信息获取装置、应激度信息获取装置及应激度判定方法

摘要

本发明提供用于获取对判定应激度有用的、与硫氧还蛋白类的氧化型浓度、还原型浓度以及它们的浓度比中的至少1种相关的信息的信息获取装置以及使用该信息获取装置的应激度信息获取装置或应激度判定方法。本发明利用由催化硫氧还蛋白类的氧化还原反应的酶等引起的反应，测定硫氧还蛋白类的氧化型浓度、还原型浓度以及它们的浓度比中的至少1种，利用该数据判定测定对象的应激度。

权利要求

1.一种信息获取装置，所述信息获取装置用于测定硫氧还蛋白类的氧化型浓度，其特征在于，所述信息获取装置包括：用于使试样与催化硫氧还蛋白类的氧化还原反应的酶发生反应的反应区域、与用于基于所述反应区域中的所述试样与所述酶的反应计算所述硫氧还蛋白类的氧化型浓度的检测装置以及用于从硫氧还蛋白类的氧化型浓度将氧化应激度分类和用于判定氧化应激度的应激度判定装置，其中，所述酶为硫氧还蛋白还原酶，

其中，所述酶是被固定在载体上的固定化酶，该固定化酶被配置在所述反应区域中，其中，所述检测装置检测基于所述反应的电化学变化，计算所述硫氧还蛋白类的氧化型的浓度，其中，所述检测装置具有酶电极，和

其中，检测所述电化学变化是检测电流、电荷量、电位、电压以及阻抗中的至少1种，所述应激度判定装置通过将所述计算的硫氧还蛋白类的氧化型浓度输入到示出硫氧还蛋白类的氧化型浓度与应激度的关系的信息中，或者示出硫氧还蛋白类的氧化型浓度和还原型浓度的比与应激度的关系的信息中来分类和判定。

2.如权利要求1所述的信息获取装置，其进一步包括：判定结果输出装置。

3.如权利要求2所述的信息获取装置，其进一步包括：显示装置，和

存储装置。

说明书

信息获取装置、应激度信息获取装置及应激度判定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及用于获取与硫氧还蛋白(thioredoxin)类浓度相关的信息的信息获取装置、使用该信息获取装置的应激度信息获取装置及应激度判定方法。更具体而言，本发明涉及区别硫氧还蛋白的氧化型(oxidized form)与还原型(reduced form)并测定其浓度的测定方法、及利用该测定方法的用于获取与硫氧还蛋白类的浓度相关的信息的装置及其用途。

背景技术

[0002] 个体或细胞经受的应激中有多种应激。对该应激进行应答的机制彼此间存在共同要素，同时激活多条信号通路，密切配合进行调节。上述应激中，氧化应激在应激中占有重要位置。作为氧化应激的原因，可以举出活性氧种、紫外线、放射线、化学物质或在细胞内产生活性氧种的刺激。已知氧化应激导致生物体内的脂质、蛋白质、DNA等被修饰或损伤。该程度较强时，引起细胞功能障碍或细胞死亡，有时成为致癌、衰老、动脉硬化、痴呆、神经疾病的原因。另一方面，也已知存在修复该损伤的机制。即在受到氧化应激的生物体内，通过诱导抗氧化机制或抗氧化物质等，在分子水平修复受到损伤的物质，保护生物体。该抗氧化物质中，作为承担细胞内的抗氧化机制的代表性蛋白质之一可以举出硫氧还蛋白。

[0003] 1964年，硫氧还蛋白作为核糖核苷酸还原酶(ribonucleotidereductase)的辅酶被发现。该酶是分子量为12kDa的蛋白质，在异种间，其活性部位具有被保存得很好的SEQ ID NO：1(Xaa：任意的氨基酸)序列。由于该硫氧还蛋白是由引起氧化应激的原因等诱导产生的，故硫氧还蛋白浓度反映生物体内由氧化应激引起的炎症的程度。

[0004] 作为该硫氧还蛋白的测定法，目前已报道了利用抗原抗体反应的酶免疫定量法(ELISA法)。例如，非专利文献1公开了使用ELISA法测得的血清中的硫氧还蛋白浓度作为丙型肝炎病毒感染患者的氧化应激的指标是有用的。

[0005] [非专利文献1]Yoshio Sumida，Toshiaki Nakamura，TakaharuYoh，Yoshiki Nakajima，Hiroki Ishikawa，Hironori Mitsuyoshi，YoshikuniSakamoto，Takeshi Okanoue，Kei Kashima，Hajime Nakamura，Junji YodoiJournal of Hepatology 2000，33，616-622.

发明内容

[0006] 如非专利文献1所公开的，现有的硫氧还蛋白浓度的测定法采用ELISA法。该方法是作为靶的硫氧还蛋白被抗体识别、捕捉，利用标识等检测被捕捉的硫氧还蛋白的量。

[0007] 本发明人等对ELISA法进行了研究，发现判断应激程度时有时存在较大的波动，作为应激感应器，有进一步改善的余地。

[0008] 对波动的原因进行了研究，首次认识到了判断应激度时，区别硫氧还蛋白类的浓度是氧化型的浓度还是还原型的浓度并进行测定的方法能准确地判断受试者的应激度。而ELISA法并不是区别溶液中的硫氧还蛋白是氧化型还是还原型后再进行测定。因此，按照现有的硫氧还蛋白的测定法测定硫氧还蛋白的氧化型、还原型的浓度或氧化型/还原型的比，在原理上是不可能的。

[0009] 本发明的目的在于提供区别试样溶液中存在的硫氧还蛋白的氧化型与还原型，获取与其浓度相关的信息的信息获取装置。本发明的其他目的在于提供能使用酶电极区别硫氧还蛋白的氧化型与还原型，获取与它们的浓度或浓度比相关的信息的装置。本发明的其他目的还在于提供能利用通过上述信息获取装置测定硫氧还蛋白的氧化型与还原型的浓度比的优点，得到用于应激度分类的信息的应激度显示装置。

[0010] 本发明的信息获取装置是获取与硫氧还蛋白类的浓度相关的信息的信息获取装置，其特征在于，所述信息获取装置利用试样中的硫氧还蛋白类的氧化还原反应，区别并测定该硫氧还蛋白类的氧化型的浓度与还原型的浓度中的至少一方。

[0011] 本发明的应激度信息获取装置是用于获取与测试对象的应激度相关的信息的应激度信息获取装置，其特征在于，所述应激度信息获取装置具有基于下述第1信息与下述第2信息判定测定对象的应激度的应激度判定装置，所述第1信息选自利用来源于测试对象的试样中的硫氧还蛋白类的氧化还原反应、区别并测定该硫氧还蛋白类的氧化型的浓度与还原型的浓度中的至少一方得到的硫氧还蛋白类的氧化型的浓度、还原型的浓度及它们的浓度比，所述第2信息是关于所述第1信息与应激程度的关系的信息。

[0012] 本发明的应激度判定方法是用于判定测试对象的应激度的应激度判定方法，其特征在于，所述应激度判定方法具有判定应激度的步骤，所述步骤利用来源于测试对象的试样中的硫氧还蛋白类的氧化还原反应，基于该硫氧还蛋白类的氧化型的浓度与还原型的浓度中的至少一方、和预先设定的基准，判定应激度。

