一种治疗烧伤的喷雾剂转让专利
申请号 : CN200310122254.2
文献号 : CN100593418C
文献日 : 2010-03-10
发明人 : 赵恒
申请人 : 西安亨通光华制药有限公司
摘要 :
本发明涉及一种治疗烧伤的药物，其特征是：它将α-溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器，在太空的特殊条件下导致α-溶血链球菌33号菌种遗传性质发生变异，优选出其中的正变异、遗传性质稳定的菌种，经培育发酵后生产成治疗烧伤的生化药剂，该菌种经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。所述的治疗烧伤的生化药剂是喷雾剂，1000ml中含太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽0.5g-10.0g。这种治疗烧伤的喷雾剂，它采用生化喷雾剂治疗烧伤，具有无毒，副作用小，有效率高，瘢痕小的特点。
权利要求 :
1、一种治疗烧伤喷雾剂的制备方法，其特征是：它将经中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心保藏，菌种编号为CGMCCNo.1082的菌种作为生产菌种再按 下述步骤制备；
菌种制备
A.斜面种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡 萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％，琼脂1-5％，绵羊血5-10％；pH 7.2-7.4；斜面种 子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.14Mpa；
启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面，接种后置 25-40℃恒温培养24-30小时；
B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡 萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％；pH 7.0-7.4；
肉汤种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力0.11-0.14Mpa；
将培养好的斜面菌种在无菌条件下按1-9％接种量接入肉汤种子培养基内，25-40 ℃恒温培养10-30小时；
发酵过程；
用发酵培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％，葡萄糖 0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；发酵培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽 压力0.11-0.14Mpa；
A.一级种子罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按1-10％接种量接入一级种子 罐，在25-40℃恒温培养10-50小时；罐压不超过0.02Mpa，通气量以能翻动培养液 为宜，连续充分搅拌；
B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接入发酵罐， 在25-40℃恒温培养20-100小时，罐压不超过0.02Mpa；灭活采用加温使发酵液温度 达到70-120℃，保温20-60分钟，冷却静置；
提取过程；
a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶20；
b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5充分搅拌 静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调pH1.0-5.0，得到溶解液并将溶解 液静置；
c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液。准确量取上清液体积，按上清液体积 计算出所需乙醇量，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌，静置后离心去除上清 液得到沉淀物；
d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心；上清液再加乙醇沉淀。这样的工艺反 复操作至含量检测合格为止，得到的沉淀物为菌种编号为CGMCCNo.1082的菌种所生 产的甘露聚糖肽粗品；真空干燥3-8小时即得生产的甘露聚糖肽产品；
最后取甘露聚糖肽按照甘露聚糖肽1g，丙二醇100g，三氯叔丁醇5g，其余 是纯化水制成1000ml的治疗烧伤的喷雾剂。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种药物，特别是关于一种用于治疗烧伤的喷雾剂。
背景技术
烧伤临床表现为疼痛，休克，肢体功能障碍，容貌毁损，愈后常留下 瘢痕，严重者给患者身心造成的损害往往持续一生。近几年随着临床医学 的发展重度烧伤治愈率已经有了很大提高。但是外用治疗药物品种较少， 对深二度烧伤治疗之后仍然遗留瘢痕。并且常用药膏或散剂在皮肤上药时 要接触创面，给病人造成很大痛苦，使用受到一定限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗烧伤的喷雾剂，它采用生化喷雾剂治疗 烧伤，具有无毒，副作用小，有效率高，瘢痕小的特点。
本发明的技术方案是：设计一种治疗烧伤的药物，其特征是：它将α -溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器，在太空的特殊条件下导致 α-溶血链球菌33号菌种遗传性质发生变异，优选出其中的正变异、遗传 性质稳定的菌种，经培育发酵后生产成治疗烧伤的生化药剂，该菌种经中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为 CGMCCNo.1082。
所述的治疗烧伤的生化药剂是喷雾剂，1000ml中含太空诱变菌种生 产的甘露聚糖肽0.5g-10.0g。
所述的喷雾剂是以α-溶血链球菌33号菌种搭载、变异、优选后的菌 种，经培育发酵生产的甘露聚糖肽，加入其它辅料和溶剂制成。
所述的辅料是防腐剂、或苯甲醇、或硫柳汞、或三氯叔丁醇、或对羟 基苯甲酸酯类。
所述的溶剂是水或甘油、或丙二醇、或聚乙二醇。
所述治疗烧伤药物的制备方法是；①优选α-溶血性链球菌33菌种进 行太空搭载，经过太空诱变精心选育的α-溶血性链球菌33号菌珠作为生 产菌种制备；经一级发酵和二级发酵，将发酵液提纯，最终生产出太空诱 变菌种生产的甘露聚糖肽.②以甘露聚糖肽为原料加入辅料及适当溶剂配 制成喷雾剂。
所述的菌种制备；
A.斜面种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨 0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％，琼脂1-5％，绵羊血5-10％； pH 7.2-7.4；
斜面种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力 0.11-0.14Mpa；
启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面， 接种后置25-40℃恒温培养24-30小时；
B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨 0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％；pH 7.0-7.4；
肉汤种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力 0.11-0.14Mpa；
将培养好的斜面菌种在无菌条件下按1-9％接种量接入肉汤种子培养 基内，25-40℃恒温培养10-30小时。
所述的发酵过程；
用发酵培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％， 葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；
发酵培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力 0.11-0.14Mpa；
A.一级种子罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按1-10％接种量接 入一级种子罐，在25-40℃恒温培养10-50小时；罐压不超过0.02Mpa， 通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；
B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接 入发酵罐，在25-40℃恒温培养20-100小时，罐压不超过0.02Mpa；灭活 放罐，灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷 却静置。
所述的提取过程；
a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶ 20或酌情而定；
b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5 或酌情而定；充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调 pH1.0-5.0，得到溶解液并将溶解液静置。
c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液。准确量取上清液体积，按上 清液体积计算出所需乙醇量，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌， 静置后离心去除上清液得到沉淀物；
d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心。上清液再加乙醇沉淀。这 样的工艺反复操作至含量检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种所 生产的甘露聚糖肽粗品；真空干燥3-8小时即得太空诱变菌种生产的甘露 聚糖肽产品。
本发明的特点是：它采用α-溶血性链球菌33号经太空诱变后新的 菌种经发酵、提纯及精制等高科技手段制备成的甘露聚糖肽喷雾剂治疗烧 伤，它具有激活淋巴细胞，促进胸腺淋巴细胞分化增殖，激活巨噬细胞， 使白细胞生成增加，促进补体生成，促进白细胞介素-1的生成，经过收 集大量用药患者病历资料深入研究归纳总结证实存在促进皮肤粘膜再生 修复作用，烧伤的感染因素可由甘露聚糖肽的增强免疫作用消除。甘露聚 糖肽治疗烧伤粘膜病变的主要机理是促进皮肤粘膜再生修复，通过促进创 伤部位巨噬细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子bFGF使烧伤创面修复。它 具有促进皮肤粘膜再生修复作用。
