稳定的注射液组合物和方法

摘要

一种用于将稳定的生物活性化合物传递给个体的组合物，其包含第一种组分和第二种组分，其中所说的第一种组分包含一种含有生物活性物质的糖玻璃或磷酸盐玻璃的微粒。该糖玻璃或磷酸盐玻璃可包含或不包含一种玻璃成形促进剂化合物，并且其中所说的第二种组分由至少一种生物相容的液体全氟化碳所组成，所说的第一种组分不溶于该液体全氟化碳并分散于其中。其中所说的液体全氟化碳可包含或不包含表面活性剂。

权利要求

1.一种药物组合物，其含有糖玻璃微粒或金属羧酸盐玻璃微粒， 所述颗粒载有活性成分，所述微粒悬浮于液体中，其特征在于微粒具 有0.1到100微米的直径，所述微粒和所述液体的密度匹配，并且所述 微粒在液体中保持稳定悬浮，其中所述液体为全氟化碳。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于所述颗粒含有无机盐 作为密度调节剂。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于所述无机盐是磷酸钙。

4.如上述权利要求任一项所述的组合物，其特征在于所述微粒含 有乳酸钙。

说明书

本发明的背景技术

准备注射的疫苗或药物溶液本来就不稳定，需要冷藏。传统的制 药工业是通过将药物进行冷冻干燥来克服这种不稳定的问题的。这样 做很浪费、不方便并且固有地具有一定的危险性，这是因为干燥药物 的错误重构可能导致剂量发生错误或可能导致溶液发生污染。在过去 的一个世纪，已经进行了许多努力来研制浓的、稳定的、备注射的液 体制剂，但可惜的是没有成功。仅仅天生坚固的小分子药物可以存在 于水性溶液中并具有有用的储存期。

在疫苗工业中这种问题尤其尖锐。到2005年时，预计全世界所 使用的疫苗剂量会达到36亿。世界卫生组织(WHO)已经声明不可能 使用在所有的时候都需要冷藏的标准疫苗制剂(“免疫法的变革” (Revolutionizing Immunizations)，Jodar L.，Aguado T.，Lloyd J.和Lambert P-H.Genetic Engineering News 1998年2月15日)。目前使用的是冷藏 器的“低温运输系统(cold chain)”，其可以从疫苗工厂中将其运送 到发展中世界的城镇中。对于疫苗企业和非政府性的健康组织而言， 利用低温运输系统进行免疫活动的花费是巨大的。WHO预计该低温 运输系统的维护费用每年在2亿美元以上。此外，免疫活动仅仅能抵 达这些居住在该低温运输系统的最后一个环节附近的人。

疫苗运动需要进行过医学训练的人以确保能正确的对给药剂量进 行注射并且没有出现降解的迹象。一些疫苗如麻疹、黄热病和BCG 疫苗需要进行重构，在本领域中这也是需要十分注意的问题。必须精 确地进行操作以确保剂量的正确性并且在操作的过程中还可能引入潜 在的污染源，这常常会导致临床上的灾祸。此外，因为由于某些组分 的化学不相容性而使之不能获得特定的混合物或“多价”疫苗，所以 在一个时期内常常需要给予一次以上的疫苗，这可能会需要进行多次 注射。WHO已经通过积极鼓励进行研究以获得不需要冷藏并且不需 要重构的下一代稳定疫苗而强调了这些问题(“预填充的单剂量注射装 置：一种新疫苗的安全性标准，或一场免疫物质传递的变革？”(Pre- Filled Monodose Injection Devices：A safety standard for new vaccines，or a revolution in the delivery of immunizations？)，Lloyd J.和Aguado M. T.，WHO出版，1998年5月。“总方针问题：可注射的固体疫苗： 在未来免疫法中的角色？”(General Policy issues：injectable solid vaccines：a role in future immunization？)，Aguado M.T.，J6dar L.，Lloyd J.， Lambert P.H.，WHO出版物No.A59781)。

这一问题的一种理想解决方案是提供一种完全稳定的备注射的制 剂。该类稳定的疫苗可以被包装在注射装置本身中成为独立的给药剂 量，或者，对于大量的免疫活动而言，可以以较大容量的形式被运送， 然后通过一种没有针头的喷射注射器来进行给药。已经有关于通过气 体喷射注射而进行干固体的经皮传递的描述(Sarphie DF，Burkoth TL， 在经皮颗粒传递中使用密质颗粒组合物的方法。PCT公开号WO 9748485(1996))，干DNA疫苗的经皮接种显然十分有效(“PowderJect 的B型肝炎DNA疫苗第一次成功的引起了人的保护免疫反应” (PowderJect’s Hepatitis B DNA Vaccine First To Successfully Elicit Protective Immune Response In Humans)， http://www.powderject.com/pressreleases.htm(1998))。

