一种SARS疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种SARS疫苗及其制备方法。该SARS疫苗是以杆状病毒为载体，在其表面展示有SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒。其制备方法包括以下步骤：1)构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体；2)将SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体转化含有杆状病毒基因组质粒Bacmid的感受态细胞，得到重组杆状病毒基因组质粒；3)将重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，对培养上清中的重组杆状病毒粒子进行纯化后，得到SARS疫苗。本发明的疫苗具有以下优点：1)安全性高；2)免疫保护效果好；3)制备方法简单，易于大规模生产。本发明在SARS防治领域具有较高的实际应用价值。

权利要求

1.一种SARS疫苗，是在表面展示有SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒；所述SARS冠状病毒S蛋白胞外区的氨基酸残基序列是序列表中SEQ ID №：2。

2.一种权利要求1所述的SARS疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体；所述展示载体中自5’至3’端顺次连接有杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽编码序列，SARS冠状病毒S蛋白胞外区编码序列，gp64蛋白或水疱性口炎病毒的G蛋白的跨膜区和胞内区的编码序列；

所述SARS冠状病毒S蛋白胞外区的氨基酸序列是序列表中SEQ ID №：2；

2)将步骤1)构建的SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体转化含有杆状病毒基因组质粒Bacmid的感受态细胞，得到重组杆状病毒基因组质粒；

3)将步骤2)获得的重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，对培养上清中的出芽型SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒粒子进行纯化后，得到SARS疫苗。

3.根据权利要求2所述的SARS疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽的氨基酸残基序列是序列表中SEQ ID №：3，gp64蛋白的跨膜区和胞内区的氨基酸残基序列是序列表中SEQ ID №4，水疱性口炎病毒的G蛋白的跨膜区和胞内区的氨基酸残基序列是序列表中SEQ ID №：5。

4.根据权利要求2或3所述的SARS疫苗的制备方法，其特征在于：所述SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体为S-gp64-DUAL或S-vsvG-DUAL。

5.根据权利要求4所述的SARS疫苗的制备方法，其特征在于：所述重组杆状病毒基因组质粒为S-gp64-Bacmid或S-vsvG-Bacmid。

6.根据权利要求2或3所述的SARS疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中用于转染的昆虫细胞为sf9细胞或sf21细胞。

说明书

一种SARS疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒病的疫苗及其制备方法，特别是涉及一种SARS疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 严重急性呼吸道症候群(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)又称非典型性肺炎，是一种急性呼吸道传染病，2003年曾在全球范围内大流行。目前已经确认该病由一种变异的冠状病毒引起，世界卫生组织将其命名为SARS冠状病毒(SARScoronavirus，SARS-CoV)。目前尚无针对SARS病毒的特效药，因此尽快研制出有效的病毒疫苗十分必要。传统的病毒疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗制备简单，但是对于SARS-Cov这样的高致病性病毒而言，在灭活苗的生产和使用过程中都存在着很高的安全隐患；弱毒疫苗相对安全，但是研制周期长，难以应急。活载体疫苗是近年来基因工程疫苗研究的热点之一，其特点是采用非致病型微生物(如痘病毒、腺病毒)作为载体构建含有病毒蛋白抗原的重组体。活载体疫苗的突出优点在于：(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答，引起良好的免疫效果；(2)可同时构成多价以及多联疫苗；(3)疫苗用量少，免疫保护时间长，不需添加佐剂。

[0003] S蛋白是SARS冠状病毒表面的一个重要蛋白，为一跨膜糖蛋白，由1255个氨基酸残基组成，包括一个N端的信号肽(自氨基端第1-11位)，一个大的胞外区(自氨基端第12-1190位)和一个较短的跨膜区及胞内区(自氨基端第1191-1255位)。S蛋白能够与细胞受体结合，在病毒侵染细胞过程中起重要作用；此外，S蛋白以三聚体的形式突出于病毒表面，也是主要的抗原决定位点。S蛋白基因的核苷酸序列在NCBI数据库中的序列号为：
DQ231462。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种用于预防严重急性呼吸道症候群(SARS)的疫苗。

[0005] 本发明所提供的SARS疫苗，是在表面展示有SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒；所述SARS冠状病毒S蛋白囊膜表面结构域具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

