环境监测及生物探勘的方法及仪器转让专利
申请号 : CN200480006698.2
文献号 : CN100595280C
文献日 : 2010-03-24
发明人 : R·U·海登
申请人 : 约翰霍普金斯大学
摘要 :
本发明关于一种环境监测及生物探勘的方法，包括下列步骤：(a)利用一种测试装置，该装置具有：(i)具有流体入口(12)及出口(14)的容器(10)，(ii)设置在该容器中的多个毛细管微观环境(16)，毛细管微观环境各具有经配置成容许流体流经该多个毛细管微观环境的入口(18)及出口(20)，且各毛细管微观环境还具有覆盖其入口及出口的构件，以防止流体流经该毛细管微观环境，(iii)连接于该容器入口的泵(40)，该泵(40)配置成能使流体从周围环境抽入容器入口，并使其通过毛细管微观环境(16)，(iv)连接于该容器出口并用于收集通过该容器的流体的构件，及(v)连接于该容器下游的止回阀(44)，以防止流体逆流进入该容器；(b)添加特定受试物质于该装置的毛细管微观环境(16)中，其中该物质加速受试环境的特定生物转化过程的能力将予以分析；(c)将此装置(1)设置在环境中并打开毛细管微观环境覆盖构件以容许流体从周围环境流经该容器及毛细管微观环境；(d)将该装置留在原位一段时间，该时间足以在该毛细管微观环境(16)中蕴育现象的发生；(e)取回该测试装置(1)，以及(f)使用自动化分析方法及市售的机械分析在该毛细管微观环境(16)中发生的现象。
权利要求 :
1.一种环境监测及生物探勘特定环境中微生物的方法，该方法包含下列步骤：将测试装置(1)放置于该环境中，其中该装置包括：
其中，具有流体入口(12)及出口(14)的容器(10)，该容器经建构成置入该环境、 在该环境中使用及自该环境取回；
位于该容器中的多个毛细管微观环境(16)，每一个毛细管微观环境具有毛细 管入口(18)及出口(20)，且该入口(18)及出口(20)经配置成容许流体流经该毛 细管微观环境(16)，每一个毛细管微观环境还具有覆盖该毛细管入口(18)及 出口(20)的构件，以阻止流体流经该毛细管微观环境；
在毛细管微观环境的至少一根中置入收集微生物的构件，以允许流体从周 围环境流经该毛细管微观环境时协助收集该周围环境原有的微生物；
打开该毛细管微观环境的覆盖构件以让流体从周围环境流经该容器及毛细管微 观环境；
让该装置(1)留在该环境中一段时间，该时间足以使欲研究的现象在该毛细管微 观环境(16)中发生；
取回该测试装置(1)；以及
分析在该毛细管微观环境(16)中发生的现象。
2.如权利要求1所述的方法，其中该装置(1)还包括与该容器连接的泵(40)，该泵经配 置成能使流体从该周围环境流入该容器入口(18)及通过该毛细管微观环境；收集流经 该毛细管微观环境的流体的构件；以及与该容器的下游连接的止回阀(44)，以防止该 流体回流入该容器(10)中。
3.如权利要求1所述的方法，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成允许使用市售 机械自动分析该毛细管微观环境。
4.如权利要求2所述的方法，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成允许使用市售 机械自动分析该毛细管微观环境。
5.如权利要求1所述的方法，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成为迅速交换的 微量滴定盘的形式。
6.如权利要求2所述的方法，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成为迅速交换的 微量滴定盘的形式。
7.如权利要求5所述的方法，其中该微量滴定盘的内容物经冷冻干燥及真空密封。
8.如权利要求6所述的方法，其中该微量滴定盘的内容物经冷冻干燥及真空密封。
9.如权利要求1所述的方法，还包含下列步骤：
在放置该装置(1)之前，在该毛细管微观环境(16)的至少一者中置入含有特定受试 物质的构件，该特定受试物质扩散入流经该毛细管微观环境的流体中。
10.如权利要求2所述的方法，还包含下列步骤：
在放置该装置(1)之前，在这种毛细管微观环境(16)的至少一者中置入含有特定受 试物质的构件，该特定受试物质扩散入流经该毛细管微观环境的流体中。
11.如权利要求3所述的方法，还包含下列步骤：
在放置该装置(1)之前，在该毛细管微观环境(16)的至少一者中置入含有特定受试 物质的构件，该特定受试物质扩散入流经该毛细管微观环境的流体中。
12.如权利要求4所述的方法法，还包含下列步骤：
在放置该装置(1)之前，在该毛细管微观环境(16)的至少一者中置入含有特定受试 物质的构件，该特定受试物质扩散入流经该毛细管微观环境的流体中。
13.一种用于环境监测及生物探勘特定环境中的微生物的测试装置(1)，该装置包含：提供多个物理性分离的毛细管微观环境(16)的构件，其中该毛细管微观环境(16) 经配置成允许流体流经该毛细管微观环境；
当该毛细管微观环境(16)经置入该环境中时收容及保护该毛细管微观环境(16)的 构件，该构件还使来自周围环境的流体流入及流经该毛细管微观环境(16)；以及覆盖通过该毛细管微观环境(16)的流体流通道的构件，以致调节通过该毛细管微 观环境的流量。
14.如权利要求13所述的测试装置(1)，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成允许 使用市售机械自动分析该多个毛细管微观环境。
15.如权利要求13所述的测试装置(1)，其还包含：
使流体从该周围环境流经该毛细管微观环境(16)的构件，收集及保留流经该毛细管微观环境(16)的该流体的构件；以及在该毛细管微观环境的下游以防该流体回流入该毛细管微观环境(16)的构件。
16.如权利要求14所述的测试装置(1)，其还包含：
使流体从该周围环境流经该毛细管微观环境(16)的构件，收集及保留流经该毛细管微观环境(16)的该流体的构件；以及在该毛细管微观环境的下游以防该流体回流入该毛细管微观环境(16)的构件。
17.如权利要求13所述的测试装置(1)，其还包含在该毛细管微观环境(16)的至少一者 中经配置成促进收集进入该毛细管微观环境的该微生物的构件。
18.如权利要求14所述的测试装置(1)，其还包含在该毛细管微观环境(16)的至少一者 中经配置成促进收集进入该毛细管微观环境的该微生物的构件。
19.如权利要求15所述的测试装置(1)，其还包含在该毛细管微观环境(16)的至少一者 中经配置成促进收集进入该毛细管微观环境的该微生物的构件。
20.如权利要求16所述的测试装置(1)，其还包含在该毛细管微观环境(16)的至少一者 中经配置成促进收集进入该毛细管微观环境的该微生物的构件。
21.如权利要求13所述的测试装置(1)，其中该毛细管微观环境(16)的至少一者中置入 含有特定受试物质的构件，且该特定受试物质扩散入流经该毛细管微观环境的流体 中。
22.如权利要求14所述的测试装置(1)，其中该毛细管微观环境(16)的至少一者中置入 含有特定受试物质的构件，且该特定受试物质扩散入流经该毛细管微观环境的流体 中。
23.如权利要求15所述的测试装置(1)，其中该毛细管微观环境(16)的至少一者中置入 含有特定受试物质的构件，且该特定受试物质扩散入流经该毛细管微观环境的流体 中。
24.如权利要求16所述的测试装置(1)，其中该毛细管微观环境(16)的至少一者中置入 含有特定受试物质的构件，且该特定受试物质扩散入流经该毛细管微观环境的流体 中。
25.如权利要求13所述的测试装置(1)，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成为迅 速交换的微量滴定盘的形式。
26.如权利要求14所述的测试装置(1)，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成为迅 速交换的微量滴定盘的形式。
27.如权利要求15所述的测试装置(1)，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成为迅 速交换的微量滴定盘的形式。
28.如权利要求16所述的测试装置(1)，其中该多个毛细管微观环境(16)经配置成为迅 速交换的微量滴定盘的形式。
29.如权利要求25所述的的测试装置(1)，其中该微量滴定盘的内容物经冷冻干燥及 真空密封。
30.如权利要求26所述的测试装置(1)，其中该微量滴定盘的内容物经冷冻干燥及真 空密封。
31.如权利要求27所述的测试装置(1)，其中该微量滴定盘的内容物经冷冻干燥及真 空密封。
32.如权利要求28所述的测试装置(1)，其中该微量滴定盘的内容物经冷冻干燥及真 空密封。
33.如权利要求13所述的测试装置(1)，还包含一遥控构件，以遥控该覆盖微观环境 流体信道的构件的操作。
34.如权利要求14所述的测试装置(1)，还包含一遥控构件，以遥控该覆盖该微观环 境流体信道的构件及该使流体流经该毛细管微观环境(16)的构件的操作。
35.如权利要求15所述的测试装置(1)，还包含一遥控构件，以遥控该覆盖微观环境 流体信道的构件的操作。
36.如权利要求16所述的测试装置(1)，还包含一遥控构件，以遥控该覆盖该微观环 境流体信道的构件及该使流体流经该毛细管微观环境(16)的构件的操作。
说明书 :
技术领域
本发明是关于环境及生物现象的量测及试验。更特定而言，本发明是关于环境监 测及生物探勘的方法及仪器。
背景技术
生物复育或者生物修复(bioremediation)是有效而并不昂贵的生物技术，其用以从 被污染的环境中除去有机及无机的污染物。当锁定溶解的金属及放射核素作为标的 时，其目标为将水溶性毒性物种转化为不溶性、较低毒性的产物。例如，铀可经由注 射碳源，刺激微生物诱导的「使溶解的U(VI)以不溶性U(IV)的形式沉淀」，而从遭污 染的地下水除去及固定于地表下。在此情况下，污染物经原位处理，而此方法则称为 「原位生物修复」。
当设计原位生物修复策略时，必须了解存在于特定清理处的地表下微生物群落的 类型、活性及营养需求。为了使主管机关及利害关系人确信污染物是经移除(或者， 在金属的情况中，金属成功地固定于地表下)而非稀释或分散于地下水，微生物群落 信息亦甚为重要。
目前，在指定场址的生物修复可行性的评估颇为耗费劳力及成本。实施生物修复 的典型手段包括下列两步骤：(1)在实验室中进行微观环境筛选研究，以测定固有 (intrinsic)生物修复的程度，并鉴定所需的碳源注射的类型、数量及频率以加速原位(in situ)生物修复的过程；这等实验亦适用于估计污染物的移除速率，然而由于实验室的 「瓶装效应(bottle effect)」所造成的偏差，故无法正确地反映原位移除速率；及(2)从 微观环境及现场样本得到微生物群落变化图，以测定该主导所需生物转化反应的微生 物种类；由于大部分微生物无法在实验室的培养基中生长，因此通常使用非培养性归 类技术(culture-independent profiling techniques)(例如基于16SrDNA的分析)。
地下水为习用追踪微生物群落的较佳样本基质(matrix)，因其易于取得且不昂贵。 不过，特定目标微生物的生活方式对于是否能在此基质中检测出该微生物则是一项严 厉考验。在极端的情况，整个生存期间皆采取固着(sessile)生活方式的目标微生物， 即使以极高密度存在，亦不可能在该处地下水中被检测出。因此，只做地下水监测可 能无法正确地反映微生物群落组成及地表下环境生态。近来，再度发现固相取样器为 克服部分这种限制的有用工具。
