向丹麦Novo Nordisk A/S索取文件AF 220/1，该文件此处引 用作为参考。
GU即甘氨酸单位(Glycine Unit)，定义为以N-乙酰酪蛋白作为 底物，在标准条件下，于40℃保温15分钟时，产生相当于1毫摩尔 甘氨酸的氨基量的蛋白水解酶活性。
酶活性也可以用PNA实验，根据与可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙 氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基苯酚的反应测量(描述于美国石油化学协 会杂志(Journal of American Oil Chemists Society)，T.M.Rothgeb， B.D.Goodlander，P.H.Garrison和L.A.Smith，(1988))。
发酵
枯草杆菌酶的发酵于30℃在摇床上(300r.p.m.)含100ml BPX培养 基的500ml带挡板Erlenmeyer锥形瓶中进行5天。
因此，为了得到例如2升培养液，需要20个Erlenmeyer锥形瓶 同时进行发酵。
培养基
BPX：组成(每升)
土豆淀粉 100g
碾碎的大麦 50g
大豆粉 20g
Na2HPO4·12H2O 9g
Pluronic 0.1g
酪蛋白钠盐 10g
培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，培养基通过加热至120℃并保 持45分钟灭菌。灭菌后加入NaHCO3至0.1M将培养基的pH调至9。
实施例
实施例1
酶变体的构建和表达：
定点诱变：
枯草杆菌酶309的定点诱变体是使用“单一位点删除(unique site elimination，USE)”或“尿嘧啶-USE”技术(分别描述于Deng等人(分 析生化(Anal.Biochem)200：81-88(1992))，Markvardsen等人(生物 技术(BioTechniques)18(3)：371-372(1995)))制成的。
模板质粒是pJS3，或该质粒含有枯草杆菌酶309变体的类似物， 例如，用一段针对T255I变体构建体的寡核苷酸，对含有N252L变体 编码基因的pJS3类似物进行USE诱变，产生最终的N252L+T255I 枯草杆菌酶309变体。
然后用限制酶KpnI和MluI将pJS3构建的枯草杆菌酶309变体 亚克隆到枯草芽孢杆菌pSX222表达型质粒中。
定域随机诱变：
进行定域随机诱变的完整策略是：
合成对应于DNA序列中待诱变部分的诱变引物(寡核苷酸)，该引 物在对应于待诱变氨基酸密码子的核苷酸处不同。
然后，将得到的诱变引物与适当的反向引物一起用于PCR反应。 将得到的PCR片段纯化和消化并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭 载体中。
或者如果有必要，将得到的PCR片段作为引物与第二个适当的反 向引物一起用于第二个PCR反应，使得能够消化诱变区并将其克隆到 穿梭载体中。PCR反应在常规条件下进行。
遵循这种策略，构建SAVINASE的定域随机文库，其中位点N252、 T255和S259被完全随机化。
合成寡核苷酸，在想要突变的氨基酸密码子的第一个和第二个碱 基处，四种碱基中的每一种(N)都占25％。在密码子的第三个核苷 酸(摇摆碱基)处，G和C(S)各占50％，以避免三个终止密码子中的 两个(TAA和TGA)。
将诱变引物(5’-C TTC TGC GTT AAC AAG TCC GCT TCC ATA CAA GTT CGT SNN TCC TAA ACT SNN TGC CGT SNN CTT TAG ATG ATT-3’(反义))与适当的反向引物(如5’GAA CTC GAT CCA GCG ATT TC 3’(有义))一起用于PCR反应，而质粒pJS3作为 模板。将这样得到的PCR产物用限制酶XhoI和HpaI克隆到pJS3穿 梭载体中。
然后用限制酶KpnI和MluI将pJS3构建的定域随机文库亚克隆 到枯草芽孢杆菌pSX222表达质粒中。
如此制备的文库含有大约100,000个单克隆/文库。
对随机选取的10个菌落测序以确认设计的突变。
为了纯化本发明的枯草杆菌酶变体，将含有本发明变体的枯草芽 孢杆菌pSX222表达质粒转化到感受态枯草芽孢杆菌菌株中并如上文 所述在含10ug/ml氯霉素(CAM)的培养基中发酵。
实施例2
酶变体的纯化：
这项操作涉及枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶309或其突 变体的2升水平发酵的纯化。
将大约1.6升发酵液在1升离心杯中于5000rpm离心35分钟。用 10％醋酸将上清液调至pH6.5，并在Seitz Supra S100过滤板上过滤。
使用配备了Amicon S1Y10 UF柱体的Amicon CH2A UF装置将 滤出液浓缩至大约400ml。在上Bacitracin亲和柱(室温，pH7)吸附前， 先将UF浓缩液离心并过滤。用含25％ 2-丙醇和1M氯化钠的0.01M 二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙缓冲液(pH7)于室温将蛋 白酶从Bacitracin柱上洗脱下来。
将来自Bacitracin纯化步骤具有蛋白酶活性的级分合并，并加到 750ml Sephadex G25柱(直径5cm，用含0.01M二甲基戊二酸、0.2M 硼酸和0.002M氯化钙，pH6.5的缓冲液平衡过)上。
将来自Sephadex G25柱具有蛋白水解活性的级分合并，并加到150ml CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱(直径5cm，用含0.01M二甲基戊二 酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙，pH6.5的缓冲液平衡过)上。
用2升相同缓冲液中的线形梯度0-0.1M氯化钠(枯草杆菌蛋白酶 147的情况下用0-0.2M氯化钠)将蛋白酶洗脱下来。
在最后的纯化步骤中，将来自CM Sepharose柱含有蛋白酶的级 分合并，并在配备了GR81PP膜(购自Danish Sugar Factories Inc.)的 Amicon超滤室中浓缩。
通过使用实施例1用于构建的技术和上述分离方法，产生并分离 得到下列枯草杆菌蛋白酶309变体：
N252L+T255I
N252V+T255A
N252M+T255C+S259H
N252S+T255E+S259C和
N252K+T255S+S259C。
实施例3
含有酶变体的洗涤组合物的洗涤性能：
下列实施例提供了在指明的条件下进行的一些洗涤测试的结果。
实验条件
表IV：评价枯草杆菌蛋白酶309变体的实验条件
洗涤剂 蛋白酶型洗涤剂95 洗涤剂剂量 3.0g/l pH 10.5 洗涤时间 15min 温度 15℃ 水硬度 6°dH 酶 枯草杆菌蛋白酶309变体，如下文所示 酶浓度 10nM 测试系统 150ml带有搅棒的玻璃烧杯 纺织品/体积 5片纺织品(φ2.5cm)于50ml洗涤剂中 测试材料 来自Testmaterials，Holland的EMPA117
使用的洗涤剂是简单型制剂。pH调至10.5，这在粉剂型洗涤剂的 正常范围内。95型洗涤剂的组成如下：
25％ STP(Na5P3O10)
25％ Na2SO4
10％ Na2CO3
20％ LAS(Nansa 80S)
5.0％ 非离子型表面活性剂(Dobanol 25-7)
5.0％ Na2Si2O5
0.5％ 羧甲基纤维素(CMC)
9.5％ 水
水硬度通过向去离子水中加入CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+＝2∶1) 调整(也可参阅《消费品中的表面活性剂：理论、技术和应用》 (Surfactants in Consumer Products：Theory，Technology and Application)，Springer Verlag 1996)。洗涤剂溶液的pH通过加入HCl 调至pH10.5。
使用Macbeth ColorEye 7000型光度计(Macbeth，Kollmorgen器 械公司(Division of Kollmorgen Instruments Corporation)，德国)测量 测试材料在460nm的反射率(reflectance，R)。测量根据供应商的说明 书进行。
枯草杆菌蛋白酶309变体的洗涤性能通过计算性能因子评价：
P＝(R变体-R空白)/(RSavinase-R空白)
P：性能因子
R变体：用变体洗涤后测试材料的反射率
RSavinase：用洗涤后测试材料的反射率
R空白：不用酶洗涤后测试材料的反射率
要求保护的枯草杆菌蛋白酶309变体相对于都具有改良 的洗涤性能-即P＞1。
变体被分成几个改良等级，用大写字母表示：
A级：1＜P≤1.5
B级：1.5＜P≤2
C级：P＞2
表V：枯草杆菌蛋白酶309变体及改良等级
改良等级 变体 A N252L+T255I N252V+T255A N252M+T255C+S259H N252S+T255E+S259C N252K+T255S+S259C B C
数目不断增加的商业用途的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的 蛋白质工程变体，如(Novo Nordisk A/S)、 (Novo Nordisk A/S)、(Gist-Brocades N.V.)、 (Genencor国际有限公司)。
还有许多蛋白酶变体在本领域中已有描述，如EP 130756 (GENENTECH)(相应于美国再颁专利34,606(GENENCOR))；EP 214435(HENKEL)；WO 87/04461(AMGEN)；WO 87/05050 (GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985) 自然(Nature)318 375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物 学杂志(J.Mol.Biol.)193 803-813；Russell和Fersht(1987)自然328 496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(AMGEN)；WO 95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER&GAMBLE公 司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAY S.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)； WO 91/00345(Novo Nordisk A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)；WO 94/02618(GIST-BROCADES N.V.)；和WO 96/34946(Novo Nordisk A/S)。
然而，尽管已经描述了许多有用的蛋白酶变体，许多工业用途仍 然需要新的改良的蛋白酶变体。
因此，本发明的目的是提供改良的蛋白质工程化蛋白酶变体，尤 其是用于洗涤剂工业。
发明概述
本发明深入研究了的残基N252、T255和S259的许 多种可能的组合，并且鉴定了具有增强的洗涤性能的一些变体。
进一步的细节参阅本文实施例(见下文)。
相应地，本发明第一方面涉及在洗涤剂中具有改良的洗涤性能的 枯草杆菌酶(subtilase)蛋白酶变体，该变体在位点252、255和/或259 具有修饰。
根据本发明的枯草杆菌酶变体优选地在两个位点252和255均有 修饰，更优选地在所有三个位点252、255和259都有修饰。
本发明第二方面涉及在洗涤剂中具有改良的洗涤性能的枯草杆菌 酶变体，其含有至少一种选自下组的修饰：
252L+255I
252V+255A
252M+255C+259H
252S+255E+259C
252K+255S+259C或