能用于驱动这些粉末注射器的氦气超音速冲击波具有有限的力 量，所以不能将细颗粒的剂量进行肌内传递。这是因为低质量的颗粒 不能获得深入渗透所需的足够动量。虽然包覆于胶态金颗粒上的DNA 疫苗的经皮传递足以获得良好的免疫原性，但是用不溶性的铝或钙盐 进行辅助的普通疫苗会诱导不可接受的皮肤刺激。它们必须被肌内给 药。所需的是一种能在从真皮内到深入肌肉内的传递深度范围内进行 传递的柔性系统，其所能传递的深度类似于用现有的针和注射器技术 所能达到的深度。对于大量的免疫活动而言，这已经通过研制一种能 促使窄的液体流(直径～0.15mm)进入到“液体指甲”中的液体喷 射注射器而得到了解决，其使用约3,000psi的压力。这种装置可以通 过在表皮上穿出微小的孔而无痛的将其剂量通过皮肤传递到深入的皮 下或肌肉组织中。给该液体流提供高动量以确保其能深度渗入。迄今 为止，注射的药物和疫苗一直都是以水为基础的，但是因为上面所讨 论的不稳定的问题，可用于这种技术的稳定的水性产品的范围十分有 限。

现在已经认识到许多生物活性分子通过在糖玻璃上进行干燥而可 被稳定化(Roser B.“蛋白质等的保护”UK专利号为2,187,191。Roser B 和Colaco C.“生物学大分子物质和其它有机化合物的稳定化”PCT公 开号WO 91/18091。Roser B.和Sen S.“新的稳定化的玻璃”PCT专利 申请号为：9805699.7，1998年)。这些干燥的稳定的活性物质不受不利 的环境如高温和离子辐射的影响。

糖对分子的显著稳定化机理是玻璃转化。在将包含活性分子的糖 溶液进行干燥时，当达到糖的溶解度限度时其可以结晶出来，或可以 变成过饱和的糖浆。糖抵抗结晶的能力是一种良好稳定剂的重要性 质。海藻糖在这方面具有良好的性质(Green JL.& Angel CA.“糖水中 的相态关系和玻璃化以及海藻糖的异常”.J.Phys.Chem.93 2880-2882 (1989))但并不是唯一的。进一步地逐步干燥使得该糖不断地固化，在 低的残余水含量下变成一种玻璃。该活性成分不知不觉地从水中的液 体溶液变成在干的糖玻璃中的固体溶液。在玻璃中的化学扩散是可以 忽略不计的，因此实际上停止了化学反应。因为变性作用是一种化学 变化，其在玻璃中不能发生，所以可以将分子稳定化。倘若能满足一 种其它的条件，以这种形式存在的分子仍然没有改变。这是一种良好 稳定剂的第二个重要性质，即是化学惰性的和没有活性的。许多玻璃 不能用就是因为它们在储存期间与产物发生反应。还原糖会发生明显 的问题，其可形成良好的物理玻璃但是然后在典型的美拉德反应中它 们的醛基团会攻击产品的氨基基团。这是许多冷冻干燥的药物需要冷 藏的主要原因。没有活性的糖可以给出稳定的产品，根本不需要进行 冷藏。

被固定在糖玻璃中的生物分子在非水性的工业溶剂中也是稳定 的，在这种非水的工业溶剂中这些分子本身和糖都是不溶的(Cleland JL. 和Jones AJS.“用有机溶剂处理的多肽的赋形剂稳定化”专利号为 5,589,167的美国专利(1994))。因为糖玻璃在非溶剂的液体中可作为非 渗透性的屏障，所以在玻璃的固体溶液中的生物分子可以被保护起来 不与溶剂和环境进行化学反应。如果该液体本身是稳定的，则在混悬 的玻璃颗粒中的敏感产物就组成了一种稳定的两相液体制剂。Cleland 和Jones(1994)所描述的类别的工业溶剂在加热中具有有限的实用性。 代用以生物可相容的非水性液体可确保甚至最不稳定的药物、疫苗和 诊断试剂可被制备成稳定的液体制剂。

设计了第一代稳定的非水性液体用于药物或疫苗传递(B.J.Roser 和S.D.Sen“在液体制剂中稳定的颗粒”编号为GB98/00817的PCT 专利申请，其描述了包含活性成分的稳定化玻璃的粉末制剂，其被混 悬于可注射的油如芝麻油、花生油或豆油中或被混悬于简单的酯如油 酸乙酯中。被混悬的糖玻璃颗粒的亲水性很强而油是疏水的。因为亲 水相和疏水相强烈的分离趋势，所以该糖玻璃倾向于向一起聚集。为 了稳定该类“油包水”型混悬液，常常需要使用溶解于连续油相中的 油溶性表面活性剂。

这些低HLB值(亲水/亲油平衡值)的表面活性剂在亲水的颗粒和 油之间的界面上积聚，并且用一种两亲层对它们进行包覆，该两亲层 与连续的油相更相容。因为各种糖玻璃颗粒之间被干性油分隔开，所 以在颗粒之间不会发生化学的相互作用。因此，在相同的油性制剂中 可有一些不同的颗粒群，各颗粒群可包含不同的可能会相互作用的分 子，在该油制剂中它们不能相互作用。用这种方法可以制造出复合的 多价疫苗。