固相取样器，以最简单的构形而言，不过是一个物理表面，该表面在目标环境中 培育一段足够长的时间，以让微生物群聚。掩埋或沉浸的载玻片曾被广泛地用于搜集 来自土壤、生物反应器及其它环境的微生物。取回这种取样器后，将微生物萃取，并 借由检测生物标记(包括DNA、磷脂质、脂肪酸及呼吸性醌(respiratory quinone))进行 鉴定。「使用固相取样器收集的微生物比得自地下水取样者更能代表代谢活性的微生 物群落」仍有争议，因为取样装置需由待收集的微生物予以活性物理附着。然而，死 亡的微生物、细胞碎片及DNA亦可能被捕捉。高度灵敏工具(例如聚合酶连锁反应， PCR)可检测出非存活物质中的生物标记以及代谢活性微生物群落成员的生物标记。
近来，曾使用安定同位素标记来区分代谢活性微生物与休眠或非活动者。安定同 位素探针(SIP)发掘出依靠富含碳-13的碳源生长的微生物的DNA将被13C标记(较 重)，因此经由密度梯度离心可从总群落DNA中解析其DNA。然而，安定同位素探 针虽为一种有效的研究工具，但应用在日常生物监测的潜力有限，因为这项技术非常 耗时且费人力。
一种鉴定微生物的替代途径为寻求基因表达产物(例如蛋白质)，而非其的特有 DNA序列。此法可借由使用最新一代质谱仪器而进行，该质谱仪能提供足够速度与 灵敏度，而且分析过程可完全自动化。
基质辅助雷射脱附游离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱(MS)具有诱使蛋白质生物标 记从完整细菌、真菌、孢子及病毒脱附的能力，提供有效且快速射出的技术，以进行 快速、可携带及牢靠的微生物鉴定。MALDI-TOF-MS技术非常快速(每件样本分析时 间＜5分钟)，样本体积需求低(＜1mL)，且具有鉴定微生物的通用能力。
近来机械装置已与MALDI-TOF仪器整合，以提供这种分析技术的自动化。最新 一代市售的机械容许样本制备及分析全自动化，包括2D凝胶的制备及显像，蛋白质 点的收集及消化，及将消化物应用于多样本MALDI-TOF分析目标。
该领域中除所有先前技艺之外，对于改良的试验方法及仪器仍有需求。例如，可 将上述技术整合以致能以单一步骤、较低成本的方法同时提供微生物群落全貌及微观 环境筛选研究的方法及技术，将对此领域有莫大的贡献。理想上该经充分研发的方法 及技术将可得到下列信息：存在的微生物为何种类型？何者为存活且具有代谢活性？ 应使用何种养分类型及养分剂量来加速生物修复？以及原位生物修复将产生何种结 果？
这种新颖方法及技术亦必须证实在其它原位应用上十分有用，例如可应用在饱和 土层(saturated media)的生物探测方面(例如发现新颖微生物、生化反应及天然产物)。 由于咸认为只有约少于百分的一的环境微生物能在实验室环境中生长及发挥机能，因 此原位探勘微生物的新方法及工具将可有效地打开窥探大部分未知微生物世界的研 究大门。
这种发明的理论基础为：既然大部分微生物无法耐受从其等的天然栖息地迁移到 实验室中，因此便将实验室搬到微生物世界中。本发明的贡献在于借由加速新颖微生 物、酶及代谢方法的发现，而同时助益人类及环境的健康。
本发明人一直从事此技术领域的研究，并致力于开发改良方法。许多其早期研究 被应用于本文所述的方法。其中大部分作品已被整理成科学文献。例如，参照：Franklin， M.P.、V.Madrid、S.Gregory及R.U.Halden，「在DOE超级基金资助地对于微生物群 落媒介的TCE经由固有还原脱氯作用转变为顺-DCE的空间分析」，发表于第103届 ASM大会，美国华盛顿特区，2003年5月18-22日；Halden，R.U.、B.G.Halden及 D.F.Dwyer，「从培育鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas)属WR1株的土壤除去二苯并呋喃 (dibenzofuran)、二苯并-p-二噁英(dibenzo-p-dioxin)及2-氯二苯并二噁英」，Appl. Environ.Microbiol.，65：2246-2249(1999)；Halden，R.U.、E.G.Peters、B.G.Halden及 D.F.Dwyer，「借由假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)POB310及改质二 芳基醚代谢性细菌中的苯氧基苯甲酸酯-加双氧酶(phenoxybenzoate-dioxygenase)所 进行的单-及二氯化苯氧基苯甲酸酯的转变」，Biotechnol.Bioeng.，69：107-112(2000)； Halden，R.U.、S.M.Tepp、B.G.Halden及D.F.Dwyer，「借由假产碱假单胞菌 POB310(pPOB)于土壤中进行3-苯氧基苯甲酸的降解」，Appl.Environ.Microbiol.，65： 3354-3359(1999；Colquhoun，D.、E.S.Wisniewski、D.A.Kalmykov，及R.U.Halden，「使 用质谱经由二氧(杂)芑(Dioxin)加双氧酶鉴定威氏鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas wittichii)RW1」，美国微生物协会第104届大会，纽奥良，路易斯安那州(美国)，2004 年5月23-27日；Halden，R.U.、R.N.Cole、C.Bradford、D.Chen及K.J.Schwab，「使 用MALDI-TOF MS及ESI-MS/MS快速测定诺沃克病毒(Norwalk virus)类的粒子」，美 国质谱协会第51届大会，加拿大魁北克省蒙特利尔，2003年6月8-12日， http://www.inmerge.com/aspfolder/ASMSSchedule2.asp；Lowe，M.、E.L.Madsen、K. Schindler、C.Smith、S.Emrich、F.Robb及R.U.Halden，「被三氯乙烯污染的超级基 金资助地于经历固有原位还原脱氯作用处理后的地球化学及微生物多样性」，FEMS Microbiology Ecology，40：123-134(2002)；Vancheeswaran，S.、R.U.Halden、K.J. Williamson、J.D.Ingle及L.Semprini，「借由四丁氧基硅烷-降解性微生物驱动的四烷 氧基硅烷及三氯乙烯/顺-1，2-二氯乙烯共代谢的非生物性及生物性转变」，Environ.Sci. Technol，33：1077-1085(1999)；及Vancheeswaran，S.、S.H.Yu、P.Daley、R.U.Halden、 K.J.Williamson、J.D.Ingle及L.Semprini，「借由以四烷氧基硅烷作为共污染物而驱动 的固有三氯乙烯复育：微观环境及现场研究的结果」，Remediation，13/14：7-25(2003)。 兹将这种作品的教示及揭示内容以参考文献方式纳入本文。
目的及优点
如以上摘述，广泛地说明与本发明相关的先前技术，其目的在于在使本发明的内 容更易了解及认同。在这方面，亦启示性地考虑本发明的目的及优点。
本发明的目的之一为提供一种环境监测及生物探勘的较低成本改良方法。
本发明的另一目的为提供一种改良的生物修复评估方法及工具，其可更有效地协 助被污染场址的环境复原及长期管理。
本发明的又一目的为提供一种改良的生物修复评估方法及工具，其可对生物修复 场址进行自动化、大规模及高通量(high-throughput)的分析。
本发明的再一目的为提供一种监测方法、工具及分析策略，以对下列参数进行自 动化、快速及同步测定：(1)流体品质及毒性，(2)固有生物修复潜力，(3)营养补充后 加速生物修复的潜力，(4)有效的生物强化策略以净化环境，(5)天然化合物及环境污 染物在自然及强化条件下的转变(turnover)速率，(6)原位DNA合成及蛋白质表达，(7) 在自然及改变的环境条件下原产及引进的生物因子的原位生长/死亡速率及代谢活 性，(8)天然环境固有的微生物群落的结构及动力性质，及(9)具有生物技术潜在利用 价值的微生物的特征及活性。
本发明的一目的为提供一种可用于评估非原产微生物、致病菌及基因工程微生物 释出至自然环境所造成的潜在风险的监测方法及工具。
本发明的另一目的为提供一种具有发现医药工业及生物技术范畴相关的微生物、 酶及天然产物的潜在价值的方法及工具。
借由参考以下所附的摘要说明、图式及详细说明，将更易了解本发明，且本发 明的这种(及其它)目的及优点亦将变得十分明显。
当设计原位生物修复策略时，必须了解存在于特定清理处的地表下微生物群落的 类型、活性及营养需求。为了使主管机关及利害关系人确信污染物是经移除(或者， 在金属的情况中，金属成功地固定于地表下)而非稀释或分散于地下水，微生物群落 信息亦甚为重要。
目前，在指定场址的生物修复可行性的评估颇为耗费劳力及成本。实施生物修复 的典型手段包括下列两步骤：(1)在实验室中进行微观环境筛选研究，以测定固有 (intrinsic)生物修复的程度，并鉴定所需的碳源注射的类型、数量及频率以加速原位(in situ)生物修复的过程；这等实验亦适用于估计污染物的移除速率，然而由于实验室的 「瓶装效应(bottle effect)」所造成的偏差，故无法正确地反映原位移除速率；及(2)从 微观环境及现场样本得到微生物群落变化图，以测定该主导所需生物转化反应的微生 物种类；由于大部分微生物无法在实验室的培养基中生长，因此通常使用非培养性归 类技术(culture-independent profiling techniques)(例如基于16SrDNA的分析)。
地下水为习用追踪微生物群落的较佳样本基质(matrix)，因其易于取得且不昂贵。 不过，特定目标微生物的生活方式对于是否能在此基质中检测出该微生物则是一项严 厉考验。在极端的情况，整个生存期间皆采取固着(sessile)生活方式的目标微生物， 即使以极高密度存在，亦不可能在该处地下水中被检测出。因此，只做地下水监测可 能无法正确地反映微生物群落组成及地表下环境生态。近来，再度发现固相取样器为 克服部分这种限制的有用工具。
固相取样器，以最简单的构形而言，不过是一个物理表面，该表面在目标环境中 培育一段足够长的时间，以让微生物群聚。掩埋或沉浸的载玻片曾被广泛地用于搜集 来自土壤、生物反应器及其它环境的微生物。取回这种取样器后，将微生物萃取，并 借由检测生物标记(包括DNA、磷脂质、脂肪酸及呼吸性醌(respiratory quinone))进行 鉴定。「使用固相取样器收集的微生物比得自地下水取样者更能代表代谢活性的微生 物群落」仍有争议，因为取样装置需由待收集的微生物予以活性物理附着。然而，死 亡的微生物、细胞碎片及DNA亦可能被捕捉。高度灵敏工具(例如聚合酶连锁反应， PCR)可检测出非存活物质中的生物标记以及代谢活性微生物群落成员的生物标记。
近来，曾使用安定同位素标记来区分代谢活性微生物与休眠或非活动者。安定同 位素探针(SIP)发掘出依靠富含碳-13的碳源生长的微生物的DNA将被13C标记(较 重)，因此经由密度梯度离心可从总群落DNA中解析其DNA。然而，安定同位素探 针虽为一种有效的研究工具，但应用在日常生物监测的潜力有限，因为这项技术非常 耗时且费人力。
一种鉴定微生物的替代途径为寻求基因表达产物(例如蛋白质)，而非其的特有 DNA序列。此法可借由使用最新一代质谱仪器而进行，该质谱仪能提供足够速度与 灵敏度，而且分析过程可完全自动化。