新药理作用试验分析验证：
烧伤的感染因素可由甘露聚糖肽的增强激活巨噬细胞作用解释。采用 白色念珠菌氘葡萄糖掺入实验，1、按甘露聚糖肽0.5ml/kg口服给药大 白兔一周。2、收集兔肺泡灌洗液。3、玻器粘附分离巨噬细胞。将被甘 露聚糖肽激活的巨噬细胞在体外与白色念珠菌共同培养24小时。4、用 水将巨噬细胞裂解，使氘标记的葡萄糖仅掺入菌丝体中。5.计数菌丝体 内氘的掺入量判断巨噬细胞对白色念珠菌生长的抑制率为97％。
甘露聚糖肽治疗烧伤的另一个机理是促进创面修复。活化的巨噬细胞分 泌碱性成纤维细胞生长因子bFGF使烧伤创面修复。
甘露聚糖肽治疗烧伤瘢痕减少的新机理是组分中甘露聚糖肽成分以竞 争抑制方式阻碍TGF-β-LAP复合物与6-磷酸-甘露糖/胰岛素样生长 因子II受体结合，从而抑制隐活TGF-β的活化。兔眼角膜紫外线烧伤模 型观察用药组伤后40日伤口胶原以网状方式沉积，瘢痕程度明显减缓。 平均愈合时间比非用药组提前7天。
治疗结果
本组30例，治愈29例，治愈率96.6％，好转1例，好转率3.4％，总 有效率100％。有好转1例中由于经费问题放弃治疗，用该法治愈2度最 大面积44％，最小面积0.5％，平均面积22％，其中浅2度创面14例，平 均治愈天数14天，合并有3度创面3例，平均治愈天数23天，在治疗过 程中未发现有任何不良反应、肝肾功能及小便检查，治疗前后无明显差 异。经临床应用观察，该药无毒和不良反应，临床应用效果好，创面愈 合快，因此，我们认为神舟三号甘露聚糖肽喷雾剂治疗烧伤创面疗效显著， 深2度烧伤不留疤痕。为烧伤创面外用药提供一种新的治疗方法。
新疗效验证：
刘东虎，男，23岁。西安亨通光华制药厂汽车司机。2003年6 月3日下午全身被汽油烧伤，头面部起泡，额部头发，眉毛，胡须烧焦， 双手烧烫起泡，双侧下肢皮肤烧烫燥烈，脱皮，渗液，剧痛难忍，心慌， 大汗淋漓。诊断：汽油烧伤(深II度)面积34.9％。治疗：抗菌消炎止痛， 静脉补液，外用神舟三号甘露聚糖肽喷雾剂，共住院19天，痊愈出院。 继续使用烧伤液，14天后复诊全身无疤痕。
(见附件：附件材料1：陕西省科学技术厅陕西省科学技术成果鉴定 证书材料
附件材料2：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号” 飞船搭载公证书。
附件材料3：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号” 飞船搭载返回地面筛选报告
附件材料4：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱 变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的形态生理生化鉴定报 告书
附件材料5：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱 变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的SDS-PAGE及 RFLP/PFGE分析鉴定报告书
附件材料6：陕西省药品检验所“神舟三号”太空诱变菌种生产的甘 露聚糖肽口服液检测报告
附件材料7：科技查新报告复印件
附件材料8：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌 种保藏受理通知书复印件)
具体实施方案
菌种选育：在α-溶血链球菌生长规律的基础上，选定较合适生长 时期的菌种，采用平皿生长的菌落、浸入其它物质中的菌悬液、带菌的砂 土等方法，于2002年3月25日搭载“神舟三号”宇宙飞船。在太空轨道 (近地点高度200公里、远地点高度350公里)进行了6天零18小时的 在轨飞行。太空的特殊条件主要体现为微重力、高真空、高辐射、交变磁 场等特殊环境。在外层空间飞行的菌种被置于一个与地球上的生态环境完 全不同的环境中，主要包括来自磁场俘获的电子、质子及低能重粒子；来 自银河系的宇宙射线如质子、粒子及更重的高能重粒子；来自太阳磁暴的 质子及重粒子等。这些粒子作用于微生物细胞核中的DNA双链结构，可导 致双链断裂。微重力、高真空环境可使DNA的碱基序列发生重组，即基因 组的重组和变异。变异后产生的新菌株，其形态特征、培养特征、生理生 化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、中试生产指标等均会发生不同 程度的变化。在宇宙飞船返回地面后，经过进一步筛选，仅优选出其中 0.2％的正变异且遗传特性稳定的菌株，经培育制成生产菌种。这种经航 天搭载诱变后选育出的菌种已经在在2003年12月29日由中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。
实验及中试生产结果表明，经空间诱变后的新型太空菌种在遗传特性 上稳定，有较强的生产适应性，由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高，多 肽含量比国家标准(80％)提高3至5倍，西安市药品检验所送样测定达 到271.6％，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上，发酵周期大 大缩短。
制备方法：
太空诱变菌种生产甘露聚糖肽的制备过程：
本发明所述的太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽是由以下方法制备：太 空菌种制备---一级发酵---二级发酵-----发酵液提纯，最终生产出甘 露聚糖肽。
①太空菌种制备：
以经过空间诱变育种精心选育的α-溶血链球菌作为生产菌种。
A.斜面种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡 萄糖0.4％，氯化钠0.5％，琼脂3％，绵羊血8％；pH 7.4。
斜面种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。
启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面， 接种后置38℃恒温培养30小时。
B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡 萄糖0.4％，氯化钠0.5％；pH 7.4。
肉汤种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。
将培养好的斜面菌种在无菌条件下按9％接种量，接入肉汤种子培养 基内，38℃恒温培养30小时。
②发酵过程：
发酵培养基：牛肉膏0.4％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％， 氯化钠0.5％。
发酵培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。
A.一级发酵罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按10％接种量，接 入一级种子罐，在29℃恒温培养30小时，罐压不超过0.02Mpa，通气量 以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌。
B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按20％接种量，接 入发酵罐，在29℃恒温培养70小时，罐压不0.02Mpa，灭活放罐。灭活 采用加温使发酵液温度达到100℃，保温60分钟，冷却静置。
③提取过程：
a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶ 20或酌情而定。
b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5 或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调 pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。
c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上 清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并 充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。
d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这 样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种生 产的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小时，即得到太空诱变菌种生产的甘 露聚糖肽产品。
上述方法得到的产品的检验：
[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。
本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。
比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg 的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录vI E)，比旋度为+70℃ 至+80℃。
[鉴别]1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液 (5-100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红 色。
2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10ul点于滤纸 上，晾干，用无水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml 溶解后.加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置 暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置 还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、 2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用 70％乙醇溶液冲洗，置品红业硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚 硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即 得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。
