结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌的方法

摘要

本发明以提供排除诊断上的假阳性的新颖的结核菌检测用引物和探针，以及提供使用它们简便、迅速并且高灵敏度地检测人型结核菌的方法为课题，涉及含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸；含有所述寡核苷酸的人型结核菌检测用引物和探针；以及以使用该引物和探针为特征的人型结核菌的检测方法。

权利要求

1.由以下引物组成的人型结核菌检测用引物对，(1)由序列号1所述的核酸序列、或者其互补序列组成的，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的引物；和(2)由序列号3所述的核酸序列、或者其互补序列组成的，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的引物，在所述引物中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鸟嘧啶、T表示胸腺嘧啶；另外，任意位置的T还可以被替换成表示尿嘧啶的U。

2.权利要求1所述的引物对，其通过标识物质被标识。

3.权利要求2所述的引物对，其中标识物质选自放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质或生物素。

4.人型结核菌检测用试剂盒，其包含权利要求1所述的引物对。

5.权利要求4所述的试剂盒，其中引物通过标识物质标识。

6.权利要求4所述的试剂盒，其还包含以由序列号1、序列号3、序列号6或序列号11所述的核酸序列、或其互补序列组成的，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为探针。

7.权利要求6所述的试剂盒，其中探针通过标识物质标识。

8.权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒由以下组合组成：

由序列号1所述的核酸序列或其互补序列组成的引物、由序列号3所述的核酸序列或其互补序列组成的引物、和由序列号6、序列号11所述核酸序列、或者其互补序列组成的探针。

9.权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒由以下组合组成：

由序列号1所述的核酸序列或其互补序列组成的引物、由序列号3所述的核酸序列或其互补序列组成的引物、和由序列号6、序列号11所述核酸序列、或者其互补序列组成的寡核苷酸的5’末端以报告色素标识的，3’末端以猝灭剂染料色素标识的标识探针。

说明书

结核菌检测用的引物和探针以及使用它们检测人型结核菌

的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及利用核酸扩增及其检测体系，在临床检查中检测人型结核菌：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，以下称为人型结核菌)的检测方法。

背景技术

[0002] 人型结核菌是导致人产生结核病的病原体，是被分类在分枝杆菌属(Mycobacterium)并具有抗酸性质的革兰氏阳性杆菌。结核病虽然近年显著减少，但是，最近产生了老年人的发病率上升、在没有经历过结核感染的年轻人中引起集体感染等重大问题。

[0003] 另一方面，除了人型结核菌以外，已知鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)等非结核性抗酸菌对人表现病原性。另外，在感染AIDS病毒的免疫缺陷者当中，非结核性抗酸菌引起疾病成了主要问题。由于这些非结核性抗酸菌病多数对抗结核药具有抗药性，所以在决定治疗方案时，鉴别诊断结核病和非结核性抗酸菌病是很重要的。但是，从临床症状、病理组织学的观点来看，鉴别结核病是非常困难的，因此诊断必须通过菌的鉴定来进行。

[0004] 在鉴别诊断结核病或非结核性抗酸菌病时，一般通过小川培养基分离培养样品，为了鉴定种而进一步采用进行生化试验的方法。然而，通常由于分枝杆菌属生长慢，培养时需要相当长的时间。因此，进行历来的基本方法的涂片试验或培养试验时，为了得到结核病与否的诊断结果，光是菌的分离培养就需要3～4周时间，然后在鉴定种的各种试验中还需要2～3周时间。

[0005] 另外也有使用针对分枝杆菌属的抗原的抗体的结核菌检测法，但是，由于分枝杆菌属种之间的交叉反应，欠缺相对于结核菌的特异性，灵敏度也不够。

[0006] 近年，利用聚合酶链反应(PCR)等的核酸扩增技术的诊断技术作为有用的方法被研究，也研究了可以被利用到结核菌的诊断中，研究了结核菌DNA基因组的各区域是否在用PCR进行的结核菌检测中可以用作靶标。