但是，随后发现这种方法具有一些缺点，使其不能形成一种通用 的解决办法。缺点包括不可避免的会发生混悬颗粒的沉积，在密度较 低的油性赋形剂中其一般具有约1.5g/cm3的密度。该专利承认了这种 问题并且希望通过将颗粒的直径降低到1μm以下来解决这一问题， 降低颗粒的直径是为了通过热力学力如布朗运动而使这些颗粒保持混 悬的状态。要求所有颗粒的直径都小于1μm对于所建议的制剂而 言是一个缺点。获得如此小的颗粒决不是一项容易的任务。改良的喷 雾干燥方案可能可以做到这一点但小粒度将使得不能使用旋流型收集 器并且需要一种用于产品回收的过滤系统。

将颗粒减少到亚微米的大小在理论上也是可行的，在将该颗粒混 悬于油中后可以用高压微量均化装置如微量流化器(Constant Systems Inc.)来达到这一目标。这样就需要进行额外的步骤，并且我们发现对 喷雾干燥的糖玻璃微球进行粉碎不是很有效，这是因为这些颗粒具有 球形的形状，所以具有很高的机械强度。这就需要使其多次通过该装 置。即使如此，还可能会有很多较大的颗粒未受影响，因此随后需要 进行过滤或沉淀步骤以除去这些较大的颗粒。在通常的油性赋形剂中 混悬液的高粘度也使得很难将其吸入到注射器中，并且在注射时只能 缓慢的进行注射。其不能象在液体喷射注射系统中那样快速的通过细 喷嘴。

还已经发现，混悬于油中的颗粒，尤其是当其包含一种低HBL 值的表面活性剂时，其随后很难被提取到一种水性环境中，即使在用 水性缓冲液进行洗涤后，它们仍然令人吃惊的紧紧结合在一起，这是 因为环绕在颗粒周围的油的斥水性涂层所导致的。因此，需要进行十 分强烈的振摇和混合或需要再加入更多的水溶性洗涤剂(这次具有高 HBL值)以使得颗粒离开油相进入水相。当颗粒的粒度变小时，这一 问题变得更为突出。最后的结果常常是一种混乱混合的乳剂而不是一 种明显分离的两相。这种问题主要会造成活性物质的缓慢和难以预料 的释放，而不是所需的迅速和可预知的传递。在体外，提取到水性环 境中时会使得油漂浮到包含溶解了的活性物质的水相的上面。在体外 应用的某些情况中这是不可接受的，如在诊断试剂盒或自动测定系统 中。最后，FDA所批准的可临床应用的天然油中的大多数都易于遭受 光降解、氧化或其它形式的损害，需要在相对较低的温度下被仔细的 储存于黑暗的环境中。此外，它们不是完全的化学惰性，以至于它们 可以与所混悬的颗粒缓慢的进行反应。

Alliance制药公司已经研究了水溶性物质的粉末在值得注意的新 的非水性全氟化碳液体中的应用(Kirkland WD用于传递活性物质的组 合物和方法，专利号为5,770,181的美国专利(1995))。这篇专利主要 关心的是PFC作为肠诊断成像的口服对比增强剂的功能。其中加入所 列举的水溶性粉末是为了改善可口性或PFC在胃肠道中的对比作用的 增强。虽然没有给出实施例，但是，Kirkland感知到这些液体也可以 用于药物传递。在该专利中仅仅特别列举了储存稳定的在商业上可获 得的粉末。我们现在发现，在糖玻璃微球中被稳定化的脆弱的活性物 质可以用于制造出十分稳定的可用于口服和非肠道给药的两相PFC液 体制剂。这极大地扩充了Kirkland专利的实用性，将其扩充到了用于 传递非肠道药物和疫苗的不需要进行任何形式冷藏的备注射的制剂 中。特别有价值的是发现了PFC的低粘度、高密度和低表面张力使得 这些稳定的混悬液可以通过自动装置如液体喷射注射器来进行传递。 这又为这种技术开辟了两个重要的领域，即大量的免疫活动以及自我 注射。

全氟化碳(PFC)是由某些有机化合物的完全氟化而获得的新型 的、十分稳定的液体。不能将其归为亲水或亲脂，因为它们实际上与 除其它的PFC外的油和水或其它任何极性或非极性的溶剂基本都不能 相混(Krafft MP & Riess JG.的综述“高氟化的两亲物和胶体体系，以 及它们在生物医学领域中的应用。一点贡献。”Biochimie 80 489-514 1998)。此外，它们既没有参与与油的疏水性相互作用，又没有参与与 水或亲水性物质的亲水性相互作用。作为一种总的相分离的结果，所 看到的亲水颗粒块在油中的强烈结合在PFC中一般不会发生。其可不 需要表面活性剂就能制造稳定的混悬液，但是可以使用氟代烃(FHC) 表面活性剂(Krafft & Riess 1998)并且其在PFC液体中在很低的浓度下 就具有活性。在这些非常低的浓度下，FHC表面活性剂可以确保某些 颗粒能形成完美的单分散体系，其中所说的颗粒在不存在FHC表面活 性剂时表现出聚集的倾向。该PFC液体本身是完全没有化学反应性 的，并且低分子量型的这种挥发性的液体在机体中不会累积，最后仅 仅是随着呼吸被呼出。