3、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含 1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按甘露聚糖肽免疫原性测定法 试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。
[检查]1、酸度：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法 测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，pH值应为3.0-5.0。
2、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光 度法(中国药典2000年版二部附录VIA)，在260nm的波长处，其吸收度不 得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。
3、总氮量：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VII D 第二法)测定.按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。
4、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每 1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶ 16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品 溶液，依法检查(附甘露聚糖肽免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低 浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。
5、干燥失重 取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0 ％(中国药典2000年版二部附录VIII L)。
6、重金属 取本品，在1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIII H) 含重金属不得过百万分之二十。
7、异常毒性 取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液， 依法检查(中国药典2000年版附录XI C).按静脉注射法给药，应符合规 定(供注射用)。
[含量测定]
1.对照品溶液的制备
精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g置100ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度.摇匀；精密量取5ml，置100ml的 量瓶中，加水至刻度，摇匀.每1ml中含甘露糖50ug。
2.供试品溶液备
取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。
3.标准曲线的制备
精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞 试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml， 摇匀，放置于室温，以0管为空白.照分光光度法(中国药典2000年版二 部附录IV A)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收 度，计算回归方程。
4.测定法
精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加3％苯酚溶液 1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量.
甘露聚糖肽免疫原性测定法(补体结合法)；
1、试液
A.酸盐缓冲液(pH7.2)
取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至 1000ml使其溶解，加10％硫酸镁溶液1ml，摇匀。
B.1％羊红细胞悬液
羊血红细胞的制备：由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取 葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000mI 使溶解，100℃灭菌30分钟)的无菌容器中，4℃保存。
1％羊血红细胞悬液的制备：取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射 液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯 化钠注射液制成1％羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20 倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光 光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在541nm的波长处测定，其 吸收度应为0.65-0.70，如超出限度应调节1％羊红细胞悬液的浓度。
C.溶血素及致敏羊血红细胞
溶血素的制备：取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25％ 羊血红细胞悬液.取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次， 共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56℃.30 分钟灭活，分装，0℃以下保存。
溶血素单位的测定：取溶血素适量，加磷酸盐缓冲液分别制成 1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、 1∶9000、1∶10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，加1％羊血细胞悬液 0.1ml，摇匀，加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液 0.2ml，摇匀，37℃保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血 素。
致敏羊血红细胞的制备：临用前，将2％的羊血红细胞悬液与2单 位溶血索等体积混合，37℃保温15分钟即得。
补体：取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0℃以下保存。
补体单位的测定：取补体适量，加磷酸盐缓冲液，分别制成1∶40、 1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液，各取0.2ml 置试管中，加0.2ml磷酸盐缓冲液，摇匀，37℃保温30分钟后，分别加 致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟.完全溶血管的最高 稀释度为1单位的补体。
抗体：取甘露聚糖肽对照品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含 10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第 一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射 1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心 分离血清，56℃下30分钟灭活，分装，0℃以下保存(临用前，需56℃30 分钟再次灭活)。
抗体单位的测定：取抗体适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶2、1∶4、 1∶8、1∶16、1∶32.1∶64、1∶128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加甘 露聚糖肽对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2ml，摇匀，于4-8℃放置4 小时以上，置37℃保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。 同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原， 以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原，抗体，以0.2ml磷酸盐缓 冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不 加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。
2、免疫原性测定法
取甘露骤糖肽对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓 度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体 0.1ml及2单位补体0.2ml.摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保 温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。观 察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同 时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以 0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲 液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血：另设的致敏羊血红细胞(不加 抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。
太空诱变菌种生产的治疗烧伤喷雾剂的制备方法：
①将喷雾剂瓶用纯化水清洗两遍，加75％酒精浸泡消毒，弃去酒精， 再用经过过滤的纯化水清洗两遍，沥干，备用。
②取甘露聚糖肽、防腐剂加入纯化水中，溶解，加溶剂至全量，流 通蒸汽灭菌30分钟，过滤。
③将配好的药液灌入喷雾剂瓶中，即得。 喷涂剂中甘露聚糖肽的剂量按照使用对象，可适当提高或降低.除上述成 分外，如果需要，本发明的制剂也可加入其它任选成分.如加入其他药物成 分制成复方制剂，或采用其他辅料制成喷涂剂.