基质辅助雷射脱附游离(MALDI)飞行时间(TOF)质谱(MS)具有诱使蛋白质生物标 记从完整细菌、真菌、孢子及病毒脱附的能力，提供有效且快速射出的技术，以进行 快速、可携带及牢靠的微生物鉴定。MALDI-TOF-MS技术非常快速(每件样本分析时 间＜5分钟)，样本体积需求低(＜1mL)，且具有鉴定微生物的通用能力。
近来机械装置已与MALDI-TOF仪器整合，以提供这种分析技术的自动化。最新 一代市售的机械容许样本制备及分析全自动化，包括2D凝胶的制备及显像，蛋白质 点的收集及消化，及将消化物应用于多样本MALDI-TOF分析目标。
该领域中除所有先前技艺之外，对于改良的试验方法及仪器仍有需求。例如，可 将上述技术整合以致能以单一步骤、较低成本的方法同时提供微生物群落全貌及微观 环境筛选研究的方法及技术，将对此领域有莫大的贡献。理想上该经充分研发的方法 及技术将可得到下列信息：存在的微生物为何种类型？何者为存活且具有代谢活性？ 应使用何种养分类型及养分剂量来加速生物修复？以及原位生物修复将产生何种结 果？
这种新颖方法及技术亦必须证实在其它原位应用上十分有用，例如可应用在饱和 土层(saturated media)的生物探测方面(例如发现新颖微生物、生化反应及天然产物)。 由于咸认为只有约少于百分的一的环境微生物能在实验室环境中生长及发挥机能，因 此原位探勘微生物的新方法及工具将可有效地打开窥探大部分未知微生物世界的研 究大门。
这种发明的理论基础为：既然大部分微生物无法耐受从其等的天然栖息地迁移到 实验室中，因此便将实验室搬到微生物世界中。本发明的贡献在于借由加速新颖微生 物、酶及代谢方法的发现，而同时助益人类及环境的健康。
本发明人一直从事此技术领域的研究，并致力于开发改良方法。许多其早期研究 被应用于本文所述的方法。其中大部分作品已被整理成科学文献。例如，参照：Franklin， M.P.、V.Madrid、S.Gregory及R.U.Halden，「在DOE超级基金资助地对于微生物群 落媒介的TCE经由固有还原脱氯作用转变为顺-DCE的空间分析」，发表于第103届 ASM大会，美国华盛顿特区，2003年5月18-22日；Halden，R.U.、B.G.Halden及 D.F.Dwyer，「从培育鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas)属WR1株的土壤除去二苯并呋喃 (dibenzofuran)、二苯并-p-二噁英(dibenzo-p-dioxin)及2-氯二苯并二噁英」，Appl. Environ.Microbiol.，65：2246-2249(1999)；Halden，R.U.、E.G.Peters、B.G.Halden及 D.F.Dwyer，「借由假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)POB310及改质二 芳基醚代谢性细菌中的苯氧基苯甲酸酯-加双氧酶(phenoxybenzoate-dioxygenase)所 进行的单-及二氯化苯氧基苯甲酸酯的转变」，Biotechnol.Bioeng.，69：107-112(2000)； Halden，R.U.、S.M.Tepp、B.G.Halden及D.F.Dwyer，「借由假产碱假单胞菌 POB310(pPOB)于土壤中进行3-苯氧基苯甲酸的降解」，Appl.Environ.Microbiol.，65： 3354-3359(1999；Colquhoun，D.、E.S.Wisniewski、D.A.Kalmykov，及R.U.Halden，「使 用质谱经由二氧(杂)芑(Dioxin)加双氧酶鉴定威氏鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas wittichii)RW1」，美国微生物协会第104届大会，纽奥良，路易斯安那州(美国)，2004 年5月23-27日；Halden，R.U.、R.N.Cole、C.Bradford、D.Chen及K.J.Schwab，「使 用MALDI-TOF MS及ESI-MS/MS快速测定诺沃克病毒(Norwalk virus)类的粒子」，美 国质谱协会第51届大会，加拿大魁北克省蒙特利尔，2003年6月8-12日， http://www.inmerge.com/aspfolder/ASMSSchedule2.asp；Lowe，M.、E.L.Madsen、K. Schindler、C.Smith、S.Emrich、F.Robb及R.U.Halden，「被三氯乙烯污染的超级基 金资助地于经历固有原位还原脱氯作用处理后的地球化学及微生物多样性」，FEMS Microbiology Ecology，40：123-134(2002)；Vancheeswaran，S.、R.U.Halden、K.J. Williamson、J.D.Ingle及L.Semprini，「借由四丁氧基硅烷-降解性微生物驱动的四烷 氧基硅烷及三氯乙烯/顺-1，2-二氯乙烯共代谢的非生物性及生物性转变」，Environ.Sci. Technol，33：1077-1085(1999)；及Vancheeswaran，S.、S.H.Yu、P.Daley、R.U.Halden、 K.J.Williamson、J.D.Ingle及L.Semprini，「借由以四烷氧基硅烷作为共污染物而驱动 的固有三氯乙烯复育：微观环境及现场研究的结果」，Remediation，13/14：7-25(2003)。 兹将这种作品的教示及揭示内容以参考文献方式纳入本文。
目的及优点
如以上摘述，广泛地说明与本发明相关的先前技术，其目的在于在使本发明的内 容更易了解及认同。在这方面，亦启示性地考虑本发明的目的及优点。
本发明的目的之一为提供一种环境监测及生物探勘的较低成本改良方法。
本发明的另一目的为提供一种改良的生物修复评估方法及工具，其可更有效地协 助被污染场址的环境复原及长期管理。
本发明的又一目的为提供一种改良的生物修复评估方法及工具，其可对生物修复 场址进行自动化、大规模及高通量(high-throughput)的分析。
本发明的再一目的为提供一种监测方法、工具及分析策略，以对下列参数进行自 动化、快速及同步测定：(1)流体品质及毒性，(2)固有生物修复潜力，(3)营养补充后 加速生物修复的潜力，(4)有效的生物强化策略以净化环境，(5)天然化合物及环境污 染物在自然及强化条件下的转变(turnover)速率，(6)原位DNA合成及蛋白质表达，(7) 在自然及改变的环境条件下原产及引进的生物因子的原位生长/死亡速率及代谢活 性，(8)天然环境固有的微生物群落的结构及动力性质，及(9)具有生物技术潜在利用 价值的微生物的特征及活性。
本发明的一目的为提供一种可用于评估非原产微生物、致病菌及基因工程微生物 释出至自然环境所造成的潜在风险的监测方法及工具。
本发明的另一目的为提供一种具有发现医药工业及生物技术范畴相关的微生物、 酶及天然产物的潜在价值的方法及工具。
借由参考以下所附的摘要说明、图式及详细说明，将更易了解本发明，且本发 明的这种(及其它)目的及优点亦将变得十分明显。
发明内容
鉴于对环境监测及生物探勘的改良方法与仪器的开发的需求，总体而言本发明致 力于满足上述需求，及克服上述先前技术的装置及方法所发现的缺点。
在第一个较佳具体例中，此方法包含下列步骤：
(a)将取样装置放置于欲调查的环境中，其中该装置包含：(i)具有流体入口及出口 的容器，(ii)设置在该容器中的多个毛细管微观环境，这种毛细管微观环境各具有经 配置成容许流体流经该毛细管微观环境的入口及出口，各毛细管微观环境更具有覆盖 其入口及出口的构件，以防止流体流经该毛细管微观环境，(iii)连接于该容器入口的 泵，该泵经配置成能从周围环境抽取流体，并迫使流体进入该容器入口及通过该毛细 管微观环境，(iv)连接于该容器出口并收集借由泵而迫使通过毛细管微观环境的流体 的构件，及(v)连接于该容器下游的止回阀，以防止流体逆流进入该容器，该多个毛细 管微观环境经配置成可使用市售的机械进行该毛细管微观环境的自动化分析；
(b)打开毛细管微观环境覆盖构件以容许流体从周围环境流经该容器及毛细管微 观环境；
(c)让该装置留在原位一段时间(称为「培育期间」)，该时间足以使欲研究的现象 在该毛细管微观环境中发生；
(d)取回该测试装置；以及
(e)使用实时(real-time)传感器、自动化分析程序及市售的机械分析在该毛细管微 观环境中发生的现象。
在另一较佳具体例中，本发明采取将上述方法与使用该装置进行筛选研究的步骤 加成的形式，其中该筛选研究针对加至毛细管微观环境中的特定受试物质，依其加速 所研究环境中的特定微生物修复过程的能力而筛分。
又，在另一较佳具体例中，本发明采取用于环境监测及生物探勘特定环境中的微 生物的测试装置。该具体例包含：(a)具有流体入口及出口的容器，(b)设置在该容器 中的多个毛细管微观环境，这种毛细管微观环境各具有经配置成容许流体流经毛细管 微观环境的入口及出口，各毛细管微观环境还具有覆盖其入口及出口的构件，以防止 流体流经毛细管微观环境，(c)连接于该容器入口的泵，该泵经配置成足以从周围环境 抽取流体，并迫使流体通过该容器入口及该毛细管微观环境，(d)连接于该容器出口并 收集借由泵推送而通过毛细管微观环境的流体的构件，及(e)连接于该容器下游的止回 阀，以防止流体逆流进入该容器，其中多个毛细管微观环境经配置成可使用市售的机 械以进行该毛细管微观环境的自动化分析。
在又一较佳具体例中，本发明采取上述测试装置，其中该多个毛细管微观环境经 配置成能辅助鉴定该容器所在位置周围环境所原产的微生物。
本发明虽然已摘述如上，但从以下较广泛的详细说明可能将更易了解及体认本发 明。当然，以下将有更多本发明的特征被论述，其等将成为本发明任何最后权利要求 的主题。
在第一个较佳具体例中，此方法包含下列步骤：
(a)将取样装置放置于欲调查的环境中，其中该装置包含：(i)具有流体入口及出口 的容器，(ii)设置在该容器中的多个毛细管微观环境，这种毛细管微观环境各具有经 配置成容许流体流经该毛细管微观环境的入口及出口，各毛细管微观环境更具有覆盖 其入口及出口的构件，以防止流体流经该毛细管微观环境，(iii)连接于该容器入口的 泵，该泵经配置成能从周围环境抽取流体，并迫使流体进入该容器入口及通过该毛细 管微观环境，(iv)连接于该容器出口并收集借由泵而迫使通过毛细管微观环境的流体 的构件，及(v)连接于该容器下游的止回阀，以防止流体逆流进入该容器，该多个毛细 管微观环境经配置成可使用市售的机械进行该毛细管微观环境的自动化分析；
(b)打开毛细管微观环境覆盖构件以容许流体从周围环境流经该容器及毛细管微 观环境；
(c)让该装置留在原位一段时间(称为「培育期间」)，该时间足以使欲研究的现象 在该毛细管微观环境中发生；
(d)取回该测试装置；以及
(e)使用实时(real-time)传感器、自动化分析程序及市售的机械分析在该毛细管微 观环境中发生的现象。
在另一较佳具体例中，本发明采取将上述方法与使用该装置进行筛选研究的步骤 加成的形式，其中该筛选研究针对加至毛细管微观环境中的特定受试物质，依其加速 所研究环境中的特定微生物修复过程的能力而筛分。
又，在另一较佳具体例中，本发明采取用于环境监测及生物探勘特定环境中的微 生物的测试装置。该具体例包含：(a)具有流体入口及出口的容器，(b)设置在该容器 中的多个毛细管微观环境，这种毛细管微观环境各具有经配置成容许流体流经毛细管 微观环境的入口及出口，各毛细管微观环境还具有覆盖其入口及出口的构件，以防止 流体流经毛细管微观环境，(c)连接于该容器入口的泵，该泵经配置成足以从周围环境 抽取流体，并迫使流体通过该容器入口及该毛细管微观环境，(d)连接于该容器出口并 收集借由泵推送而通过毛细管微观环境的流体的构件，及(e)连接于该容器下游的止回 阀，以防止流体逆流进入该容器，其中多个毛细管微观环境经配置成可使用市售的机 械以进行该毛细管微观环境的自动化分析。