[0013] 本发明的酶电极是具有导电性部件与酶的酶电极，其特征在于，所述酶是催化硫氧还蛋白类的氧化还原反应的酶。

[0014] 本发明的硫氧还蛋白类浓度的测定方法是测定试样中的硫氧还蛋白类的浓度的方法，其特征在于，所述方法利用试样中的硫氧还蛋白类与氧化还原酶的反应，区别并测定该硫氧还蛋白类的氧化型的浓度与还原型的浓度中的至少一方。

[0015] 根据本发明，可以提供能区别硫氧还蛋白类的浓度是氧化型的浓度或还原型的浓度的信息获取装置。

[0016] 通过对下述示例性的实施方案的描述，能够使本发明的特点变得更为清楚。

附图说明

[0017] 图1是利用在使用2种指标的2轴中的坐标位置进行应激评价的评价方法的例子。

[0018] 图2是利用在使用多个指标的多轴中描绘的图形的形状评价图案的应激评价方法的例子。

[0019] 图3是使用酶电极的硫氧还蛋白氧化型浓度感应器的感应部的简图。

[0020] 图4是使用酶电极测定的电流或累计电荷量与硫氧还蛋白浓度的依赖性的示意图。

[0021] 图5是在酶电极上进行的与硫氧还蛋白氧化型的还原相关的一系列反应的模式图。

[0022] 图6是使用酶电极测定的硫氧还蛋白还原型的量与添加的硫氧还蛋白浓度的依赖性的示意图。

[0023] 图7是使用比色法的硫氧还蛋白的氧化型、还原型浓度感应器的示意图。

[0024] 图8是使用比色法得到的硫氧还蛋白与比较对象相比的吸光度变化的硫氧还蛋白浓度依赖性的示意图。

[0025] 图9是反应步骤中进行的硫氧还蛋白氧化型的还原反应的模式图。

[0026] 图10是使用比色法测定的硫氧还蛋白的还原型的量与添加的硫氧还蛋白浓度的依赖性的示意图。

[0027] 图11是以硫氧还蛋白的氧化型浓度或硫氧还蛋白整体的浓度作为指标评价丙型肝炎患者与健康者的应激的结果的示意图。

[0028] 图12是使用硫氧还蛋白的总浓度、硫氧还蛋白的氧化型/还原型比2种指标评价应激时的2轴评价的示意图。

[0029] 图13是表示应激度信息获取装置结构之一例的框(block)图。

[0030] 图14是表示应激度信息获取装置结构之一例的框图。

[0031] 图15是使用酶电极的硫氧还蛋白的还原型浓度感应器的感应部的简图。

[0032] 图16是使用酶电极测定的电流或累计电荷量与硫氧还蛋白浓度的依赖性的示意图。

[0033] 图17是在酶电极上进行的与硫氧还蛋白的还原型的氧化相关的一系列反应的模式图。

[0034] 图18是使用酶电极测定的硫氧还蛋白的量与添加的硫氧还蛋白浓度的依赖性的示意图。

[0035] 图19是使用NADPH修饰电极系统的硫氧还蛋白的氧化型、还原型浓度感应器的示意图。

[0036] 图20是使用修饰电极的硫氧还蛋白的还原型浓度感应器的感应部的简图。

[0037] 图21是使用NADPH修饰电极系统的电流、电荷量与硫氧还蛋白的氧化型、还原型的浓度的依赖性的示意图。

[0038] 图22是在NADPH修饰电极上进行的硫氧还蛋白的还原型的氧化相关的一系列反应的模式图。

[0039] 符号说明

[0040] 1 反应槽盖

[0041] 2 反应槽壁

[0042] 3 基板

[0043] 4 绝缘层

[0044] 5 试样导入口或空气排出口

[0045] 6 反应槽

[0046] 7 参比电极

[0047] 8 工作电极

[0048] 9 对电极

[0049] 10 试剂层

[0050] 11 导线

[0051] 12 集电垫(current collecting pad)

[0052] 13 通孔

[0053] 14 酶层

具体实施方式

[0054] 本发明的用于获取与硫氧还蛋白类的浓度相关的信息的信息获取装置具有利用试样中的硫氧还蛋白类的氧化还原反应，区别并测定该硫氧还蛋白类的氧化型的浓度与还原型的浓度中的至少一方的结构。

[0055] 上述装置的优选方案为具有用于测定选自硫氧还蛋白类的氧化型的浓度、还原型的浓度以及它们的浓度比的项目中的至少1项的结构。上述装置至少具有用于使上述试样与催化硫氧还蛋白类的氧化还原反应的酶发生反应的反应区域、和用于基于上述反应区域中的上述试样与上述酶的反应计算上述项目中的1项以上的检测装置。

[0056] 本发明的硫氧还蛋白类的浓度的测定或与浓度相关的信息的获取还包含求出试样中的浓度本身的情况或求出规定量试样中的测定对象(化合物)的绝对量的情况。例如，采集10ml血，测定其中的绝对量也包括在本发明的浓度测定范畴内。

[0057] 首先，详细说明硫氧还蛋白类。硫氧还蛋白中存在2个半胱氨酸残基之间形成二硫键的氧化型及形成二硫醇(dithiol)的还原型。其中，还原型作为抗氧化物质发挥作用，不仅单独消除活性氧种，而且通过与过氧化物还原酶(peroxiredoxin)作用消除细胞内的活性氧种，成为氧化型。另一方面，氧化型在硫氧还蛋白还原酶与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)的作用下转化为还原型。

[0058] 催化硫氧还蛋白类的氧化还原反应的酶，区别硫氧还蛋白类为氧化型或还原型，催化对应于该酶的反应。因此，可以测定用现有的ELISA法原理上不可能测定的硫氧还蛋白类的氧化型的浓度、还原型的浓度或氧化型与还原型的浓度比。

[0059] 作为催化此时的硫氧还蛋白的氧化还原反应的酶，可以适用硫氧还蛋白氧化酶、硫氧还蛋白脱氢酶、硫氧还蛋白还原酶、过氧化物还原酶，其中，优选使用硫氧还蛋白还原酶。该酶可以单独使用，也可以与其他不催化硫氧还蛋白的氧化还原的酶一起使用。特别优选使催化硫氧还蛋白不参与的反应的酶与催化硫氧还蛋白的氧化还原反应的酶共同使用。+
作为该例子，可以举出硫氧还蛋白还原酶与铁氧还蛋白NADP 还原酶的组合。

[0060] 此种情况下的硫氧还蛋白类除硫氧还蛋白(TRX)之外，还包括被称为硫氧还蛋白超族(thioredoxin super family)的具有硫氧还蛋白样区域(domain)的一系列蛋白质组。该硫氧还蛋白超族分子具有由SEQ ID NO：1组成的活性部位，通过活性部位的二硫键/二硫醇基团发挥其氧化还原能力。另外，硫氧还蛋白超族中，也包括具有多个硫氧还蛋白基序(motif)的分子。作为上述硫氧还蛋白超族的例子，可以举出TRX、Sptrx、PDI、ERp72及ERdj5。

[0061] 此种情况下的利用酶反应的测定方法是指用于测定硫氧还蛋白类浓度的反应中包含酶反应的测定方法。利用使氧化还原酶作用于硫氧还蛋白类的酶反应及连接了硫氧还蛋白类的氧化还原反应的酶反应中的至少一方测定硫氧还蛋白类的浓度。如前所述，除了由氧化还原酶引起的硫氧还蛋白类的反应之外，也可以将用于取得能经检测装置检出的变化的其他酶反应连接硫氧还蛋白类的氧化还原酶反应。用于测定浓度的酶反应中使用的酶，可以以固定在载体上的状态进行使用。