[0006] 其中作为载体的杆状病毒可以是任一的杆状病毒。

[0007] 本发明的第二个目的是提供一种上述SARS疫苗的制备方法。

[0008] 本发明所提供的SARS疫苗的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 1)构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体；所述展示载体中自5’至3’端顺次连接有杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽(gp64 SP)编码序列，SARS冠状病毒S蛋白胞外区(S ectodomain)编码序列，gp64蛋白或水疱性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)的跨膜区和胞内区的编码序列；

[0010] 2)将步骤1)构建的SARS冠状病毒S胞外区的杆状病毒表面展示载体转化含有杆状病毒基因组质粒Bacmid的感受态细胞，通过同源重组得到重组杆状病毒基因组质粒；

[0011] 3)将步骤2)获得的重组杆状病毒基因组质粒转染昆虫细胞，对培养上清中的出芽型SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒粒子进行纯化后，得到SARS疫苗。

[0012] 在上述制备方法中，所述步骤1)中杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列，SARS冠状病毒S蛋白胞外区具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列，gp64蛋白的跨膜区和胞内区具有序列表中SEQ ID№：4的氨基酸残基序列，水疱性口炎病毒的G蛋白的跨膜区和胞内区具有序列表中SEQ ID、№：5的氨基酸残基序列；用于构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体的出发载体可为pFastBac DUAL、pFastBac I等，优选为pFastBacDUAL；以pFastBac DUAL为出发载体，构建的SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体为S-gp64-DUAL或S-vsvG-DUAL。

[0013] 步骤2)中含有杆状病毒基因组质粒Bacmid的感受态细胞为E.coliDH10Bac，优选为E.coli DH10Bac；将S-gp64 DUAL转染E.coli DH10Bac后得到的重组杆状病毒基因组质粒为S-gp64-Bacmid；将S-vsvG-DUAL转染E.coliDH10Bac后得到的重组杆状病毒基因组质粒为S-vsvG-Bacmid。

[0014] 步骤3)中可用于转染的昆虫动物细胞为sf9细胞或sf21等，优选为sf9细胞。

[0015] 上述制备方法适用于包括AcMNPV和家蚕NPV在内的所有使用重组杆状病毒表面展示技术制备的SARS疫苗。

[0016] 本发明提供了一种SARS疫苗及其制备方法。该SARS疫苗是以杆状病毒(Baculovirus)作为载体，利用杆状病毒表面展示技术构建的以SARS-CoV S蛋白胞外区为抗原的重组杆状病毒。具体来讲，本发明疫苗的构建原理是，将SARS-CoV的S蛋白胞外区的N端融合杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽，C端融合gp64(或水疱性口炎病毒的G蛋白，VSV-G)的跨膜区和胞内区，该重组蛋白在昆虫细胞内表达后被分选到细胞膜上，最后被包装于出芽型的杆状病毒的囊膜表面，从而达到表面展示的目的。本发明的疫苗具有以下优点：1)安全性高，杆状病毒本身为一种昆虫病毒，在哺乳动物细胞中无法复制，对哺乳动物没有任何毒性且不具备潜在的危险性；2)免疫保护效果好，由于杆状病毒本身的免疫特性，该活载体疫苗能够同时引起机体的体液免疫系统和细胞免疫系统，体液免疫系统能够产生对重组于杆状病毒表面的SARS-CoV S蛋白产生特异性的中和抗体，产生的中和抗体不仅能和血液中的病毒粒子结合，还可以阻断病毒和受体的结合从而阻断病毒进入细胞，细胞免疫系统则可以消除已被病毒感染的细胞，此外，利用杆状病毒表面展示技术可将外源蛋白完整的展示于重组杆状病毒表面，并能极大程度地维持外源蛋白的天然构象，从而使外源蛋白具有良好的免疫原性，有效的引起免疫反应，实验证明，将本发明的SARS-CoV S蛋白的重组杆状病毒免疫小鼠后，可在小鼠血清中检测到针对S蛋白的中和抗体的产生，对病毒感染具有较好的抑制效果；3)制备方法简单，易于大规模生产。基于上述优点，本发明在医学，特别是SARS的防治领域具有较高的实际应用价值。