在上述任何变体中含有一个或多个保守修饰的变体(例如252L(疏 水性氨基酸)+255I变体的保守修饰包括如252I(疏水性氨基酸)+255I 和252V(疏水性氨基酸)+255I的变体)。
本发明第三方面涉及编码本发明枯草杆菌酶变体的分离DNA序 列。
本发明第四方面涉及含有编码本发明枯草杆菌酶变体的分离DNA 序列的表达载体。
本发明第五方面涉及转化了第四方面的表达载体的微生物宿主细 胞。
本发明还涉及本发明的枯草杆菌蛋白酶的生产方法，包括将根据 第四方面的表达载体插入到合适的微生物宿主中，培养宿主以表达需 要的枯草杆菌酶，并回收酶产品。
本发明还涉及含有本发明枯草杆菌酶变体的组合物。
最后本发明涉及突变酶在许多工业相关应用中的用途，特别是在 清洁组合物中的用途，本发明还涉及含有突变酶的清洁组合物，尤其 是含有突变枯草杆菌蛋白酶的洗涤组合物。
定义
在进一步详细论述本发明之前，先定义下列术语。
氨基酸的命名
A＝Ala＝丙氨酸
V＝Val＝缬氨酸
L＝Leu＝亮氨酸
I＝Ile＝异亮氨酸
P＝Pro＝脯氨酸
F＝Phe＝苯丙氨酸
W＝Trp＝色氨酸
M＝Met＝蛋氨酸
G＝Gly＝甘氨酸
S＝Ser＝丝氨酸
T＝Thr＝苏氨酸
C＝Cys＝半胱氨酸
Y＝Tyr＝酪氨酸
N＝Asn＝天冬酰胺
Q＝Gln＝谷氨酰胺
D＝Asp＝天冬氨酸
E＝Glu＝谷氨酸
K＝Lys＝赖氨酸
R＝Arg＝精氨酸
H＝His＝组氨酸
X＝Xaa＝任何氨基酸
核酸命名
A＝腺嘌呤
G＝鸟嘌呤
C＝胞嘧啶
T＝胸腺嘧啶(只存在于DNA中)
U＝尿嘧啶(只存在于RNA中)
变体的命名
在描述本发明产生或包括的各种酶变体时，采用以下命名法以便 简化：
原氨基酸位点取代氨基酸
根据这种命名法，在位点195由谷氨酸取代甘氨酸被记做：
Gly 195 Glu或G195E
同一位点的甘氨酸被删除记做：
Gly 195＊或G195＊
而一个额外的氨基酸残基如赖氨酸的插入记做：
Gly 195 GlyLys或G195GK
在相对于用于编号的序列存在删除的位点处的插入，用：
＊36Asp 或＊36D
表示天冬氨酸在位点36的插入。
多重突变用加号分开，即：
Arg 170 Tyr+Gly 195 Glu或R170Y+G195E
表示在位点170和195的突变，用酪氨酸和谷氨酸分别取代精氨 酸和甘氨酸。
蛋白酶
将能切开蛋白质底物中酰氨键的酶归类为蛋白酶或肽酶(可互换使 用)(参阅Walsh，1979，酶反应机制(Enzymatic Reaction Mechanisms)， W.H.Freeman and Company，旧金山，第三章)。
氨基酸位点/残基的编号
如果没有特别指出，本文使用的氨基酸编号相应于枯草杆菌酶 BPN’(BASBPN)序列。BPN’序列的进一步描述参阅Siezen等人，蛋 白质工程(Protein Engng.)4(1991)719-737和图1。
丝氨酸蛋白酶
丝氨酸蛋白酶是指能催化肽键水解，并且在其活性位点存在必需 丝氨酸残基的酶(White，Handler和Smith，1973“生化原理”(Principles of Biochemistry)，第五版，McGraw-Hill书籍公司，纽约，第271-272 页)。
细菌丝氨酸蛋白酶的分子量范围为20,000-45,000道尔顿。它们 被二异丙基氟磷酸盐抑制。它们水解简单的末端酯，而且与真核生物 的糜蛋白酶(也是丝氨酸蛋白酶)的活性相似。范围更窄的术语-碱性蛋 白酶(包括一个亚组)反映了一些丝氨酸蛋白酶最适pH高，从pH9.0到 11.0(参阅Priest(1977)细菌学回顾(Bacteriological Rev.)41711-753)。
枯草杆菌酶
丝氨酸蛋白酶的一个暂时命名为枯草杆菌酶的亚组，由Siezen等 人[蛋白质工程4(1991)719-737]提出。它们由对40多种丝氨酸蛋 白酶(以前被称作类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease))的氨基酸 序列同源分析定义。枯草杆菌蛋白酶以前被定义为由革兰氏阳性细菌 或真菌产生的丝氨酸蛋白酶，而现在根据Siezen等人的定义，它是枯 草杆菌酶的一个亚组。已经鉴定了多种枯草杆菌酶，而且许多枯草杆 菌酶的氨基酸序列已经测定。关于这些枯草杆菌酶更详细的描述和它 们的氨基酸序列参阅Siezen等人的文献和本文图1。
枯草杆菌酶的一个亚组，I-S1，包括“经典的”枯草杆菌蛋白酶， 如枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶 Carlsberg(，Novo NordiskA/S)和枯草杆菌蛋白酶DY。
由Siezen等人(见上文)划分了枯草杆菌酶的另一个亚组，I-S2。I- S2亚组蛋白酶被描述成高度碱性的枯草杆菌蛋白酶，包括如枯草杆菌 蛋白酶PB92(，Gist-Brocades NV)、枯草杆菌蛋白酶309 (，Novo NordiskA/S)、枯草杆菌蛋白酶147(， Novo NordiskA/S)和碱性弹性蛋白酶YaB。
“”
由Novo NordiskA/S出售。
它是来源于迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶309，而且与BABP92 只在N87S不同(参阅本文图1)。
亲本枯草杆菌酶
术语“亲本枯草杆菌酶”指根据Siezen等人(蛋白质工程4：719- 737(1991))定义的枯草杆菌酶。进一步细节参阅上文“枯草杆菌酶”的 描述。亲本枯草杆菌酶也可以是由天然来源分离得到的枯草杆菌酶， 随后进行了修饰而同时保留了枯草杆菌酶的特征。
术语“亲本枯草杆菌酶”或者可以称作“野生型枯草杆菌酶”。
枯草杆菌酶变体的修饰
本文讨论的枯草杆菌酶变体修饰中使用的术语“修饰”被定义为 包括化学改性以及基因操作。修饰可以是在感兴趣的氨基酸位点处的 取代、删除和/或插入。
枯草杆菌酶变体
在本文中，术语枯草杆菌酶变体或突变的枯草杆菌酶指由表达突 变基因的生物体产生的枯草杆菌酶，该突变基因来源于具有原始或亲 本基因并产生相应亲本酶的亲本微生物，其中亲本基因已经被突变以 得到在合适的宿主中表达时产生突变枯草杆菌酶的突变基因。
同源枯草杆菌酶序列
本文鉴定了枯草杆菌酶中的特殊氨基酸残基用于修饰 以得到本发明的枯草杆菌酶变体。
然而，本发明并不限于这种特殊枯草杆菌酶的修饰，而是扩展到 与有同源的一级结构的其它亲本(野生型)枯草杆菌酶。
为了鉴定其它同源枯草杆菌酶，在本发明的范围内，进行了枯草 杆菌酶与以前对比的一组枯草杆菌酶的对比，并保持以前的对比不变。 进行了枯草杆菌酶中18个高度保守残基的比较。这18个高度保守残 基列于表I(关于这些保守残基的进一步细节参阅Siezen等人)。
表I 枯草杆菌酶中的18个高度保守残基
位点：保守残基
23 G
32 D
34 G
39 H
64 H
65 G
66 T
70 G
83 G
125 S
127 G
146 G
154 G
155 N
219 G
220 T
221 S
225 P
在进行了对比之后(为了实现对比，允许必要的插入和删除)，鉴定 出了合适的同源残基。然后该同源残基可以根据本发明进行修饰。
使用CLUSTALW(第1.5版，1995年4月)电脑对比程序 (J.D.Thompson，D.G.Higgins和T.J.Gibson(1994)核酸研究(Nucleic Acid Research)，22：4673-4680)，设定缺口开放罚分(GAP open penalty)10.0和缺口延伸罚分(GAP extension penalty)0.1，用 BLOSUM30蛋白质质量矩阵，使用程序中的特征对比(Profile alignments)选项进行给定枯草杆菌酶在以前对比的枯草杆菌酶组中的 对比。对于在本发明范围中的给定枯草杆菌酶，优选18个高度保守残 基100％保守。然而，在18个残基中多于或等于17的对比，或少至16 个保守残基的对比也足够用于鉴定同源残基。在枯草杆菌酶中，应当 维持催化三组合Asp32/His64/Ser221的保守性。
图1显示了以前确定的对比，还显示了在此对比中各枯草杆菌酶 对于18个高度保守残基的相同性百分比。
在此描述的基础上，鉴定适当的同源枯草杆菌酶和根据本发明可 以进行修饰的相应同源残基对于本领域技术人员是常规工作。为了说 明这一点，下文的表II显示了部分同源枯草杆菌酶和可根据本发明进 行修饰的相应合适残基。
表II 同源枯草杆菌酶及根据本发明适合于修饰的相应同源残基
位点/酶 BASBPN BYSYAB BLS309 BLS147 TVTHER 252+255 N252L+ T255I N252L+ T255I N252L+ T255I Q252L+ T255I N252L+ D255I 252+255 N252V+ T255A N252V+ T255A N252V+ T255A Q252V+ T255A N252V+ D255A 252+255+ 259 N252M+ T255C+ D259H N252M+ T255C+ N259H N252M+ T255C+ S259H Q252M+ T255C+ S259H N252M+ D255C+ G259H
显然本领域技术人员可以容易地给出包含其它同源枯草杆菌酶的 相似或更大的表格。
洗涤性能
酶在例如清洗过程中催化待清洗物体上的各种天然存在底物的降 解的能力，通常被称作它的洗涤能力(washing ability)、可洗力 (washability)、去垢力(detergency)或洗涤性能(wash performance)。 在本申请中，用术语洗涤性能表示这种特性。
分离DNA序列
术语“分离的”，当应用于DNA序列分子时，表示该DNA序列 已从其天然遗传环境中取出并且因而不含其它无关的或多余的编码序 列，而且以适合于在基因工程蛋白质生产系统中使用的形式存在。这 些分离分子是与其天然环境分开的分子，包括cDNA和基因组克隆。 本发明的分离DNA分子不含它们最初与之相关的其它基因，但是可能 包含天然存在的5’和3’非翻译区如启动子和终止子。这些相关区域的 鉴定显然是本领域的基本技术之一(参阅如Dynan和Tijan，自然 (Nature)316：774-78，1985)。术语“分离DNA序列”也可称作“克 隆DNA序列”。
分离蛋白质
当应用于蛋白质时，术语“分离的”说明该蛋白质存在于不同于 它的天然环境的条件下。在优选的形式中，分离蛋白质基本不含其它 蛋白质，尤其是其它同源蛋白质(即“同源杂质”(见下文))。优选提供 高度纯化形式的蛋白质，即由SDS-PAGE鉴定纯度高于40％、纯度高 于60％、纯度高于80％，更优选纯度高于95％，甚至更优选纯度高 于99％。
术语“分离蛋白质”也可称作“纯化蛋白质”。
同源杂质
术语“同源杂质”指来自本发明多肽最初来源的同源细胞中的任 何杂质(如除本发明多肽外的另一种多肽)。
来源于
如本文与特殊微生物来源一起使用的术语“来源于”，指多核苷酸 和/或多肽由特殊来源、或由插入了来自该来源的基因的细胞产生。
底物
术语“底物”与蛋白酶底物有关的使用，应当被理解为其范围最 宽的形式，如含有至少一个易被枯草杆菌蛋白酶水解的肽键的化合物。
产物
术语“产物”与来源于蛋白酶酶反应的产物有关的使用在本文中 应当被理解为包括涉及枯草杆菌酶的水解反应的产物。产物可能是下 一个水解反应的底物。
图的简要描述
图1显示了许多同源枯草杆菌酶根据枯草杆菌酶中18个高度保守 的残基的对比。这18个高度保守残基以粗体标明。所有显示的枯草杆 菌酶，除了JP170外，在保守残基处100％相同。JP170在保守残基 G146处是“N”而不是“G”。
发明详述
具有改良的洗涤性能的枯草杆菌酶变体：
本发明鉴定了BLS309()的洗涤性能有所改善的变 体。
相应地，本发明的实施方案涉及枯草杆菌酶变体，其中修饰选自：
N252L+T255I
N252V+T255A
N252M+T255C+S259H
N252S+T255E+S259C
N252K+T255S+S259C或
在上述任何变体中包含一个或多个保守修饰的变体(如N252L(疏 水性氨基酸)+T255I变体的保守修饰包括如N252I(疏水性氨基 酸)+T255I和N252V(疏水性氨基酸)+T255I之类变体)。
本文测试了许多本发明的枯草杆菌酶变体，显示在洗涤剂中有改 良的洗涤性能(参阅本文实施例(见下文))。
本领域众所周知，氨基酸的相似保守氨基酸取代只会给酶的特性 带来轻微改变。