[0007] 例如报道了检测编码分枝杆菌属的65千道尔顿抗原的基因区域的方法(例如参照非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4、非专利文献5)。然而，已知65千道尔顿抗原基因除了在人型结核菌中具有以外，在鸟分枝杆菌(M.avium)(鸟型结核菌)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、BCG和海分枝杆菌(M.marinum)等同属菌中也具有。尤其是，由于与非结核性抗酸菌病的典型的病原菌鸟分枝杆菌或堪萨斯分枝杆菌的交叉性高，因此检测65千道尔顿抗原基因的方法作为特异地检测人型结核菌的方法还存在问题。

[0008] 另外，研究了使用自牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)DNA鉴定的序列-编码MPB70蛋白质的基因序列进行结核分枝杆菌的鉴定的试验方法(例如，参照非专利文献6)。然而，Kulski等人在FEMS MicrobiolLett.1997年3月1日；148(1)：43-48(非专利文献
7)报道了其结果，已知其中进行的PCR检验结果在以MPB70蛋白质作为靶标时，与堪萨斯分枝杆菌的DNA中存在的类似序列产生交叉反应，该方法在特异地检测人型结核菌检测中也存在问题。

[0009] 此外，报道了编码蛋白质抗原b(Pab)的基因序列作为标记的结核分枝杆菌/牛分枝杆菌的检测方法(例如参照非专利文献8)，证实了以结核分枝杆菌/牛分枝杆菌检测目的使用该标记的有效性。但是，由于考虑到Pab基因在结核基因组中仅存在一个拷贝，因此不太优选作为核酸扩增的靶标材料(相对地，后述的IS6110序列在核酸基因组中存在10个拷贝。)。

[0010] 此外，报道了IS6110作为探针的RFLP(限制性片段长度多态性)可以在结核菌的诊断中使用(例如参照非专利文献9)，并且可以作为结核的流行病学调查的重要工具在世界各国中被使用。IS6110是结核菌特有的插入序列，在染色体DNA中存在多个IS6110，其在每种菌株中的数目、位置不同，其特性在一定程度上稳定地遗传下去。其结果是根据菌株的不同而显示不同的RFLP型，也可以分为衍生的组。直至目前为止，很多报道涉及使用IS6110的结核检测方法，报道了具有超过75％的灵敏度和接近100％的特异性。但是，另一方面，研究结果也报道了在使用IS6110的检测方法中，存在产生假阳性的问题(非专利文献10)。另外，也有对IS6110设计特异的引物而进行PCR的检测方法(例如参照专利文献1、专利文献2、专利文献3、专利文献4)，但存在涉及结核分枝杆菌以外的来自分枝杆菌属的与IS6110相关的序列也扩增的问题。另外，IS6110样序列也存在于结核菌以外的其他微生物中，在以IS6110作为靶标的检测方法中，暗示了这些微生物也被检测出来的问题。因此，历来检测IS6110的方法在特异地检测各种人型结核菌方面是不充分的，并存在问题。

[0011] 由以上看出：目前的情况是期望确立一种新的特异地检测人型结核菌的方法。

[0012] 专利文献1：特表平5-507617号公报

[0013] 专利文献2：特表平11-514522号公报

[0014] 专利文献3：日本专利第2814422号公报

[0015] 专利文献4：美国专利第5370998号说明书

[0016] 专利文献5：特开昭60-500717号公报

[0017] 专利文献6：特开昭60-281号公报

[0018] 专利文献7：美国专利第5210015号说明书

[0019] 专利文献8：美国专利第5538848号说明书

[0020] 专利文献9：美国专利第5,801,155号说明书

[0021] 专利文献10：美国专利第5925517号说明书

[0022] 专利文献11：美国专利第6,492,121号说明书

[0023] 专利文献12：日本专利第2650159号公报

[0024] 专利文献13：特公平7-114718号公报

[0025] 专利文献14：特开昭58-40099号公报

[0026] 专利文献15：特开昭62-265999号公报

[0027] 非专利 文献1：Chia等 人，J.Clin.Microbiol.，1990年，第28卷，第 9期，1877-1880页；

[0028] 非专利文献2：Brisson-Noel等人，Lancet，1989年，第334卷，p.1069-1071[0029] 非专利文献3：Hackel等人，Molecular and cellular Probes，1990年，第4卷，p.205-210