[0017] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

[0018] 图1为SARS疫苗制备方法的流程图

[0019] 图2为S-gp64-DUAL和S-vsvG-DUAL的物理图谱

[0020] 图3为S-gp64及S-vsvG重组病毒分别感染Sf9细胞38小时、48小时后表达的S蛋白的Western blot检测结果

[0021] 图4为纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒及野生型杆状病毒的S蛋白利gp64蛋白的Western blot检测结果

[0022] 图5为纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒的S蛋白免疫荧光检测结果[0023] 图6为纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒的免疫电镜检测结果

[0024] 图7为S-gp64及S-vsvG重组病毒对低浓度假病毒感染小鼠的免疫和中和活性测试结果

[0025] 图8为S-gp64及S-vsvG重组病毒对高浓度假病毒感染小鼠的免疫和中和活性测试结果

具体实施方式

[0026] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比浓度均为质量百分浓度，所用引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成。

[0027] 实施例1、SARS疫苗的制备

[0028] 采用 Invitrogen公司 的Bac-to-Bac 体外 转 座系 统(货 号：10359-016，10608-016)并按照说明书构建本发明的SARS疫苗，制备方法的流程图如图1所示，具体方法包括以下步骤：

[0029] 一、SARS冠状病毒S蛋白胞外区cDNA的亚克隆

[0030] 根据SARS冠状病毒S蛋白基因的cDNA全长序列(序列表中的SEQ ID №：1)设计引物，PCR扩增S蛋白胞外区cDNA片段，引物序列如下：

[0031] Fs-12：5’-ggg agtggtagtgaccttgacc-3’(方框内碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)

[0032] Rs-1190：5’-attggg gttgctcatattttcccaattc-3’(方框内碱基为限制性内切酶Not I识别位点)

[0033] 以含SARS冠状病毒S蛋白基因的cDNA全长序列的质粒为模板，在引物Fs-12和Rs-1190的引导下，使用高保真Pyrobest酶(TaKaRa公司)用常规PCR方法扩增SARS冠状病毒S蛋白胞外区基因的cDNA片段，经琼脂糖电泳纯化和回收后的cDNA片段待用。

[0034] 二、构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体

[0035] 以Bac-to-Bac体外转座系统中的供体质粒pFastBac DUAL为载体，构建SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体。具体方法为：首先，将杆状病毒自身的囊膜蛋白gp64的信号肽(gp64 SP)的编码序列(gp64 SP是gp64蛋白自氨基端第1-34位氨基酸残基，具有系列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列)用限制性内切酶Bgl II和BamH I酶切后，与经BamH I酶切的载体pFastbac DUAL连接，将其引入pFastbac DUAL的BamHI位点；然后，将gp64蛋白和水疱性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)的跨膜区和胞内区(gp64 TM+CTD是gp64蛋白自氨基端第471-512位氨基酸残基，具有序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列；VSV-G TM+CTD是VSV-G蛋白自氨基端第441-511位氨基酸残基，具有序列表中SEQ ID №：5的氨基酸残基序列位氨基酸)的编码序列用限制性内切酶Pst I和Hind III酶切后，分别与经Pst I和Hind III酶切的上述连有gp64信号肽编码序列的线性载体连接，将其引入相应位点；最后，将步骤一得到的的SARS冠状病毒S蛋白胞外区(S ectodomain)的cDNA片段用限制性内切酶BamH I和Not I酶切后，与经BamH I和Not I酶切的上述连有gp64信号肽和gp64 TM+CTD(或VSV-G TM+CTD)编码序列的线性载体连接，得到两种SARS冠状病毒S蛋白胞外区的杆状病毒表面展示载体，分别命名为S-gp64-DUAL和S-vsvG-DUAL，其物理图谱和插入序列位置如图2所示。

[0036] 三、SARS冠状病毒S蛋白胞外区重组杆状病毒的获得

[0037] 将步骤二构建的S-gp64-DUAL和S-vsvG-DUAL供体质粒分别用热激法转入E.coliDH10Bac感受态细胞(Invitrogen)中进行同源重组，重组后得到两种杆状病毒基因组质粒，分别命名为S-gp64-Bacmid和S-vsvG-Bacmid，经纯化后再将上述两种杆状病毒基因组质粒分别通过脂质体介导法转染Sf9细胞，72小时后收集转染细胞上清，上清内即含有出芽型的SARS冠状病毒S蛋白胞外区的重组杆状病毒粒子，分别命名为S-gp64和S-vsvG。将上述收集的感染细胞上清5000g，10分钟低速离心去除细胞碎片(沉淀)，再4℃、100,000g超速离心2小时，得到粗提的纯化病毒(沉淀)。用1/100离心前体积的PBS悬浮沉淀，并进行蔗糖密度梯度离心，取出病毒条带，经透析后即可作为用于人体免疫的SARS疫苗。