因为是气体的极佳的溶剂，所以PFC一直被大量用于的非常特 别的临床应用。它们用二氧化碳交换溶解氧的能力优于血红蛋白的能 力。这首先在R.P.Geyer，1968年的“无血大鼠”中得到了证实(Geyer RP，Monroe RG & Taylor K.“完全用全氟化碳-清洁剂制剂灌注的大鼠 的存活情况”，Organ Perfusion and Preservation，J.V Norman，J Folkman， L.E.Hardison，L.E Ridolf和F.J.Veith编辑.Appleton-Century-Crofts， 纽约，85-95(1968))。目前对在某些手术过程中作为人血液输血的供替 代的选择的水包PFC型乳剂形式的商品名为OxygentTM(Alliance Pharmaceutical Corp.)的全氟辛基溴化物进行了评估。液体形式的PFC 已经通过吸入被吸入到肺中用于治疗早产婴儿的呼吸窘迫综合征。

还发现它们的高密度以及化学惰性很有价值。用商品名为 VitreonTM(Vitrophage Inc.)的全氟菲来预防在手术期间眼囊的萎陷，并 且其还可使得脱离的视网膜复位。PFC还已经被用作磁共振成像(MRI) 的造影剂，并且对于这种目的而言，还已经报道了可以将亲水性的粉 末混悬于其中以改善其成像性或使其更适口。(Kirkland W.D.“传递 活性物质的组合物和方法”专利号为5,770,181的美国专利，1998)。 这篇专利还暗示了PFC作为传递微粒状水溶性药物的连续相的应用。 因为以干粉末状态存在的在室温下稳定的非肠道药物的数目是有限 的，所以这篇专利对于大多数可注射的药物不适用。但是，在Roser 和Garcia de Castro(1998)中描述的药物在糖玻璃的微球粉末中的稳定 化与可注射的PFC结合，使得这项技术适用于基本上所有的非肠道药 物和疫苗。

本发明的概述

本发明使用一种两相体系作为药物传递制剂，在混悬液中用PFC 作为连续相，其包含一种不连续的玻璃相。以全氟化碳为基础的制剂 的主要优点在于可以将不同的PFC进行混合从而获得密度范围为约1.5 至2.5g/cm3的最终混合物。这使得微粒可以被制备成密度匹配的混悬 液体以便于这些微粒不会漂浮在表面上或沉积到容器的底部而仍然可 以保持稳定悬浮的形式。因此，与以油为基础的制剂不同，这种制剂 不需要将微粒亚微米化来防止沉积作用，这种制剂中的微粒在大小上 可以变化很大。仅仅是为了制剂的目的才对最终颗粒的直径进行控 制。想要用于针注射或喷射注射的制剂可以包含0.1至100微米的颗 粒，或优选1至10微米。这样做可以极大的简化颗粒的制造方法并 且避免了通过研磨来制造十分细小的颗粒的必要性。可以通过常规的 喷雾干燥或冷冻干燥之后进行简单的干法或湿法研磨来制备颗粒。当 在混悬液中需要有高固体含量时，希望颗粒的形状为球形。形状不规 则的颗粒“结合”到一起的趋势更强从而会抑制自由流动，而球形的 颗粒具有固有的“润滑性”，从而确保固体含量可以达到20％以上。 该类颗粒可以很容易的通过喷雾干燥、喷雾冷冻干燥或乳剂固化来进 行制备。

如果制备恰当的话，该混悬的粉末不需要表面活性剂就能制造出 稳定的混悬液，当用水进行振摇时该糖玻璃颗粒几乎立即溶解。如果 将少量的聚集看作一个问题，则可以在将该稳定粉末进行混合前或进 行混合后向该PFC液体中有益的加入少量的如Krafft和Riess(1998) 所述的FHC表面活性剂。与PFC相似，这些FHC本来的惰性就十分 强并且没有反应性。因此，没有颗粒的溶剂化作用并且在混悬的颗粒 和PFC相之间没有化学反应。因为该糖玻璃颗粒和PFC液体在环境 中都是稳定的，所以不会由于光、高温、氧等等而发生降解。其具有 在体内或体外都可以忽略不计的毒性并且已经被管理的权威机构深入 测试和批准可作为血液的替代品大量的输注到动物和人体内。虽然已 经有报道称高分子量的PFC会在肝中积聚，但是在本发明应用中所用 的低分子量的实例最后都在呼气时从机体排出。