[0030] 非专利文献4：Woods，Cole，FEMS Mycrobiology Letters，1989年，第65卷，p.305-310

[0031] 非专利文献5：Hance等人，Molecular Microbiology，1989年，第3卷，第7期，p.843-849

[0032] 非专利文献6：Kulski等人，J.Clin Microbiol.，1995年，第33期，p.668-674[0033] 非专利文献7：Kulski等人，FEMS Microbiol Lett.1997年3月1日，第148卷，第1期，p.43-48

[0034] 非专利文献8：Sjobring等人，J.Clin.Microbiol.，1990年，第28卷，第10期，p.2200-2204

[0035] 非 专利 文 献9：Hermans PWM等 人，J.Clin.Microbiol.，1990年，第28 卷，p.2051-2058

[0036] 非专利文献10：Lee等人，Neurological Sciences，1994年，第123卷，p.173-179[0037] 非专利文献11：Thierry等人，Nucleic Acid Res.，1990年，第18卷，第1期，p.188

[0038] 非专利文献12：Nucleic Acids Res.，1986年，第14卷，p.6115-6128[0039] 非专利文献13：Kent PT，Kubica GP，Pubric HealthMycobacteriology，A Guild for the Level III laboratory，U.S.Department ofHealth and Human Services，Public Health Service，Center for DiseaseControl，Atlanta，U.S.A.，1985年，p.31-55发明内容

[0040] 发明欲解决的课题

[0041] 鉴于上述情况，本发明的目的是提供一种排除诊断上的假阳性的新颖的结核菌检测用引物，和使用该引物简便、迅速且准确度高地检测人型结核菌的检测方法。

[0042] 用于解决课题的手段

[0043] 本发明以解决上述课题为目的并已完成了发明，包括以下内容。

[0044] (1)含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8中所述的核酸序列(其中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鸟嘌呤、T表示胸腺嘧啶。另外，任意位置的T可以被尿嘧啶(U)替换。下同)的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。

[0045] (2)一种人型结核菌检测用引物，含有寡核苷酸，该寡核苷酸含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5中所述的核酸序列的部分或全部、或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交。

[0046] (3)一种人型结核菌检测用探针，含有寡核苷酸，该寡核苷酸含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8中所述的核酸序列的部分或全部、或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交。

[0047] (4)一种人型结核菌的检测方法，其特征在于：使用寡核苷酸作为引物和/或探针，该寡核苷酸含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5中所述的核酸序列的部分或全部、或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交。

[0048] (5)一种人型结核菌检测用试剂盒，包括含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5中所述的核酸序列的部分或全部、或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物和/或探针。

[0049] 本发明人对直至目前所确定的人型结核菌和其他生物的各种基因，反复进行各属种之间的各基因序列的同源性的理论验证和实验验证，结果发现存在这样的碱基序列，所述碱基序列特异地与人型结核菌的插入重复序列-IS6110序列的特定区域杂交，是对人型结核菌的检测有用的碱基序列。

[0050] 对这些发现作进一步深入的研究，结果研发了对人型结核菌具有特异性、并用于其检测的寡核苷酸(序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7和序列号8中所述的核酸序列)和利用它们的人型结核菌检测用核酸引物和标识探针，并确立使用它们的人型结核菌的检测方法。

[0051] 发明效果

[0052] 根据本发明的人型结核菌的检测方法，与历来使用的IS6110作为靶标的结核菌的检测方法相比，可能排除诊断上的假阳性，并且可能以更高的特异性和精确度检测人型结核菌。

[0053] 附图简述

[0054] [图1]是实施例1中所得的电泳结果。另外，各泳道的数字分别表示分别使用以下的试样时的结果。M4：分子量标记(标记4)、a：大肠菌(Escherichia coil)、b、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，人型结核菌)、c、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、i：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、j：胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)、l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、m：无色分枝杆菌(Mycobacteriumnonchromogenicum)、n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)、p：偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)、q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、s：Mybacterium peregrinum。