下面的表III列出了几组保守氨基酸。
表III 保守氨基酸取代
碱性的： 精氨酸
赖氨酸
组氨酸
酸性的： 谷氨酸
天冬氨酸
极性的： 谷氨酰胺
天冬酰胺
疏水性的：亮氨酸
异亮氨酸
缬氨酸
芳香族的：苯丙氨酸
色氨酸
酪氨酸
小的： 甘氨酸
丙氨酸
丝氨酸
苏氨酸
甲硫氨酸
因此，枯草杆菌酶变体如252L+255I、252I+255I和252V+255I 将具有相似的洗涤性能改良。而且，枯草杆菌酶变体如N252L+T255I、 N252I+T255I和N252V+T255I也将具有相似的洗涤性能改良。
根据本文公开的枯草杆菌酶变体，鉴定其它适当的保守取代以获 得具有改良的洗涤性能的枯草杆菌酶变体，对于本领域技术人员将是 常规工作。
在本发明的实施方案中，感兴趣的是那些属于I-S1和I-S2亚组的 枯草杆菌酶。
关于I-S1亚组，优选的亲本枯草杆菌酶选自ABSS168、BASBPN、 BSSDY和BLSCAR或它们的保留了I-S1亚组特征的功能性变体。
关于I-S2亚组，优选的亲本枯草杆菌酶选自BLS147、BLS309、 BAPB92、TVTHER和BYSYAB或它们的保留了I-S2亚组特征的功 能性变体。
本发明还包括上述位点处的任何一个或多个修饰与对亲本酶氨基 酸序列的任何其它修饰的组合。尤其包括与本领域所知的用以改良酶 特性的其它修饰的组合。本领域描述了许多具有不同改良特性的枯草 杆菌酶变体，其中一部分在本文“发明背景”部分中提及(见上文)。那 些参考文献在本文公开，作为鉴定可以有利地与本发明枯草杆菌酶变 体相组合的枯草杆菌酶变体的参考。
这些组合包括位点：222(改善氧化稳定性)和218(改善热稳定性)， Ca结合位点的取代使酶稳定，如位点76，和现有技术已知的许多其 它修饰。
在进一步的实施方案中，本发明的枯草杆菌酶变体可以有利地与 下列任何位点处的一个或多个修饰组合：
27、36、57、76、97、101、104、120、123、167、170、206、218、 222、224、235和274。
特别地，下面的BLS309和BAPB92变体被认为适合于组合：
K27R，＊36D，S57P，N76D，G97N，S101G，V104A，V104N，V104Y，H120D，
N123S，Y167A，Y167I，R170S，R170L，R170N，Q206E，N218S，M222S，
M222A，T224S，K235L和T274A.
另外，包括V104N+S101G、K27R+V104Y+N123S+T274A或 N76D+V104A变异或者这些突变(V104N、S101G、K27R、V104Y、 N123S、T274A、N76D、V104A)的其它组合的任何变异与任何一个或 多个上文提及的修饰组合的变体具有改良的特性。
此外，本发明主要方面的枯草杆菌酶变体优选与129、131、133 和194中任何位点处的一个或多个修饰(更优选129K、131H、133P、 133D和194P修饰，最优选P129K、P131H、A133P、A133D和A194P 修饰)组合。那些修饰中的任何一种都可能使本发明的枯草杆菌酶变体 的表达水平更高。
在枯草杆菌酶基因中产生突变
用于克隆本发明的枯草杆菌酶和用于将突变引入基因(如枯草杆菌 酶基因)的许多方法在本领域中是众所周知。
通常，可以使用克隆基因和在该基因中引入突变(随机和/或定点) 的标准方法得到本发明的枯草杆菌酶变体。关于合适的技术的进一步 描述参阅本文实施例(见下文)和(Sambrook等人(1989)分子克隆：实验 室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；F.M.Ausubel等人(主编)“分 子生物学的最新方法”，John Wiley and Sons，1995；C.R.Harwood 和S.M.Cutting(主编)“芽孢杆菌的分子生物学方法”，John Wiley and Sons，(1990)；和WO 96/34946)。
表达载体
含有编码本发明酶的DNA构建体的重组表达载体可以是能够方便 地进行重组DNA操作的任何载体，载体的选择经常取决于它将要导入 的宿主细胞。由此，载体可以是自主复制的载体，即以染色体外实体 形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒。或者，载体 可以是这样一种类型，当它被导入到宿主细胞中时，会部分或全部整 合到宿主细胞基因组中，并与整合的染色体一起复制。
载体优选是表达载体，其中编码本发明酶的DNA序列可操作地连 接了DNA转录所需的附加片段。一般来说，表达载体来源于质粒或病 毒DNA，或者可以含有二者的元件。术语“可操作地连接”指的是诸 片段的排列方式使得它们能够行使与预期用途(如转录由启动子起始并 贯穿编码酶的DNA序列)一致的功能。
启动子可以是在所选宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列， 可以来源于与宿主细胞同源或异源的编码蛋白质的基因。
适用于细菌宿主细胞的启动子的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽 糖源淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀 粉酶基因、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶基因或短小芽孢杆菌木糖苷酶基 因的启动子，或者λ噬菌体PR或PL启动子，或者大肠杆菌lac、trp 或tac启动子。
如果需要，编码本发明酶的DNA序列还可以可操作地连接合适的 终止子。
本发明的重组载体还可以含有使载体能够在所选宿主细胞中复制 的DNA序列。
载体还可以含有选择标记，如其产物补偿宿主细胞缺陷的基因， 或者编码对卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、壮观霉素等抗生素 或对重金属或除草剂的抗性的基因。
为了将本发明的酶导入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中 提供分泌信号序列(也称作前导序列、前体序列或前序列)。分泌信号序 列以正确的阅读框架与编码酶的DNA序列连接。分泌信号序列通常位 于编码酶的DNA序列的5’端。分泌信号序列可以是通常与酶有关的 序列或可以来自编码另一个分泌蛋白的基因。
用于分别连接编码本发明酶的DNA序列、启动子和任选终止子和 /或分泌信号序列，或用适当的PCR扩增方案将这些序列装配起来， 和将它们插入含有复制或整合所需信息的合适载体的方法，是本领域 技术人员众所周知的(参阅如Sambrook等人，出处同上)。
宿主细胞
导入宿主细胞的编码本发明酶的DNA序列可以是与所选宿主同源 或异源的序列。如果与宿主细胞同源，即由宿主细胞天然产生的，通 常将它可操作地连接另一个启动子序列，或者如果可行的话，则连接 另一个分泌信号序列和/或终止子序列(非天然的)。术语“同源”意指 包括编码所选宿主生物天然的酶的DNA序列。术语“异源”意指包括 宿主细胞天然不表达的DNA序列。因此，DNA序列可以来自另一种 生物体，或者可以是合成序列。
待导入本发明DNA构建体或重组载体的宿主细胞可以是能够产生 本发明酶的任何细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。
经过培养能够产生本发明酶的细菌宿主细胞的例子是革兰氏阳性 细菌，如芽孢杆菌属的菌株，诸如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟 缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀 粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽 孢杆菌或苏云金芽孢杆菌菌株，或链霉菌属的菌株，诸如浅青紫链霉 菌或鼠灰链霉菌，或者革兰氏阴性细菌诸如大肠杆菌。细菌的转化可 以通过原生质体转化、电穿孔、接合或通过感受态细胞以已知的方式 进行(参阅Sambrook等人，见上文)。
当在细菌诸如大肠杆菌中进行表达时，酶可以保留在细胞质中， 通常以不溶性颗粒存在(称为包涵体)，或可以被细菌分泌序列引导到周 质空间。在前一种情况中，裂解细胞，回收颗粒，变性，然后稀释变 性剂使酶重新折叠。在后一种情况中，酶可以从周质空间回收，如用 超声波或渗透休克破碎细胞，以释放周质空间的成分，并回收酶。
当在革兰氏阳性细菌诸如芽孢杆菌或链霉菌菌株中进行表达时， 酶可以保留在细胞质中，或可以被细菌分泌序列引导到细胞外培养基 中。在后一种情况中，酶可以如下文所述从培养基中回收。
生产枯草杆菌酶的方法
本发明提供了生产本发明分离酶的方法，其中将转化了编码该酶 的DNA序列的合适宿主细胞在允许酶产生的条件下培养，并从培养液 中回收产生的酶。
当含有编码酶的DNA序列的表达载体被转化到异源宿主细胞中 时，有可能异源重组产生本发明的酶。
由此有可能得到高度纯化的枯草杆菌酶组合物，其特征为不含同 源杂质。
在本文中，同源杂质指由本发明的酶最初来源的同源细胞产生的 任何杂质(如不同于本发明的酶的其它多肽)。
用于培养转化宿主细胞的培养基可以是适合于所选宿主细胞生长 的任何常规培养基。可以很方便地将表达的枯草杆菌酶分泌到培养基 中，并通过众所周知的方法从中回收，所述方法包括经离心或过滤将 细胞与培养基分开、经盐(如硫酸铵)沉淀培养基中的蛋白质成分， 随后通过如离子交换层析、亲和层析等层析方法纯化。
本发明的枯草杆菌酶变体的用途
本发明的枯草杆菌酶变体可以用于许多工业用途，尤其是用于洗 涤剂工业中。
本发明还涉及含有本发明的枯草杆菌酶变体的酶组合物。
下文描述了关于优选的工业应用的概述和相应的优选酶组合物。
此概述并非旨在完全列出本发明枯草杆菌酶变体的所有适当应 用。本发明的枯草杆菌酶变体可应用于本领域内已知使用蛋白酶、尤 其是枯草杆菌酶的其它工业应用中。
含有突变酶的洗涤组合物
本发明包括本发明的突变酶在清洁和洗涤组合物中的用途以及含 有突变枯草杆菌蛋白酶的这种组合物。这些清洁和洗涤组合物在本领 域中有很好的描述，关于合适的清洁和洗涤组合物的进一步描述参阅 WO 96/34946、WO 97/07202和WO 95/30011。
还可以参考本文的实施例，显示本发明的许多枯草杆菌酶变体改 良的洗涤性能。
洗涤剂的公开内容和实例
本发明的洗涤组合物中含有表面活性剂体系，其中表面活性剂可 以选自非离子型和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性型和/或两性离 子型和/或半极性型表面活性剂。
表面活性剂一般以0.1-60％重量的量存在。
优选将表面活性剂配制成与组合物中存在的酶组分相容。在液体 或凝胶组合物中，最优选将表面活性剂配制成能促进或至少是不降低 这些组合物中的任何酶的稳定性。
根据本发明使用的优选体系包括本文中所述的作为表面活性剂的 一种或多种非离子和/或阴离子表面活性剂。
烷基酚的聚氧乙烯、聚氧丙烯和聚氧丁烯缩合物适合用作本发明 表面活性剂体系的非离子表面活性剂，其中优选聚氧乙烯缩合物。这 些化合物包括具有含约6-14个碳原子，优选约8-14个碳原子直链或 支链构型之烷基的烷基酚与烯化氧的缩合产物。在优选的实施方案中， 环氧乙烷存在的量等于每摩尔烷基酚约2-25摩尔，更优选约3-15摩 尔的环氧乙烷。这类市售的非离子表面活性剂包括：由GAF Corporation销售的IgepalTM CO-630；和均由Rohm & Haas Company 销售的TritonTM X-45、X-114、X-100和X-102。这些表面活性剂通常 被称之为烷基酚烷氧基化物(例如，烷基酚乙氧基化物)。
伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合物适合用作本发明的 非离子表面活性剂。该脂族醇的烷基链可以是直链或支链的、伯或仲 的，并且通常含有约8-22个碳原子。优选的是具有含约8-20个碳原 子，更优选约10-18个碳原子烷基的醇与每摩尔醇约2-10摩尔环氧乙 烷的缩合产物。所述的缩合产物中每摩尔醇有约2-7摩尔的环氧乙烷， 最优选2-5摩尔的环氧乙烷。可从市场上购得的这类非离子表面活性 剂的例子包括：由Union Carbide Corporation销售的TergitolTM 15- S-9(C11-C15直链醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)和TergitolTM 24-L-6 NMW(C12-C14伯醇与6摩尔环氧乙烷的窄分子量分布的缩合产物)；和 由Shell Chemical Company销售的NeodolTM 45-9(C14-C15直链醇与9 摩尔环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM 23-3(C12-C13直链醇与3.0摩尔 环氧乙烷的缩合产物)、NeodolTM 45-7(C14-C15直链醇与7摩尔环氧乙 烷的缩合产物)、NeodolTM 45-5(C14-C15直链醇与5摩尔环氧乙烷的缩 合产物)；由Procter & Gamble Company销售的KyroTM EOB(C13-C15 醇与9摩尔环氧乙烷的缩合产物)；和由Hoechst销售的Genapol LA050(C12-C14醇与5摩尔环氧乙烷的缩合产物)。这些产物的HLB的 优选范围是8-11，最优选8-10。
也可用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是在 US4565647中公开的烷基多糖，该多糖具有含约6-30，优选约10-16 个碳原子的疏水基团和含约1.3-10，优选约1.3-3，最优选约1.3-2.7个 糖单元的多糖如多糖苷亲水基团。可以使用任何含有5或6个碳原子 的还原糖，例如，可以用葡萄糖、半乳糖和半乳糖基部分代替葡萄糖 基部分(任选地，在2-，3-，4-等位连接疏水基团从而得到与葡萄糖苷 或半乳糖苷不同的葡萄糖或半乳糖)。该糖间键可以在，例如，附加糖 单元的1位和前一糖单元的2-，3-，4-，和/或6-位之间。
优选的烷基多糖苷具有下式：
R2O(CnH2nO)t(糖基)x
其中R2选自：烷基、烷基苯基、羟基烷基、羟基烷基苯基、和其 混合形式，其中烷基含有约10-18，优选约12-14个碳原子；n是2或 3，优选2；t是0-约10，优选0；x是约1.3-10，优选约1.3-3，最优 选约1.3-2.7。该糖基优选是从葡萄糖衍生的。为了制备这些化合物， 先形成醇或烷基多乙氧基醇，然后与葡萄糖或葡萄糖源反应，从而形 成葡糖苷(在1-位连接)。然后另外的糖基单元在其1-位置与前面的糖 基单元2-，3-，4-，和/或6-位置，优选主要在2-位之间连接。
环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基之间的缩合 产物也适合用作本发明的附加非离子表面活性剂体系。这些化合物的 疏水部分的分子量优选为约1500-1800并显示出水不溶性。将聚氧乙 烯部分加成到该疏水部分会增加整个分子的水溶性，在聚氧乙烯含量 不超过该缩合产物总重量的约50％(相当于与多达约40摩尔的环氧乙 烷缩合)时，仍能保持该产品的液体性质。这类化合物的例子包括某些 可从市场上购得的由BASF销售的PluronicTM表面活性剂。
也适合用作本发明非离子表面活性剂体系的非离子表面活性剂是 环氧乙烷与从环氧丙烷和乙二胺反应得到的产物的缩合产物。这些产 物的疏水部分由乙二胺和过量环氧丙烷的反应产物组成，并且分子量 一般是约2500-3000。该疏水部分与环氧乙烷缩合，缩合程度为该缩合 产物含有约40-80％重量的聚氧乙烯并且分子量为约5000-11000。这 类非离子表面活性剂的例子包括某些可从市场上购得的由BASF销售 的TetronicTM化合物。
优选用作本发明表面活性剂体系的非离子表面活性剂是：烷基酚 的聚氧乙烯缩合物、伯和仲脂族醇与约1-25摩尔环氧乙烷的缩合产物、 烷基多糖、和其混合物。最优选的是具有3-15个乙氧基的C8-C14烷基 酚乙氧基化物和具有2-10个乙氧基的C8-C18(优选平均为C10)醇乙氧基 化物、和其混合物。
非常优选的非离子表面活性剂是下式的多羟基脂肪酸酰胺表面活 性剂：
其中R1是H，或R1是C1-4烃基、2-羟基乙基、2-羟基丙基或其混 合形式，R2是C5-31烃基，Z是具有直链烃基链、至少3个羟基直接连 接到该链上的多羟基烃基，或其烷氧基化的衍生物。优选地，R1是甲 基，R2是直链C11-15烷基或C16-18烷基或链烯基链，例如椰油烷基，或 其混合形式，Z是在还原性胺化反应中从还原糖如葡萄糖、果糖、麦 芽糖或乳糖衍生的。
非常优选的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化的硫酸盐表面活 性剂。其例子是式RO(A)mSO3M的水溶性盐或酸，其中R是未取代 的C10-C24烷基或具有C10-C24烷基部分的羟基烷基，优选C12-C20烷基 或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基烷基，A是乙氧基或丙氧基单 元，m大于0，一般为约0.5-6，更优选约0.5-3，M是H或阳离子， 该阳离子可以是：例如金属阳离子(如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取 代铵阳离子。本文也涵盖烷基乙氧基化硫酸盐以及烷基丙氧基化硫酸 盐。取代铵阳离子的具体例子包括：甲基、二甲基、三甲基铵阳离子 和季铵阳离子如四甲基铵和二甲基哌啶鎓阳离子和从烷基胺如乙胺、 二乙胺、三乙胺、其混合物衍生的那些阳离子等。举例说明的表面活 性剂是：C12-C18烷基聚乙氧基化物(1.0)硫酸盐(C12-C18E(1.0)M)、C12- C18烷基聚乙氧基化物(2.25)硫酸盐(C12-C18E(2.25)M)、C12-C18烷基聚 乙氧基化物(3.0)硫酸盐(C12-C18E(3.0)M)、C12-C18烷基聚乙氧基化物(4.0) 硫酸盐(C12-C18E(4.0)M)，其中M方便地选自钠和钾。
适用的阴离子表面活性剂是烷基酯磺酸盐表面活性剂，包括按照 “美国油类化学家协会杂志”(The Journal of the American Oil Chemists Society)，52(1975)，第323-329页用气态SO3磺化的C8-C20 羧酸(即脂肪酸)的直链酯。合适的原料包括从牛脂、棕榈油等衍生的天 然脂类物质。
优选的烷基酯磺酸盐表面活性剂(尤其是用于洗衣用途的)包括下面 结构式的烷基酯磺酸盐表面活性剂：
其中R3是C8-C20烃基，优选烷基，或其组合，R4是C1-C6烃基， 优选烷基，或其组合，M是与烷基酯磺酸根形成水溶性盐的阳离子。 合适的成盐阳离子包括金属阳离子(如钠、钾和锂)和取代或未取代的铵 阳离子(例如单乙醇胺、二乙醇胺、和三乙醇胺)。优选地，R3是C10-C16 烷基，R4是甲基、乙基或异丙基。特别优选的是甲基酯磺酸盐，其中 R3是C10-C16烷基。
其它合适的阴离子表面活性剂包括：烷基硫酸盐表面活性剂，它 们是式ROSO3M的水溶性盐或酸，其中R优选是C10-C24烃基，优选 具有C10-C20烷基部分的烷基或羟基烷基，更优选C12-C18烷基或羟基 烷基，M是H或阳离子，例如碱金属阳离子(如钠、钾、锂)，或者铵 或取代铵(如甲基、二甲基和三甲基铵阳离子，和季铵阳离子例如四甲 基铵和二甲基哌啶鎓阳离子，和从烷基胺例如乙胺、二乙胺、三乙胺 和其混合形式衍生的季铵阳离子)等。一般地，对于较低的洗涤温度(例 如低于约50℃)，C12-C16烷基链是优选的，而对于较高的洗涤温度(例 如高于约50℃)，C16-C18烷基链是优选的。
其它对洗涤目的有用的阴离子表面活性剂也可以包括在本发明的 衣物洗涤组合物中。它们可以包括：皂的盐(包括，例如钠、钾、铵、 和取代的铵如单、二和三乙醇胺盐)、C8-C22伯或仲烷烃磺酸盐、C8-C24 烯烃磺酸盐、通过碱土金属柠檬酸盐热解产物的磺化制备的磺化多羧 酸(例如在英国专利说明书号1082179中所述的)、C8-C24烷基聚二醇醚 硫酸盐(含有多达10摩尔的环氧乙烷)；烷基甘油磺酸盐、脂肪酰基甘 油磺酸盐、脂肪油基甘油硫酸盐、烷基酚氧乙烯醚硫酸盐、石蜡烃磺 酸盐、烷基磷酸盐、羟乙磺酸盐如酰基羟乙磺酸盐、N-酰基牛磺酸盐、 烷基琥珀酰胺酸盐和磺基琥珀酸盐、磺基琥珀酸的单酯(特别是饱和和 不饱和C12-C18单酯)和磺基琥珀酸的二酯(特别是饱和和不饱和C6-C12 二酯)、酰基肌氨酸盐、烷基多糖的硫酸盐例如烷基多葡糖苷(下面所述 的非离子型非硫酸化的化合物)的硫酸盐、支链伯烷基硫酸盐、和烷基 多乙氧基羧酸盐例如那些式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+的盐，其中 R是C8-C22烷基，k是1-10的整数，M是形成水溶性盐的阳离子。树 脂酸及氢化的树脂酸也是合适的，例如松香、氢化松香，以及存在于 或衍生于松浆油的树脂酸和氢化树脂酸。
烷基苯磺酸盐是非常优选的。特别优选的是线性(直链)烷基苯磺酸 盐(LAS)，其中该烷基优选含有10-18个碳原子。
其它例子描述于“表面活性剂与去污剂”(Surface Active Agents and Detergents)(第I和II卷，Schwartz，Perry and Berch)中。各种 这样的表面活性剂也一般性地公开于US3929678中(第23栏58行-第 29栏23行，该文献引入本文作为参考)。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约1-40％， 优选约3-20％重量的上述阴离子表面活性剂。
本发明的衣物洗涤组合物也可以含有阳离子、两性、两性离子和 半极性表面活性剂，以及上文中并未述及的非离子和/或阴离子表面活 性剂。
适用于本发明衣物洗涤组合物中的阳离子洗涤表面活性剂是具有 一个长链烃基的那些表面活性剂。这样的阳离子表面活性剂的例子包 括铵表面活性剂例如烷基三甲基铵卤化物，和具有下式的那些表面活 性剂：
[R2(OR3)y][R4(OR3)y]2R5N+X-
其中R2是在烷基链中具有约8-18个碳原子的烷基或烷基苄基， 每个R3选自：-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH(CH2OH)-、- CH2CH2CH2-、和其混合形式；每个R4选自：C1-C4烷基、C1-C4羟基 烷基、由两个R4连接在一起形成的苄基环结构、- CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH(其中R6是己糖或分子量低于 约1000的己糖聚合物，并且当y不是0时是氢)；R5与R4所述相同或 是烷基链，其中R2+R5的总碳原子数不大于约18；每个y是0-约10， 且该y值的和是0至约15；X是任何相容的阴离子。
非常优选的阳离子表面活性剂是具有下式的、在本发明组合物中 有用的水溶性季铵盐化合物：
R1R2R3R4N+X-(i)
其中R1是C8-C16烷基，每个R2、R3和R4各自独立地是C1-C4烷 基、C1-C4羟基烷基、苄基和-(C2H4O)xH(其中x的值为2-5)，X是阴 离子。R2、R3、R4中不多于1个是苄基。
R1的优选烷基链长度是C12-C15，当该烷基是从椰油或棕榈仁脂衍 生的链长度的混合物，或是通过烯烃合成或OXO醇合成而合成衍生 的时尤为如此。
用于R2、R3和R4的优选基团是甲基和羟基乙基，阴离子X可以 选自：卤素离子、甲基硫酸根、醋酸根和磷酸根离子。
用于本文中的合适的式(I)季铵化合物的例子是：
氯化或溴化椰油基三甲基铵；
氯化或溴化椰油基甲基二羟基乙基铵；
氯化癸基三乙基铵；
氯化或溴化癸基二甲基羟基乙基铵；
氯化或溴化C12-15二甲基羟基乙基铵；
氯化或溴化椰油基二甲基羟基乙基铵；
甲基硫酸肉豆蔻基三甲基铵；
氯化或溴化月桂基二甲基苄基铵；
氯化或溴化月桂基二甲基(乙氧基)4铵；
胆碱酯(式(i)的化合物，其中R1是
烷基，R2、R3、R4是甲基)。
二烷基咪唑啉[式(i)的化合物]。
其它在本文中有用的阳离子表面活性剂也描述于US4228044和 EP000224中。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-25％， 优选约1-8％重量的上述阳离子表面活性剂。