[0062] 用于检出在基于酶反应的反应区域得到的变化的检测法，没有特别限定。作为检测法优选使用酶电极法、吸光度法(包括比色法)、发光检测法，更优选采用酶电极法、比色法。

[0063] 作为该比色法的例子，可以举出利用NADPH变化为NADP+时340nm处的吸光度变化的方法，或除NADPH之外，还使用其他色素的方法。作为该色素的例子，可以举出5，5’-二硫二(2-硝基苯甲酸)、二硫苏糖醇。

[0064] 此种情况下的进行测定时的环境，没有特别限定，优选使用硫氧还蛋白类存在于液体中的环境，更优选使用含有水、醇类、离子性液体的溶液。

[0065] 酶电极至少具有导电性部件及催化硫氧还蛋白类的氧化还原反应的酶而构成。作为酶，除催化硫氧还蛋白类的氧化还原反应的酶之外，还可以根据需要并用其他酶。

[0066] 导电性部件将酶反应中产生的电性变化导入外部电路，使其能够被测定，可以利用由导电性高、在进行酶反应的条件下具有充分的电化学稳定性的材料组成的导电性部件。作为该导电性部件的构成材料的例子，可以举出Au、Pt等金属、聚乙炔类、聚芳撑类等导电性高分子、含有In、Sn、Zn等的金属氧化物等。作为导电性部件的构成材料的例子，还可以举出石墨、炭黑、碳纳米管、碳纳米角(Carbonnanohorn)、富勒烯(fullerene)化合物等碳材料等。或者也可以为上述材料中的2种以上的复合材料或在基体表面设有导电性材料层的复合材料。

[0067] 将酶固定在导电性部件上的方法只要是能够以可获得所希望的酶电极的功能的方式固定酶的方法即可，没有特别限定，可以采用公知的方法。另外，可以并用酶和促进酶与导电性部件间的电子传递的金属络合物、醌类、杂环化合物等介体(mediator)。

[0068] 利用上述结构的酶电极可以构成硫氧还蛋白类的使用酶电极法的信息获取装置。该信息获取装置可以至少使用下述结构要素构成。

[0069] (1)能容纳试样溶液的反应区域。

[0070] (2)设置在反应区域中的酶电极。

[0071] (3)反应检测装置，该装置通过检测反应区域中收纳的试样溶液与酶电极之间的反应的电变化，测定上述列举的项目中的至少1个项目。

[0072] 通过使用该装置，可以测定与硫氧还蛋白类的氧化型、还原型相关的浓度、以及与氧化型和还原型的浓度相关的比率中的至少一项。

[0073] 酶电极法是指酶反应与根据电极反应检出的信号相关的测定方法，具体而言，可以举出在电极上反应的物质的浓度通过酶反应发生变化的方法或电极间的电信号通过酶反应发生变化的方法。作为上述例子，前者可以举出在电极上的包括氧或过氧化氢、或醌类、金属配位化合物的氧化还原物质的浓度随酶反应发生变化的方法，后者可以举出电极间的阻抗(impedance)随酶反应发生变化的方法。上述前者与后者的区别只是为了便于定义，不能否定某测定法同时属于两者。该酶电极中，可以将酶或在酶与电极间传递电荷的物质中的一方或者两方固定在电极上。

[0074] 使用电极进行测定时，优选通过粗化电极表面或形成具有微细结构的材料来增大表面积，以及对电极表面实施降低本底电流(background current)的处理。作为该处理的例子，可以举出对电极进行化学修饰的方法或进行物理修饰的方法。作为具体例子，前者可以举出吸附硫醇化合物或硅烷化合物的方法，后者可以举出用氟树脂膜或透析膜覆盖电极表面的方法。上述方法可以单独使用，也可以组合使用。

[0075] 可利用酶电极，测定基于硫氧还蛋白的氧化型及还原型中的至少一方参与的酶反应的电化学变化，算出硫氧还蛋白的氧化型及还原型中的至少一方的浓度。作为该电变化，可以举出电流、电荷量、电位、电压及阻抗，测定其中的1种以上，根据该值可以算出硫氧还蛋白的氧化型及还原型中的至少一方的浓度。此处测定的电流可以是起因于电极上的物质的反应的电流，其可以为稳恒电流，也可以为瞬变电流。此处测定的电荷量可以是观测到的电流值的累计，其可以是试样溶液中的特定物质的全电解，也可以为部分电解。此处测定的电位是酶活性中心的电位或氧化还原比随酶反应发生变化的化合物的电位，该电位可以是静态的也可以是动态的。此处测定的阻抗可以是电极间的阻抗与酶反应相关地变化的阻抗，可以使用阻抗中的虚数部分、实数部分或它们的组合对阻抗进行评价。

[0076] 即，检测伴随酶反应的电化学变化时，可以通过电流、电荷量、电位、电压及阻抗中的至少1种检测上述电化学变化，算出氧化型或还原型的浓度。

[0077] 作为检测电化学变化的方法，可以进一步举出下面的具体例。

[0078] (A)用电流、电荷量评价随还原硫氧还蛋白类的氧化型的酶反应而移动的电子的量的方法。

[0079] (B)利用媒介物质，通过电极间的电流、电荷量评价随还原硫氧还蛋白类的氧化型的酶反应而移动的电子的量的方法。

[0080] (C)用电极间的电流、电荷量、电位、电压评价随还原硫氧还蛋白类的氧化型的酶反应而被氧化的媒介物质的氧化型/还原型之比的方法。

[0081] 需要说明的是，上述评价是指根据预先设定的基准例如校准线，从测定得到的电流、电荷量、电位、电压算出测定对象物质的浓度。

[0082] 测定的硫氧还蛋白类的来源没有特别限定，优选使用生物体的体液、组织。其中，更优选使用动物的体液，最优选使用人的体液。该体液没有特别限定，优选使用血液、构成血液的成分(包括血清、血浆)、尿、唾液。

[0083] 该情况下的装置优选能在进行硫氧还蛋白类的测定前后进行其他处理。作为该处理的例子，可以举出分离、分割(segmentation)、过滤、清洗、萃取、提纯、温度变化、分散、混合、沉淀、透析、蒸馏、修饰(包括化学反应)、脱氧、消泡、超声波处理、微波处理、伴有施加磁场的处理、电解、电泳、色谱图(chromatogram)。可以根据需要组合使用选自上述处理中的1种处理或2种以上的处理。优选采用将上述前后处理自动化并将其组装为装置的一部分的方法。另外优选将微流路等微小空间用于该前后处理和/或测定中。

[0084] 作为使用酶反应的测定方法的具体例子，有使用硫氧还蛋白类的还原酶(硫氧还蛋白还原酶)的测定方法。该测定方法使硫氧还蛋白还原酶特异地作用于试样所含的硫氧还蛋白类的氧化型，使其还原为还原型。通过各种检测法检测此时的氧化还原反应，区别于还原型，求出氧化型的浓度。还可以通过使用硫氧还蛋白类的氧化酶，相同地操作，区别于氧化型，求出试样中的还原型的浓度。

[0085] 也可以使用硫氧还蛋白还原酶求出硫氧还蛋白类的还原型在试样中的浓度。例如，首先预先测定试样中的氧化型浓度，在试样中加入氧化硫氧还蛋白类的氧化剂，将试样中存在的还原型转化为氧化型，利用酶反应等除去剩余的氧化剂。然后，实施与测定试样中的氧化型浓度的方法相同的浓度测定法。从检出的数值减去添加氧化剂前的氧化型浓度求出还原型的浓度。