它们的低表面张力和低粘度确保了它们非常易于通过在皮下注射 器的针、自动系统或液体喷射注射器中所会遇到的狭窄的孔。PFC是 极佳的电绝缘体，因此易于获得带有相同的低表面静电荷的颗粒的单 分散混悬液。它们是干燥的，并且是完全非吸湿性的液体。它们的极 低的水含量保持了混悬粉末的干燥性，防止了掺杂在其中的活性物质 的溶解或降解。它们独特的溶剂特性缺乏性使之成为混悬亲水或疏水 颗粒的理想物质，即最终的混悬液实际上可以与容器或传递装置中所 用的任何物质相容。这与以油为基础的制剂相反，以油为基础的制剂 可造成注射器的严重阻塞，例如由活塞上的橡胶封口膨胀而造成阻 塞。可以获得各种密度、蒸汽压和挥发性的PFC，(表I)。它们的 高密度使得它们在大多数常用的缓冲液中下沉，使之易于与溶解于漂 浮在顶部的水相中的该产品颗粒分离。因此，这促进了其在体外的应 用如诊断学的应用。

本发明详细描述

表I一些PFC的性质

全氟-      MW     密度     粘度     表面张力  蒸汽压

                  (Kg/L)   (mPas)   (mN/m)    (mbar)

己烷       338    1.682    0.656    11.1      294

正-辛烷    438    1.75     1.27     16.98     52

十氢萘    462    1.917    5.10    17.6    8.8

菲        624    2.03     28.4    19      ＜1

在Kirkland(1995)中已经暗示了PFC作为传递药理学物质或生物 活性物质的赋形剂的应用。这篇专利仅仅列举了天生稳定的可商业获 得的调味或泡腾粉末等等。其没有包含任何稳定化的生物活性物质如 疫苗或药物的实例。此外，其并没有考虑通过用PFC作为活性颗粒的 混悬赋形剂而制备一种可注射(非肠道)制剂的可能性。为了获得一 种具有长储存期的用PFC作为非水性赋形剂的本生脆弱生物分子的稳 定制剂，优选地将该颗粒制备成包含能稳定所掺杂的活性物质的玻璃 成形剂的形式。可以使用各种糖，包括在编号为WO 91/18091的PCT 申请中所描述的海藻糖、乳糖醇、异麦芽糖醇(palatinit)等等或更优 选在申请号为9820689.9的UK专利申请中所描述的其它更有效的单 糖糖醇或玻璃成形剂。

为了防止颗粒漂浮在密质PFC相上面，有益的在该颗粒中加入 一种密度调节剂。其可以是可溶性的盐如氯化钠或氯化钾或硫酸钠或 硫酸钾，或更优选地是一种不溶性的物质如硫酸钡、磷酸钙、二氧化 钛或氢氧化铝。优选不溶性的无毒物质，这是因为在机体内大量离子 盐的释放可造成相当大的局部疼痛和刺激作用。在一些情况中，如在 疫苗制剂中，该不溶性的物质可以是该活性制剂的一部分如佐剂。该 密度调节剂可以以在糖玻璃颗粒中的固体溶液形式存在或可以以一种 混悬于糖玻璃中的不溶性颗粒物质的形式存在。当进行恰当的制备 时，该糖玻璃颗粒的密度可以大约与PFC液体的密度相配，浮力适中， 并且既不漂浮又不沉降而是仍然不结块的稳定混悬体。

因为PFC液体是良好的电绝缘体，电阻率一般高于1013ohm.cm， 所以在混悬颗粒上的微小表面电荷对于混悬液的稳定性具有重要的影 响。为了防止混悬颗粒由于弱的短距离力而发生的聚集，其优选地被 制备成包含能为该干颗粒提供弱的残余静电荷的赋形剂如赖氨酸或天 门冬氨酸的形式。这样做可以通过确保颗粒的电荷排斥力来防止聚集 作用，这与在稳定的胶体中所观察到的相似。或者，可以有益地将少 量的FHC表面活性剂如全氟癸酸溶解于PFC中形成分散的混悬液， 优选地形成单分散的混悬液。

这些颗粒可以用各种方式来进行制备，包括风干、喷雾干燥或冷 冻干燥，这些颗粒不需要特别小，而可以是一种直径为0.1μm至100 μm的颗粒的异质混合物。对于一些应用而言，甚至可以使用毫米大 小的颗粒。

这些稳定的混悬液的应用既不仅限于上面所列举的非肠道的应 用，又不仅限于如Kirkland(1995)中所列举的口服应用。因为PFC液 体赋形剂是无毒并且无反应活性的，所以其是一种适用于粘膜的理想 的赋形剂，包括可用于肺内、鼻内、眼内、直肠内和阴道内给药。这 篇专利所提供的能制造稳定的、无菌并且无刺激性的可用于甚至非常 不稳定的药物或疫苗的粘膜传递的制剂的能力是相当先进的。因为微 生物在缺乏水的情况下不能生长，所以在长期储存和间歇应用期间， 该非常干燥的并且完全非吸湿性的PFC液体还十分有助于维持这些制 剂的无菌性。