实施例1：
甘露聚糖肽 0.5g
聚乙二醇400 50g
苯甲醇 10g
纯化水 制成1000ml
取甘露聚糖肽0.5g，苯甲醇10g，加纯化水800ml使溶解，再加入 聚乙二醇400 50g使混合均匀，过滤，自滤器上加水至全量，搅匀，流通 蒸汽灭菌30分钟，分装至事先已清洁、灭菌的喷雾剂瓶中，即得。
实施例2：
甘露聚糖肽 1g
丙二醇 100g
三氯叔丁醇 5g
纯化水 制成1000ml
取甘露聚糖肽1g，三氯叔丁醇5g，加纯化水800ml使溶解，再加 入丙二醇100g使混合均匀，过滤，自滤器上加水至全量，搅匀，流通蒸汽 灭菌30分钟，分装至事先已清洁、灭菌的喷雾剂瓶中，即得。
使用方法
1、将药液直接喷涂于创面(严重污染者和磷烧伤者除外)。新创面开 始用药时，每小时应用药四至五次，待创面不甚疼痛后。可一至二小时 用药一次。
2、创面破皮者用药时用二层药用纱布浸饱药液覆盖在创面上(即湿 敷)，并经常保持纱布湿润。如分泌物不多，可每天换纱布一次(换纱布时 如纱布与创面粘附时可用烧伤药连续浸泡半小时左右)，如分泌物多，可每 天换纱布二至三次，必须保持创面周围皮肤清洁卫生；
3、磷烧伤者必须在暗室用无菌水反复冲洗至磷冲清干净后方能用烧 伤液
4、污染重的及其它化学品灼伤(如强酸？强碱？酒精)先用无菌水将创 面清洗 干净，然后直接涂药，如遇破皮创面仍需按以上方法湿敷；
5、如遇陈旧溃疡创面可用三至四层纱布湿敷，每日换纱布二至三次， 并要保持敷料上的湿度；
6、浅二度水泡一般不要刺破放水，直接用药在创面.深二度水泡可适 时适量放水，然后用药在创面上.浅二度创面水肿消退后，形成的软膜自然 脱落，此时仍要继续用药，加快皮肤恢复正常.深二度创面有坏死组织，由表 向里液化，其分泌物粘附在湿敷的纱布上，继续用药时，勿擦伤创面组织，并 保持敷料上液体饱和.
7、三度烧伤的湿敷方法与深二度相同，但湿敷纱布不低于四层.小面积 三度创面可自行湿敷愈合，大面积三度创面仍需助外科手术恢复(5)新用 途验证：亨通光华公司卫生所公司技术科研制的神舟三号甘露聚糖肽喷雾 剂对30例各种原因烧伤创面进行了临床疗效观察，取得了满意的效果，报 告如下：临床资料
本组30例，其中男21例，女9例，年龄2岁-83岁。受伤距入院时间： 1小时至5天，平均1天，烧伤原因：热水烫伤15例，火焰烧伤13例， 热排水管烫伤2例。烧伤面积1％-10％18例，11％-20％10例， 21％-44％2例，以2度烧伤为主，其中浅2度烧伤22例，深2度烧 伤8例，伴有3度烧伤3例，3度烧伤平均面积2％-5％。
治疗方法：
本组病例经清洗后小水泡保留三天后处理，大水泡低位引流或用注射 器吸干水泡液，去除部分腐皮，取烧伤液与消毒纱布混匀单层敷于创面， 再将该液喷于创面上，新鲜创面每2-3小时喷一次，每天换药一次，3 天后改每天喷药5-6次，保持纱布湿润，5天后改为每天3-4次，直到 至创面愈合，大面积烧伤除局部用药外，应常规输液及静滴抗菌素，休克 期应注意保温。
本发明的技术方案是：设计一种治疗烧伤的药物，其特征是：它将α -溶血链球菌33号菌种搭载往返式太空飞行器，在太空的特殊条件下导致 α-溶血链球菌33号菌种遗传性质发生变异，优选出其中的正变异、遗传 性质稳定的菌种，经培育发酵后生产成治疗烧伤的生化药剂，该菌种经中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为 CGMCCNo.1082。
所述的治疗烧伤的生化药剂是喷雾剂，1000ml中含太空诱变菌种生 产的甘露聚糖肽0.5g-10.0g。
所述的喷雾剂是以α-溶血链球菌33号菌种搭载、变异、优选后的菌 种，经培育发酵生产的甘露聚糖肽，加入其它辅料和溶剂制成。
所述的辅料是防腐剂、或苯甲醇、或硫柳汞、或三氯叔丁醇、或对羟 基苯甲酸酯类。
所述的溶剂是水或甘油、或丙二醇、或聚乙二醇。
所述治疗烧伤药物的制备方法是；①优选α-溶血性链球菌33菌种进 行太空搭载，经过太空诱变精心选育的α-溶血性链球菌33号菌珠作为生 产菌种制备；经一级发酵和二级发酵，将发酵液提纯，最终生产出太空诱 变菌种生产的甘露聚糖肽.②以甘露聚糖肽为原料加入辅料及适当溶剂配 制成喷雾剂。
所述的菌种制备；
A.斜面种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨 0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％，琼脂1-5％，绵羊血5-10％； pH 7.2-7.4；
斜面种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力 0.11-0.14Mpa；
启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面， 接种后置25-40℃恒温培养24-30小时；
B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨 0.3-0.8％，葡萄糖0.1-0.8％，氯化钠0.2-0.6％；pH 7.0-7.4；
肉汤种子培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力 0.11-0.14Mpa；
将培养好的斜面菌种在无菌条件下按1-9％接种量接入肉汤种子培养 基内，25-40℃恒温培养10-30小时。
所述的发酵过程；
用发酵培养基：牛肉膏0.2-0.8％，酵母膏0.2-0.8％，蛋白胨0.3-0.8％， 葡萄糖0.1-0.9％，氯化钠0.2-0.6％；
发酵培养基灭菌温度105-125℃，时间30分钟，蒸汽压力 0.11-0.14Mpa；