[0086] 本发明的应激度信息获取装置及应激度判定方法是根据下面的第1信息与第2信息判定测定对象的应激度的方法。

[0087] (1)区别来源于测定对象的试样中的硫氧还蛋白类的氧化型与还原型，测定它们的浓度所得的第1信息。

[0088] (2)与该第1信息和应激度之间的关系相关的第2信息。

[0089] 上述第1信息中可以使用硫氧还蛋白的氧化型的浓度、还原型的浓度及它们的浓度比中的至少1项。该装置优选具有基于第2信息，对与硫氧还蛋白类浓度相关的上述项目中的至少1项进行分类，判定测定对象的应激度的应激度判定装置。

[0090] 图13及图14表示上述装置的构成单元的框图之一例。

[0091] 图13所示的装置至少具有输入装置、CPU及输出装置，以及根据需要设置的存储装置及显示装置。来源于测定对象的硫氧还蛋白类的浓度值或表示浓度的数据从输入装置输入。此处，表示浓度的数据是与用于测定浓度的检测法相对应的吸光度或电流值等。CPU中写入了基于预先设定的基准处理输入的数据，对测定对象的应激度进行分类加以判定的程序。根据该程序判定的应激度、即判定结果可以通过输出装置输出。例如，使用显示器作为显示装置时，判定结果显示在显示器上。或者也可以从输出装置将判定结果输出在纸等适当的介质上。

[0092] 用于分类应激度的预先设定的基准可以根据统计学收集的数据制成。例如，将应激度分类为多个等级，基于统计学收集的数据确定与各等级相当的硫氧还蛋白类的氧化型的浓度范围。对应于该等级对来源于测定对象的试样中的硫氧还蛋白类的氧化型的浓度进行分类，用CPU自动判定测定对象具有哪个等级的应激度。作为该应激度的分类、判定的指标，可以使用硫氧还蛋白类的氧化型的浓度、还原型的浓度及它们的浓度比中的至少1个项目。也可以根据需要补充使用硫氧还蛋白类(氧化型+还原型)在试样中的浓度作为指标。

[0093] 如图13所示，通过预先设置存储装置，可以预先记录与来源于测定对象的硫氧还蛋白类的浓度相关的数据或判定结果，也可以用CPU制作与每小时、日、周、月或年的经时变化相关的数据。

[0094] 图14所示的装置还具有测定硫氧还蛋白类在试样中的浓度的信息获取装置。作为该信息获取装置，优选至少使用进行利用上述酶反应的测定的装置。

[0095] 在应激度信息获取装置中所利用的硫氧还蛋白类的浓度的测定值可以利用如下求得的值。

[0096] (1)硫氧还蛋白类的氧化型的浓度

[0097] (1-1)使用试样测定的硫氧还蛋白类的氧化型的浓度。

[0098] (1-2)作为试样中所含的氧化型与还原型的总和的硫氧还蛋白类总浓度减去还原型的浓度得到的浓度。

[0099] (1-3)由作为试样中所含的氧化型与还原型的总和的硫氧还蛋白类总浓度、与氧化型和还原型的浓度比得到的氧化型的浓度。

[0100] (2)硫氧还蛋白类的还原型的浓度

[0101] (2-1)使用试样测定的硫氧还蛋白类的还原型的浓度。

[0102] (2-2)作为氧化型与还原型的总和的硫氧还蛋白类总浓度减去氧化型的浓度得到的浓度。

[0103] (2-3)由作为试样中所含的氧化型与还原型的总和的硫氧还蛋白类总浓度、与氧化型和还原型的浓度比得到的还原型的浓度。

[0104] (3)硫氧还蛋白类的氧化型与还原型的浓度比

[0105] (3-1)由使用试样测定的氧化型与还原型的浓度求得的比值。

[0106] (3-2)由作为氧化型与还原型的总和的硫氧还蛋白类总浓度、与氧化型的浓度求出的比值。

[0107] (3-3)由作为氧化型与还原型的总和的硫氧还蛋白类总浓度、与还原型的浓度求出的比值。

[0108] (3-4)测定硫氧还蛋白的活性部位的电位或电位与活性部位的电位相关地发生变化的物质的电位所得的比值。

[0109] 作为求出测定硫氧还蛋白的活性部位的电位或电位与活性部位的电位相关地发生变化的物质的电位所得的比值的方法可以举出下面的方法。

[0110] 首先，电位的测定在下述条件下进行，所述条件为存在以足够测定的速度与硫氧还蛋白的活性部位进行电子移动的电极、或能将该活性部位与电极间电连接的物质，能测定硫氧还蛋白的活性部位的电位的条件。在该条件下，用能斯特(Nernst)式计算根据硫氧还蛋白的氧化型/还原型的比值变化的电位。

[0111] 能斯特式：

[0112] (E＝E0+(RT/nF)In(aO/aR)

[0113] E：电极电位

[0114] E0：标准电极电位

[0115] R：气体常数

[0116] T：绝对温度

[0117] n：参与反应的电子数

[0118] F：法拉第常数

[0119] ao：氧化型的活度(active amount)

[0120] aR：还原型的活度

[0121] 需要说明的是，作为测定硫氧还蛋白类的总量的方法，可以组合不使用酶的方法。作为该方法，可以举出酶免疫测定法(ELISA)等。

[0122] 由于如果对生物体施加氧化应激，则诱导产生作为抗氧化物质的硫氧还蛋白，其浓度增大，故如非专利文献1所述将其用作氧化应激的指标。但是，该指标是经由下述多个步骤的间接指标，即

[0123] 1、氧化应激的发生、

[0124] 2、生物体感受到氧化应激、

[0125] 3、硫氧还蛋白的诱导、以及

[0126] 4、硫氧还蛋白的浓度增加。

[0127] 因此，存在下述问题：从氧化应激的发生至硫氧还蛋白浓度增大的期间产生时间差，另外，经由上述多个步骤的过程中响应度(response)出现个体差异，结果导致观测到的硫氧还蛋白类浓度产生个体差异。因此，有时难以以该指标为基准，进一步进行高精度的应激评价、疾病诊断、经过观察等。

[0128] 本发明人等对氧化应激的发生与用于评价氧化应激的指标之间的关系进行了研究。在研究过程中注意到生物体内的硫氧还蛋白的氧化型的浓度(或氧化型/还原型比)如下面1～3所述与硫氧还蛋白浓度相比经较少步骤进行应答。

[0129] 1.氧化应激的发生。

[0130] 2.由硫氧还蛋白还原型消除氧化应激，并生成硫氧还蛋白氧化型。

[0131] 3.硫氧还蛋白氧化型的浓度(或氧化型/还原型比)的上升。

[0132] 另外，还注意到该过程不包括生物体对氧化应激的感知或硫氧还蛋白的诱导之类的被认为个体差异大的步骤。基于上述发现，完成了以硫氧还蛋白的氧化型的浓度、或氧化型与还原型的浓度比为指标，评价氧化应激的方法。

[0133] 如上所述，该方法与现有方法相比较，指标直接针对氧化应激。因此，从氧化应激的施加至检测为止期间的应答性优良。另外，由于硫氧还蛋白的氧化型是硫氧还蛋白被氧化而生成的，直接反映施加的氧化应激，因此具有与现有的硫氧还蛋白总量的测定方法相比个体差异少的优点。结果可以进行更准确的氧化应激的评价、疾病的诊断、经过观察等。