在又一较佳具体例中，本发明采取上述测试装置，其中该多个毛细管微观环境经 配置成能辅助鉴定该容器所在位置周围环境所原产的微生物。
本发明虽然已摘述如上，但从以下较广泛的详细说明可能将更易了解及体认本发 明。当然，以下将有更多本发明的特征被论述，其等将成为本发明任何最后权利要求 的主题。
附图说明
图1为本发明的较佳具体例的概要图式。
图2为图1所示的外壳的截面图，包括邻接毛细管微观环境入口的阀板于开放及 关闭位置的放大示意图。
图3为显示图1的阀板的拆解图以及造成横向移动以开启或关闭毛细管微观环境 入口的组件。
图4为本发明的较佳具体例的概要图式，其经延伸入地下水探测井中。
图5A至5C是例示说明本发明在铀污染场址进行微生物群落分析的应用。公知 微生物群落分析产生如图5A所示的图。本发明，如图5B所示，容许在各种环境条 件下测定96种或以上的群落概况(profile)。如图5C所示，本发明取样器中的环境条 件容许选择性富集化(enrichment)污染物降解性细菌(pollutant-degrading bacteria)，其中 某些为第一次被检测出。
图6是显示经安装在一假设场址进行环境监测及生物探勘的96孔微量滴定盘的 可能配置，该假设场址含有经来自点源(point source)的燃料烃类及二苯并呋喃 (dibenzofuran)，以及来自非点源(non-point source)的类除虫菊酯(pyrethroid)降解物3- 苯氧基苯甲酸(3-POB)污染的地下水。
图2为图1所示的外壳的截面图，包括邻接毛细管微观环境入口的阀板于开放及 关闭位置的放大示意图。
图3为显示图1的阀板的拆解图以及造成横向移动以开启或关闭毛细管微观环境 入口的组件。
图4为本发明的较佳具体例的概要图式，其经延伸入地下水探测井中。
图5A至5C是例示说明本发明在铀污染场址进行微生物群落分析的应用。公知 微生物群落分析产生如图5A所示的图。本发明，如图5B所示，容许在各种环境条 件下测定96种或以上的群落概况(profile)。如图5C所示，本发明取样器中的环境条 件容许选择性富集化(enrichment)污染物降解性细菌(pollutant-degrading bacteria)，其中 某些为第一次被检测出。
图6是显示经安装在一假设场址进行环境监测及生物探勘的96孔微量滴定盘的 可能配置，该假设场址含有经来自点源(point source)的燃料烃类及二苯并呋喃 (dibenzofuran)，以及来自非点源(non-point source)的类除虫菊酯(pyrethroid)降解物3- 苯氧基苯甲酸(3-POB)污染的地下水。
具体实施方式
在详细地解释至少一种本发明的具体例前，需明了本发明非限于应用在以下说明 或图式所例示的构造细节及组件配置。本发明还具有其它具体例并能以各种方式实施 及进行。再者，需了解本文所使用的术语及专有名词仅是用于说明而非用于限定。
如先前所说明，本发明具有许多目的，包括：污染场址的管理及生物修复，地球 上及外层空间环境微生物的检测，经引进自然环境的微生物的风险评估，以及寻找应 用于生物技术的新颖微生物、酶及/或化合物。
本发明提供监测工具以及分析策略或方法。其等容许自动、快速及同步进行许多 关键生物修复参数的测定及天然土壤及水环境的原产微生物群落的鉴定，以及发掘于 生物技术上具有潜在利用价值的微生物。
微生物得以在其自然环境中培育、选择性富集(enrichment)及广泛性生化鉴定的技 术由本发明首创。该技术为：
(a)组合使用下列工具/手段：固相取样技术、原位富集及生化筛选、电子供给者/ 接受者配对的使用、同位素标记及借由自动化分析的大量平行筛选；
(b)利用原位微观环境数组及非培养性(culture-independent)微生物群落分析，得到 微生物群落的全貌；
(c)可提供数百种甚至数千种假设性环境事态的数据，以使人们可快速且以自动方 式测定这种扰乱造成的环境改变的大约比率；
(d)适合借由使用计算机辅助的删减图谱技术(subtractive profiling technique)找出 特定微生物与所观测到的反应的关系；
(e)与现有的机械系统可充分兼容，以容许使用化学、物理、生物、基因组(genomic) 及蛋白质组(proteomic)分析技术进行快速及自动化分析；
(f)容许人们测定非原产微生物在面临物理、生物及/或化学压力源(stressor)时如何 适应自然环境；
(g)可依原位应用(in situ application)、异位应用(ex situ application)或此两者的组合 而予以最适化；及
(h)容许蛋白质组分析法采用快速及全自动化分析(例如，基质辅助雷射脱附/游离 飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)及使用串接质谱(MS/MS)的酶消化物的蛋白质定序)。
本发明的一具体例为采取原位微观环境数组(ISMA)取样器或测试装置1的形式。 如图1至4所示，其主要组件包括：
具有流体入口12与出口14的外壳或容器10；
装置于该外壳内的多个毛细管微观环境16，这种毛细管微观环境16的组合相当 于微观环境数组，各个毛细管微观环境16分别具有经配置成容许流体流经该毛细管 微观环境16的入口18及出口20，且各个毛细管微观环境含有过滤材料22(选择在毛 细管微观环境中具有协助收集微生物的能力者)；
具开口28的上阀板24及下阀板26，该开孔28经配置成可与毛细管入口18及 出口20对准；
具有偶合构件32及弹簧组合34的气压缸30，其能使这种阀侧向移动以打开或 关闭毛细管微观环境的入口18及出口20；
用以防止从这种开口溢漏的密封垫片36及38；
连接于入口12的泵40，其按一定尺寸制作而可从容器10的周围环境抽取流体， 并将流体推送入容器入口12及使其通过毛细管微观环境16；
与泵的出口连接的收集装置或囊袋(bladder)42以用于收集通过容器10的流体；
连接于泵40与囊袋42间的止回阀44以防止流体回流入容器10；以及
将取样器1经由垂绳48垂悬于延伸至所欲研究区域的钻井中时，做为压载物的 重物46。
本发明的初始ISMA原型取样器以市售的96孔(8×12)微量滴定盘格式(例如 Wheaton Scientific公司制品)为主；亦可使用类似的384或1536(或更多)盘的格式。由 具有96钻孔的铁氟龙(Teflon)块所组成的初始原型取样器的各个孔(或「微观环境」) 代表各个微观环境毛细管(1.12mL；0.295时[直径]×1时[长度])。
在ISMA原型取样器1中纳入泵40、关闭机构阀板24及26以及半通透性膜， 使得吾等可在未将栖息的微生物从其天然环境中移出(此可能造成伤害)的情况下，接 种微生物并继而将该装置于该环境中培育。泵的构造，除图中所示者外，还包括(但 不限于)多信道泵及泵数组，以将流体输送到一个或多个个别微观环境毛细管的入口。
在本发明的ISMA取样器1中可设置收集装置或囊袋42。流经数组的流体离开 容器并经收集于囊袋中。可能需要置换收集装置中的空气，此可借由以下方法达成： 在收集装置中加装排放阀(bleed valve)，使空气经由一条沿着垂绳上升至流体抽取处 上方一段距离的管线逸出。
当流体流经该装置，微生物及化学物质可被捕捉于毛细管微观环境16中。当收 集装置填满时，浮力可将力量传送至泵，并激活关闭机构的阀板24及26，借此使数 组封闭。装置1可立即(或以批次方式另外进行一段培养期后)从环境中移除以进行进 一步分析。
本发明的ISMA取样器1可设计成能重复使用。为达成此目的，本发明可装设能 容许微量滴定盘快速更换的构件。
可更换的微量滴定盘经制成于使用前得以长时间存放者。为达成此目的，可将定 制的微量滴定盘的内容物冷冻干燥及真空密封。破除真空并将微量滴定内容物再度水 合后，此装置即可用于测试。微量滴定内容物包括，但不限定于，含有特定受试物质、 受试化合物、受试细胞器或微生物的构件。
本发明的ISMA取样器1可装设有捕捉欲研究的微生物及化学物质的手段。该手 段可选自吸附、沉淀、沉降、凝结、过滤、染色、萃取、层析、亲和性分离、尺寸排 除性分离、被动附着于呈示表面(presented surface)及主动附着于呈示表面所构成的组 群。
本发明的ISMA取样器1可装设有微流系统，其在捕捉的样本借由阻隔层(对化 合物而言为非通透性、半通透性或完全通透性)进行物理性及/或化学性围堵的前，可 将少许液体体积及设定量的细胞器(organelle)输送至测试室中。此实施态样使得吾等 可将「未曾人工培养过」或「无法人工培养」的细菌培养至足以进行生化识别及鉴定 的数量。
本取样器亦可适用于研究有益或有害化学药物在自然环境中的影响。在此种应用 中，取样器1经修改成在各个测试隔间或微观环境中尽可能接近地反映所讨论的物 理、化学或生物环境(例如流过含有当地沉积物等的小室)。在取样器布署的前，将受 试化学物质纳入取样器中，并使其从取样器扩散至周围环境流体。在与当地环境交互 作用的后，所有化学物质将被收集于囊袋中。
本取样器亦可适用于研究有益或有害生物在自然环境中的影响。在这种应用中， 取样器1经修改成在各个测试隔间或微观环境中尽可能接近地反映所讨论的物理、化 学或生物环境(例如流过含有当地沉积物等的小室)。在取样器布署的前，将测试微生 物接种于取样器中，并使取样器在当地培育，让受试微生物或物种与当地环境交互作 用，但不使其释出至环境中。
修改取样器的关闭阀板24及26，以使微观环境隔间接续开启或关闭。可于取样 器1中加装实时监测设备(pH、Eh、温度或DO等)，以在借由目标环境改变(例如下 大雨等)所选择的特定时点实时增加功能及激发反应。无线电频率信号及遥控装置可 代替标准的垂线48，与取样器1联系，并测定培育期间发生的化学变化。
需知本装置的设计亦可改变，以将此装置布署于具有极端条件的特殊环境中，这 种特殊环境包括(但不限于)异于地球上的极端pH、温度、压力、放射线或重力条件等。 再者，亦可将许多类型的微流体、过滤器、吸收材料、半通透膜及交替关闭机构与此 取样器整合，以在允许取样器1中发生化学变化的培育期间，实时分离接种物。
再者，需知本方法及装置可使用于任何含有流体的环境的生物探勘及环境监测， 这种含有流体的环境包括(但不限于)地表下环境、地表环境、太空的饱和环境及大型 生物体死亡或存活的环境。
在取样器1的微流构造中可纳入光学及/或电子检测系统，以在当单一细胞被输 送至微观环境中时立即将个别微观环境封闭，借此大幅增加单离新颖微生物的成功 率。
例如，当以光学传感器检测到单一微生物进入该装置时，可起动阀板从「开放」 位置移向「关闭」位置。在「关闭」状态下可呈示不同表面。如果存在的表面对微生 物及水流为非通透性，则可达完全限制状态。如果存在的表面为半通透膜，则水可继 续流过该装置而微生物则保持限制状态。
本发明用于鉴定微生物的手段包括寻找基因表达产物(例如蛋白质)及其特有的 DNA序列。例如，使用核糖体蛋白质做为生物标记并借由MALDI TOF MS以鉴定微 生物。
为借由MALDI TOF MS对特定微生物进行快速且自动化的测定，个别微观环境 可配置成只协助特定微生物的生长。这是借由在微观环境中含有促进目标微生物生长 而抑制非目标微生物生长与存活的化学物质而达成。例如，并用选择性基材与抗生素 可达到该目的。这种选择性培养方式一种微生物实验室的常用策略，如今则移到原位 进行。借由此方式实施，可达到特定微生物的生长及关键生物分子的表达。将特定微 生物进行原位选择性培养后，使用质谱以对这种生物作直接检测及鉴定。因为这种富 集(enriched)化样本的信号对噪声特性已增高，因此无需进行大量样本的制备及处理。
