本发明提供用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法，通过巯基连接臂与氨基酸的羧基结合，用常规多肽合成策略合成多肽，并用氢氟酸溶液切割，使硅氧键断裂生成四氟化硅气体和水，冷冻干燥后直接得到所需的产物多肽硫酯。本发明的有益之处是开发一种全新的苄巯基聚硅氧烷类固相合成载体，在可分解挥发的固相载体上进行常规的固相有机合成反应合成目标分子，然后采用适当的切割条件分解固相载体为可挥发性的物质、连接剂和产物，真空干燥后直接得到产物，避免了萃取、分离、蒸发溶剂等步骤。本发明方法设计合理，成本低，操作简便，后处理避免了萃取、分离、蒸发溶剂等步骤，非常适合平行合成和自动化合成化合物组合库以供活性筛选。
1.一种用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法，多肽硫脂库具有以下结构通式：其中m＝0-3
R，R，R 相同或不同，选自氢，甲基，异丁基，苄基，或巯甲基，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)冰水浴下，在正硅酸乙酯中加入水搅拌5-30分钟后，加入对氯甲基苯基三甲氧基硅烷，继续搅拌0.5-5小时，至生成溶胶，停止搅拌，25-60℃下保温，至完全固化成凝胶；
(2)100-130℃下真空加热干燥，得到苄氯硅胶I；
(3)50-75℃下，苄氯硅胶I在溴化钾的N，N-二甲基甲酰胺溶液中反应2-12小时，得到苄溴硅胶II；
(4)50-75℃下，苄溴硅胶II在硫脲III的醇溶液中反应过夜，得到化合物IV，然后加入多烯多胺，反应过夜，即生成苄巯基硅胶V；
(5)苄巯基硅胶V与氨基酸VI，在1-羟基苯并三唑，N，N′-二异丙基碳二亚胺，N，N-二甲基甲酰胺条件下反应，生成连接在硅胶上的叔丁氧羰基保护的氨基酸VII，用55％三氟醋酸脱叔丁氧羰基保护得到化合物VIII；
(6)化合物VIII与化合物VI在1-羟基苯并三唑，N，N′-二异丙基碳二亚胺，N，N-二甲基甲酰胺条件下反应，生成连接在硅胶上的叔丁氧羰基保护的二肽，用55％三氟醋酸脱叔丁氧羰基保护得到连有二肽的硅胶；
(7)重复步骤(6)三次，分别得到连有三肽、四肽、五肽的硅胶IX；
(8)化合物IX用氢氟酸溶液切割，使硅氧键断裂生成四氟化硅气体和水，多肽以硫酯的形式切割下来，冷冻干燥后直接得到多肽硫酯X；
2.根据权利要求1所术的用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法，其特征是：步骤(5)得到的作为固相合成载体的苄巯基硅胶V具有以下结构式：
3.根据权利要求1所述的一种用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法，其特征在于，所述三肽的氨基酸偶联顺序为异亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸。
4.根据权利要求1所述的一种用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法，其特征在于，所述四肽的氨基酸偶联顺序为甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸。
5.根据权利要求1所述的一种用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法，其特征在于，所述四肽的氨基酸的偶联顺序为丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸。
6.根据权利要求1所述的一种用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法，其特征在于，所述五肽的氨基酸的偶联顺序为甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸。
7.根据权利要求1所述的一种用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法，其特征在于，所述五肽的氨基酸的偶联顺序为丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、半胱氨酸。
用可挥发苄巯基硅胶合成多肽硫酯库的固相合成方法
技术领域
[0001] 本发明属固相合成载体及化合物合成，主要涉及“可挥发”固相合成苄巯基硅胶的合成及多肽硫酯库的固相合成方法。