因为长期以来挥发性的全氟代烃和含氯氟烃一直在吸入剂中被用 作推进剂用于使药物能够传递到肺的深处，所以这里所描述的该稳定 的PFC制剂是用于制备肺内传递液体STASIS小滴细雾的理想物质。 对于这种应用而言，在PFC小滴中组成不连续的被混悬相的颗粒的大 小很重要并不应超过1至5μm，优选0.1至1μm的直径。对于传 递至鼻和眼中的其它粘膜表面而言，粒度大小的重要性稍微差一些， 并且可以高至100μm的直径，甚至可以达到几个mm的直径。

附图说明

图1
碱性磷酸酯酶(Sigma Aldrich Ltd.)被以甘露醇33.3％、乳酸钙 33.3％和降解的明胶33.3％(Byco C，Croda Colloids Ltd.)为基础的玻璃 所稳定化，被喷雾干燥成微球，并且以干粉末或在全氟萘烷中的稳定 混悬液的形式被存储于55℃。该活性仍然为约100％标记值(20天为 103％，30天为94％)。未被混悬于PFC中的干粉末没有更大的损失(仍 然有约80％的活性)
图2
通过在20％海藻糖溶液中加入磷酸钙来将一种商品化的破伤风 类毒素疫苗(由Evans Medeva plc友情提供的#T022)制备成密度匹配的 粉末。用两个流体喷头将其喷到液氮中来冷冻干燥，然后，将该冻干 的微球粉末在Labconco干燥器中进行冷冻干燥，在最初的干燥期间 初始的搁板温度为-40℃。在注射了相同剂量的用盐水缓冲剂重构或作 为油或PFC中的无水制剂的ASSIST稳定化破伤风类毒素疫苗后4、8 和12星期时，测定六组豚鼠的抗体反应，每组有10只豚鼠。
对于所有干燥制剂的反应低于新鲜的疫苗对照的反应(未表示出 来)，这表明喷雾干燥的制剂显著丧失了免疫原性。正如用捕获的ELISA 所测定的那样，干燥过程并没有改变该类毒素的抗原性。这表明在干 燥时需要做更多的工作来改善氢氧化铝佐剂的保存。
对于用磷酸钙进行了密度匹配的STASIS疫苗的反应(组3)基 本上与作为对照的用水性缓冲剂进行重构的疫苗和在油包粉末型疫苗 中(组2)的反应相同，而仅仅用非水性赋形剂进行注射的对照动物 (组4和5)并没有表现出反应。
优选实施方案的描述
实施例1：
在PFC中的喷雾干燥的颗粒
颗粒是用Labplant SD 1型喷雾干燥机，用糖和其它的赋形剂， 通过将水性溶液进行喷雾干燥来进行制备的。典型的制剂是：
A.甘露醇            15％w/v
  乳酸钙            15％w/v
  在水中
B.海藻糖            15％w/v
  磷酸钙            15％w/v
  在水中
用具有0.5mm内径的液体孔的两个流体喷头来制备该颗粒。发 现最大喷嘴气流量的一半是最佳的，并且在135℃的入口温度和70-75 ℃的出口温度的条件下来对干燥室进行操作。用玻璃旋流来收集颗 粒，并且通过在4小时内将温度逐渐升至80℃而在真空中将其进行第 二次干燥。一旦冷却，用超声将其混悬于PFC中。发现在MSE MK 2 超声室中用钛探针在约75％的功率下进行操作以提供30秒钟突发的 超声能量或浸入到Decon FS200 Frequency清扫超声浴中进行高至10 分钟的操作就足够了。
所得的混悬液是单分散的并且通过显微镜观察，其由约0.5至30 μm粒度范围的球形玻璃颗粒所组成，其平均粒度约为10μm。甘露 醇/乳酸钙颗粒在几分钟内就升至该PFC层的顶端，但是通过轻轻地 振摇其就可以很容易的被重新分散。海藻糖/磷酸钙颗粒的密度基本与 PFC相配并且形成了稳定的混悬液。
以1、10、20和40％w/v的浓度将糖玻璃颗粒的喷雾干燥的粉末 混悬于全氟己烷、全氟萘烷和全氟菲中。发现它们都能获得几乎不会 发生聚集情况的单分散的混悬液。向该PFC中加入0.1％的全氟癸酸 可以抑制在表面上所发生的任何轻微的聚集趋势。发现这些混悬液通 过吸入或喷出可以容易的通过25g针。
实施例2：
在PFC中玻璃稳定化的酶的混悬液的稳定性
如上所述的那样用Labplant机器来喷雾干燥碱性磷酸酯酶(Sigma Aldrich Ltd.)。该制剂包含甘露醇33.3％w/w、磷酸钙33.3％w/w和 降解的明胶(Byco C，Croda colloids Ltd.)33.3％。将该干燥的酶以干粉 末的形式或在全氟萘烷中的混悬液的形式储存在55℃下。在55℃下 放置的时间高于30天时，所制备的这些微球中的酶表现出的酶活性 仍然接近100％，其中所说的微球由被混悬于全氟萘烷中的以甘露醇 为基础的玻璃所组成(图1)。
实施例3：
体内效力