A.一级种子罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按1-10％接种量接 入一级种子罐，在25-40℃恒温培养10-50小时；罐压不超过0.02Mpa， 通气量以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌；
B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按2-20％接种量接 入发酵罐，在25-40℃恒温培养20-100小时，罐压不超过0.02Mpa；灭活 放罐，灭活采用加温使发酵液温度达到70-120℃，保温20-60分钟，冷 却静置。
所述的提取过程；
a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶ 20或酌情而定；
b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5 或酌情而定；充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调 pH1.0-5.0，得到溶解液并将溶解液静置。
c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液。准确量取上清液体积，按上 清液体积计算出所需乙醇量，将乙醇缓慢加入到上清液中，并充分搅拌， 静置后离心去除上清液得到沉淀物；
d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心。上清液再加乙醇沉淀。这 样的工艺反复操作至含量检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种所 生产的甘露聚糖肽粗品；真空干燥3-8小时即得太空诱变菌种生产的甘露 聚糖肽产品。
本发明的特点是：它采用α-溶血性链球菌33号经太空诱变后新的 菌种经发酵、提纯及精制等高科技手段制备成的甘露聚糖肽喷雾剂治疗烧 伤，它具有激活淋巴细胞，促进胸腺淋巴细胞分化增殖，激活巨噬细胞， 使白细胞生成增加，促进补体生成，促进白细胞介素-1的生成，经过收 集大量用药患者病历资料深入研究归纳总结证实存在促进皮肤粘膜再生 修复作用，烧伤的感染因素可由甘露聚糖肽的增强免疫作用消除。甘露聚 糖肽治疗烧伤粘膜病变的主要机理是促进皮肤粘膜再生修复，通过促进创 伤部位巨噬细胞分泌碱性成纤维细胞生长因子bFGF使烧伤创面修复。它 具有促进皮肤粘膜再生修复作用。
新药理作用试验分析验证：
烧伤的感染因素可由甘露聚糖肽的增强激活巨噬细胞作用解释。采用 白色念珠菌氘葡萄糖掺入实验，1、按甘露聚糖肽0.5ml/kg口服给药大 白兔一周。2、收集兔肺泡灌洗液。3、玻器粘附分离巨噬细胞。将被甘 露聚糖肽激活的巨噬细胞在体外与白色念珠菌共同培养24小时。4、用 水将巨噬细胞裂解，使氘标记的葡萄糖仅掺入菌丝体中。5.计数菌丝体 内氘的掺入量判断巨噬细胞对白色念珠菌生长的抑制率为97％。
甘露聚糖肽治疗烧伤的另一个机理是促进创面修复。活化的巨噬细胞分 泌碱性成纤维细胞生长因子bFGF使烧伤创面修复。
甘露聚糖肽治疗烧伤瘢痕减少的新机理是组分中甘露聚糖肽成分以竞 争抑制方式阻碍TGF-β-LAP复合物与6-磷酸-甘露糖/胰岛素样生长 因子II受体结合，从而抑制隐活TGF-β的活化。兔眼角膜紫外线烧伤模 型观察用药组伤后40日伤口胶原以网状方式沉积，瘢痕程度明显减缓。 平均愈合时间比非用药组提前7天。
治疗结果
本组30例，治愈29例，治愈率96.6％，好转1例，好转率3.4％，总 有效率100％。有好转1例中由于经费问题放弃治疗，用该法治愈2度最 大面积44％，最小面积0.5％，平均面积22％，其中浅2度创面14例，平 均治愈天数14天，合并有3度创面3例，平均治愈天数23天，在治疗过 程中未发现有任何不良反应、肝肾功能及小便检查，治疗前后无明显差 异。经临床应用观察，该药无毒和不良反应，临床应用效果好，创面愈 合快，因此，我们认为神舟三号甘露聚糖肽喷雾剂治疗烧伤创面疗效显著， 深2度烧伤不留疤痕。为烧伤创面外用药提供一种新的治疗方法。
新疗效验证：
刘东虎，男，23岁。西安亨通光华制药厂汽车司机。2003年6 月3日下午全身被汽油烧伤，头面部起泡，额部头发，眉毛，胡须烧焦， 双手烧烫起泡，双侧下肢皮肤烧烫燥烈，脱皮，渗液，剧痛难忍，心慌， 大汗淋漓。诊断：汽油烧伤(深II度)面积34.9％。治疗：抗菌消炎止痛， 静脉补液，外用神舟三号甘露聚糖肽喷雾剂，共住院19天，痊愈出院。 继续使用烧伤液，14天后复诊全身无疤痕。
(见附件：附件材料1：陕西省科学技术厅陕西省科学技术成果鉴定 证书材料
附件材料2：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号” 飞船搭载公证书。
附件材料3：太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株经“神舟三号” 飞船搭载返回地面筛选报告
附件材料4：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱 变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的形态生理生化鉴定报 告书
附件材料5：中国科学院微生物所关于“神舟三号”飞船搭载太空诱 变菌种生产的甘露聚糖肽生产菌株与地面对照菌的SDS-PAGE及 RFLP/PFGE分析鉴定报告书
附件材料6：陕西省药品检验所“神舟三号”太空诱变菌种生产的甘 露聚糖肽口服液检测报告
附件材料7：科技查新报告复印件