[0038] 实施例2、S-gp64及S-vsvG重组病毒表面S蛋白的鉴定

[0039] 一、Western blot及免疫荧光鉴定结果

[0040] 将实施例1获得的S-gp64及S-vsv6重组病毒分别感染Sf9细胞后，通过Westernblot及免疫荧光的方法对Sf9细胞中表达的S蛋白和纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒进行初步检测，以野生型杆状病毒为对照。感染后38小时、48小时后Sf9细胞中表达的S蛋白的Western blot检测结果如图3所示(wt Bac为野生型杆状病毒)，在感染后38小时、48小时后的Sf9细胞中均可检测到约175KDa的S蛋白条带，且感染后48小时后S蛋白的表达量显著提高。纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒及野生型杆状病毒的S蛋白和gp64蛋白的Western blot检测结果如图4所示(A为S蛋白检测结果，B为gp64蛋白检测结果；wt Bac为野生型杆状病毒)，结果仅在纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒中检测到S蛋白，而在纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒及野生型杆状病毒均可检测到约64KDa的gp64蛋白。
分别感染有S-gp64、S-vsvG重组病毒的Sf9细胞的免疫荧光检测结果如图5所示(Sf9细胞为对照)，S蛋白分布于Sf9转染细胞的质膜上。

[0041] 二、免疫电镜鉴定结果

[0042] 在免疫电镜下对纯化的S-gp64、S-vsvG重组病毒及野生型杆状病毒的S蛋白进行鉴定，鉴定结果如图6所示，胶体金颗粒分布于重组病毒表面，在S-gp64中分布于病毒的一端(a中的黑箭头)，而在S-vsvG中则分布于整个病毒表面(b中的黑箭头)和类似膜(b中的白箭头)的结构中，而在野生型杆状病毒(c)和仅用胶体金二抗标记的S-gp64病毒中(d)则没有特异性的胶体金颗粒分布。

[0043] 上述鉴定结果表明S-gp64及S-vsvG重组病毒表面正确展示有S蛋白。

[0044] 实施例3、S-gp64及S-vsvG重组病毒的小鼠免疫和中和活性测试[0045] 分别取0.1mL纯化的S-gp64及S-vsvG重组病毒皮下注射6周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后的第11天以相同剂量加强免疫一次，第25天检测小鼠血清中中和抗体的活性，中和活性是通过测定小鼠抗血清对一种S蛋白-HIV假病毒的感染抑制效果来测定的，以野生型杆状病毒免疫的鼠血清为阴性对照(wt Bac)，其对假病毒感染没有抑制作用；以SARS康复患者的血清为阳性对照(Positive，实验中稀释度为1∶200-3200)，其对假病毒感染具有明显的抑制作用。低浓度假病毒感染(病毒感染浓度为0.2ng/孔)的中和活性检测结果如图7所示(A为S-gp64实验组，B为S-vsvG实验组)，高浓度假病毒感染(病毒感染浓度为10ng/孔)的中和活性检测结果如图8所示(A为S-gp64实验组，B为S-vsvG实验组)，在1∶20稀释度水平下，所有重组病毒免疫抗血清都可抑制约80％的假病毒感染，表明其含有针对S蛋白的中和抗体，具有很高的中和活性，而在1∶80至1∶160稀释度水平下，重组病毒免疫抗血清的抑制能力下降至50％。上述中和活性测试结果表明本发明的重组S蛋白的杆状病毒能够有效地引起中和抗体的产生，是一种有效的针对SARS-CoV的候选疫苗。

[0046] 序列表

[0047] <160>5

[0048] <210>1

[0049] <211>3768

[0050] <212>DNA

[0051] <213>SARS冠状病毒(SARS coronavirus，Coronaviridae)