与国家生物标准品和对照品协会(经过了世界卫生组织认可的实 验室)一起进行了类似制剂的临床前试验，其中所说的类似制剂包含临 床破伤风类毒素疫苗(由Medeva plc友情提供)。该试验的结果表明 该稳定的STASIS制剂使豚鼠免疫形成保护性的血清抗体反应的能力 完全等于以水为基础的液体疫苗(图2)。这证实在PFC中的混悬液可 形成一种在体内具有与常规的与水为基础的液体制剂相同的生物利用 度的备注射的制剂。
实施例4：
喷雾冷冻干燥的颗粒
该颗粒也通过将液体小滴喷入到液氮中，然后将该冷冻的粉末在 真空中进行干燥来进行制备。这些颗粒比喷雾干燥的颗粒的密度低一 些，并且在浓度高于20％w/v时在PFC中形成糊状物。在较低的浓度 下，它们在超声后可形成单分散的混悬液。
所用的典型制剂是：
物质            终浓度w/w
A.海藻糖        100％
B.海藻糖        50％
磷酸钙          49.5％
氢氧化铝        0.5％
实施例5：
研磨的疏水颗粒
当从熔化状态骤冷或从氯仿或二氯甲烷的溶液中被快速干燥时， 疏水的糖衍生物蔗糖八醋酸酯和海藻糖八醋酸酯易于形成玻璃。已经 对它们作为药物传递的控释基质的应用进行了描述(Roser等人“用于 其中所加入的分子的控释的固体传递系统以及其制备方法”公开号为 WO 96/03978的PCT申请，1994)。
海藻糖八醋酸酯粉末可以通过在马弗炉中进行熔化然后在不锈钢 板上将该熔化物骤冷来进行制备。用研棒和研钵将所得的玻璃片进行 研磨，然后用高速匀浆机对其进行处理以将其制备成一种细粉。以1 和10％w/v的浓度将该粉末混悬于全氟己烷、全氟萘烷和全氟菲中。 发现它们都可以给出分散良好的混悬液。发现这些混悬液可以很容易 的通过23g针。
实施例6：
在水性环境中的重构
因为可溶性糖玻璃颗粒的本性和PFC的性质，可预见到在这些 混悬液中的活性成分在机体内将会迅速释放。为了证明所包含的活性 成分的完全释放，将颗粒制备成包含：
海藻糖                20％w/v
乳酸钙                20％w/v
赖氨酸                0.5％w/v
媒染剂Blue 9染料      1％w/v
用如上的方法将该制剂进行喷雾干燥，然后将其加入到全氟菲和 全氟萘烷中制成20％w/v的深蓝色不透明的混悬液。在加入与混悬 液体积相等的水并进行振摇后，发现实际上所有的蓝色染料都被释放 到了水相中，形成了一种漂浮在几乎无色的PFC上的澄清的蓝色层， 二者之间具有十分清楚的明显介面。
实施例7：
在混悬液中的颗粒间不具有反应活性
因为在PFC混悬液中的各个微球在物理上是与所有其它的颗粒 相互隔离的，所以可能会发生反应的物质可以共存于相同混悬液的不 同颗粒中而不会有任何相互作用的危险。当该糖玻璃被溶解时，这些 分子可以碰面，发生反应。
为了证明这一点，制备一种包含两种类型颗粒的混悬液，一种(a) 为酶——碱性磷酸酯酶，另一种(b)为其无色的底物，磷酸对硝基苯。
制剂是：
a)海藻糖              10％w/v
  硫酸钠              10％w/v
  碱性磷酸酯酶        20U/ml
  在5mM Tris/HCl缓冲剂(pH 7.6)中
b)海藻糖              10％w/v
  硫酸钠              10％w/v
  磷酸对硝基苯        0.44％w/v
  在包含1mM氯化锌和1mM氯化镁的100mM甘氨酸缓冲
  剂(pH 10.2)中
发现包含10％w/v的粉末“a”和10％w/v的粉末“b”的全氟 萘烷中粉末混悬液在37℃下放置3星期时没有形成任何颜色反应，而 仍然是白色的混悬液。
加入水并进行振摇后，则该粉末溶解于上面的水相中。在几分钟 内发生酶反应，出现对-硝基苯酚的正黄色，在新制备的样品中和在37 ℃下放置3星期的样品中都会出现这种情况。
实施例8：
在“组织空间”模型中的产品释放
为了解释当注射到体内时PFC混悬液可能会发生的行为，制备 一种模型——透明的水合组织空间，这种模型是通过在聚苯乙烯小瓶 子中移堆0.2％的琼脂糖凝胶来进行制备的。将0.1ml实施例5的全氟 萘烷混悬液用25g针注射到该琼脂糖凝胶中。这样就形成了一个扁平 的混悬液的白色的球。在接下来的5-10分钟，该白色从球的底部开始 变得澄清，向上进行，之后剩下一个澄清的PFC球。因为酶和底物由 于该玻璃颗粒的溶解而被释放出来，所以它们彼此进行反应而产生了 黄色的对硝基苯酚，然后在接下来的1小时中其在整个琼脂糖内进行 扩散。
实施例9：
密度匹配