这种原位培养技术亦可使用于测定原位微生物的代谢及分解活性。针对此目的， 存在的化学物质可含有同位素标记，例如碳-12的同位素(例如13C及14C)。
使用本发明与SIP及建立非培养性微生物群落概况的工具的结合为另外一种重要 的应用。
这种方法的优点以图5A至5C例示说明，在图中应用于含有铀的饱和地表下环 境的生物修复。公知微生物群落分析得到图5A所示的图，该技术可检测出所有存在 的细菌，然而并未提供其代谢活性的信息。使用经同位素标记的养分可显示何种经检 测出的微生物具有代谢活性(如图5A所示的右半边群落)。
如图5B所示，使用ISMA取样器1容许在各种环境条件(例如铀以不同浓度存在 时的筛选研究)下测定96种或以上的群落的概况。将所得到的结果使用删减群落剖析 法(subtractive community profiling)进行计算机分析，以使人们从庞大活性微生物群落 中鉴定出重要的污染物转变性微生物(pollutant-transforming microorganisms)(并非所有 代谢活性微生物均参与生物修复过程)。
取样器中的环境条件容许污染物降解性细菌(pollutant-degrading bacteria)的选择 性富集化，其中某些可能第一次被检测到，参照图5C。在适当条件下，弱势存在的 群落可经富集化至能进行MALDI TOF MS检测/鉴定的程度。
为识别在指定场址可检测到的可能相关性微生物中何种会进行期望的反应，可使 用SIP方法。安定同位素可经使用做为化学报导试剂(chemical reporters)，以协助从休 眠或死亡群落成员中，或从进行与所需要的生物修复或生物刺激(biostimulation)无关 的功能的成员中识别代谢活性细菌。
经同位素标记的受质(substrate)(例如13C-标记乙酸盐)可在小型化、现场布署的沉 井式(down well)ISMA中做为生物转化活性的化学报导剂。如先前所述，该装置的各 者具有物理性分离的不同测试环境、[测试孔」或毛细管微观环境。
本发明的方法首先将以适当方式配置的ISMA放置于待测试的环境中(例如遭受 污染的地下场址，其可由监测井进入)。一旦将ISMA垂入监测井中至期望的深度， 则借由导线传导的电讯(亦可经由其它方式，例如程序化的内建机构)从地面激活。装 置激活后，各个[测试孔」暴露于地下水流中。悬浮于地下水中的微生物于是附着于 呈示的表面上，而被捕捉于本装置中。装置接收到再度关闭的信号的前，将有更多自 由活动的微生物被捕捉。
一些测试孔可含有关注的污染物。如先前所述，个别测试孔亦可含有一种经安定 同位素标记的养分，以测定其对微生物生长及活性的影响。将已关闭的装置在原位培 育，以让微生物在经标记的受质(substrate)上生长。
所有在培育期间直接或间接利用经同位素标记的电子供给者的细菌内，经同位素 标记的DNA经富集化(enriched)。将此工具从井中取回后，从此装置收集微生物，且 将其中经同位素标记的较高密度DNA，借由密度-梯度离心(density-gradient centrifugation)与背景DNA分离。继而将这种较高密度的DNA(以及未标记的DNA) 使用已知的分子技术分析。
寡聚核苷酸微数组可用于鉴定/计数目标-特异性微生物，而克隆库(clone library) 可被用于鉴定新颖、未经培养过的微生物。理想上可将该装置与自动化萃取DNA的 市售机械合用。
微生物诱生的金属/放射核素腐蚀的程度，可借由雷射以光学方式扫描置于ISMA 内的金属表面而量测，另一方面，污染物的生物转化可经由添加染料/报导剂(reporter) 以生化方式检测，或经由量测电阻而以电化学方式检测。量测可实时于原位或于布署 后(post-deployment)，经由分析毛细管内容物、囊袋内容物以及整合入该装置且有机 会与吸入该装置的流体进行化学交互作用的吸收材料而进行。
若铀为被关切的污染物，则铀覆盖表面的分析将可测出在原位条件下铀减少的程 度及计算污染物移除的速率。
如先前所说明，此装置的测试孔亦可设置有能缓慢且连续地释出化学物质(例如 外来碳源及能源，其它养分，及调节试剂例如pH调节剂或氧化还原试剂)的基质。该 基质可为含有所述养分的聚合物或膜胞囊。其中，若期望，可选择基质/膜的扩散特 性，以使各个测试孔中养分浓度不同。存在的养分可以固态、液态或气态添加。能源 可以存在或不存在污染物被覆的方式提供。
一些测试孔可经配置成适于原位连续流通操作。流经此装置的方式可为被动式或 主动式。在主动式装置中，小型泵40可促进地下水流动，而具不同长度及构造的配 管则可用于防止一测试孔的排出流体成为另一测试孔的输入液。
图6显示经配置成在一假设场址进行环境监测及生物探勘的96孔微量滴定盘的 可能配置，在该假设场址含有被来自点源(point source)的燃料烃类及二苯并喃，以 及来自非点源(non-point source)的类除虫菊酯(pyrethroid)降解物3-苯氧基苯甲酸 (3-POB)污染的地下水。该96微观环境毛细管以12行(从「A」至「L」)及8列(从「i」 至「viii」)的方式平行排列。在依据该场址而定制的微量滴定盘中，所有毛细管均含 有织布材料以捕捉微生物。在接近各微观环境毛细管的前半部入口处，该织布材料中 含有琼脂珠粒做为惰性扩散基质。在接近各微观环境毛细管的后半部出口处，该织布 材料中含有吸收珠粒，可吸收污染物。毛细管Ai未含有任何受试物质或微生物。当 ISMA以流通模式布署于受污染的水域时，借由实时传感器所报导微观环境Ai的化 学条件反映周围地下水品质。同样地，从微观环境Ai所包含的吸收珠粒的化学分析， 将可测知布署在当地地下水期间通过微观环境的污染物量随时间的变化。在流通模式 期间将微生物捕捉于ISMA后，移动阀板以关闭此装置。微观环境Ai(现以批次模式 培育)的实时感测数据，将可报导周围环境条件下污染物降解的动态(固有生物修复速 率，或污染物以呈时间的函数方式减少)。
如果通过微观环境Ai的地下水为厌氧性(ISMA布署位置1，溢漏燃料槽的紧邻 递降区(immediately downgradient))，则燃料烃类的生物降解将缓慢且不完全。为加速 生物降解过程，可考虑使用多种电子接受剂。常用电子接受化合物的快速、同步筛选 可在ISMA中于第「i」列(Bi至Ii)的微观环境得到。存在于这种微观环境的电子接受 化合物呈从高度氧化性至较偏向还原性的氧化还原梯度状态：Bi，氧释放配方(a)； Ci，硝酸盐(b)；Di，亚硝酸盐(c)；Ei，氧化锰(MnO2)(d)；Fi，铁(Fe(III))(e)；Gi，铀(U(VI))(f)； Hi，铬(Cr(VI))(g)；及Ii，硫酸盐(h)。借由以批次模式培育ISMA且各种电子接受剂以 高于污染物的浓度存在，实时传感器将可从微观环境Bi至Ii直接报导于各种氧化还 原条件下燃料烃类的生物降解的筛选研究结果。一旦鉴定出最佳的氧化还原条件，则 测定所需的剂量。假设污染物转变在含有氧释放配方(a)的微观环境(Bi)中最为快速， 则此「养分」的最佳剂量可借由比较在所含有氧释出配方比微观环境Bi高5倍(Ji)、 10倍(Ki)及50倍(Li)的微观环境中所得到的降解速率而推算。因此，使用最上列微观 环境得到的数据已可估算出固有及提高的生物降解速率，并鉴定出最佳氧化还原条件 及电子接受剂的最佳剂量。其它养分及条件可用类似方式筛选。
使用第二列微观环境Aii至Fii调查借由化学处理清理燃料泼溢场址的地下水的 有效性。评估芬顿试剂(Fenton’s reagent)(m)及高锰酸钾(n)移除烃类的效力。在所示的 配置中，微观环境Aii及Bii被惰性膜过滤器所包覆，其容许液体流入毛细管，但阻 止微生物进入。以流动模式及批次模式将微观环境依序培育，而可于原位直接比较该 二种氧化剂或化学处理策略。微观环境Cii及Dii未以惰性膜密封，除此的外分别与 Aii及Dii相同。从此两对微观环境的化学数据直接比较，可使人们能评估生物转化 及化学氧化过程是否能同时发生。
为进行场址评估，可在指定场址的各个位置布署相同的ISMA取样器。就此处讨 论的假设性场址而言，布署位置2位于释放场址的远处递降区，在烃污染物流(plume) 的外。在此位置，预期地下水为好氧性且只含有来自非点源(non-point source)的污染 物。在本情况，污染物以3-苯氧基苯甲酸及二苯并喃为代表。
接种有生命力微生物(水合者或冷冻干燥者)的ISMA取样器可用于评估致病性或 非致病性微生物的生物强化能力(bioaugmentation)及环境风险。用于此途的定制ISMA 取样器于每个微观环境(Eii至Hii)中播种一千万个特定种类微生物：Eii，大肠杆菌 O157：H7，一种致病菌(o)；Fii，威氏鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas wittichii)RW1株， 一种二苯并哺降解性细菌(p)；Gii，假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)POB310株，一种3-苯氧基苯甲酸盐降解性微生物(q)；及Hii，假单 胞菌属B13-D5株，一种以基因工程技术制造且被特别设计用来快速且完全地降解3- 苯氧基苯甲酸的微生物(r)。
一种评估微生物在目标环境中存活性的方法，为在将ISMA取样器布署、培育及 取出后，计算可培养的细胞数。环境条件对经播种的微生物存活性的影响，可借由比 较相等微观环境于不同位置培育时所得的微生物数而评估，例如在布署位置1及2的 致病性大肠杆菌株的存活率，可借由比较得自在该二位置的微观环境Eii的存活数量 而评估。
RW1株可利用二苯并呋喃做为碳源及能源的天然产微生物。在遭受二苯并呋喃 污染的水域中检测到该菌表示在该场址对于该化学物质有固有生物修复潜力。该微生 物的一种检测技术为使用菌株-特异性PCR引子及探针。或者，该细菌亦可借由质谱 检测。然而，如果RW1株存在于该场址的地下水中，其再该环境中的密度通常比达 成任务所需数量少十的数次方。ISMA隔间Iii经配置成可克服这项限制。微观环境 Iii含有选择性受质二苯并呋喃(s)。当在好氧地下水中以批次方式原位培育微观环境 Iii期间，RW1株借由消耗二苯并呋喃而生长，这将使得RW1株密度从无法检测出的 程度提高到可检测出的程度。二苯并呋喃的存在有二目的。第一，使目标细菌(RW1) 生长至足以借由质谱检测的程度(每微观环境的细胞总数＞107)：第二，增加二氧(杂) 芑二氧化酶(dioxin dioxygenase)(可做为RW1的质谱鉴定的标的的特有酶)的表达量。 RW1的原位生长及于RW1细胞中诱生大量二氧(杂)芑二氧化酶的合并效果为在质谱 分析期间提高的信号对噪声比(即原位生物标记放大)：相对于环境微生物混合物中所 含的非目标蛋白质背景而言，二氧(杂)芑二氧化酶的含量高。
微生物在饥饿状况下可分裂数次以形成超微细菌(ultra-microbacteria)；在这等情 况，活细胞数显示细菌生长(增殖)，但事实上当地细菌群体(bacterial population)属于 灭绝边缘。ISMA可协助区别真实的微生物生长及上述饥饿效应。此项目标可借由使 用含有微生物RW1(b)及安定同位素标记(含有13C)的二苯并呋喃类似物(S)的微观环 境Jii而达成。于原位培育该微观环境后，可借由质谱分析其内容物。若检测到二氧(杂) 芑二氧化酶的轻(未标记)及重(同位素标记)肽的混合物，表示RW1株的原位生长成功； 借由质谱检测到的重同位素对轻同位素之比，可提供有关13C-二苯并呋喃在原位摄取 的速率的信息，这种量测在现场测试(field test)中无法获得，因为大量注射经同位素标 记的化合物在成本上不利，并且面临管理问题。