两性表面活性剂也适用于本发明的衣物洗涤组合物中。这些表面 活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的脂族衍生物，或杂环仲或叔胺的 脂族衍生物，其中脂族基团可以是直链或支链的。其中1个脂族取代 基含有至少约8个碳原子，一般约8-18个碳原子，并且至少一个脂族 取代基含有阴离子型水增溶性基团，例如羧基、磺酸根、硫酸根。见 US3929678(第19栏18-35行)的两性表面活性剂的例子。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％ 重量，优选约1-10％重量的上述两性表面活性剂。
两性离子表面活性剂也适用于本发明的衣物洗涤组合物中。这些 表面活性剂可以概括地描述为仲或叔胺的衍生物，杂环的仲或叔胺的 衍生物，或者季铵、季鏻或叔锍化合物的衍生物。见US3929678(第19 栏38行-22栏48行)的两性离子表面活性剂的例子。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％ 重量，优选约1-10％重量的上述两性离子表面活性剂。
半极性非离子表面活性剂是一特殊类型的非离子表面活性剂，它 们包括：含有1个约10-18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个 碳原子的烷基或羟基烷基的2个部分的水溶性氧化胺；含有1个约10- 18个碳原子的烷基部分和选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基 的2个部分的水溶性氧化膦；和含有1个约10-18个碳原子的烷基部 分和1个选自含有约1-3个碳原子的烷基或羟基烷基的部分的水溶性 亚砜。
半极性非离子表面活性剂包括具有下式的氧化胺表面活性剂：
其中R3是含有约8-22个碳原子的烷基、羟基烷基、或烷基苯基， 或其混合形式；R4是含有约2-3个碳原子的亚烷基或羟基亚烷基或其 混合形式；x是0-约3；每个R5是含有约1-3个碳原子的烷基或羟基 烷基，或含有约1-3个氧乙烯基团的多氧乙烯基。R5基团可以彼此连 接，例如通过氧或氮原子，从而形成环结构。
特别地，这些氧化胺表面活性剂包括氧化C10-C18烷基二甲基胺和 氧化C8-C12烷氧基乙基二羟基乙基胺。
当包括在其中时，本发明的衣物洗涤组合物一般含有约0.2-15％ 重量，优选约1-10％重量的上述半极性非离子表面活性剂。
助洗剂体系
本发明的组合物还可含有助洗剂体系。任何常规助洗剂体系都适 用于本文中，其包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、多羧酸盐和脂肪酸、诸 如乙二胺四乙酸盐的材料、金属离子螯合剂例如氨基多磷酸盐特别是 乙二胺四亚甲基膦酸和二亚乙基三胺五亚甲基膦酸。尽管由于明显的 环境原因并不优选，但本文中也可以使用磷酸盐助洗剂。
合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常是无机水合的硅铝 酸盐材料，更具体地是水合的合成沸石，例如水合的沸石A、X、B、 HS或MAP。
另一种合适的无机助洗剂材料是层状硅酸盐例如SKS- 6(Hoechst)。SKS-6是由硅酸钠(Na2Si2O5)组成的结晶层状硅酸盐。
合适的含有1个羧基的多羧酸盐包括：乳酸、乙醇酸和其醚衍生 物的水溶性盐，如在比利时专利号831368、821369和821370中所公 开的。含有2个羧基的多羧酸盐包括：琥珀酸、丙二酸、(亚乙二氧基) 二乙酸、马来酸、二甘醇酸、酒石酸、丙醇二酸和富马酸的水溶性盐， 以及在德国专利2446686和2446687及US3935257中所述的醚羧酸 盐，和在比利时专利号840623中所述的亚硫酰基羧酸盐。含有3个羧 基的多羧酸盐具体地包括水溶性柠檬酸盐、乌头酸盐(aconitrate)和柠 康酸盐以及琥珀酸盐衍生物，例如，在英国专利号1379241中所述的 羧基甲氧基琥珀酸盐，在荷兰申请7205873中所述的乳氧琥珀酸盐 (lactoxysuccinate)，和氧多羧酸盐材料例如在英国专利号1387447中 所述的2-氧杂-1，1，3-丙三羧酸盐.
含有4个羧基的多羧酸盐包括：在英国专利号1261829中公开的 氧联二琥珀酸盐、1，1，2，2-乙四羧酸盐、1，1，3，3-丙四羧酸盐和1，1，2，3- 丙四羧酸盐。含有磺基取代基的多羧酸盐包括：在英国专利号1398421 和1398422和US3936448中公开的磺基琥珀酸盐衍生物、和在英国专 利号1082179中所述的磺化的热解柠檬酸盐，而英国专利号1439000 中公开了含有膦取代基的多羧酸盐。
脂环和杂环多羧酸盐包括：环戊烷-顺，顺，顺-四羧酸盐、环戊二烯 五羧酸盐(cyclopentadienide pentacarboxylate)、2，3，4，5-四氢呋喃-顺， 顺，顺-四羧酸盐、2，5-四氢呋喃-顺-二羧酸盐、2，2，5，5-四氢呋喃-四羧酸 盐、1，2，3，4，5，6-己烷-六羧酸盐和多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇和木糖 醇)的羧甲基衍生物。芳香族多羧酸盐包括：苯六甲酸、1，2，4，5，-苯四 酸和在英国专利号1425343中公开的苯二甲酸衍生物。
在上面的多羧酸盐中，优选的多羧酸盐是每分子含有最多达3个 羧基的羟基羧酸盐，更具体地是柠檬酸盐。
用于本发明组合物中的优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐 助洗剂例如沸石A或层状硅酸盐(SKS-6)的混合物，以及水溶性羧酸螯 合剂例如柠檬酸。
包括在本发明洗涤组合物中的合适的螯合剂包括：乙二胺-N，N’- 二琥珀酸(EDDS)或其碱金属、碱土金属、铵或取代铵盐，或其混合物。 优选的EDDS化合物是游离酸形式的和其钠或镁盐。这样的优选EDDS 钠盐的例子包括Na2EDDS和Na4EDDS。这样的优选EDDS镁盐的例 子包括MgEDDS和Mg2EDDS。镁盐是最优选包括在本发明组合物中 的。
优选的助洗剂体系包括水不溶性硅铝酸盐助洗剂例如沸石A和水 溶性羧酸螯合剂例如柠檬酸的混合物。
可以形成用于粒状组合物的助洗剂体系中一部分的其它助洗剂材 料包括：无机材料例如碱金属碳酸盐、碳酸氢盐、硅酸盐，和有机材 料例如有机膦酸盐、氨基多亚烷基膦酸盐和氨基多羧酸盐。
其它合适的水溶性有机盐是均聚和共聚的酸或其盐，其中该聚羧 酸包括两两之间被不多于2个碳原子分开的至少两个羧基。
这类聚合物公开于GB-A-1596756中。这样的盐的例子是MW 2000-5000的聚丙烯酸盐和其与马来酸酐的共聚物，这样的共聚物具有 20000-70000，特别是约40000的分子量。
洗涤助洗剂盐的量通常为组合物重量的5-80％。用于液体洗涤剂 的助洗剂的优选量是5-30％。
酶
除了本发明的酶制剂外，优选洗涤组合物还含有提供清洗性能和/ 或织物护理益处的其它酶。
这样的酶包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过 氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。
蛋白酶：可以使用适用于碱性溶液的其它任何蛋白酶。合适的蛋 白酶包括动物、植物或微生物来源的。微生物来源是优选的。包括化 学或基因修饰的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生 物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子是枯草杆菌蛋白酶， 尤其是从芽孢杆菌衍生的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌 蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草 杆菌蛋白酶168(描述于WO 89/06270中)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子 是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和描述于WO 89/06270中的镰孢属蛋 白酶。
优选的市售蛋白酶包括：由Novo Nordisk A/S(Denmark)以商品 名Alcalase、Savinase、Primase、Durazym和Esperase销售的那些， 由Genencor International以商品名Maxatase、Maxacal、Maxapem、 Properase、Purafect、和Purafect OXP销售的那些，和由Solvay Enzymes以商品名Opticlean和Optimase销售的那些。按组合物重量 计，可以以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选0.001-0.5％，最优 选0.01-0.2％酶蛋白的量将蛋白酶掺入到本发明的组合物中。
脂肪酶：可以使用任何适用于碱性溶液的脂肪酶。合适的脂肪酶 包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因工程修饰的突变体。
有用的脂肪酶的例子包括Humicola lanuginosa脂肪酶，例如描述 于EP 258068和EP305216中的，Rhizomucor miehei脂肪酶，例如 描述于EP 238023中的，假丝酵母属脂肪酶例如C.antarctica脂肪酶， 例如描述于EP214761中的C.antarctica脂肪酶A或B，假单胞菌属 脂肪酶例如描述于EP 218272中的产碱假单胞菌和类产碱假单胞菌脂 肪酶、例如描述于EP 331376中的洋葱假单胞菌脂肪酶、例如公开于 GB1372034中的司徒茨氏假单胞菌脂肪酶，荧光假单胞菌脂肪酶，芽 孢杆菌脂肪酶例如枯草芽孢杆菌脂肪酶(Dartois等，(1993)，Biochemica et Biophsica acta 1131，253-260)、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶(JP 64/744992)和短小芽孢杆菌脂肪酶(WO 91/16422)。
此外，很多克隆的脂肪酶也是有用的，包括Yamaguchi等在1991 年《基因》103，61-67上描述的沙门氏柏干酪青霉脂肪酶、白地霉脂肪 酶(Schimada，Y.等，(1989)，生物化学杂志，106，383-388)，和各种根 霉属脂肪酶例如德列马根霉脂肪酶(Hass，M.J.等，(1991)，Gene 109， 117-113)、雪白根霉脂肪酶(Kugimiya等，(1992)，Biosci.Biotech. Biochem.56，716-719)和米根霉脂肪酶。
其它类型的脂类分解酶，如角质酶也是有用的，例如WO88/09867 所述来自门多萨假单胞菌的角质酶，来自Fusarium solani pisi的角质 酶(如WO90/09446所述)。
特别合适的脂肪酶是下面这些脂肪酶：例如M1 vLipaseTM、Luma fastTM和LipomaxTM(Genecor)，LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S)，和Lipase P“Amano”(Amano Pharmacetical Co.Ltd.)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将脂肪酶掺入到本发明的洗 涤组合物中。
淀粉酶：可以使用适用于碱性溶液的任何淀粉酶(α和/或β)。合 适的淀粉酶包括细菌和真菌来源的那些。包括化学或基因工程修饰的 突变体。淀粉酶包括：例如，在GB1296839中详细描述的从地衣芽孢 杆菌的特定菌株得到的α-淀粉酶。市售的淀粉酶是DuramylTM、 TermamylTM、FungamylTM和BANTM(从Novo Nordisk A/S得到)和 RapidaseTM和Maxamyl PTM(从Genencor得到)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将淀粉酶掺入到本发明的洗 涤组合物中。