附件材料8：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏菌 种保藏受理通知书复印件)
具体实施方案
菌种选育：在α-溶血链球菌生长规律的基础上，选定较合适生长 时期的菌种，采用平皿生长的菌落、浸入其它物质中的菌悬液、带菌的砂 土等方法，于2002年3月25日搭载“神舟三号”宇宙飞船。在太空轨道 (近地点高度200公里、远地点高度350公里)进行了6天零18小时的 在轨飞行。太空的特殊条件主要体现为微重力、高真空、高辐射、交变磁 场等特殊环境。在外层空间飞行的菌种被置于一个与地球上的生态环境完 全不同的环境中，主要包括来自磁场俘获的电子、质子及低能重粒子；来 自银河系的宇宙射线如质子、粒子及更重的高能重粒子；来自太阳磁暴的 质子及重粒子等。这些粒子作用于微生物细胞核中的DNA双链结构，可导 致双链断裂。微重力、高真空环境可使DNA的碱基序列发生重组，即基因 组的重组和变异。变异后产生的新菌株，其形态特征、培养特征、生理生 化反应、代谢产物、遗传性状及蛋白表达、中试生产指标等均会发生不同 程度的变化。在宇宙飞船返回地面后，经过进一步筛选，仅优选出其中 0.2％的正变异且遗传特性稳定的菌株，经培育制成生产菌种。这种经航 天搭载诱变后选育出的菌种已经在在2003年12月29日由中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.1082。
实验及中试生产结果表明，经空间诱变后的新型太空菌种在遗传特性 上稳定，有较强的生产适应性，由其发酵产生的甘露聚糖肽含量提高，多 肽含量比国家标准(80％)提高3至5倍，西安市药品检验所送样测定达 到271.6％，发酵含量比对照组产物含量平均高出三倍以上，发酵周期大 大缩短。
制备方法：
太空诱变菌种生产甘露聚糖肽的制备过程：
本发明所述的太空诱变菌种生产的甘露聚糖肽是由以下方法制备：太 空菌种制备---一级发酵---二级发酵-----发酵液提纯，最终生产出甘 露聚糖肽。
①太空菌种制备：
以经过空间诱变育种精心选育的α-溶血链球菌作为生产菌种。
A.斜面种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡 萄糖0.4％，氯化钠0.5％，琼脂3％，绵羊血8％；pH 7.4。
斜面种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。
启封菌种冷冻管，用无菌肉汤培养基稀释，在无菌条件下接入血斜面， 接种后置38℃恒温培养30小时。
B.肉汤种子培养基：牛肉膏0.5％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.5％，葡 萄糖0.4％，氯化钠0.5％；pH 7.4。
肉汤种子培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。
将培养好的斜面菌种在无菌条件下按9％接种量，接入肉汤种子培养 基内，38℃恒温培养30小时。
②发酵过程：
发酵培养基：牛肉膏0.4％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄糖0.4％， 氯化钠0.5％。
发酵培养基灭菌温度121℃，时间30分钟，蒸汽压力0.12Mpa。
A.一级发酵罐：将优良的肉汤菌种在无菌条件下按10％接种量，接 入一级种子罐，在29℃恒温培养30小时，罐压不超过0.02Mpa，通气量 以能翻动培养液为宜，连续充分搅拌。
B.二级发酵罐：将一级发酵培养液在无菌条件下按20％接种量，接 入发酵罐，在29℃恒温培养70小时，罐压不0.02Mpa，灭活放罐。灭活 采用加温使发酵液温度达到100℃，保温60分钟，冷却静置。
③提取过程：
a、发酵液进行浓缩，使浓缩液体积与发酵液体积比控制在1∶15-1∶ 20或酌情而定。
b、发酵液的浓缩液加入80-99％乙醇，体积量比控制在1∶1.5-1∶5.5 或酌情而定。充分搅拌静置后，离心去除上清液，沉淀用蒸馏水溶解，调 pH5.0，得到溶解液并将溶解液静置。
c、再将溶解液离心去除杂质得到上清液，准确量取清液体积，按上 清液体积计算出所需乙醇量，调pH值，将乙醇缓慢加入到上清液中，并 充分搅拌，静置后离心去除上清液得到沉淀物。
d、沉淀物再用蒸馏水溶解，调pH，离心，上清液再加乙醇沉淀。这 样的工艺反复操作至中间检测合格为止，得到的沉淀物为太空诱变菌种生 产的甘露聚糖肽粗品。真空干燥3-8小时，即得到太空诱变菌种生产的甘 露聚糖肽产品。
上述方法得到的产品的检验：
[性状]本品为白色或微黄色无定形粉末；无臭、无味。
本品在水中易溶，在乙醇、氯仿及丙酮中不溶。
比旋度：取本品，精密称定，加水溶解并稀释成每1ml中约含10mg 的溶液，依法测定(中国药典2000年版二部附录vI E)，比旋度为+70℃ 至+80℃。
[鉴别]1、取本品10mg，加水0.5ml使溶解，加a-萘酚乙醇溶液 (5-100)1ml，摇匀，沿管壁缓缓加硫酸0.5ml，数分钟后，界面呈紫红 色。
2、取本品，加水制成每1ml中含1mg的溶液，取约10ul点于滤纸 上，晾干，用无水乙醇固定，置高硝酸溶液(取高碘酸1.2g，加水30ml 溶解后.加0.2mol/L醋酸钠溶液1.5ml与乙醇100ml，混匀即得。置 暗处保存，可使用数月)中浸泡5分钟，取出，用70％乙醇溶液冲洗，置 还原液(取碘化钾5g，硫代硫酸钠5g，加水100ml使溶解，再加乙醇150ml、 2mol/L盐酸液2.5ml，随加随搅拌，临用时配)中浸泡5分钟，取出，用 70％乙醇溶液冲洗，置品红业硫酸试液中浸泡约30分钟，取出，用焦亚 硫酸钠溶液(取焦亚硫酸钠0.4g，加盐酸1ml，加水溶解使成100ml，即 得)，冲洗，晾干，在滤纸片点样处应呈紫红色。