微观环境Kii可用于例示说明借由于ISMA取样器中引进标准微观环境，可得到 数据归一化(data normalization)的益处。微观环境Kii相同于Jii，然而使用惰性半通透 膜密封，以排除原产的地下水微生物进入。该微观环境可做为取样位置的代谢活性的 基准(benchmark)。例如，当ISMA取样器在布署位置2的浅水域中布署一整年，由于 水温的微妙变化，13C-二苯并呋喃的转变及13C的同化作用(assimilation)将产生季节性 的变动。布署于不同空间点及不同时间的同等配置ISMA所得到的数据组，经由使用 来自标准微观环境(例如Kii)的读数予以归一化，将可直接比较。借由这种作法，一 年实施期间所得到的第「i」列的微观环境的结果可归结成单一数值。若不如此，可 能显示在该水域中烃类降解活性相对减损。
在布署及取出ISMA取样器后，各个毛细管微观环境的微生物群落可使用非培养 性技术(culture-independent techniques)加以分析，这种技术例如为DNA萃取、16S RNA 基因的扩增、借由变性(denatured)梯度凝胶电泳(DGGE)分离扩增产物、及带(bands) 的定序继而进行种系发育序列分析(phylogenetic sequence analysis)。找出微生物功能与 种系发育(phyIogeny)间的关联是一重要目标。删减群落剖析法(subtractive community profiling)，亦即借由从彼此间删减多个数据组以从庞大数据库去除不相关信息的方 法，为一种从大量微生物中鉴定出主导所研究的生化过程的微生物的可行方式(第5A 至5C图)。
另一种达成该目标的途径为使用安定同位素探针。基于三个理由，ISMA技术大 幅增加该技术的利用性。第一，由于可使与昂贵的同位素标记化合物掺合所需液体的 体积减至最低，因此降低SIP分析的成本。第二，容许批次式培养，此与于开放系统 中加标记相较，可大幅提高标记效率。第三，避免现场测试时将经同位素标记的化合 物注入目标环境所造成的管理难题。
利用ISMA技术并使用SIP可借由微观环境Aiii及Biii例示说明。微观环境Aiii 与微观环境Iii相同，只是所含的二苯并呋哺用13C标记。在布署位置2中使用ISMA 取样器后，微观环境Iii的非培养性微生物群落分析得到大量DNA序列，其中有些可 能相当于自然产生的二苯并呋喃降解性微生物。然而，其不易与大量的其它细菌(背 景)区别。借由SIP分析微观环境Aiii有助于二苯并呋喃降解性微生物的鉴定。在原 位布署ISMA取样器的后，从微观环境Aiii萃取DNA。将得到的DNA在氯化铯密 度梯度中离心(spun)，以将12C-DNA与13C-DNA分离。借由PCR、DGGE及DNA 定序分析13C-DNA，将可鉴定出参与二苯并呋喃转变的微生物。
若检测到对应于单一13C-标记微生物的序列，且该DNA序列数据与RW1不同， 则表示利用该ISMA技术发现能代谢二苯并喃的新颖微生物。若于微观环境Aiii 中检测到的13C-标记的代谢物与报导的RW1不同，则表示检测到新颖的生化过程， 其中代谢物本身可能代表具有潜在商业价值的新颖天然产物。同样地，若在微观环境 Biii(含有13C-标记的蔗糖；T)中检测到显著的真菌生长，同时未检测到对应于革兰氏 阳性细菌的13C-标记的DNA，则显示存在适合治疗动物及人类革兰氏阳性细菌感染 的真菌天然产物。
个别测试系统的复制可在该12×8微量滴定盘格式中随机分配。复制系统的分析 可使所得到的实验数据更为精确。图6所示的复制实验包括：Ai的复制-Ciii至Liii； 第i列的复制-第iv、vi及viii列；第ii列的复制-第v及vii列。
本文揭示的测试系统能报导固有(生物修复)生物腐蚀潜力及速率。在地表下环境 的微生物群落组成与功能二方面的分析上，删减剖析法(subtractive profiling)得到的 数据组的计算机分析增加先前未达到的识别能力。
本发明的技术以新颖及非显而易知的方式使用各种已获证实的技巧及技术以达 到期望的目标：于优势条件及于可在原位产生以加速生物修复过程的条件下，快速自 动化分析现场样本的微生物群落组成、降解潜力及降解活性。本发明中组合使用的技 巧/技术包括：
1)进行监测孔取样的沉井(down-well)器材
2)微量滴定盘测试及全自动化的分析
3)连续释出微生物养分的缓释化合物
4)输送养分的膜技术
5)微流体技术
6)微生物诱发的腐蚀的雷射检测
7)自动化DNA萃取
8)微生物的同位素标记
9)用于分离高密度经标记DNA的密度梯度分析
10)使用微数组及生物信息的微生物群落分析
11)鉴定相关微生物的删减群落剖析法
12)可分析吸收材料以测定个别测试隔间中流体的化学组成。
借由下列方法可辅助本发明分析方法的应用：(a)开发用于鉴定混合培养物中的 微生物的质谱技术，及(b)制作微生物鉴定数据库软件及寻找用于解读核糖体生物标记 及微生物MALDI TOF质谱的算法。
本发明的分析速度及容易度，可借由以其它适于识别同位素分布的更方便量测技 术(例如，使用MALDI TOF MS及生物信息数据库搜寻以进行自动化微生物鉴定)取 代分子-基因分析而达成。样本处理使用市售的机械(例如，Amersham生物科学机械) 及快速的样本清洁与处理工具(例如，Gyrolab MALDI SPI等)，并合用酶消化步骤(例 如，胰蛋白酶消化)。
建议使用中央实验室设施来分析布署于原位的取样器。这种方式可达到自动化分 析及高度标准化。标准化分析可改善量测精确度并允许测定该技术上可能限制量测准 确性的系统偏差(由于「瓶装效应」造成)。一旦鉴定出这种偏差，这种偏差可经计算 及修正，以致吾等可高度正确及精确地预测处理措施后可见到的环境改变。
使用本发明测试装置的组件进行的概念证实(proof-of-concept)实验已证明下列事 项：
1.有益的微生物群落数据可借由使用公知分析地下水样本及生物修复微观环境 的非培养性工具而得到。
2.微观环境中电子接受者及供给者的筛选可增加对微生物群落剖析(profiling)的 识别/预测能力。
3.将经安定同位素标记的电子供给化合物加至微观环境装置中可协助代谢活性 微生物的鉴定。
4.适当微生物-特异性蛋白质的质谱分析可用于直接鉴定环境中混合培养物内的 微生物，而无需使用耗时且费劳力的分离技术。
5.适当使用现有蛋白质鉴定数据库软件所含的微生物-鉴定算法，将可进行混合培 养物的分析。
虽然上述的揭示内容关于本发明的较佳具体例，然而需了解以上提出的细节只为 说明之用。本领域技术人员可在未背离本发明的精神与范畴下，对于本发明进行各种 改变及修饰。
相关申请案的交互参照
本申请案主张下列美国临时专利申请案的优先权：2003年3月10日申请的第 60/453,411号案；2003年4月16日申请的第60/463,394号案；2003年7月8日申请 的第60/485,475号案；2003年12月9日申请的第60/528,256号案以及2004年2月4 日申请的第60/541,781号案；所有这种申请案皆已由RolfU.Halden申请并转让给约 翰霍普金斯大学(The John Hopkins University)。
如先前所说明，本发明具有许多目的，包括：污染场址的管理及生物修复，地球 上及外层空间环境微生物的检测，经引进自然环境的微生物的风险评估，以及寻找应 用于生物技术的新颖微生物、酶及/或化合物。
本发明提供监测工具以及分析策略或方法。其等容许自动、快速及同步进行许多 关键生物修复参数的测定及天然土壤及水环境的原产微生物群落的鉴定，以及发掘于 生物技术上具有潜在利用价值的微生物。
微生物得以在其自然环境中培育、选择性富集(enrichment)及广泛性生化鉴定的技 术由本发明首创。该技术为：
(a)组合使用下列工具/手段：固相取样技术、原位富集及生化筛选、电子供给者/ 接受者配对的使用、同位素标记及借由自动化分析的大量平行筛选；
(b)利用原位微观环境数组及非培养性(culture-independent)微生物群落分析，得到 微生物群落的全貌；
(c)可提供数百种甚至数千种假设性环境事态的数据，以使人们可快速且以自动方 式测定这种扰乱造成的环境改变的大约比率；
(d)适合借由使用计算机辅助的删减图谱技术(subtractive profiling technique)找出 特定微生物与所观测到的反应的关系；
(e)与现有的机械系统可充分兼容，以容许使用化学、物理、生物、基因组(genomic) 及蛋白质组(proteomic)分析技术进行快速及自动化分析；
(f)容许人们测定非原产微生物在面临物理、生物及/或化学压力源(stressor)时如何 适应自然环境；
(g)可依原位应用(in situ application)、异位应用(ex situ application)或此两者的组合 而予以最适化；及
(h)容许蛋白质组分析法采用快速及全自动化分析(例如，基质辅助雷射脱附/游离 飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)及使用串接质谱(MS/MS)的酶消化物的蛋白质定序)。
本发明的一具体例为采取原位微观环境数组(ISMA)取样器或测试装置1的形式。 如图1至4所示，其主要组件包括：
具有流体入口12与出口14的外壳或容器10；
装置于该外壳内的多个毛细管微观环境16，这种毛细管微观环境16的组合相当 于微观环境数组，各个毛细管微观环境16分别具有经配置成容许流体流经该毛细管 微观环境16的入口18及出口20，且各个毛细管微观环境含有过滤材料22(选择在毛 细管微观环境中具有协助收集微生物的能力者)；
具开口28的上阀板24及下阀板26，该开孔28经配置成可与毛细管入口18及 出口20对准；
具有偶合构件32及弹簧组合34的气压缸30，其能使这种阀侧向移动以打开或 关闭毛细管微观环境的入口18及出口20；
用以防止从这种开口溢漏的密封垫片36及38；
连接于入口12的泵40，其按一定尺寸制作而可从容器10的周围环境抽取流体， 并将流体推送入容器入口12及使其通过毛细管微观环境16；
与泵的出口连接的收集装置或囊袋(bladder)42以用于收集通过容器10的流体；
连接于泵40与囊袋42间的止回阀44以防止流体回流入容器10；以及
将取样器1经由垂绳48垂悬于延伸至所欲研究区域的钻井中时，做为压载物的 重物46。
本发明的初始ISMA原型取样器以市售的96孔(8×12)微量滴定盘格式(例如 Wheaton Scientific公司制品)为主；亦可使用类似的384或1536(或更多)盘的格式。由 具有96钻孔的铁氟龙(Teflon)块所组成的初始原型取样器的各个孔(或「微观环境」) 代表各个微观环境毛细管(1.12mL；0.295时[直径]×1时[长度])。
在ISMA原型取样器1中纳入泵40、关闭机构阀板24及26以及半通透性膜， 使得吾等可在未将栖息的微生物从其天然环境中移出(此可能造成伤害)的情况下，接 种微生物并继而将该装置于该环境中培育。泵的构造，除图中所示者外，还包括(但 不限于)多信道泵及泵数组，以将流体输送到一个或多个个别微观环境毛细管的入口。
在本发明的ISMA取样器1中可设置收集装置或囊袋42。流经数组的流体离开 容器并经收集于囊袋中。可能需要置换收集装置中的空气，此可借由以下方法达成： 在收集装置中加装排放阀(bleed valve)，使空气经由一条沿着垂绳上升至流体抽取处 上方一段距离的管线逸出。