通过两种常规的干燥法中的任何一种方法所获得的糖玻璃颗粒 (即海藻糖)一般具有约1.5g/cm3的密度。我们所测试的全氟化碳的密 度一般为1.68至2.03g/cm3(表I)。为此，当被制备成混悬液时，糖 玻璃颗粒倾向于漂浮到PFC层的上面，这样就会产生一种活性成分不 能均匀分布的制剂。但是，为了制备出一种在PFC中的稳定的混悬液， 可以对粉末进行改性，在这种混悬液中这些粉末具有适中的浮力，既 不下沉又不上浮。其可以通过在颗粒形成之前向其中加入高密度的物 质来实现。这些高密度的物质可以是水溶性的或水不溶性的。
非水溶性物质
密度为3.14g/cm3的正磷酸三钙被批准用作疫苗的佐剂并且实际 上不溶于水。所制备的包含约50％磷酸钙的粉末表现出密度增加，其 密度约为2g/cm3，并且以20％的固态量在全氟菲中形成稳定的混悬 液。
在PFC中，在20％的固体量时形成稳定的混悬液的粉末的实例 包括：
1 在全氟萘烷中
  物质          终浓度w/w
A.海藻糖        50％
  磷酸钙        50％
B.海藻糖        47.5％
  乳酸钙        10.0％
  磷酸钙        42.5％
2 在全氟菲中：
  物质          终浓度w/w
  甘露醇        18.2％
  肌醇          18.2％
  乳酸钙        18.2％
  磷酸钙        45.4％
一直被用于增加密度的其它的非水溶性物质包括硫酸钡和二氧化 钛。可以使用任何具有适宜密度的无毒并不溶的物质。
水溶性物质
水溶性盐如具有2.7g/cm3密度的硫酸钠也可以被用作密度增强 剂。下面的粉末在全氟萘烷中可形成稳定的混悬液：
物质          终浓度w/w
海藻糖        50％
硫酸钠        50％
还可以使用其它无毒的高密度的水溶性物质。已经发现这些制剂 在对豚鼠进行皮下注射后可以造成不适，这可能是因为高浓度的离子 盐的迅速溶解所造成的。
实施例10：
密度匹配对混悬液中的活性物质的作用
某些疫苗被制备成吸附到作为佐剂的不溶性凝胶或颗粒上的形 式。氢氧化铝和磷酸钙被广泛的用于这种目的。这些不溶性的佐剂它 们本身就可以被用于增加被混悬的颗粒的密度。在这种情况中，高密 度的物质不是完全惰性的，而是实际上可以从溶液中吸附活性高分 子。必须证明这种吸附不足以改变该活性。为了对这一点进行试验， 用碱性磷酸酯酶作为模型的活性物质/疫苗。
制备如下的溶液：
佐剂等级的磷酸钙    10％w/v    (Superphos Kemi a/s)
海藻糖              10％w/v
ZnCl2               1mM
MgCl2               1mM
碱性磷酸酯酶        20U/ml
在5mM Tris HCl缓冲液(pH 7.6)中
然后将该溶液在37℃下充分混合10分钟以使得该碱性磷酸酯酶 被吸附到磷酸钙上。通过将磷酸钙进行离心，对上清液进行取样，在 405nm的波长下用底物——磷酸对硝基苯来测定其酶动力学来测定每 分钟的吸收度改变值。将该溶液进行喷雾干燥，获得一种细粉。用上 述方法，在上清液中对该粉末再水化后该酶的任何解吸作用进行测 定。以20％w/v的浓度将该粉末混悬于全氟菲中，发现可以形成一种 稳定的混悬液。
试验样品                    d吸收度/分钟(405nm)
初始溶液(25μl)             0.409
如上所得的上清液(25μl)                 0.034
再水化的粉末(25μl，20％w/v，在水中)    0.425
如上所得的上清液(25μl)                 0.004
20％w/v的在全氟萘烷中的粉末(25μl)      0.430
该实验证明：
通过包含辅助的磷酸钙，颗粒的密度可以与PFC载体的密度相 匹配。
在制剂过程中没有发生显著的解吸或酶活性损失。
实施例11：
将实施例1的甘露醇基玻璃的STASIS制剂混悬于全氟萘烷中， 然后将其填充到一种手术上清洁的、泵作用的聚丙烯喷雾器中，这种 喷雾器在临床上通常被用来传递羟甲唑啉鼻用减充血剂(Sudafed， Warner Lambert)。将该混悬液的两股喷雾分别传递到人类志愿者的两 个鼻孔中，已要求这些志愿者对不适感的程度进行评估。志愿者报告 根本没有不适。给药后没有观察到副作用。
本申请为中国专利申请No.00819965.5(PCT/US00/28244)的分 案申请。