[0134] 另外，对不限于氧化应激的多种应激进行应答的机制具有彼此相同的要素，同时激活各种信号通路，彼此密切相连地进行调节。因此，根据本发明的能评价氧化应激的方法，也可以评价其他应激。

[0135] 作为该情况下的评价应激的指标，可以单独使用硫氧还蛋白类的氧化型的浓度、或氧化型与还原型的浓度比，也可以组合使用，还优选组合其他指标进行使用。作为组合使用时的评价方法的例子，可以举出下面的方法。

[0136] (1)根据存在于x、y的2轴中的象限对应激度进行分类评价的方法。

[0137] (2)用以2轴的x、y座标与原点为顶点的三角形面积进行评价的方法。

[0138] (3)使用如图1所示的在2轴上的坐标位置的方法。

[0139] (4)在x、y、z的3轴中，用以x、y、z座标与原点为顶点的四面体的体积进行评价的方法。

[0140] (5)用如图2所示的由多轴描绘出的图形的形状评价图案的方法。

[0141] 对以硫氧还蛋白的氧化型与还原型的浓度比为单指标的情况进行说明，根据统计学上得到的数据预先设定上述浓度比与应激程度(应激度)的关系。例如，根据浓度比将应激度按应激度降序分为A到D四个等级。按照上述方法测定来源于测定对象的试样中所含的硫氧还蛋白的氧化型与还原型的浓度比，根据得到的测定值将测定对象的应激度分类为A～D中的一种。该分类处理可以根据规定的程序用计算机处理氧化型与还原型的浓度比的实测值而自动进行。该情况下，计算机的CPU等构成分类装置。分类结果可以利用输出装置通过纸或各种显示器等所希望的介质进行输出，也可以预先存储在存储装置中，根据需要取出。图13给出了上述应激度信息获取装置的构成单元的框图之一例。

[0142] 本发明的应激度信息获取装置具有上述分类装置及分类结果输出装置，除此之外，还可以具有用于测定硫氧还蛋白的氧化型的浓度、还原型的浓度及它们的浓度比中的至少一个项目的信息获取装置。图14给出了带有浓度信息获取装置的应激度信息获取装置之一例的框图。

[0143] 本发明的应激度信息获取装置及应激度判定方法可以优选用于获取与对疾病的诊断、疾病的经过观察有用的应激度相关的信息。作为该疾病，只要是伴随与硫氧还蛋白类的氧化型相关的浓度、与硫氧还蛋白类的氧化型、还原型浓度相关的比率的变化的疾病即可，没有特别限定。作为该疾病的例子，可以举出肺病、循环器官疾病、肝病、消化器官疾病、肾病、糖尿病、获得性免疫缺陷综合症、肿瘤、皮肤病。

[0144] 本发明的应激度信息获取装置及应激度判定方法优选用在使用硫氧还蛋白类作为药物时在硫氧还蛋白类给药前评价或预测其效果、或在给药后评价或预测其效果方面。

[0145] 例如，图13及图14的装置可以将基于用应激度信息获取装置判定的测定对象的应激度确定的疾病的可能性显示在显示装置中。该情况下，可以预先将下述程序输入CPU，进行上述处理，所述程序以统计学收集得到的数据为基础，预先求出应激度与疾病的关系，根据利用该数据判定的应激度选择可能的疾病。另外，能预先用存储装置存储测定对象的经时数据，输出测定对象的经时性应激度变化，基于该变化每次测定时将相关疾病的经过分类为“经过良好”或“无变化”等进行显示。上述分类也能根据基于统计学收集的数据制成的基准而完成。

[0146] 本发明的应激度信息获取装置及应激度判定方法优选用在使用硫氧还蛋白类作为药物时在硫氧还蛋白类给药前评价或预测其效果、或在给药后评价或预测其效果方面。

[0147] 例如，图13及图14所示装置的存储装置中能预先存储给药有效的应激度的图案，比较该图案与从测定对象得到的数据，制作辅助预测测定对象的给药有效性的数据。

[0148] 另外，将与给药有效时或无效时相关的应激度变化的图案(例如经时变化)作为保存数据，预先存储在图13及图14的装置中。然后，使用该保存数据，比较来源于给药后的测定对象的数据与该应激度变化的图案，评价给药是有效的或能预测其有效。作为上述评价的基准利用的应激度的图案或应激度变化的图案也可以基于统计学收集的数据进行制作。

[0149] [实施例]

[0150] 下面举出实施例更加详细地说明本发明，本发明的方法并不仅限定于所述实施例。

[0151] 实施例1

[0152] NADPH酶电极系统

[0153] 图3表示本发明的测定硫氧还蛋白类的氧化型浓度、还原型浓度、或氧化型与还原型的浓度比的装置之一例。图3中上面表示的部分表示按从上方向下方的顺序展开各部件得到的平面图。图3的剖面图是在装置的垂直方向上的剖面图。图3表示使用酶电极的硫氧还蛋白的氧化型浓度感应器的感应部的基本结构之一例。

[0154] 该装置的感应部大致由反应槽盖1、反应槽壁2、基板3、绝缘层4构成。反应槽盖1由例如带有粘合剂的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)树脂构成，在其上设有作为试样的导入口和空气的排出口的开口5，分别位于反应槽6的对角。反应槽壁2由例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)构成，设计成基板3的电极7、8、9上能保持一定量的试样(举例为500μL)。基板3例如使用由聚酰亚胺构成的板材，在基板3上设置工作电极8、对电极9、参比电极7。
各电极通过通孔13连接在基板3的背面，通过导线11连接在集电垫12上。经预先覆铜的聚酰亚胺基板的镀覆、光刻而形成通孔13与导线11。

[0155] 作为工作电极8，使用实施了聚氨基苯胺处理的玻璃碳电极。从玻璃碳棒上切下薄片，用导电性糊料粘合在临时的基板(图上未标识)上。从背面引出导线，使用用于聚氨基苯胺处理的参比电极及对电极(图上未标识)，在含有0.01M的2-硝基苯胺的1.0M的硫酸水溶液中，用恒电位仪(potentistat)对作为工作电极8的玻璃碳的圆筒形薄片施加电位。将1.5V施加10秒、-0.5V施加50秒的循环反复1小时后，施加-0.5V电位10分钟，然后进行水洗，得到作为工作电极的电极。水洗后，从临时的基板上取下该电极，用导电性糊料粘合在感应器基板3上。对电极9通过在基板3上喷涂Ti/Pt进行成膜而制作。膜厚可以举出Ti 100nm、Pt 200nm作为一例。参比电极7如下进行制作：与对电极9相同地形成Ti/Pt后，进一步喷涂形成Ag层，然后进行氯化处理。Ag层的膜厚可以举出500nm作为一例。Ag层的厚度必须根据使用环境、时间进行最优化。作为Ag层的氯化处理是通过在FeCl3的50mM水溶液中浸渍10分钟而进行的。各电极上涂布一定组成、一定量的试剂层。试剂层通过预先混合一定量的酶以及根据需要混合酶载体、介体分子进行配制，并使其易溶于水溶液。下面说明试剂层配制法。

[0156] 配制混合了50nmol(相当于紫精分子)固定在藻酸中的紫精(viologen)衍生物、+1μmol NADPH、0.1单位铁氧还蛋白NADP 还原酶、1单位硫氧还蛋白还原酶的水溶液。对工作电极8滴加该水溶液后，用干燥槽干燥而形成。