当流体流经该装置，微生物及化学物质可被捕捉于毛细管微观环境16中。当收 集装置填满时，浮力可将力量传送至泵，并激活关闭机构的阀板24及26，借此使数 组封闭。装置1可立即(或以批次方式另外进行一段培养期后)从环境中移除以进行进 一步分析。
本发明的ISMA取样器1可设计成能重复使用。为达成此目的，本发明可装设能 容许微量滴定盘快速更换的构件。
可更换的微量滴定盘经制成于使用前得以长时间存放者。为达成此目的，可将定 制的微量滴定盘的内容物冷冻干燥及真空密封。破除真空并将微量滴定内容物再度水 合后，此装置即可用于测试。微量滴定内容物包括，但不限定于，含有特定受试物质、 受试化合物、受试细胞器或微生物的构件。
本发明的ISMA取样器1可装设有捕捉欲研究的微生物及化学物质的手段。该手 段可选自吸附、沉淀、沉降、凝结、过滤、染色、萃取、层析、亲和性分离、尺寸排 除性分离、被动附着于呈示表面(presented surface)及主动附着于呈示表面所构成的组 群。
本发明的ISMA取样器1可装设有微流系统，其在捕捉的样本借由阻隔层(对化 合物而言为非通透性、半通透性或完全通透性)进行物理性及/或化学性围堵的前，可 将少许液体体积及设定量的细胞器(organelle)输送至测试室中。此实施态样使得吾等 可将「未曾人工培养过」或「无法人工培养」的细菌培养至足以进行生化识别及鉴定 的数量。
本取样器亦可适用于研究有益或有害化学药物在自然环境中的影响。在此种应用 中，取样器1经修改成在各个测试隔间或微观环境中尽可能接近地反映所讨论的物 理、化学或生物环境(例如流过含有当地沉积物等的小室)。在取样器布署的前，将受 试化学物质纳入取样器中，并使其从取样器扩散至周围环境流体。在与当地环境交互 作用的后，所有化学物质将被收集于囊袋中。
本取样器亦可适用于研究有益或有害生物在自然环境中的影响。在这种应用中， 取样器1经修改成在各个测试隔间或微观环境中尽可能接近地反映所讨论的物理、化 学或生物环境(例如流过含有当地沉积物等的小室)。在取样器布署的前，将测试微生 物接种于取样器中，并使取样器在当地培育，让受试微生物或物种与当地环境交互作 用，但不使其释出至环境中。
修改取样器的关闭阀板24及26，以使微观环境隔间接续开启或关闭。可于取样 器1中加装实时监测设备(pH、Eh、温度或DO等)，以在借由目标环境改变(例如下 大雨等)所选择的特定时点实时增加功能及激发反应。无线电频率信号及遥控装置可 代替标准的垂线48，与取样器1联系，并测定培育期间发生的化学变化。
需知本装置的设计亦可改变，以将此装置布署于具有极端条件的特殊环境中，这 种特殊环境包括(但不限于)异于地球上的极端pH、温度、压力、放射线或重力条件等。 再者，亦可将许多类型的微流体、过滤器、吸收材料、半通透膜及交替关闭机构与此 取样器整合，以在允许取样器1中发生化学变化的培育期间，实时分离接种物。
再者，需知本方法及装置可使用于任何含有流体的环境的生物探勘及环境监测， 这种含有流体的环境包括(但不限于)地表下环境、地表环境、太空的饱和环境及大型 生物体死亡或存活的环境。
在取样器1的微流构造中可纳入光学及/或电子检测系统，以在当单一细胞被输 送至微观环境中时立即将个别微观环境封闭，借此大幅增加单离新颖微生物的成功 率。
例如，当以光学传感器检测到单一微生物进入该装置时，可起动阀板从「开放」 位置移向「关闭」位置。在「关闭」状态下可呈示不同表面。如果存在的表面对微生 物及水流为非通透性，则可达完全限制状态。如果存在的表面为半通透膜，则水可继 续流过该装置而微生物则保持限制状态。
本发明用于鉴定微生物的手段包括寻找基因表达产物(例如蛋白质)及其特有的 DNA序列。例如，使用核糖体蛋白质做为生物标记并借由MALDI TOF MS以鉴定微 生物。
为借由MALDI TOF MS对特定微生物进行快速且自动化的测定，个别微观环境 可配置成只协助特定微生物的生长。这是借由在微观环境中含有促进目标微生物生长 而抑制非目标微生物生长与存活的化学物质而达成。例如，并用选择性基材与抗生素 可达到该目的。这种选择性培养方式一种微生物实验室的常用策略，如今则移到原位 进行。借由此方式实施，可达到特定微生物的生长及关键生物分子的表达。将特定微 生物进行原位选择性培养后，使用质谱以对这种生物作直接检测及鉴定。因为这种富 集(enriched)化样本的信号对噪声特性已增高，因此无需进行大量样本的制备及处理。
这种原位培养技术亦可使用于测定原位微生物的代谢及分解活性。针对此目的， 存在的化学物质可含有同位素标记，例如碳-12的同位素(例如13C及14C)。
使用本发明与SIP及建立非培养性微生物群落概况的工具的结合为另外一种重要 的应用。
这种方法的优点以图5A至5C例示说明，在图中应用于含有铀的饱和地表下环 境的生物修复。公知微生物群落分析得到图5A所示的图，该技术可检测出所有存在 的细菌，然而并未提供其代谢活性的信息。使用经同位素标记的养分可显示何种经检 测出的微生物具有代谢活性(如图5A所示的右半边群落)。
如图5B所示，使用ISMA取样器1容许在各种环境条件(例如铀以不同浓度存在 时的筛选研究)下测定96种或以上的群落的概况。将所得到的结果使用删减群落剖析 法(subtractive community profiling)进行计算机分析，以使人们从庞大活性微生物群落 中鉴定出重要的污染物转变性微生物(pollutant-transforming microorganisms)(并非所有 代谢活性微生物均参与生物修复过程)。
取样器中的环境条件容许污染物降解性细菌(pollutant-degrading bacteria)的选择 性富集化，其中某些可能第一次被检测到，参照图5C。在适当条件下，弱势存在的 群落可经富集化至能进行MALDI TOF MS检测/鉴定的程度。
为识别在指定场址可检测到的可能相关性微生物中何种会进行期望的反应，可使 用SIP方法。安定同位素可经使用做为化学报导试剂(chemical reporters)，以协助从休 眠或死亡群落成员中，或从进行与所需要的生物修复或生物刺激(biostimulation)无关 的功能的成员中识别代谢活性细菌。
经同位素标记的受质(substrate)(例如13C-标记乙酸盐)可在小型化、现场布署的沉 井式(down well)ISMA中做为生物转化活性的化学报导剂。如先前所述，该装置的各 者具有物理性分离的不同测试环境、[测试孔」或毛细管微观环境。
本发明的方法首先将以适当方式配置的ISMA放置于待测试的环境中(例如遭受 污染的地下场址，其可由监测井进入)。一旦将ISMA垂入监测井中至期望的深度， 则借由导线传导的电讯(亦可经由其它方式，例如程序化的内建机构)从地面激活。装 置激活后，各个[测试孔」暴露于地下水流中。悬浮于地下水中的微生物于是附着于 呈示的表面上，而被捕捉于本装置中。装置接收到再度关闭的信号的前，将有更多自 由活动的微生物被捕捉。
一些测试孔可含有关注的污染物。如先前所述，个别测试孔亦可含有一种经安定 同位素标记的养分，以测定其对微生物生长及活性的影响。将已关闭的装置在原位培 育，以让微生物在经标记的受质(substrate)上生长。
所有在培育期间直接或间接利用经同位素标记的电子供给者的细菌内，经同位素 标记的DNA经富集化(enriched)。将此工具从井中取回后，从此装置收集微生物，且 将其中经同位素标记的较高密度DNA，借由密度-梯度离心(density-gradient centrifugation)与背景DNA分离。继而将这种较高密度的DNA(以及未标记的DNA) 使用已知的分子技术分析。
寡聚核苷酸微数组可用于鉴定/计数目标-特异性微生物，而克隆库(clone library) 可被用于鉴定新颖、未经培养过的微生物。理想上可将该装置与自动化萃取DNA的 市售机械合用。
微生物诱生的金属/放射核素腐蚀的程度，可借由雷射以光学方式扫描置于ISMA 内的金属表面而量测，另一方面，污染物的生物转化可经由添加染料/报导剂(reporter) 以生化方式检测，或经由量测电阻而以电化学方式检测。量测可实时于原位或于布署 后(post-deployment)，经由分析毛细管内容物、囊袋内容物以及整合入该装置且有机 会与吸入该装置的流体进行化学交互作用的吸收材料而进行。
若铀为被关切的污染物，则铀覆盖表面的分析将可测出在原位条件下铀减少的程 度及计算污染物移除的速率。
如先前所说明，此装置的测试孔亦可设置有能缓慢且连续地释出化学物质(例如 外来碳源及能源，其它养分，及调节试剂例如pH调节剂或氧化还原试剂)的基质。该 基质可为含有所述养分的聚合物或膜胞囊。其中，若期望，可选择基质/膜的扩散特 性，以使各个测试孔中养分浓度不同。存在的养分可以固态、液态或气态添加。能源 可以存在或不存在污染物被覆的方式提供。
一些测试孔可经配置成适于原位连续流通操作。流经此装置的方式可为被动式或 主动式。在主动式装置中，小型泵40可促进地下水流动，而具不同长度及构造的配 管则可用于防止一测试孔的排出流体成为另一测试孔的输入液。
图6显示经配置成在一假设场址进行环境监测及生物探勘的96孔微量滴定盘的 可能配置，在该假设场址含有被来自点源(point source)的燃料烃类及二苯并喃，以 及来自非点源(non-point source)的类除虫菊酯(pyrethroid)降解物3-苯氧基苯甲酸 (3-POB)污染的地下水。该96微观环境毛细管以12行(从「A」至「L」)及8列(从「i」 至「viii」)的方式平行排列。在依据该场址而定制的微量滴定盘中，所有毛细管均含 有织布材料以捕捉微生物。在接近各微观环境毛细管的前半部入口处，该织布材料中 含有琼脂珠粒做为惰性扩散基质。在接近各微观环境毛细管的后半部出口处，该织布 材料中含有吸收珠粒，可吸收污染物。毛细管Ai未含有任何受试物质或微生物。当 ISMA以流通模式布署于受污染的水域时，借由实时传感器所报导微观环境Ai的化 学条件反映周围地下水品质。同样地，从微观环境Ai所包含的吸收珠粒的化学分析， 将可测知布署在当地地下水期间通过微观环境的污染物量随时间的变化。在流通模式 期间将微生物捕捉于ISMA后，移动阀板以关闭此装置。微观环境Ai(现以批次模式 培育)的实时感测数据，将可报导周围环境条件下污染物降解的动态(固有生物修复速 率，或污染物以呈时间的函数方式减少)。
如果通过微观环境Ai的地下水为厌氧性(ISMA布署位置1，溢漏燃料槽的紧邻 递降区(immediately downgradient))，则燃料烃类的生物降解将缓慢且不完全。为加速 生物降解过程，可考虑使用多种电子接受剂。常用电子接受化合物的快速、同步筛选 可在ISMA中于第「i」列(Bi至Ii)的微观环境得到。存在于这种微观环境的电子接受 化合物呈从高度氧化性至较偏向还原性的氧化还原梯度状态：Bi，氧释放配方(a)； Ci，硝酸盐(b)；Di，亚硝酸盐(c)；Ei，氧化锰(MnO2)(d)；Fi，铁(Fe(III))(e)；Gi，铀(U(VI))(f)； Hi，铬(Cr(VI))(g)；及Ii，硫酸盐(h)。借由以批次模式培育ISMA且各种电子接受剂以 高于污染物的浓度存在，实时传感器将可从微观环境Bi至Ii直接报导于各种氧化还 原条件下燃料烃类的生物降解的筛选研究结果。一旦鉴定出最佳的氧化还原条件，则 测定所需的剂量。假设污染物转变在含有氧释放配方(a)的微观环境(Bi)中最为快速， 则此「养分」的最佳剂量可借由比较在所含有氧释出配方比微观环境Bi高5倍(Ji)、 10倍(Ki)及50倍(Li)的微观环境中所得到的降解速率而推算。因此，使用最上列微观 环境得到的数据已可估算出固有及提高的生物降解速率，并鉴定出最佳氧化还原条件 及电子接受剂的最佳剂量。其它养分及条件可用类似方式筛选。