[0055] [图2]是实施例2中所得的电泳结果。另外，各泳道的数字分别表示分别使用以下试样时的结果。M1：分子量标记(标记1)、M4：分子量标记(标记4)、a：大肠杆菌(Escherichia coil)、b、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，人型结核菌)、c、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacteriumscrofulaceum)、g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、i：鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)、l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、m：无色分 枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)、n：地 分枝杆 菌(Mycobacterium terrae)、o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)、p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、s：Mybacterium peregrinum。

[0056] [图3-1]是比较例1中所得电泳图。另外，各泳道的数字分别表示分别使用以下试样时的结果。另外，当使用无色分枝杆菌(Mycobacteriumnonchromogenicum)作为试样时(m)的条带用虚线圆圈起来表示。另外，当使用次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)作为试样时(o)的条带用箭头指向的虚线圆圈起来表示。M1：分子量标记(标记1)、M4：分子量标记(标记4)、a：大肠杆菌(Escherichia coil)、b、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、c、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansasii)、d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)、f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacteriumscrofulaceum)、g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)、h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、i：鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)、j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)、l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)、n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、o：次要分枝杆菌(Mycobacteriumtriviale)、p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、r：
脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、s：Mybacterium peregrinum(peregrinum分枝杆菌)。

[0057] [图3-2]表示对次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)试样进行上述电泳所得的部分(o)中，对扩增片段的大小判断为与人型结核菌的阳性条带非常相似的部分的PCR产物进行纯化、分析得到的核酸序列列表。其中，源自部分(b)的人型结核菌的PCR产物的序列作为第一核苷酸序列，为了比较，表示在序列表的上段。另外，自部分(o)所得的次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)来源的PCR产物的序列作为第二核苷酸序列，表示在序列表的下段。

[0058] [图4]表示在实施例3中进行的实时PCR检测结果，绘制相对各PCR用DNA试样的基因组的拷贝数(x轴、对数值)的Ct值(y轴)的校正曲线。

[0059] [图5]是实施例4所得的电泳的结果。另外，各泳道的数字分别表示分别使用以下的试样时的结果。M：分子量标记、(1)没有试样、(2)人型结核菌+鸟分枝杆菌(M.avium)+胞内分枝杆菌(M.intracellulare)+堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、(3)人型结核菌、(4)鸟分枝杆菌(M.avium)+胞内分枝杆菌(M.intracellulare)+堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、(5)人型结核菌(10个拷贝)+鸟分枝杆菌(M.avium)+胞内分枝杆菌(M.intracellulare)+堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、(6)鸟分枝杆菌(M.avium)、(7)人型结核菌+胞内分枝杆菌(M.intracellulare)+堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)。另外，在电泳模式的左边用箭头表示电泳方向，表示各扩增产物的部分的出现顺序。“TB”表示结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、“avium”表示鸟分枝杆菌(M.avium)、“intra”表示胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、“kansasii”表示堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)。

[0060] [图6]表示在实施例5中进行的实时PCR检测结果，绘制相对各PCR用DNA试样的基因组的拷贝数(x轴、对数值)的Ct值(y轴)的校正曲线。

[0061] 实施发明的最佳方式

[0062] 本发明涉及的人型结核菌的IS6110基因是由全长885个碱基对的碱基序列组成，例如在根据巴斯德研究所的报告“Nucleic Acid Res1990，No.18(1)，p.188”(非专利文献11)中记载了该全碱基序列。

[0063] 作为本发明涉及的寡核苷酸，可以列举含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸(以下，简称为本发明的寡核苷酸。)。

[0064] 作为本发明涉及的含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸，例如可以列举含有与序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列具有约70％或以上、优选约80％或以上、更优选约90％或以上、最优选约95％或以上的同源性的碱基序列的寡核苷酸，或特征在于含有序列表的序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部，并且由连续10个碱基或以上、优选20个碱基或以上组成的寡核苷酸。

[0065] 作为本发明涉及的含有相对序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部为互补序列的部分或全部的寡核苷酸，例如可以列举具有与含有本发明的序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂交的碱基序列的部分或全部的寡核苷酸。

[0066] 所谓上述的本发明涉及的具有与含有本发明的序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂交的碱基序列的部分或全部的寡核苷酸，具体地，可以列举具有在高严格的条件或严格的条件下，与含有本发明的序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸杂交的碱基序列的部分或全部的寡核苷酸等。