[0157] 下面对该固定在藻酸层内的紫精衍生物的合成方法进行说明。

[0158] 在4，4’-联吡啶中加入等摩尔的碘甲烷、1，4-二溴丁烷，在110℃下、在高压釜中反应6小时。从得到的产物中减压蒸馏除去原料，将水溶性成分放入硅胶柱，得到作为目标物质的1-甲基-1’-溴丁基-4，4’-联吡啶溴化物、碘化物盐(BrBuV)。将28.7mg市售的藻酸钠(分子量为20000)与0.15mmol1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解在20mL水中。搅拌40分钟后，加入0.75mmol市售的聚环氧乙烷二胺，进一步搅拌1小时。将该溶液用水透析24小时，加入0.3mmol BrBuV，在5℃下用水透析12小时，由此得到固定在藻酸上的紫精衍生物。

[0159] 在测定之前配制氧化型、还原型的硫氧还蛋白。硫氧还蛋白的氧化型如下得到：在含有市售的硫氧还蛋白与足够量的过氧化物还原酶的磷酸缓冲液中加入足够量的过氧化氢，氧化硫氧还蛋白后，用凝胶过滤色谱法分离得到。另一方面，硫氧还蛋白的还原型如下得到：在含有足够量的硫氧还蛋白还原酶的磷酸缓冲溶液中添加足够量的NADPH，还原硫氧还蛋白后经凝胶过滤色谱法分离得到。

[0160] 将测定部连接在恒电位仪上，分别配制在50mM pH7.0的磷酸缓冲液中加入了硫氧还蛋白的氧化型的溶液、在50mM pH7.0的磷酸缓冲液中加入了硫氧还蛋白的还原型的溶液。调温至37℃，进行氮气鼓泡后，从测定部的注入口加入配制得到的溶液，对工作电极施加相对于参比电极为-0.9V的电位。以观测得到的稳恒电流量或累计电荷量为纵轴、添加的氧化型或还原型的硫氧还蛋白浓度为横轴，观测得到的电荷量具有图4所示的倾向。同一图中，41及43是表示氧化型的曲线、42及44是表示还原型的曲线。即，在缓冲液中加入了硫氧还蛋白的氧化型的试样，硫氧还蛋白浓度增大的同时，稳恒电流值或电荷量也增大。与此相反，在缓冲液中加入了硫氧还蛋白的还原型的试样，即使增大硫氧还蛋白的浓度，稳恒电流值或电荷量也不增大。总之，在氧化型的情况下，进行如图5所示的反应：硫氧还蛋白的氧化型通过硫氧还蛋白还原酶的催化作用从NADPH接受电子，成为还原型。该反应量与溶液中的硫氧还蛋白的氧化型的量、即溶液中能被还原的硫氧还蛋白的量成比例。与此相反，在还原型的情况下，由于硫氧还蛋白已经为还原型，故无法从NADPH接受电子。另外，使用该测定部对硫氧还蛋白的还原型量(R/mol)进行定量时，预先，作为前处理，向试样溶液中加入一定量的过氧化物还原酶与摩尔量大于预想的硫氧还蛋白还原型量的过氧化氢。
由此，预先使溶液中的硫氧还蛋白的还原型成为氧化型。其后，在系统中加入过氧化氢酶分解剩余的H2O2。然后按照与测定硫氧还蛋白的氧化型量时相同的方法测定电荷量(X/C)。接着可以使用溶液中的硫氧还蛋白的氧化型61的量(O/mol)与X，利用式(R)＝(X/2F)-(O)(F:法拉第常数)，求出试样中的还原型62的量。该情况下以算出的还原型量为纵轴、分别以氧化型、还原型溶液的硫氧还蛋白浓度为横轴时的曲线具有图6所示的倾向。同一图中，
61是表示氧化型的曲线，62是表示还原型的曲线。

[0161] 实施例2

[0162] NADPH比色系统

[0163] 图7是说明本发明的测定硫氧还蛋白类的氧化型浓度、还原型浓度、或氧化型与还原型的浓度比的装置，具体而言，是用于说明使用比色法的硫氧还蛋白的氧化型、还原型浓度感应器的基本步骤的图。该感应器具有构成反应区域的单元和检测装置，所述检测装置具有用于测定基于在单元中发生的反应的光学变化的光源74与受光元件76。使用该感应器的测定处理大致由光学单元的导入步骤、试样导入步骤、反应步骤、检测步骤、排出步骤组成。光学单元导入步骤71是将导入了反应试剂的光学单元固定在支架上。作为反应试剂之一例，可以举出溶解有硫氧还蛋白还原酶、NADPH的磷酸缓冲液。另外，作为浓度、量之一例，可以举出0.5mL含有0.1单位硫氧还蛋白、50nmol NADPH的0.1M pH7.0的磷酸缓冲液。试样导入步骤72是向光学单元内导入试样。导入的试样量，作为其一例可以举出0.5mL。在反应步骤73中，搅拌溶液，将单元保持在适于酶反应的温度(例如25℃)。此时的反应时间可以为足以使硫氧还蛋白的氧化型全部转化为还原型的时间(例如20分钟)，也可以准确测定从导入试样开始的时间，观测变化中的吸光度。检测步骤中使单色光源、多色光源、由光栅(grating)等分光多色光源得到的光通过光学单元，用受光元件检测透射光。排出步骤75是排出测定结束的光源单元。

[0164] 作为反应试剂使用0.5mL含有0.1单位硫氧还蛋白、50nmolNADPH的0.1M pH7.0的磷酸缓冲液。作为试样，使用含有0～10nmol硫氧还蛋白的氧化型或还原型的0.1M pH7.0的磷酸缓冲液各0.5mL。求出在25℃下使各试样反应20分钟时在检测部位处观测的吸光度。另一方面，使用0.5mL不含有硫氧还蛋白的磷酸缓冲液作为该试样的比较对象，求出在25℃下反应20分钟时在检测部位处观测的吸光度。以(比较对象)-(试样)的值为纵轴、加入的硫氧还蛋白的浓度为横轴，得到的吸光度具有图8所示的倾向。同一图中，81是表示氧化型的曲线，82是表示还原型的曲线。此处，NADPH在340nm处具有吸光系数-1 -1 +
为6220M cm 的吸收，与此相反，作为氧化型的NADP 不具有吸收。在缓冲液中加入了硫氧+
还蛋白的氧化型81的试样在硫氧还蛋白浓度增加的同时，因NADPH转化为NADP，使得在
340nm处的吸光度小于比较对象。与此相反，在缓冲液中加入了硫氧还蛋白的还原型82的试样即使增大硫氧还蛋白的浓度，NADPH的浓度也不发生变化，吸光度也不发生变化。总之，添加有硫氧还蛋白的氧化型的溶液进行图9所示的反应，即硫氧还蛋白的氧化型通过硫氧还蛋白酶的催化作用从NADPH接受电子，成为还原型。该反应量与溶液中的硫氧还蛋白的氧化型量、即在溶液中能被还原的硫氧还蛋白量成比例。与此相反，添加还原型的情况下，由于硫氧还蛋白已经为还原型，故难以从NADPH接受电子。

[0165] 另外，使用该感应器对硫氧还蛋白的还原型量(R/mol)进行定量时，作为前处理，预先向试样溶液中加入一定量的过氧化物还原酶与过氧化氢，使溶液中的硫氧还蛋白的还原型转化成为氧化型。其后，按照与测定硫氧还蛋白的氧化型量时相同的方法测定吸光度，算出与比较对象的差值(Y)。然后用添加的过氧化氢量(H/mol)、溶液中的硫氧还蛋白的氧化型量(O/mol)与对应于Y的NADPH量(Y’/mol)，根据式(R)＝(H)+(O)-(Y’)求出还原型的量。该情况下，以算出的还原型量为纵轴、氧化型、还原型溶液各自的硫氧还蛋白浓度为横轴的曲线具有图10所示的倾向。同一图中，101是表示氧化型的曲线，102是表示还原型的曲线。