背景技术
[0002] 肽类化合物是一类具有广泛生物活性的化合物。多肽硫酯是一类含功能基因的直链肽，是合成环肽的重要前体，通过链状多肽C端的硫代酯与N端的2-氨基硫醇(如半胱氨酸)经过化学选择性勾合成环形成环肽。固相及溶液合成多肽硫酯均有报道。与Boc保护氨基酸固相合成相匹配的方法，由于后处理采用氟化氢气体切割，价格昂贵，且操作不便，因而使用受到限制。采用与Fmoc化学相匹配的多肽硫酯合成方法，由于用来脱去Fmoc保护基的哌啶能与硫酯键的羰基发生亲核反应而将多肽从树脂上切下，因此很难得到较长的多肽硫酯。近来报道了“安全连接分子(safety-catch linker)”的方法，即用3-羧丙基磺酰胺作为连接分子，因为有些多肽形成二级结构而易于聚集，使得固相合成时产率很低。液相方法制备多肽硫酯通常需要固相结合液相多步合成，逐步分离、萃取、纯化才能得到多肽前体，制约了环肽化合物快速平行合成及活性筛选。所以，开发一种新的固相合成载体用于平行合成和自动化合成多肽硫脂库具有重要意义。
发明内容
[0003] 本发明的目的是开发一种苄巯基聚硅氧烷类固相合成载体，苄巯基硅胶通过巯基连接臂与氨基酸的羧基结合，通过常规多肽合成策略合成多肽，并用氢氟酸溶液切割，使硅氧键断裂生成四氟化硅气体和水，冷冻干燥后直接得到所需的产物多肽硫酯。
[0004] 制备的多肽硫脂库具有以下结构通式：
[0005]
[0006] 其中m＝0-3
[0007] R1，R2，R3相同或不同，选自氢，甲基，异丙基，异丁基，苄基，胍基丙基，乙酰氨，丙酰氨，羟基甲基，2-羟基乙基，羧基甲基，羧基乙基，氨基丁基，对羟基苄基，巯甲基，4-咪唑基甲基，2-巯甲基乙基，3-吲哚基甲基。
[0008] 本发明的苄巯基聚硅氧烷类固相合成载体和多肽硫脂库通过以下步骤实现：
[0009] (1)冰水浴下，在正硅酸乙酯中加入一定量水搅拌5-30分钟后，加入对氯甲基苯基三甲氧基硅烷，继续搅拌0.5-5小时，至生成溶胶，停止搅拌，25-60℃下保温，至完全固化成凝胶；
[0010] (2)100-130℃下真空加热干燥，得到苄氯硅胶I：
[0011]
[0012] (3)50-75℃下，苄氯硅胶I在KBr(溴化钾)的DMF(N，N-二甲基甲酰胺)溶液中反应2-12小时，得到苄溴硅胶II：
[0013]
[0014] (4)50-75℃下，苄溴硅胶II在硫脲III的醇溶液中反应过夜，得到化合物IV，然后加入多烯多胺，反应过夜，即生成苄巯基硅胶V，
[0015]
[0016] 以下用 表示苄巯基硅胶；
[0017] (5)苄巯基硅胶V与氨基酸VI，在HOBt(1-羟基苯并三唑)，DIC(N，N-二异丙基碳二亚胺)，DMF条件下反应，生成连接在硅胶上的Boc(叔丁氧羰基)保护的氨基酸VII，用55％TFA(三氟醋酸)脱Boc保护得到化合物VIII，
[0018] (6)化合物IV与氨基酸(化合物VI)在HOBt，DIC，DMF条件下反应，生成连接在硅胶上的Boc保护的二肽，用55％TFA(三氟醋酸)脱Boc保护得到连有二肽的硅胶，[0019] (7)重复步骤6一次，二次，三次，分别得到连有三肽、四肽、五肽的硅胶(化合物IX)，
[0020] (8)化合物IX用氢氟酸溶液切割，使硅氧键断裂生成四氟化硅气体和水，多肽以硫酯的形式切割下来，冷冻干燥后直接得到多肽硫酯X。
[0021] 反应过程表示如下：
[0022]
[0023] 本发明的有益之处是开发一种全新的苄巯基聚硅氧烷类固相合成载体，在可分解挥发的固相载体上进行常规的固相有机合成反应合成目标分子，然后采用适当的切割条件分解固相载体为可挥发性的物质、连接剂和产物，真空干燥后直接得到产物，避免了萃取、分离、蒸发溶剂等步骤。本发明方法设计合理，成本低，操作简便，后处理避免了萃取、分离、蒸发溶剂等步骤，非常适合平行合成和自动化合成化合物组合库以供活性筛选。
具体实施方式
[0024] 下面将通过实施例对本发明作进一步的说明。
[0025] 实施例1：对氯甲基苯基硅胶的制备
[0026] 20g(mmol)四乙氧基硅烷和4.75克水加入烧杯，在冰水浴下搅拌5分钟，再加入对氯甲基苯基三甲氧基硅烷，搅拌2-3小时后生成溶胶，停止搅拌，55℃下保温过夜，固化成凝胶。真空130℃下干燥24小时后，水洗，再次真空干燥，得到白色的对氯甲基苯基硅胶，产率100％。
[0027] 实施例2：对溴甲基苯基硅胶的制备
[0028] 实施例1中制得的对氯甲基苯基硅胶，75℃下在KBr的DMF溶液中反应3小时，即得对溴甲基苯基硅胶。