纤维素酶：可以使用适用于碱性溶液的任何纤维素酶。合适的纤 维素酶包括细菌和真菌来源的那些。包括化学或基因工程修饰的突变 体。合适的纤维素酶公开于US4435307(其中公开了从Humicola insolens生产的真菌纤维素酶)，WO96/34108和WO96/34092(其中公 开了来自芽孢杆菌的细菌嗜碱性纤维素酶BCE103)，WO94/21801、 US5,475,101和US5,419,778(其中公开了木霉的EGIII纤维素酶)中。 特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶。这样的纤维素 酶的例子是描述于欧洲专利申请0495257中的纤维素酶。市售的纤维 素酶包括从一株Humicola insolens生产的CelluzymeTM(Novo Nordisk A/S)以及KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将纤维素酶掺入到本发明的 洗涤组合物中。
过氧化物酶/氧化酶：过氧化物酶与过氧化氢或其源(例如过碳酸 盐、过硼酸盐或过硫酸盐)一起使用。氧化酶与氧一起使用。两种类型 的酶均可用于“溶液漂白”，即在洗涤液中一起洗涤，优选与例如WO 94/12621和WO 95/01426中所述的增强剂一起洗涤所述织物时，防止 染料从染色织物转移到另一织物上。合适的过氧化物酶/氧化酶包括植 物、细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因工程修饰的突变体。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将过氧化物酶和/或氧化酶 掺入到本发明的洗涤组合物中。
在本文中包括上述酶的混合物，特别是蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶 和/或纤维素酶的混合物。
按组合物重量计，一般以0.00001-2％，优选0.0001-1％，更优选 0.001-0.5％，最优选0.01-0.2％酶蛋白的量将本发明的酶或掺入到洗涤 组合物中的其它任何酶掺入到本发明的洗涤组合物中。
漂白剂
可以包括在本发明洗涤组合物中的附加的任选洗涤组分包括漂白 剂，例如粒径为400-800微米的PB1、PB4和过碳酸盐。这些漂白剂 组分可以包括一种或多种氧漂白剂，并且根据所选择的漂白剂，可包 括一种或多种漂白活化剂。当存在氧漂白化合物时，其存在的量一般 是约1-25％。通常，在非液体配方例如粒状洗涤剂中，漂白化合物是 任选加入的组分。
用于本文中的漂白剂组分可以是任何在洗涤组合物中有用的漂白 剂，包括氧漂白剂以及本领域已知的其它漂白剂。
适合于本发明的漂白剂可以是活化的或未活化的漂白剂。
一类可以使用的氧漂白剂包括过羧酸漂白剂和其盐。这类试剂的 合适的例子包括：单过氧邻苯二甲酸镁六水合物，间氯过苯甲酸、4- 壬氨基-4-氧代过氧丁酸和双过氧十二烷双酸的镁盐。这样的漂白剂公 开于US4483781、US740446、EP0133354和US4412934中。非常优 选的漂白剂也包括如在US4634551所述的6-壬氨基-6-氧代过氧己酸。
另一类可以使用的漂白剂包括卤素漂白剂。例如，次卤酸盐漂白 剂的例子包括三氯异氰脲酸，以及二氯异氰脲酸的钠和钾盐，和N-氯 代和N-溴代烷烃磺基酰胺。这样的材料通常以最终产品重量的0.5-10 ％、优选1-5％的量加入。
可以将过氧化氢释放剂与漂白活化剂一起使用，该漂白活化剂是： 例如四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS，描述于 US4412934中)、3，5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐(ISONOBS，描述于 EP120591中)或五乙酰基葡萄糖(PAG)；将它们过水解后能形成过氧酸 作为活性漂白物质，导致改进的漂白作用。另外，非常合适的是这些 漂白活化剂：C8(6-辛酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐、C9(6-壬酰胺基己酰 基)羟苯磺酸盐和C10(6-癸酰胺基己酰基)羟苯磺酸盐或其混合物。还合 适的活化剂是酰化的柠檬酸酯，例如在欧洲专利申请号91870207.7所 公开的。
可用于本发明清洗组合物中的有用的漂白剂，包括过氧酸和含有 漂白活化剂和过氧漂白化合物的漂白体系描述于专利申请USSN 08/136626中。
通过在洗涤和/或漂洗过程的开始或期间加入能够生成过氧化氢的 酶体系(即酶和其底物)，也可以存在过氧化氢。这样的酶体系公开于欧 洲专利申请EP0537381中。
除了氧漂白剂以外的漂白剂也是本领域已知的，并且可以在本文 中使用。特别重要的一类非氧漂白剂包括光活化漂白剂，例如磺化的 锌和/或铝酞菁。这些材料可以在洗涤期间沉积在被洗物上.当存在氧 时用光照射，例如通过将衣服挂出在日光中干燥时，该磺化的锌酞菁 被活化，结果该被洗物被漂白。优选的锌酞菁和光活化漂白方法描述 于US4033718中。洗涤组合物一般含有约0.025-1.25％重量的磺化锌 酞菁。
漂白剂也可以包括锰催化剂。锰催化剂可以是例如在“低温漂白 的有效锰催化剂(Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching)”，自然369，1994，pp.637-639中所述的一种化合物。
抑泡剂
另一个任选的组分是抑泡剂，例如硅氧烷和硅石-硅氧烷混合物。 硅氧烷通常可以用烷基化的聚硅氧烷材料来表示，而硅石一般以细分 散形式使用，例如二氧化硅气凝胶和干凝胶和各种类型的疏水二氧化 硅。这些材料可以作为颗粒加入，其中抑泡剂有利地可释放地掺入到 水溶性或水分散性的、基本上无表面活性的洗涤剂不可渗透的载体中。 另外，可以将抑泡剂溶解或分散在液体载体中并通过喷雾在一种或多 种其它组分上来涂覆。
优选的硅氧烷抑泡剂公开于US3933672中。其它特别有用的抑泡 剂是德国专利申请DTOS2646126中所述的自乳化硅氧烷抑泡剂。这 样的化合物的例子是可从Dow Corning购得的DC-544，它是硅氧烷- 二元醇共聚物。特别优选的抑泡剂是含有硅油和2-烷基-链烷醇混合物 的抑泡剂体系。合适的2-烷基-链烷醇是以商品名Isofol 12R购得的2- 丁基-辛醇。
这样的抑泡剂体系公开于欧洲专利申请EPO593841中。
特别优选的硅氧烷泡沫控制剂描述于欧洲专利申请92201649.8 中。所述的组合物可以含有硅氧烷/硅石混合物以及熏制的无孔硅石例 如AerosilR。
按组合物重量计，通常以0.001-2％，优选0.01-1％的量使用上述 的抑泡剂。
其它组分
可以在洗涤组合物中使用的其它组分有例如污垢悬浮剂、污垢除 去剂、荧光增白剂、磨料、杀菌剂、变色抑制剂、着色剂和/或包覆或 未包覆的香料。
特别合适的包覆材料是由多糖基质和多羟基化合物组成的水溶性 胶囊，如在GB 1464616中所述的。
其它合适的水溶性包覆材料包括从取代二羧酸的未凝胶化淀粉酸 酯衍生的糊精，例如在US3455838中所述的.这些酸酯糊精优选是从 诸如蜡质玉米、蜡质高粱、西米、木著和马铃薯的淀粉制备的。所述 的包覆材料的合适例子包括由National Starch制造的N-Lok。该N-Lok 包覆材料由改性的玉米淀粉和葡萄糖组成。该淀粉是通过加上单官能 取代基例如辛烯基琥珀酸酐改性的。
适合于本文中的防再污染剂和污垢悬浮剂包括纤维素衍生物，例 如甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素，和均聚或共聚的聚羧 酸或其盐。这类聚合物包括上述作为助洗剂提到的聚丙烯酸盐和马来 酸酐-丙烯酸共聚物，以及马来酸酐与乙烯、甲基乙烯醚或甲基丙烯酸 的共聚物，其中马来酸酐至少构成共聚物的20％摩尔。按组合物重量 计，这些材料通常以组合物重量的0.5-10％，更优选0.75-8％，最优 选1-6％的量使用。
优选的荧光增白剂是阴离子性的，其例子是：4，4’-双-(2-双乙醇氨 基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠盐、4，4’-双-(2-吗啉 代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2，4-二苯胺 基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4’，4”-双-(2，4-二苯胺基-s-三 嗪-6-基氨基)芪-2-磺酸一钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟乙基 氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(4-苯基-2，1，3-三唑 -2-基)芪-2：2’-二磺酸二钠、4，4’-双-(2-苯胺基-4-(1-甲基-2-羟乙基氨 基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2：2’-二磺酸二钠、2(芪基-4”-(萘并-1’，2’：4，5)- 1，2，3-三唑-2”-磺酸钠和4，4’-双-(2-磺基苯乙烯基)联苯。
其它有用的聚合物材料是聚乙二醇，特别是分子量为1000-10000， 更具体是2000-8000和最优选是约4000的那些。以0.20-5％重量，更 优选0.25-2.5％重量的量使用这些聚合物材料。这些聚合物和上述均聚 或共聚的聚羧酸盐对于存在过渡金属杂质时改进白度维持性，织物灰 分沉积和对粘土、蛋白质性和可氧化性污垢的清洗性能是重要的。
在本发明组合物中有用的污垢除去剂是对苯二甲酸与乙二醇和/或 丙二醇单元各种对比的常规共聚物或三元共聚物。这样的聚合物的例 子公开于US4116885和US4711730及EP0272033中。根据EP0272033 特别优选的聚合物具有下式：
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75
其中PEG是-(OC2H4)O-，PO是(OC3H6O)，T是(pOOC6H4CO)。
还非常有用的是作为二甲基对苯二甲酸酯、二甲基磺基间苯二酸 酯、乙二醇和1，2-丙二醇无规共聚物的改性聚酯，该端基主要由磺基 苯甲酸酯组成，还有一小部分是乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯。目的 是“主要”得到在两端由磺基苯甲酸基团封端的聚合物，本文中是绝 大多数本文所述共聚物是由磺基苯甲酸基团封端的。然而，某些共聚 物并未完全封端，因此其端基可以由乙二醇和/或1，2-丙二醇的单酯组 成，其“次要”地由这样的物质组成。
本文中选择的聚酯含有约46％重量的二甲基对苯二甲酸，约16％ 重量的1，2-丙二醇，约10％重量的乙二醇，约13％重量的二甲基磺基 苯甲酸和约15％重量的磺基间苯二酸，并且其分子量为约3000。该聚 酯和其制备方法详细地叙述于EP311342中。
柔软剂
可以将织物柔软剂加入到本发明的衣物洗涤组合物中。这些试剂 在类型上可以是无机或有机的。无机柔软剂的例子是在GB-A-1400898 和US5019292中公开的绿土粘土。有机的织物柔软剂包括如在GB-A- 1514276和EP 0011340中公开的水不溶性叔胺，其与单C12-C14季胺 盐的混合物(公开于EP-B 0026528中)，和如在EP 0242919中所公开 的二长链酰胺。织物柔软剂体系的其它有用有机组分包括高分子量的 聚氧乙烯材料，如在EP 0299575和0313146中所公开的。
绿土粘土的含量一般在5-15％重量的范围，更优选8-12％重量， 作为干混合组分材料加入到配方的其余部分中。以0.5-5％重量，一般 1-3％重量的量加入有机织物柔软剂，例如水不溶性叔胺或二长链酰胺 材料，而以0.1-2％重量，一般0.15-1.5％重量的量加入高分子量聚氧 乙烯材料和水溶性阳离子材料。尽管在某些情况下作为干混颗粒加入 它们可以更方便，但一般将这些材料加到该组合物的喷雾干燥组分上， 或者作为熔融的液体将它们喷雾到组合物的其它固体组分上.