[0166] 实施例3

[0167] 前处理

[0168] 从丙型肝炎患者及健康人的上臂采集血液，以3000rpm离心10分钟，得到血清。使用实施例1的电极测定该血清中的硫氧还蛋白的氧化型及还原型浓度。另一方面，采用市售的夹心(sandwich)ELISA法(Redox Bio Science公司制试剂盒)测定同样的血清的硫氧还蛋白浓度。此时的测定结果具有图11的倾向。即以硫氧还蛋白的氧化型浓度作为指标的情况，与以硫氧还蛋白总浓度为指标的情况相比较，个体差异小，提高对氧化应激的应答性。原因在于测定的硫氧还蛋白的总浓度与氧化应激的关系是经由1.氧化应激的发生、2.生物体对氧化应激的感知、3.硫氧还蛋白的诱导、4.硫氧还蛋白的浓度增大等多个步骤间接得到的。与此相反，硫氧还蛋白的氧化型浓度因硫氧还蛋白被氧化而直接增加，直接反映施加的氧化应激。因此，与测定硫氧还蛋白的总量相比，个体差异小，认为能进行响应度高的氧化应激的评价。

[0169] 实施例4

[0170] 应激评价

[0171] 图12是评价氧化应激之一例，是以硫氧还蛋白的总浓度为纵轴，硫氧还蛋白的氧化型/还原型比为横轴得到的图。此处，可以认为属于符号A表示的区域的人可能受到强氧化应激，该氧化应激起因于疾病时，可以认为作为药物给与的硫氧还蛋白具有改善症状的可能性。可以认为属于符号B所示区域的人存在下述可能性：虽然硫氧还蛋白的浓度高，但没有受到强氧化应激；或虽然过去受过强氧化应激，但现在正下降。另外，也可以认为属于该符号B所示区域的人即使患有产生氧化应激的疾病，作为药物给与的硫氧还蛋白改善症状的可能性也不高。原因在于体内已经大量存在还原型的硫氧还蛋白时，即使进一步从外部给与硫氧还蛋白，减轻氧化应激的可能性也并不是那么高。然后，可以认为属于符号C表示的区域的人，所有指标均表示没有受到强氧化应激的可能性高。最后，属于符号D表示的区域的人，仅在硫氧还蛋白的总浓度的判断中判断为没有受到强氧化应激的可能性高。但是，可以认为存在下述可能性：最近受到过强氧化应激的可能性，即处于从硫氧还蛋白被诱导至硫氧还蛋白的总浓度上升的过渡期的可能性；和为硫氧还蛋白的诱导能力低的体质的可能性。属于该符号D表示的区域的人患有产生氧化应激的疾病时，作为药物给与的硫氧还蛋白改善症状的可能性高。

[0172] 由此，与以硫氧还蛋白总浓度为指标时的情况相比较，导入硫氧还蛋白的氧化型/还原型比作为进一步的指标。结果可以得到一些新的有用的数据，如氧化应激对生物体当时的影响、施加氧化应激的时期、硫氧还蛋白用作药物时的有效性等。

[0173] 实施例5

[0174] 酶电极还原型测定系统

[0175] 图15是表示本发明的测定硫氧还蛋白类的还原型浓度、氧化型浓度或氧化型与还原型的浓度比的装置之一例。测定电极部位的基本结构与图3所示装置相同，不同点在于：工作电极8的制作方法不同，没有试剂层10，具有酶层14。下面以该不同点为中心对制作方法进行说明。

[0176] 工作电极8例如由碳电极、含有锇络合物的聚合物与固定在其上的酶组成。下面说明其配制方法。

[0177] 采用丝网印刷法将市售的碳糊料涂布在基板3上，通过UV-O3处理进行亲水化。在-2其上滴下混合了含有锇络合物的聚合物、酶、交联剂水溶液的液体(以50μLcm 作为滴下量之一例)，使其干燥，制作工作电极。作为滴下液的例子，可以举出由具有下述结构的化合物1、辣根过氧化物酶(Horse Radish Peroxidase)、聚乙二醇二缩水甘油基醚组成，作为浓-1 -1 -1
度的例子，可以分别举出5mgmL 、1mgmL 、0.2mgmL 。

[0178] [化合物1]

[0179]

[0180] 说明化合物1的制备方法。

[0181] 在带有回流管的100mL茄形烧瓶中，加入20mL乙二醇、0.08g(NH4)2[OsCl6]、0.38g4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶。然后，利用搅拌器搅拌，在氮气流下用微波合成器(Milestone microsynth)照射300W20分钟。将溶液冷却至室温后，加入25mL溶解有0.4g Na2S2O4的水。过滤在室温下搅拌1小时后生成的紫黑色沉淀，进行水洗，除去过量的盐。
其后，用二乙基醚清洗，除去未反应的配体，减压下加热到60℃，干燥，得到Os(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)2Cl2。

[0182] 在带有温度计、回流管的100mL三颈烧瓶中加入15mL水、2.63g丙烯酰胺、0.403mL1-乙烯基咪唑、0.069mL N，N，N’，N’-四甲基乙二胺。在氮气流下，进一步加入0.06g过硫酸铵。在水浴(water bath)中、40℃下加热30分钟，其后，将反应容器用空气冷却。在强烈搅拌下的500mL甲醇中滴入生成的粘稠液体，使其沉降，离心分离沉降物进行回收，加入能溶解沉降物的最小量的水，进行溶解，进一步在强烈搅拌下的500mL甲醇中滴入该水溶液使其沉降。再次离心分离沉降物，进行回收，在减压下、加热到60℃下，干燥得到聚丙烯酰
1
胺-聚乙烯基咪唑的7.49/1共聚物。经 HNMR测定(D2O)确定分子的生成、单元比。

[0183] 准备带有回流管的100mL茄形烧瓶。向其中加入25mL乙二醇、17.5mL乙醇、0.19g刚刚配制的Os(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)2Cl2、0.22g聚丙烯酰胺-聚乙烯基咪唑的共聚物。然后，用搅拌器搅拌，在氮气流下用微波合成器照射400W2小时。将溶液冷却到室温后，在强烈搅拌下的500mL二乙基醚溶液中滴入添加有20mL乙醇的溶液，在生成的粘稠沉淀中进一步加入20mL乙醇。将其再一次滴入在强烈搅拌下的500mL二乙基醚溶液中，在减压下、将得到的粘稠状沉淀加热到60℃进行干燥，得到作为目标物质的式(1)所示的络合物聚合物。

[0184] 作为酶层14例如使用在聚偏1，1-二氟乙烯膜上保持有过氧化物还原酶的层。保-2持量例如可以举出250单位cm 。其是将酶水溶液滴到膜上干燥而制得的。该膜被配置成覆盖工作电极8。