[0067] 另外，其中所谓的“高严格的条件”具体地是指例如在50％的甲酰胺中、42～70℃、优选60～70℃的杂交，然后在0.2～2×SSC、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)中、25～
70℃洗净的条件。

[0068] 另外，所谓的“严格的条件”具体地是指例如在6×SSC或与其等价的盐浓度的杂交溶液中，在50～70℃的温度条件下进行16小时的杂交，在6×SSC或与其等价的盐浓度的溶液等中根据需要进行预洗净后，在1×SSC或与其等价的盐浓度的溶液等中洗净的条件。

[0069] 所谓本发明涉及的与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸，可以列举前述的具有在高严格的条件或严格的条件下，与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的碱基序列的寡核苷酸等。该高严格的条件和严格的条件如前所述。

[0070] 另外，本发明的寡核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)。当然核糖核酸时，胸苷残基(T)与尿苷残基(U)可以相互替换。另外，也可以在合成时将任意位置的T变为U进行合成，得到含有尿苷残基的DNA。同样地也可以得到含有将任意位置的U变成T的胸苷残基的RNA。另外，也可以是1个或多个核苷酸的缺失、插入或替换，也可以是如肌苷(I)这样的修饰核苷酸。

[0071] 为了获得本发明的寡核苷酸，也可以使用通过本身公知的化学合成法制备的寡核苷酸。因此，相比克隆化的寡核苷酸或多核苷酸，更可以容易、大量且便宜地获得一定质量的寡核苷酸。

[0072] 例如，使用通常进行DNA合成的DNA合成仪，根据通常的磷酰胺(ホスホァミダィト)法合成寡核苷酸，根据使用阴离子交换柱色谱的常规方法进行纯化，可以得到作为目的的本发明的寡核苷酸。

[0073] 作为本发明涉及的人型结核菌检测用引物，可以列举具有含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5中所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的人型结核菌检测用引物(以下称为本发明的引物)。

[0074] 本发明的引物中使用的含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5中所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸的具体例子，可以是在前述的本发明的寡核苷酸的叙述中所述的。

[0075] 另外，本发明的引物，例如在符合作为目的的核酸杂交条件下，从含有序列号1～5中所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互补序列的部分或全部的寡核苷酸中，考虑解链温度(Tm值)等、可以以适当区域的适当长度使用。考虑到维持作为引物序列的特异性所需的碱基数，优选具有10个碱基或以上、更优选具有20个碱基或以上的长度。

[0076] 将本发明的引物作为在PCR等中使用的引物时，例如优选正向引物是含有序列号1或2中所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部的寡核苷酸，反向引物是含有序列号3或4中所述的核酸序列的部分或全部、或其互补序列的部分或全部的寡核苷酸。

[0077] 其中，正向引物优选序列号1或2中所述的核酸序列的寡核苷酸，反向引物优选序列号3或4中所述的核酸序列的寡核苷酸。

[0078] 作为特别优选的引物的组合，可以列举(a)正向引物是序列号1中所述的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是序列号3中所述的核酸序列的寡核苷酸的组合，或(b)正向引物是序列号2中所述的核酸序列的寡核苷酸、反向引物是序列号4中所述的核酸序列的寡核苷酸的组合。

[0079] 获得本发明的引物的方法是如获得前述的本发明的核苷酸的方法中所述的方法。

[0080] 本发明的引物也可以通过标识物质被标识。

[0081] 作为用于通过标识物质标识本发明的引物的标识物质，可以使用放射性同位素或酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标识物质中的任一种。

[0082] 例如，作为放射性同位素，可以列举32P、33P、35S等；作为酶，可以列举碱性磷酸酶、西洋辣根过氧化物酶等；作为荧光物质，可以列举花菁染料(Cyanine Dye)系的Cy3、Cy5(Amasham Bioscience公司)、荧光素等；作为发光物质，可以列举含有吖啶嗡酯(Acridinium Ester)的化学发光试剂等。