聚合染料转移抑制剂
按照本发明的洗涤组合物还包括0.001-10％重量，优选0.01-2％ 重量，更优选0.05-1％重量的聚合染料转移抑制剂。一般将所述的聚 合染料转移抑制剂加入到洗涤组合物中以便抑制染料从有色织物转移 到与其一起洗涤的织物上。在染料于洗涤中附着到其它物品上之前， 这些聚合物会络合或吸附从染色织物洗涤下来的短效染料。
特别合适的聚合染料转移抑制剂是聚N-氧化胺聚合物、N-乙烯基 吡咯烷酮和N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚乙烯 基鎓唑烷酮和聚乙烯基咪唑，或其混合物。
加入这样的聚合物也增强了本发明酶的性能。
本发明的洗涤组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状或粒状形式。
可以按例如US4106991和US4661452(两者均是Novo Industri A/S 的专利)中所公开的生产无尘的颗粒，并且该颗粒可以任选地用本领域 已知的方法涂覆。蜡质涂覆材料的例子是平均分子量为1000-20000的 聚(氧乙烯)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧 基化壬基酚；乙氧基化的脂肪醇，其中该醇含有12-20个碳原子并且 其中有15-80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单-、二- 及三-甘油酯。在GB1483591中给出了适合于流化床技术涂覆的成膜 涂覆材料的例子。
本发明的粒状组合物也可以是“致密形式”的，即它们具有比常 规的粒状洗涤剂相对高的密度，即550-950g/l；在这样的情况下，本 发明的粒状洗涤组合物将含有比常规颗粒洗涤剂更少量的“无机填料 盐”；一般的填料盐是碱土金属的硫酸盐和氯化物，一般是硫酸钠；“致 密”的洗涤剂一般包括不多于10％的填料盐。本发明的液体组合物也 可以是“浓缩形式”的，在这样的情况下，本发明的液体洗涤组合物 将比常规的液体洗涤剂含有较低量的水。按组合物重量计，浓缩的液 体洗涤剂的水含量一般低于30％，更优选低于20％，最优选低于10 ％。
例如，可以将本发明的组合物配制为手洗或机洗衣物洗涤组合物， 包括洗衣添加剂组合物和适用于脏织物预处理的组合物，漂洗加入的 织物柔软剂组合物，和用于普通家庭硬表面清洗和碗碟洗涤的组合物。
下面的实例旨在举例说明本发明的组合物，而不对本发明范围作 任何限制。
在洗涤组合物中，缩写组分符号具有下面的意义：
LAS ：直链C12烷基苯磺酸钠
TAS ：牛脂烷基硫酸钠
XYAS ：C1X-C1Y烷基硫酸钠
SS ：式2-丁基辛酸的仲皂表面活性剂
25EY ：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C12-C15的
直链伯醇
45EY ：与平均Y摩尔环氧乙烷缩合的主要为C14-C15的
直链伯醇
XYEZS ：每摩尔与平均Z摩尔环氧乙烷缩合的C1x-C1Y烷
基硫酸钠
非离子 ：由BASF Gmbh以商品名Plurafax LF404销售
的、平均乙氧基化程度为3.8和平均丙氧基化程
度为4.5的C13-C15混合乙氧基化/丙氧基化脂肪
醇
CFAA ：C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TFAA ：C16-C18烷基N-甲基葡糖酰胺
硅酸盐 ：无定型硅酸钠(SiO2∶Na2O比＝2.0)
NaSKS-6 ：式d-Na2Si2O5的结晶层状硅酸盐
碳酸盐 ：无水碳酸钠
磷酸盐 ：三聚磷酸钠
MA/AA ：1∶4的马来酸/丙烯酸共聚物，平均分子量约
80000
聚丙烯酸酯 ：BASF GmbH以商品名PA30销售的平均分子量
为约8000的聚丙烯酸酯均聚物
沸石A ：式Na12(AlO2SiO2)12.27H2O的水合硅铝酸钠，主
要粒径为1-10微米
柠檬酸盐 ：柠檬酸三钠二水合物
柠檬酸 ：柠檬酸
过硼酸盐 ：无水过硼酸钠一水合物漂白剂，经验式为
NaBO2.H2O2
PB4 ：无水过硼酸钠四水合物
过碳酸盐 ：经验式为2Na2CO3.3H2O2的无水过碳酸钠漂白
剂
TAED ：四乙酰基乙二胺
CMC ：羧甲基纤维素钠
DETPMP ：由Monsanto以商品名Dequest 2060销售的二
乙三胺五(亚甲基膦酸)
PVP ：聚乙烯吡咯烷酮聚合物
EDDS ：钠盐形式的乙二胺-N，N’-二琥珀酸，[S，S]异构体
抑泡剂 ：25％熔点为50℃的石蜡，17％的疏水性二氧化
硅，58％的石蜡油
颗粒抑泡剂 ：颗粒形式的12％硅氧烷/二氧化硅，18％的硬脂
醇，70％的淀粉
硫酸盐 ：无水硫酸钠
HMWPEO ：高分子量聚氧乙烯
TAE 25 ：牛脂醇乙氧基化物(25)
洗涤剂实施例I
可以按如下所示制备本发明粒状织物清洗组合物：
线性C12烷基苯磺酸钠 6.5
硫酸钠 15.0
沸石A 26.0
次氮基三醋酸钠 5.0
本发明的酶 0.1
PVP 0.5
TAED 3.0
硼酸 4.0
过硼酸盐 18.0
苯酚磺酸盐 0.1
次要组份至 100
洗涤剂实施例II
可以按如下所示制备本发明的致密粒状织物清洗组合物(密度 800g/l)：
45AS 8.0
25E3S 2.0
25E5 3.0
25E3 3.0
TFAA 2.5
沸石A 17.0
NaSKS-6 12.0
柠檬酸 3.0
碳酸盐 7.0
MA/AA 5.0
CMC 0.4
本发明的酶 0.1
TAED 6.0
过碳酸盐 22.0
EDDS 0.3
粒状抑泡剂 3.5
水/次要组份 至100％
洗涤剂实施例III
按如下所示制备在洗涤彩色织物中特别有用的本发明粒状织物清 洗组合物：
LAS 10.7 -
TAS 2.4 -
TFAA - 4.0
45AS 3.1 10.0
45E7 4.0 -
25E3S - 3.0
68E11 1.8 -
25E5 - 8.0
柠檬酸 15.0 7.0
碳酸盐 - 10
柠檬酸 2.5 3.0
沸石A 32.1 25.0
NaSKS-6 - 9.0
MA/AA 5.0 5.0
DETPMP 0.2 0.8
本发明的酶 0.10 0.05
硅酸盐 2.5 -
硫酸盐 5.2 3.0
PVP 0.5 -
聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物/- 0.2
乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮
的共聚物
过硼酸盐 1.0 -
苯酚磺酸盐 0.2 -
水/次要组份 至 100％
洗涤剂实施例IV
可按如下所示制备本发明具有“通过洗涤进行软化”的能力的粒 状织物清洗组合物：
45AS - 10.0
LAS 7.6 -
68AS 1.3 -
45E7 4.0 -
25E3 - 5.0
氯化椰油烷基二甲基羟乙基铵 1.4 1.0
柠檬酸盐 5.0 3.0
NaSKS-6 - 11.0
沸石A 15.0 15.0
MA/AA 4.0 4.0
DETPMP 0.4 0.4
过硼酸盐 15.0 -
过碳酸盐 - 15.0
TAED 5.0 5.0
绿土粘土 10.0 10.0
HMWPEO - 0.1
本发明的酶 0.10 0.05
硅酸盐 3.0 5.0
碳酸盐 10.0 10.0
粒状抑泡剂 1.0 4.0
CMC 0.2 0.1
水/次要组份 至 100％
洗涤剂实施例V
可按如下制备本发明的重垢液体织物清洗组合物：
I II
酸形式的LAS - 25.0
柠檬酸 5.0 2.0
酸形式的25AS 8.0 -
酸形式的25AE2S 3.0 -
25AE7 8.0 -
CFAA 5 -
DETPMP 1.0 1.0
脂肪酸 8 -
油酸 - 1.0
乙醇 4.0 6.0
丙二醇 2.0 6.0
本发明的酶 0.10 0.05
氯化椰油烷基二甲基羟乙基铵 - 3.0
绿土粘土 - 5.0
PVP 2.0 -
水/次要组份 至 100％
在皮革工业中的应用
本发明的枯草杆菌酶可以用于皮革工业，尤其用于皮的脱毛。
在该应用中，本发明的枯草杆菌酶变体优选在还含有另一种蛋白 酶的酶组合物中使用。
关于合适的其它蛋白酶的更详细的描述参阅关于适用于洗涤组合 物中的酶的部分(见上文)。
在毛纺工业中的应用
本发明的枯草杆菌酶可以用于毛纺工业，尤其是用于含毛衣物的 洗涤。
在该应用中，本发明的枯草杆菌酶变体优选在还含有另一种蛋白 酶的酶组合物中使用。
关于适当的其它蛋白酶的更详细描述参阅关于适用于洗涤组合物 中的酶的部分(见上文)。
本发明在下列实施例中有更详细的描述，这些实施例并不以任何 方式意图限制本发明要求的范围。
材料和方法
菌株：
枯草芽孢杆菌DN1885(Diderichsen等人，1990)。
迟缓芽孢杆菌309和147是迟缓芽孢杆菌的特殊菌株，保藏于 NCIB，编号NCIB 10309和10147，而且描述于美国专利号3,723,250 中，该专利文献本文引用作为参考。
大肠杆菌MC1000(M.J.Casadaban和S.N.Cohen(1980)；分子生 物学杂志138 179-207)，用常规方法制成r-，m+，其还描述于美国专 利申请号039,298。
质粒
pJS3：大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，含有编码枯草杆菌酶 309的合成基因(由Jacob Schiodt等人描述于“蛋白质和多肽通讯” (Protein and Peptide letters)3：39-44(1996))。
pSX222：枯草芽孢杆菌表达载体(描述于WO 96/34946)。
常用分子生物学方法
除非特别指出，DNA操作和转化用分子生物学的标准方法进行 (Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉 港，纽约；F.M.Ausubel等人(主编)“分子生物学通用方法”(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley and Sons，1995； C.R.Harwood和S.M.Cutting(主编)“芽孢杆菌的分子生物学方法” (Molecular Biological Methods for Bacillus)，John Wiley and Sons， 1990)。