[0185] 将测定部连接在恒电位仪上，分别配制在50mM pH7.0的磷酸缓冲液中添加有硫氧还蛋白的氧化型的溶液、在50mM pH7.0的磷酸缓冲液中添加有硫氧还蛋白的还原型的溶液。调温至37℃，进行氮鼓泡后，从测定部的注入口添加配制的溶液，进一步加入摩尔量为预想的硫氧还蛋白的摩尔量的1～数倍的过氧化氢水溶液。对工作电极施加相对于参比电极为+0.2V的电位。以观测到的稳恒电流量或累计电荷量为纵轴、添加的氧化型或还原型的硫氧还蛋白浓度为横轴，观测到的电荷量具有图16的倾向。同图中，161是表示氧化型的曲线，162是表示还原型的曲线。即，在缓冲液中添加有硫氧还蛋白的还原型的试样在硫氧还蛋白浓度增加的同时，稳恒电流值或电荷量减少。与此相反，在缓冲液中添加有硫氧还蛋白的氧化型的试样即使增大硫氧还蛋白的浓度，稳恒电流值或电荷量也不减少。该含义能用图17进行说明。不存在硫氧还蛋白的还原型时，通过辣根过氧化物酶的催化反应与锇络合物的电子传递作用，可以在电极上观测到溶液中H2O2的氧化反应产生的电流、电荷。此处，如果在体系中存在硫氧还蛋白的还原型，则在酶层中进行在过氧化物还原酶的催化作用下硫氧还蛋白的还原型消耗溶液中的H2O2的反应。因此，存在硫氧还蛋白的还原型时，由H2O2氧化反应产生的电流、电荷降低，该降低量与溶液中硫氧还蛋白的还原型量、即溶液中能被氧化的硫氧还蛋白量成比例。与此相反，存在氧化型的情况下，由于硫氧还蛋白已经是氧化型，即使辣根过氧化物酶存在也不被氧化，所以即使增大硫氧还蛋白的氧化型的浓度，稳恒电流值或电荷量也不减少。

[0186] 另外，使用该测定部定量硫氧还蛋白的氧化型量(O/mol)时，作为前处理，预先在试样溶液中添加一定量的硫氧还蛋白还原酶与摩尔量比预想的硫氧还蛋白的氧化型量多的NADPH。由此，预先使溶液中的硫氧还蛋白的氧化型转化成为还原型。其后，向系统中导+入NADPH氧化酶与氧，使剩余的NADPH转化为NADP。之后按照与测定硫氧还蛋白的还原型量时相同的方法测定电荷量(X/C)。然后，使用溶液中的硫氧还蛋白的还原型量(R/mol)和X，利用式(O)＝(X/2F)-(R)(F：法拉第常数)求出试样中的氧化型量。该情况下以算出的还原型量为纵轴，以氧化型、还原型溶液各自的硫氧还蛋白浓度为横轴的图，具有图18的倾向。同图中，181是表示氧化型的曲线，182是表示还原型的曲线。

[0187] 实施例6

[0188] NADPH修饰电极系统

[0189] 图19是用于说明本发明的测定硫氧还蛋白类的氧化型、还原型浓度、或氧化型与还原型的浓度比的装置(具体而言，使用比色法的硫氧还蛋白的氧化型、还原型浓度感应器)的基本步骤的图。

[0190] 该感应器具有构成反应区域的单元和检测装置，所述检测装置具有用于测定基于在单元中发生的反应的电化学变化的电化学测定单元。使用该感应器的测定处理大致由试样的导入步骤191、试剂导入步骤192、反应步骤、反应溶液导入步骤、检测步骤、排出步骤195组成。

[0191] 试样导入步骤是将一定量的测定试样导入反应容器193。

[0192] 试剂导入步骤是将用于反应的试剂导入反应容器。

[0193] 作为反应试剂之一例可以举出溶解有硫氧还蛋白还原酶、NADPH的磷酸缓冲液。

[0194] 在反应步骤中，搅拌溶液，将单元保持在适合酶反应的温度，使试样与所加的试剂进行反应。

[0195] 此时的反应时间可以为足以使硫氧还蛋白的氧化型全部转化为还原型的时间(例如20分钟)，也可以准确测定从导入试样开始的时间，在随后的检测步骤中观测变化中的信号。

[0196] 然后，反应溶液导入步骤中，电化学单元不具备反应单元时，将反应后的溶液转移至电化学单元199。检测步骤是从恒电位仪196向金电极施加电位，检测并记录应答电流、电荷。然后排出步骤是将测定后的反应液排出。

[0197] 图20是表示本发明的测定硫氧还蛋白类的氧化型、还原型浓度或氧化型与还原型的浓度比的装置之一例的图。

[0198] 测定电极部位的基本结构与图3所示装置相同，不同点在于：工作电极8的制作方法不同，没有试剂层10。下面以该不同点为中心对制作方法进行说明。

[0199] 工作电极8例如由金电极、修饰在金电极上的分子例如(吡咯喹啉醌，pyrroloquinoline quinone，PQQ)组成。

[0200] 下面说明其配制方法。

[0201] 在基板3上以钛为基底蒸镀金，采用喷涂等进行制膜。通过UV-O3处理清洗金电极。在其上滴下胱胺(cystamine)水溶液，进行水洗。然后滴下含有偶联剂N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的PQQ的缓冲溶液，用缓冲溶液进行清洗。

[0202] 作为试剂使用0.5mL含有0.1单位硫氧还蛋白还原酶、50nmolNADPH的0.1M pH7.0的磷酸缓冲液。

[0203] 作为试样，使用含有0～10nmol硫氧还蛋白的氧化型或还原型的0.1M pH7.0的磷酸缓冲液各0.5mL。测定在25℃下使各试样反应20分钟时在检测部位处观测的电流值或电荷量。另一方面，使用0.5mL不含有硫氧还蛋白的磷酸缓冲液作为该试样的比较对象，求出在25℃下反应20分钟时在检测部位处观测的电流值或电荷量。

[0204] 将电极部连接在恒电位仪上，将反应液调温至37℃，进行氮气鼓泡后，从测定部的注入口加入配制得到的溶液，对工作电极施加相对于参比电极为0.2V的电位。

[0205] 以观测得到的稳恒电流量或累计电荷量为纵轴、添加的氧化型或还原型的硫氧还蛋白浓度为横轴，观测得到的电荷量具有图21所示的倾向。同一图中，211及213是表示氧化型的曲线、212及214是表示还原型的曲线。

[0206] 在缓冲液中加入了硫氧还蛋白的氧化型的试样，硫氧还蛋白浓度增大的同时，稳恒电流值或电荷量减少。与此相反，在缓冲液中加入了硫氧还蛋白的还原型的试样，即使增大硫氧还蛋白的浓度，稳恒电流值或电荷量也不减少。该现象可以用图22说明。

[0207] 在电极上观察到通过PQQ的起因于NADPH的氧化反应的电流，该电流值或电荷量与溶液中的NADPH的浓度成比例地增减。

[0208] 硫氧还蛋白为氧化型时，在硫氧还蛋白还原酶的催化作用下，被NADPH还原，溶液中的NADPH的浓度下降，与此相反，硫氧还蛋白为还原型时，由于已经不能被NADPH还原，故溶液中的NADPH的浓度不下降。

[0209] 另外，使用该感应器定量硫氧还蛋白的还原型的量(R/mol)时，作为如实施例2中所述的前处理，可以利用使溶液中的硫氧还蛋白的还原型预先成为氧化型的方法。

[0210] 产业上的可利用性

[0211] 根据本发明，可以提供测定硫氧还蛋白类的氧化型浓度、还原型浓度、或氧化型与还原型浓度的比率的装置，可以用作以上述项为指标进行应激评价的装置。

[0212] 用上述典型例对本发明进行了描述，应当理解为本发明并不限定于上述典型例。下述权利要求的范围与最宽的解释一致，包括全部的改良和等效的结构与功能。