3、取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每1ml中含 1mg的溶液作为供试品溶液和对照品溶液，按甘露聚糖肽免疫原性测定法 试验，供试品和对照品管应均无溶血发生。
[检查]1、酸度：取本品，加水制成每1ml中含10mg的溶液，依法 测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，pH值应为3.0-5.0。
2、吸收度：取本品，加水制成每1ml中含0.4mg的溶液，照分光光 度法(中国药典2000年版二部附录VIA)，在260nm的波长处，其吸收度不 得大于0.25，在280nm的波长处，其吸收度不得大于0.20。
3、总氮量：取本品，照氮测定法(中国药典2000年版二部附录VII D 第二法)测定.按干燥品计算，含总氮量应为0.8-2.0％。
4、免疫原性：取供试品和对照品适量，分别加氯化钠注射液制成每 1ml中含10mg的溶液，再分别用磷酸盐缓冲液制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶ 16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256的稀释液作为供试品溶液和对照品 溶液，依法检查(附甘露聚糖肽免疫原性测定法)，供试品不溶血管的最低 浓度应不得高于对照品相应浓度的一倍以上。
5、干燥失重 取本品，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过5.0 ％(中国药典2000年版二部附录VIII L)。
6、重金属 取本品，在1.0g，依法检查(中国药典2000年版VIII H) 含重金属不得过百万分之二十。
7、异常毒性 取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含0.5mg的溶液， 依法检查(中国药典2000年版附录XI C).按静脉注射法给药，应符合规 定(供注射用)。
[含量测定]
1.对照品溶液的制备
精密称取经105℃干燥至恒重的D-甘露糖对照品0.1g置100ml 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度.摇匀；精密量取5ml，置100ml的 量瓶中，加水至刻度，摇匀.每1ml中含甘露糖50ug。
2.供试品溶液备
取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含40ug的溶液。
3.标准曲线的制备
精密称取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置具塞 试管中，各加水至1.0ml，再加3％苯酚溶液1.0ml，摇匀，冲入硫酸4.5ml， 摇匀，放置于室温，以0管为空白.照分光光度法(中国药典2000年版二 部附录IV A)在490nm的波长处测定吸收度。以甘露糖ug数对相应的吸收 度，计算回归方程。
4.测定法
精密量取供试品溶液1.0ml，照标准曲线制备项下自“再加3％苯酚溶液 1.0ml”起，依法操作，测定吸收度，由回归方程计算甘露糖的含量.
甘露聚糖肽免疫原性测定法(补体结合法)；
1、试液
A.酸盐缓冲液(pH7.2)
取氯化钠8.5g、磷酸氢二钠0.565g及磷酸二氢钾0.135g，加水至 1000ml使其溶解，加10％硫酸镁溶液1ml，摇匀。
B.1％羊红细胞悬液
羊血红细胞的制备：由绵羊颈静脉无菌采血于盛有等量阿氏液(取 葡萄糖20.5g、枸椽酸钠8.0g、氯化钠4.2g，枸椽酸5.5g，加水至1000mI 使溶解，100℃灭菌30分钟)的无菌容器中，4℃保存。
1％羊血红细胞悬液的制备：取上述羊血红细胞适量，用氯化钠注射 液洗涤三次，每次离心5分钟(2000转/分)，取压积羊血红细胞，用氯 化钠注射液制成1％羊血红细胞悬液。取悬液，用氯化钠注射液稀释20 倍制成供试品溶液，另取等量悬液加水稀释20倍作为空白溶液，照分光 光度法(中国药典2000年版二部附录IV A)，在541nm的波长处测定，其 吸收度应为0.65-0.70，如超出限度应调节1％羊红细胞悬液的浓度。
C.溶血素及致敏羊血红细胞
溶血素的制备：取上述压积羊血红细胞，用氯化钠注射液制成25％ 羊血红细胞悬液.取家兔1只，静脉注射上述羊血红细胞悬液，每日一次， 共七次，前三次3ml，后三次5ml，末次注射后七日采血。分离血清，56℃.30 分钟灭活，分装，0℃以下保存。
溶血素单位的测定：取溶血素适量，加磷酸盐缓冲液分别制成 1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶7000、1∶8000、 1∶9000、1∶10000的稀释液，各取0.1ml置试管中，加1％羊血细胞悬液 0.1ml，摇匀，加稀释度为1∶30的豚鼠血清(补体)0.2ml及磷酸盐缓冲液 0.2ml，摇匀，37℃保温30分钟，完全溶血管的最高稀释度为1单位溶血 素。
致敏羊血红细胞的制备：临用前，将2％的羊血红细胞悬液与2单 位溶血索等体积混合，37℃保温15分钟即得。
补体：取三只以上的豚鼠，心脏采血，离心分离血清，0℃以下保存。
补体单位的测定：取补体适量，加磷酸盐缓冲液，分别制成1∶40、 1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160、1∶180的稀释液，各取0.2ml 置试管中，加0.2ml磷酸盐缓冲液，摇匀，37℃保温30分钟后，分别加 致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟.完全溶血管的最高 稀释度为1单位的补体。