使用第二列微观环境Aii至Fii调查借由化学处理清理燃料泼溢场址的地下水的 有效性。评估芬顿试剂(Fenton’s reagent)(m)及高锰酸钾(n)移除烃类的效力。在所示的 配置中，微观环境Aii及Bii被惰性膜过滤器所包覆，其容许液体流入毛细管，但阻 止微生物进入。以流动模式及批次模式将微观环境依序培育，而可于原位直接比较该 二种氧化剂或化学处理策略。微观环境Cii及Dii未以惰性膜密封，除此的外分别与 Aii及Dii相同。从此两对微观环境的化学数据直接比较，可使人们能评估生物转化 及化学氧化过程是否能同时发生。
为进行场址评估，可在指定场址的各个位置布署相同的ISMA取样器。就此处讨 论的假设性场址而言，布署位置2位于释放场址的远处递降区，在烃污染物流(plume) 的外。在此位置，预期地下水为好氧性且只含有来自非点源(non-point source)的污染 物。在本情况，污染物以3-苯氧基苯甲酸及二苯并喃为代表。
接种有生命力微生物(水合者或冷冻干燥者)的ISMA取样器可用于评估致病性或 非致病性微生物的生物强化能力(bioaugmentation)及环境风险。用于此途的定制ISMA 取样器于每个微观环境(Eii至Hii)中播种一千万个特定种类微生物：Eii，大肠杆菌 O157：H7，一种致病菌(o)；Fii，威氏鞘胺醇单胞菌(Sphingomonas wittichii)RW1株， 一种二苯并哺降解性细菌(p)；Gii，假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)POB310株，一种3-苯氧基苯甲酸盐降解性微生物(q)；及Hii，假单 胞菌属B13-D5株，一种以基因工程技术制造且被特别设计用来快速且完全地降解3- 苯氧基苯甲酸的微生物(r)。
一种评估微生物在目标环境中存活性的方法，为在将ISMA取样器布署、培育及 取出后，计算可培养的细胞数。环境条件对经播种的微生物存活性的影响，可借由比 较相等微观环境于不同位置培育时所得的微生物数而评估，例如在布署位置1及2的 致病性大肠杆菌株的存活率，可借由比较得自在该二位置的微观环境Eii的存活数量 而评估。
RW1株可利用二苯并呋喃做为碳源及能源的天然产微生物。在遭受二苯并呋喃 污染的水域中检测到该菌表示在该场址对于该化学物质有固有生物修复潜力。该微生 物的一种检测技术为使用菌株-特异性PCR引子及探针。或者，该细菌亦可借由质谱 检测。然而，如果RW1株存在于该场址的地下水中，其再该环境中的密度通常比达 成任务所需数量少十的数次方。ISMA隔间Iii经配置成可克服这项限制。微观环境 Iii含有选择性受质二苯并呋喃(s)。当在好氧地下水中以批次方式原位培育微观环境 Iii期间，RW1株借由消耗二苯并呋喃而生长，这将使得RW1株密度从无法检测出的 程度提高到可检测出的程度。二苯并呋喃的存在有二目的。第一，使目标细菌(RW1) 生长至足以借由质谱检测的程度(每微观环境的细胞总数＞107)：第二，增加二氧(杂) 芑二氧化酶(dioxin dioxygenase)(可做为RW1的质谱鉴定的标的的特有酶)的表达量。 RW1的原位生长及于RW1细胞中诱生大量二氧(杂)芑二氧化酶的合并效果为在质谱 分析期间提高的信号对噪声比(即原位生物标记放大)：相对于环境微生物混合物中所 含的非目标蛋白质背景而言，二氧(杂)芑二氧化酶的含量高。
微生物在饥饿状况下可分裂数次以形成超微细菌(ultra-microbacteria)；在这等情 况，活细胞数显示细菌生长(增殖)，但事实上当地细菌群体(bacterial population)属于 灭绝边缘。ISMA可协助区别真实的微生物生长及上述饥饿效应。此项目标可借由使 用含有微生物RW1(b)及安定同位素标记(含有13C)的二苯并呋喃类似物(S)的微观环 境Jii而达成。于原位培育该微观环境后，可借由质谱分析其内容物。若检测到二氧(杂) 芑二氧化酶的轻(未标记)及重(同位素标记)肽的混合物，表示RW1株的原位生长成功； 借由质谱检测到的重同位素对轻同位素之比，可提供有关13C-二苯并呋喃在原位摄取 的速率的信息，这种量测在现场测试(field test)中无法获得，因为大量注射经同位素标 记的化合物在成本上不利，并且面临管理问题。
微观环境Kii可用于例示说明借由于ISMA取样器中引进标准微观环境，可得到 数据归一化(data normalization)的益处。微观环境Kii相同于Jii，然而使用惰性半通透 膜密封，以排除原产的地下水微生物进入。该微观环境可做为取样位置的代谢活性的 基准(benchmark)。例如，当ISMA取样器在布署位置2的浅水域中布署一整年，由于 水温的微妙变化，13C-二苯并呋喃的转变及13C的同化作用(assimilation)将产生季节性 的变动。布署于不同空间点及不同时间的同等配置ISMA所得到的数据组，经由使用 来自标准微观环境(例如Kii)的读数予以归一化，将可直接比较。借由这种作法，一 年实施期间所得到的第「i」列的微观环境的结果可归结成单一数值。若不如此，可 能显示在该水域中烃类降解活性相对减损。
在布署及取出ISMA取样器后，各个毛细管微观环境的微生物群落可使用非培养 性技术(culture-independent techniques)加以分析，这种技术例如为DNA萃取、16S RNA 基因的扩增、借由变性(denatured)梯度凝胶电泳(DGGE)分离扩增产物、及带(bands) 的定序继而进行种系发育序列分析(phylogenetic sequence analysis)。找出微生物功能与 种系发育(phyIogeny)间的关联是一重要目标。删减群落剖析法(subtractive community profiling)，亦即借由从彼此间删减多个数据组以从庞大数据库去除不相关信息的方 法，为一种从大量微生物中鉴定出主导所研究的生化过程的微生物的可行方式(第5A 至5C图)。
另一种达成该目标的途径为使用安定同位素探针。基于三个理由，ISMA技术大 幅增加该技术的利用性。第一，由于可使与昂贵的同位素标记化合物掺合所需液体的 体积减至最低，因此降低SIP分析的成本。第二，容许批次式培养，此与于开放系统 中加标记相较，可大幅提高标记效率。第三，避免现场测试时将经同位素标记的化合 物注入目标环境所造成的管理难题。
利用ISMA技术并使用SIP可借由微观环境Aiii及Biii例示说明。微观环境Aiii 与微观环境Iii相同，只是所含的二苯并呋哺用13C标记。在布署位置2中使用ISMA 取样器后，微观环境Iii的非培养性微生物群落分析得到大量DNA序列，其中有些可 能相当于自然产生的二苯并呋喃降解性微生物。然而，其不易与大量的其它细菌(背 景)区别。借由SIP分析微观环境Aiii有助于二苯并呋喃降解性微生物的鉴定。在原 位布署ISMA取样器的后，从微观环境Aiii萃取DNA。将得到的DNA在氯化铯密 度梯度中离心(spun)，以将12C-DNA与13C-DNA分离。借由PCR、DGGE及DNA 定序分析13C-DNA，将可鉴定出参与二苯并呋喃转变的微生物。
若检测到对应于单一13C-标记微生物的序列，且该DNA序列数据与RW1不同， 则表示利用该ISMA技术发现能代谢二苯并喃的新颖微生物。若于微观环境Aiii 中检测到的13C-标记的代谢物与报导的RW1不同，则表示检测到新颖的生化过程， 其中代谢物本身可能代表具有潜在商业价值的新颖天然产物。同样地，若在微观环境 Biii(含有13C-标记的蔗糖；T)中检测到显著的真菌生长，同时未检测到对应于革兰氏 阳性细菌的13C-标记的DNA，则显示存在适合治疗动物及人类革兰氏阳性细菌感染 的真菌天然产物。
个别测试系统的复制可在该12×8微量滴定盘格式中随机分配。复制系统的分析 可使所得到的实验数据更为精确。图6所示的复制实验包括：Ai的复制-Ciii至Liii； 第i列的复制-第iv、vi及viii列；第ii列的复制-第v及vii列。
本文揭示的测试系统能报导固有(生物修复)生物腐蚀潜力及速率。在地表下环境 的微生物群落组成与功能二方面的分析上，删减剖析法(subtractive profiling)得到的 数据组的计算机分析增加先前未达到的识别能力。
本发明的技术以新颖及非显而易知的方式使用各种已获证实的技巧及技术以达 到期望的目标：于优势条件及于可在原位产生以加速生物修复过程的条件下，快速自 动化分析现场样本的微生物群落组成、降解潜力及降解活性。本发明中组合使用的技 巧/技术包括：
1)进行监测孔取样的沉井(down-well)器材
2)微量滴定盘测试及全自动化的分析
3)连续释出微生物养分的缓释化合物
4)输送养分的膜技术
5)微流体技术
6)微生物诱发的腐蚀的雷射检测
7)自动化DNA萃取
8)微生物的同位素标记
9)用于分离高密度经标记DNA的密度梯度分析
10)使用微数组及生物信息的微生物群落分析
11)鉴定相关微生物的删减群落剖析法
12)可分析吸收材料以测定个别测试隔间中流体的化学组成。
借由下列方法可辅助本发明分析方法的应用：(a)开发用于鉴定混合培养物中的 微生物的质谱技术，及(b)制作微生物鉴定数据库软件及寻找用于解读核糖体生物标记 及微生物MALDI TOF质谱的算法。
本发明的分析速度及容易度，可借由以其它适于识别同位素分布的更方便量测技 术(例如，使用MALDI TOF MS及生物信息数据库搜寻以进行自动化微生物鉴定)取 代分子-基因分析而达成。样本处理使用市售的机械(例如，Amersham生物科学机械) 及快速的样本清洁与处理工具(例如，Gyrolab MALDI SPI等)，并合用酶消化步骤(例 如，胰蛋白酶消化)。
建议使用中央实验室设施来分析布署于原位的取样器。这种方式可达到自动化分 析及高度标准化。标准化分析可改善量测精确度并允许测定该技术上可能限制量测准 确性的系统偏差(由于「瓶装效应」造成)。一旦鉴定出这种偏差，这种偏差可经计算 及修正，以致吾等可高度正确及精确地预测处理措施后可见到的环境改变。
使用本发明测试装置的组件进行的概念证实(proof-of-concept)实验已证明下列事 项：
1.有益的微生物群落数据可借由使用公知分析地下水样本及生物修复微观环境 的非培养性工具而得到。
2.微观环境中电子接受者及供给者的筛选可增加对微生物群落剖析(profiling)的 识别/预测能力。
3.将经安定同位素标记的电子供给化合物加至微观环境装置中可协助代谢活性 微生物的鉴定。
4.适当微生物-特异性蛋白质的质谱分析可用于直接鉴定环境中混合培养物内的 微生物，而无需使用耗时且费劳力的分离技术。
5.适当使用现有蛋白质鉴定数据库软件所含的微生物-鉴定算法，将可进行混合培 养物的分析。
虽然上述的揭示内容关于本发明的较佳具体例，然而需了解以上提出的细节只为 说明之用。本领域技术人员可在未背离本发明的精神与范畴下，对于本发明进行各种 改变及修饰。
相关申请案的交互参照
本申请案主张下列美国临时专利申请案的优先权：2003年3月10日申请的第 60/453,411号案；2003年4月16日申请的第60/463,394号案；2003年7月8日申请 的第60/485,475号案；2003年12月9日申请的第60/528,256号案以及2004年2月4 日申请的第60/541,781号案；所有这种申请案皆已由RolfU.Halden申请并转让给约 翰霍普金斯大学(The John Hopkins University)。