[0052] <400>1

[0053] atgtttattt tcttattatt tcttactctc actagtggta gtgaccttga ccggtgcacc 60[0054] acttttgatg atgttcaagc tcctaattac actcaacata cttcatctat gaggggggtt 120[0055] tactatcctg atgaaatttt tagatcagac actctttatt taactcagga tttatttctt 180[0056] ccattttatt ctaatgttac agggtttcat actattaatc atacgtttgg caaccctgtc 240[0057] atacctttta aggatggtat ttattttgct gccacagaga aatcaaatgt tgtccgtggt 300[0058] tgggtttttg gttctaccat gaacaacaag tcacagtcgg tgattattat taacaattct 360[0059] actaatgttg ttatacgagc atgtaacttt gaattgtgtg acaacccttt ctttgctgtt 420[0060] tctaaaccca tgggtacaca gacacatact atgatattcg ataatgcatt taattgcact 480[0061] ttcgagtaca tatctgatgc cttttcgctt gatgtttcag aaaagtcagg taattttaaa 540[0062] cacttacgag agtttgtgtt taaaaataaa gatgggtttc tctatgttta taagggctat 600[0063] caacctatag atgtagttcg tgatctacct tctggtttta acactttgaa acctattttt 660[0064] aagttgcctc ttggtattaa cattacaaat tttagagcca ttcttacagc cttttcacct 720[0065] gctcaagaca tttggggcac gtcagctgca gcctattttg ttggctattt aaagccaact 780[0066] acatttatgc tcaagtatga tgaaaatggt acaatcacag atgctgttga ttgttctcaa 840[0067] aatccacttg ctgaactcaa atgctctgtt aagagctttg agattgacaa aggaatttac 900[0068] cagacctcta atttcagggt tgttccctca ggagatgttg tgagattccc taatattaca 960[0069] aacttgtgtc cttttggaga ggtttttaat gctactaaat tcccttctgt ctatgcatgg 1020[0070] gagagaaaaa aaatttctaa ttgtgttgct gattactctg tgctctacaa ctcaacattt 1080[0071] ttttcaacct ttaagtgtta tggcgtttct gccactaagt tgaatgatct ttgcttctcc 1140[0072] aatgtctatg cagattcttt tgtagtcaag ggagatgatg taagacaaat agcgccagga 1200[0073] caaactggtg ttattgctga ttataattat aaattgccag atgatttcat gggttgtgtc 1260[0074] cttgcttgga atactaggaa cattgatgct acttcaactg gtaattataa ttataaatat 1320[0075] aggtatctta gacatggcaa gcttaggccc tttgagagag acatatctaa tgtgcctttc 1380[0076] tcccctgatg gcaaaccttg caccccacct gctcttaatt gttattggcc attaaatgat 1440[0077] tatggttttt acaccactac tggcattggc taccaacctt acagagttgt agtactttct 1500[0078] tttgaacttt taaatgcacc ggccacggtt tgtggaccaa aattatccac tgaccttatt 1560[0079] aagaaccagt gtgtcaattt taattttaat ggactcactg gtactggtgt gttaactcct 1620[0080] tcttcaaaga gatttcaacc atttcaacaa tttggccgtg atgtttctga tttcactgat 1680[0081] tccgttcgag atcctaaaac atctgaaata ttagacattt caccttgctc ttttgggggt 1740[0082] gtaagtgtaa ttacacctgg aacaaatgct tcatctgaag ttgctgttct atatcaagat 1800[0083] gttaactgca ctgatgtttc tacagcaatt catgcagatc aactcacacc agcttggcgc 1860[0084] atatattcta ctggaaacaa tgtattccag actcaagcag gctgtcttat aggagctgag 1920[0085] catgtcgaca cttcttatga gtgcgacatt cctattggag ctggcatttg tgctagttac 1980[0086] catacagttt ctttattacg tagtactagc caaaaatcta ttgtggctta tactatgtct 2040[0087] ttaggtgctg atagttcaat tgcttactct aataacacca ttgctatacc tactaacttt 2100[0088] tcaattagca ttactacaga agtaatgcct gtttctatgg ctaaaacctc cgtagattgt 2160[0089] aatatgtaca tctgcggaga ttctactgaa tgtgctaatt tgcttctcca atatggtagc 2220[0090] ttttgcacac aactaaatcg tgcactctca ggtattgctg ctgaacagga tcgcaacaca 2280[0091] cgtgaagtgt tcgctcaagt caaacaaatg tacaaaaccc caactttgaa atattttggt 2340[0092] ggttttaatt tttcacaaat attacctgac cctctaaagc caactaagag gtcttttatt 2400[0093] gaggacttgc tctttaataa ggtgacactc gctgatgctg gcttcatgaa gcaatatggc 2460[0094] gaatgcctag gtgatattaa tgctagagat ctcatttgtg cgcagaagtt caatggactt 2520[0095] acagtgttgc cacctctgct cactgatgat atgattgctg cctacactgc tgctctagtt 2580[0096] agtggtactg ccactgctgg atggacattt ggtgctggcg ctgctcttca aatacctttt 2640[0097] gctatgcaaa tggcatatag gttcaatggc attggagtta cccaaaatgt tctctatgag 2700[0098] aaccaaaaac aaatcgccaa ccaatttaac aaggcgatta gtcaaattca agaatcactt 2760[0099] acaacaacat caactgcatt gggcaagctg caagacgttg ttaaccagaa tgctcaagca 2820[0100] ttaaacacac ttgttaaaca acttagctct aattttggtg caatttcaag tgtgctaaat 2880[0101] gatatccttt cgcgacttga taaagtcgag gcggaggtac aaattgacag gttaattaca 2940[0102] ggcagacttc aaagccttca aacctatgta acacaacaac taatcagggc tgctgaaatc 3000[0103] agggcttctg ctaatcttgc tgctactaaa atgtctgagt gtgttcttgg acaatcaaaa 3060[0104] agagttgact tttgtggaaa gggctaccac cttatgtcct tcccacaagc agccccgcat 3120[0105] ggtgttgtct tcctacatgt cacgtatgtg ccatcccagg agaggaactt caccacagcg 3180[0106] ccagcaattt gtcatgaagg caaagcatac ttccctcgtg aaggtgtttt tgtgtttaat 3240[0107] ggcacttctt ggtttattac acagaggaac ttcttttctc cacaaataat tactacagac 3300[0108] aatacatttg tctcaggaaa ttgtgatgtc gttattggca tcattaacaa cacagtttat 3360[0109] gatcctctgc aacctgagct tgactcattc aaagaagagc tggacaagta cttcaaaaat 3420[0110] catacatcac cagatgttga tcttggcgac atttcaggca ttaacgcttc tgtcgtcaac 3480[0111] attcaaaaag aaattgaccg cctcaatgag gtcgctaaaa atttaaatga atcactcatt 3540[0112] gaccttcaag aattgggaaa atatgagcaa tatattaaat ggccttggta tgtttggctc 3600[0113] ggcttcattg ctggactaat tgccatcgtc atggttacaa tcttgctttg ttgcatgact 3660[0114] agttgttgca gttgcctcaa gggtgcatgc tcttgtggtt cttgctgcaa gtttgatgag 3720[0115] gatgactctg agccagttct caagggtgtc aaattacatt acacataa 3768[0116] <210>2