抗体：取甘露聚糖肽对照品适量，加氯化钠注射液制成每1ml中含 10mg的对照品溶液免疫家兔，隔日采用耳静脉注射对照品溶液一次。第 一次注射0.2ml，第二次至第五次各注射0.5ml，第六次至第十次各注射 1.0ml，第十一次至第十五次各注射2.0ml，末次注射后三日采血，离心 分离血清，56℃下30分钟灭活，分装，0℃以下保存(临用前，需56℃30 分钟再次灭活)。
抗体单位的测定：取抗体适量，加磷酸盐缓冲液分别制成1∶2、1∶4、 1∶8、1∶16、1∶32.1∶64、1∶128的稀释液，各取0.1ml置试管中，加甘 露聚糖肽对照品溶液0.1ml及2单位补体0.2ml，摇匀，于4-8℃放置4 小时以上，置37℃保温30分钟，不溶血管的最高稀释度为1单位抗体。 同时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原， 以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原，抗体，以0.2ml磷酸盐缓 冲液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血；另设的致敏羊血红细胞(不 加抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。
2、免疫原性测定法
取甘露骤糖肽对照品与供试品适量，照药品项下的规定制成不同浓 度的对照品溶液和供试品溶液，各取0.1ml置试管中，加入2单位抗体 0.1ml及2单位补体0.2ml.摇匀，于4-8℃放置4小时以上，置37℃保 温30分钟，加入致敏羊血红细胞0.2ml，摇匀，37℃再保温30分钟。观 察各管的溶血情况，不溶血管的最低浓度代表甘露聚糖肽的免疫原性。同 时设抗原(不加抗体，以0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、抗体(不加抗原，以 0.1ml磷酸盐缓冲液代替)、补体(不加抗原、抗体、以0.2ml磷酸盐缓冲 液代替)对照管，以上三种对照管应全溶血：另设的致敏羊血红细胞(不加 抗原、抗体和补体，以0.4ml磷酸盐缓冲液代替)对照管应不溶血。
太空诱变菌种生产的治疗烧伤喷雾剂的制备方法：
①将喷雾剂瓶用纯化水清洗两遍，加75％酒精浸泡消毒，弃去酒精， 再用经过过滤的纯化水清洗两遍，沥干，备用。
②取甘露聚糖肽、防腐剂加入纯化水中，溶解，加溶剂至全量，流 通蒸汽灭菌30分钟，过滤。
③将配好的药液灌入喷雾剂瓶中，即得。 喷涂剂中甘露聚糖肽的剂量按照使用对象，可适当提高或降低.除上述成 分外，如果需要，本发明的制剂也可加入其它任选成分.如加入其他药物成 分制成复方制剂，或采用其他辅料制成喷涂剂.
实施例1：
甘露聚糖肽 0.5g
聚乙二醇400 50g
苯甲醇 10g
纯化水 制成1000ml
取甘露聚糖肽0.5g，苯甲醇10g，加纯化水800ml使溶解，再加入 聚乙二醇400 50g使混合均匀，过滤，自滤器上加水至全量，搅匀，流通 蒸汽灭菌30分钟，分装至事先已清洁、灭菌的喷雾剂瓶中，即得。
实施例2：
甘露聚糖肽 1g
丙二醇 100g
三氯叔丁醇 5g
纯化水 制成1000ml
取甘露聚糖肽1g，三氯叔丁醇5g，加纯化水800ml使溶解，再加 入丙二醇100g使混合均匀，过滤，自滤器上加水至全量，搅匀，流通蒸汽 灭菌30分钟，分装至事先已清洁、灭菌的喷雾剂瓶中，即得。
使用方法
1、将药液直接喷涂于创面(严重污染者和磷烧伤者除外)。新创面开 始用药时，每小时应用药四至五次，待创面不甚疼痛后。可一至二小时 用药一次。
2、创面破皮者用药时用二层药用纱布浸饱药液覆盖在创面上(即湿 敷)，并经常保持纱布湿润。如分泌物不多，可每天换纱布一次(换纱布时 如纱布与创面粘附时可用烧伤药连续浸泡半小时左右)，如分泌物多，可每 天换纱布二至三次，必须保持创面周围皮肤清洁卫生；
3、磷烧伤者必须在暗室用无菌水反复冲洗至磷冲清干净后方能用烧 伤液
4、污染重的及其它化学品灼伤(如强酸？强碱？酒精)先用无菌水将创 面清洗 干净，然后直接涂药，如遇破皮创面仍需按以上方法湿敷；
5、如遇陈旧溃疡创面可用三至四层纱布湿敷，每日换纱布二至三次， 并要保持敷料上的湿度；
6、浅二度水泡一般不要刺破放水，直接用药在创面.深二度水泡可适 时适量放水，然后用药在创面上.浅二度创面水肿消退后，形成的软膜自然 脱落，此时仍要继续用药，加快皮肤恢复正常.深二度创面有坏死组织，由表 向里液化，其分泌物粘附在湿敷的纱布上，继续用药时，勿擦伤创面组织，并 保持敷料上液体饱和.
7、三度烧伤的湿敷方法与深二度相同，但湿敷纱布不低于四层.小面积 三度创面可自行湿敷愈合，大面积三度创面仍需助外科手术恢复(5)新用 途验证：亨通光华公司卫生所公司技术科研制的神舟三号甘露聚糖肽喷雾 剂对30例各种原因烧伤创面进行了临床疗效观察，取得了满意的效果，报 告如下：临床资料
本组30例，其中男21例，女9例，年龄2岁-83岁。受伤距入院时间： 1小时至5天，平均1天，烧伤原因：热水烫伤15例，火焰烧伤13例， 热排水管烫伤2例。烧伤面积1％-10％18例，11％-20％10例， 21％-44％2例，以2度烧伤为主，其中浅2度烧伤22例，深2度烧 伤8例，伴有3度烧伤3例，3度烧伤平均面积2％-5％。
治疗方法：
本组病例经清洗后小水泡保留三天后处理，大水泡低位引流或用注射 器吸干水泡液，去除部分腐皮，取烧伤液与消毒纱布混匀单层敷于创面， 再将该液喷于创面上，新鲜创面每2-3小时喷一次，每天换药一次，3 天后改每天喷药5-6次，保持纱布湿润，5天后改为每天3-4次，直到 至创面愈合，大面积烧伤除局部用药外，应常规输液及静滴抗菌素，休克 期应注意保温。