用于DNA操作的酶根据供应商的说明书使用。
用于基因操作的酶
除非特别指出，所有用于DNA操作的酶，如限制性内切酶、连接 酶等等，均购自New England Biolabs，Inc.。
蛋白水解活性
在本发明中蛋白水解活性以“千诺氏蛋白酶单位”(Kilo NOVO Protease Units，KNPU)表示。活性是相对于标准酶()测定 的，而且测定是建立在标准条件下(即50℃，pH8.3，反应时间9分钟， 测量时间3分钟)蛋白水解酶消化二甲基酪蛋白(DMC)溶液的基础之上 的。可以向丹麦Novo Nordisk A/S索取文件AF 220/1，该文件此处引 用作为参考。
GU即甘氨酸单位(Glycine Unit)，定义为以N-乙酰酪蛋白作为 底物，在标准条件下，于40℃保温15分钟时，产生相当于1毫摩尔 甘氨酸的氨基量的蛋白水解酶活性。
酶活性也可以用PNA实验，根据与可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙 氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基苯酚的反应测量(描述于美国石油化学协 会杂志(Journal of American Oil Chemists Society)，T.M.Rothgeb， B.D.Goodlander，P.H.Garrison和L.A.Smith，(1988))。
发酵
枯草杆菌酶的发酵于30℃在摇床上(300r.p.m.)含100ml BPX培养 基的500ml带挡板Erlenmeyer锥形瓶中进行5天。
因此，为了得到例如2升培养液，需要20个Erlenmeyer锥形瓶 同时进行发酵。
培养基
BPX：组成(每升)
土豆淀粉 100g
碾碎的大麦 50g
大豆粉 20g
Na2HPO4·12H2O 9g
Pluronic 0.1g
酪蛋白钠盐 10g
培养基中的淀粉用α-淀粉酶液化，培养基通过加热至120℃并保 持45分钟灭菌。灭菌后加入NaHCO3至0.1M将培养基的pH调至9。
实施例
实施例1
酶变体的构建和表达：
定点诱变：
枯草杆菌酶309的定点诱变体是使用“单一位点删除(unique site elimination，USE)”或“尿嘧啶-USE”技术(分别描述于Deng等人(分 析生化(Anal.Biochem)200：81-88(1992))，Markvardsen等人(生物 技术(BioTechniques)18(3)：371-372(1995)))制成的。
模板质粒是pJS3，或该质粒含有枯草杆菌酶309变体的类似物， 例如，用一段针对T255I变体构建体的寡核苷酸，对含有N252L变体 编码基因的pJS3类似物进行USE诱变，产生最终的N252L+T255I 枯草杆菌酶309变体。
然后用限制酶KpnI和MluI将pJS3构建的枯草杆菌酶309变体 亚克隆到枯草芽孢杆菌pSX222表达型质粒中。
定域随机诱变：
进行定域随机诱变的完整策略是：
合成对应于DNA序列中待诱变部分的诱变引物(寡核苷酸)，该引 物在对应于待诱变氨基酸密码子的核苷酸处不同。
然后，将得到的诱变引物与适当的反向引物一起用于PCR反应。 将得到的PCR片段纯化和消化并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭 载体中。
或者如果有必要，将得到的PCR片段作为引物与第二个适当的反 向引物一起用于第二个PCR反应，使得能够消化诱变区并将其克隆到 穿梭载体中。PCR反应在常规条件下进行。
遵循这种策略，构建SAVINASE的定域随机文库，其中位点N252、 T255和S259被完全随机化。
合成寡核苷酸，在想要突变的氨基酸密码子的第一个和第二个碱 基处，四种碱基中的每一种(N)都占25％。在密码子的第三个核苷 酸(摇摆碱基)处，G和C(S)各占50％，以避免三个终止密码子中的 两个(TAA和TGA)。
将诱变引物(5’-C TTC TGC GTT AAC AAG TCC GCT TCC ATA CAA GTT CGT SNN TCC TAA ACT SNN TGC CGT SNN CTT TAG ATG ATT-3’(反义))与适当的反向引物(如5’GAA CTC GAT CCA GCG ATT TC 3’(有义))一起用于PCR反应，而质粒pJS3作为 模板。将这样得到的PCR产物用限制酶XhoI和HpaI克隆到pJS3穿 梭载体中。
然后用限制酶KpnI和MluI将pJS3构建的定域随机文库亚克隆 到枯草芽孢杆菌pSX222表达质粒中。
如此制备的文库含有大约100,000个单克隆/文库。
对随机选取的10个菌落测序以确认设计的突变。
为了纯化本发明的枯草杆菌酶变体，将含有本发明变体的枯草芽 孢杆菌pSX222表达质粒转化到感受态枯草芽孢杆菌菌株中并如上文 所述在含10ug/ml氯霉素(CAM)的培养基中发酵。
实施例2
酶变体的纯化：
这项操作涉及枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶309或其突 变体的2升水平发酵的纯化。
将大约1.6升发酵液在1升离心杯中于5000rpm离心35分钟。用 10％醋酸将上清液调至pH6.5，并在Seitz Supra S100过滤板上过滤。
使用配备了Amicon S1Y10 UF柱体的Amicon CH2A UF装置将 滤出液浓缩至大约400ml。在上Bacitracin亲和柱(室温，pH7)吸附前， 先将UF浓缩液离心并过滤。用含25％ 2-丙醇和1M氯化钠的0.01M 二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钙缓冲液(pH7)于室温将蛋 白酶从Bacitracin柱上洗脱下来。
将来自Bacitracin纯化步骤具有蛋白酶活性的级分合并，并加到 750ml Sephadex G25柱(直径5cm，用含0.01M二甲基戊二酸、0.2M 硼酸和0.002M氯化钙，pH6.5的缓冲液平衡过)上。
将来自Sephadex G25柱具有蛋白水解活性的级分合并，并加到150ml CM Sepharose CL 6B阳离子交换柱(直径5cm，用含0.01M二甲基戊二 酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙，pH6.5的缓冲液平衡过)上。
用2升相同缓冲液中的线形梯度0-0.1M氯化钠(枯草杆菌蛋白酶 147的情况下用0-0.2M氯化钠)将蛋白酶洗脱下来。
在最后的纯化步骤中，将来自CM Sepharose柱含有蛋白酶的级 分合并，并在配备了GR81PP膜(购自Danish Sugar Factories Inc.)的 Amicon超滤室中浓缩。
通过使用实施例1用于构建的技术和上述分离方法，产生并分离 得到下列枯草杆菌蛋白酶309变体：
N252L+T255I
N252V+T255A
N252M+T255C+S259H
N252S+T255E+S259C和
N252K+T255S+S259C。
实施例3
含有酶变体的洗涤组合物的洗涤性能：
下列实施例提供了在指明的条件下进行的一些洗涤测试的结果。
实验条件
表IV：评价枯草杆菌蛋白酶309变体的实验条件
洗涤剂 蛋白酶型洗涤剂95 洗涤剂剂量 3.0g/l pH 10.5 洗涤时间 15min 温度 15℃ 水硬度 6°dH 酶 枯草杆菌蛋白酶309变体，如下文所示 酶浓度 10nM 测试系统 150ml带有搅棒的玻璃烧杯 纺织品/体积 5片纺织品(φ2.5cm)于50ml洗涤剂中 测试材料 来自Testmaterials，Holland的EMPA117
使用的洗涤剂是简单型制剂。pH调至10.5，这在粉剂型洗涤剂的 正常范围内。95型洗涤剂的组成如下：
25％ STP(Na5P3O10)
25％ Na2SO4
10％ Na2CO3
20％ LAS(Nansa 80S)
5.0％ 非离子型表面活性剂(Dobanol 25-7)
5.0％ Na2Si2O5
0.5％ 羧甲基纤维素(CMC)
9.5％ 水
水硬度通过向去离子水中加入CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+＝2∶1) 调整(也可参阅《消费品中的表面活性剂：理论、技术和应用》 (Surfactants in Consumer Products：Theory，Technology and Application)，Springer Verlag 1996)。洗涤剂溶液的pH通过加入HCl 调至pH10.5。
使用Macbeth ColorEye 7000型光度计(Macbeth，Kollmorgen器 械公司(Division of Kollmorgen Instruments Corporation)，德国)测量 测试材料在460nm的反射率(reflectance，R)。测量根据供应商的说明 书进行。
枯草杆菌蛋白酶309变体的洗涤性能通过计算性能因子评价：
P＝(R变体-R空白)/(RSavinase-R空白)
P：性能因子
R变体：用变体洗涤后测试材料的反射率
RSavinase：用洗涤后测试材料的反射率
R空白：不用酶洗涤后测试材料的反射率
要求保护的枯草杆菌蛋白酶309变体相对于都具有改良 的洗涤性能-即P＞1。
变体被分成几个改良等级，用大写字母表示：
A级：1＜P≤1.5
B级：1.5＜P≤2
C级：P＞2
表V：枯草杆菌蛋白酶309变体及改良等级
改良等级 变体 A N252L+T255I N252V+T255A N252M+T255C+S259H N252S+T255E+S259C N252K+T255S+S259C B C