[0029] 实施例3：对巯基甲基苯基硅胶的制备
[0030] 取按实例2合成的对溴甲基苯基硅胶，在硫脲的乙二醇溶液中加热至130℃，反应过夜，再加入四乙烯五胺反应过夜，甲醇洗涤后，即得对巯基甲基苯基硅胶。
[0031] 实施例4：对氯甲基苯基硅胶连接的Boc-氨基酸的制备
[0032] 取按实例1合成的对氯甲基苯基硅胶100mg，加入1.1倍过量的Boc-丙氨酸锶、0.1倍的KI(碘化钾)，55℃下DMF溶液中反应过夜后，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，DCM(二氯甲烷)洗涤，即得连接在硅胶上的Boc-丙氨酸。
[0033] 实施例5：对巯基甲基苯基硅胶连接的二肽的制备
[0034] 将100mg按实例3合成的对巯基甲基苯基硅胶封入树脂袋，加入5倍过量的Boc-苯丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，加入15ml的反应瓶中，密封后放上摇床，室温振摇2小时后，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。DCM洗涤，DIEA(二异丙基乙胺)中和后，加入5倍过量的Boc-丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基，即得对巯基硅胶上连接的二肽。
[0035] 实施例6：C-端苄硫酯Phe-Ala二肽的制备
[0036] 取实施例5中制备的对巯基硅胶上连接的二肽放入聚丙烯试管中，加入1ml 35％的氢氟酸水溶液，摇床上室温振摇30分钟，使硅胶溶解。冷冻干燥后直接得到C-端苄硫酯Phe-Ala的二肽。经LC-MS分析产物的分子量为342，HPLC分析产物的纯度为92％。
[0037] 实施例7：C-端苄硫酯Phe-Ala-Phe三肽的制备
[0038] 将100mg按实例3合成的对巯基甲基苯基硅胶封入树脂袋，5倍过量的Boc-苯丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，加入15ml的反应瓶中，密封后放上摇床，室温振摇2小时后，倒去反应液，用DMF洗涤三次后，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。DCM洗涤，DIEA中和后，加入5倍过量的Boc-丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基。DCM洗涤，DIEA中和后，加入5倍过量的Boc-苯丙氨酸、HOBt、DIC和DMF，室温下反应2小时，加入55％的TFA/DCM，反应30分钟脱去Boc保护基，即可得到连接在硅胶上的三肽。加入1ml 35％的氢氟酸水溶液，摇床上室温振摇30分钟，使硅胶溶解。冷冻干燥后即得C-端苄硫酯Phe-Ala-Phe三肽。经LC-MS分析产物的分子量为489，HPLC分析产物的纯度为87％。
[0039] 实施例8：C-端苄硫酯Ile-Phe-Cys三肽的制备
[0040] 操作过程同实施例7。氨基酸偶联的顺序为异亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸。经LC-MS分析产物的分子量为487，HPLC分析产物的纯度84.3％。
[0041] 实施例9：C-端苄硫酯Gly-Ile-Phe-Cys四肽的制备
[0042] 操作过程同实施例7。氨基酸偶联的顺序为甘氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸，经LC-MS分析产物的分子量为544，HPLC分析产物的纯度84.5％。
[0043] 实施例10：C-端苄硫酯Ala-Phe-Leu-Cys四肽的制备
[0044] 操作过程同实施例7。氨基酸偶联的顺序为丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸，经LC-MS分析产物的分子量为558，HPLC分析产物的纯度82.8％。
[0045] 实施例11：C-端苄硫酯Gly-Ala-Phe-Leu-Cys五肽的制备
[0046] 操作过程同实施例7。氨基酸偶联的顺序为甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸，经LC-MS分析产物的分子量为615，HPLC分析产物的纯度80.5％。