[0117] <211>1179

[0118] <212>PRT

[0119] <213>SARS冠状病毒(SARS coronavirus，Coronaviridae)

[0120] <400>2

[0121] Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala[0122] 1 5 10 15[0123] Pro Asn Tyr Thr Gln His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro[0124] 20 25 30

[0125] Asp Glu Ile Phe Arg Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe[0126] 35 40 45

[0127] Leu Pro Phe Tyr Ser Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr[0128] 50 55 60

[0129] Phe Gly Asn Pro Val Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala[0130] 65 70 75 80[0131] Thr Glu Lys Ser Asn Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met[0132] 85 90 95[0133] Asn Asn Lys Ser Gln Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val[0134] 100 105 110[0135] Val Ile Arg Ala Cys Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala[0136] 115 120 125

[0137] Val Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn[0138] 130 135 140

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[0285] <213>杆状病毒(Autographa californica nucleopolyhedrovirus，AcMNPV，[0286] Baculoviridae)

[0287] <400>4

[0288] Met Ala Glu Gly Glu Leu Ala Ala Lys Leu Thr Ser Phe Met Phe Gly[0289] 1 5 10 15[0290] His Val Val Asn Phe Val Ile Ile Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr[0291] 20 25 30

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[0297] <213>水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，Rhabdoviridae)[0298] <400>5

[0299] Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly[0300] 1 5 10 15[0301] Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile[0302] 20 25 30

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