[0083] 通过放射性同位素标识本发明的引物时，可以列举在合成引物时，通过掺入使用放射性同位素标识的核苷酸以标识引物的方法、或合成引物后，使用放射性同位素标识的方法等。具体地，可以列举通常使用较多的随机引物法、切口移位法、通过T4多核苷酸激酶的5′-末端标识法、使用末端转脱氧核苷酰酶的3′-末端标识法、RNA标记法等。

[0084] 通过酶标识本发明的引物时，可以使用使碱性磷酸酶、西洋辣根过氧化物酶等酶分子与标识的引物直接共价键合等该领域中常用的方法即直接标识法。

[0085] 通过荧光物质标识时，例如可以通过该领域中常用方法的标识技术掺入荧光素标识的核苷酸到引物上。另外，在具有连接臂的核苷酸作为序列的寡核苷酸的一员的替代方法(例如，参照非专利文献12)中，也可以通过荧光物质标识核苷酸。这时，也有通过特开昭60-500717号公报(专利文献5)中公开的合成法由脱氧尿苷化学合成5位上具有连接臂的尿苷，在上述寡核苷酸链中引入荧光物质的方法。

[0086] 通过发光物质标识的方法和通过生物素标识的方法，通常可以根据该领域中采用的发光标识或生物素标识核苷酸的常规方法进行。

[0087] 作为本发明涉及的人型结核菌检测用探针，可以列举含有寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的探针(以下称为本发明的探针)，该寡核苷酸含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交。

[0088] 在本发明的探针中使用的本发明的寡核苷酸的具体例子如前述的本发明的寡核苷酸的叙述中所述。

[0089] 本发明的探针例如在符合作为目的的核酸杂交条件下，由含有序列号1～8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互补序列的部分或全部的寡核苷酸，计算解链温度(Tm值)等，可以以合适的长度使用合适的区域。但是，考虑到使探针具有充分的特异性，同时为了维持作为探针序列的特异性所需的碱基数，优选具有10个碱基或以上，更优选20个碱基或以上的长度。

[0090] 另外，序列号6、序列号7或序列号8中所述的核酸序列是通过使用本发明的引物进行PCR而被扩增的核酸序列。例如，序列号6中所述的核酸序列是通过以序列号1中所述的核酸序列的寡核苷酸作为正向引物，序列号3中所述的核酸序列的寡核苷酸作为反向引物进行PCR而被扩增的序列；序列号7中所述的核酸序列是通过以序列号2中所述的核酸序列的寡核苷酸作为正向引物，序列号4中所述的核酸序列的寡核苷酸作为反向引物进行PCR而被扩增的序列；序列号8中所述的核酸序列是通过以序列号4中所述的核酸序列的互补链序列的寡核苷酸(序列号14)作为正向引物，序列号5中所述的核酸序列的寡核苷酸作为反向引物通过PCR而被扩增的序列。

[0091] 获得本发明的探针的方法如在获得前述的本发明的核苷酸的方法中所述。

[0092] 本发明的探针可以通过标识物质被标识。

[0093] 作为通过标识物质标识本发明的探针中所使用的标识物质，可以使用放射性同位素或酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标识物质的任一种。

[0094] 标识本发明的探针的标识物质的具体例子和标识方法如在本发明的引物的标识方法的叙述中所述。

[0095] 另外，作为后述的实时PCR检测法中使用的标识探针，可以列举通过在实时检测法中通常使用的标识物质对本发明的探针进行了标识的探针。例如，可以列举5′末端使用报告荧光物质(羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)等)标识的，3′末端使用猝灭剂染料(例如羧基四甲基若丹明(TAMRA)等荧光物质、Black Hole Quencher染料BHQ，4-((4-二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等的非荧光物质)标识的本发明的寡核苷酸。

[0096] 作为在本发明涉及的人型结核菌的检测中使用的试样，可以列举人的痰、血液、经支气管采样等的各种临床材料。另外，也可以是从样品中分离培养的培养菌、自它们分离纯化的核酸、或通过核酸扩增检测体系等被扩增的核酸。

[0097] 从上述试样提取、纯化DNA可以依据从样品中提取抗酸菌(结核菌)DNA中使用的常规方法进行。

[0098] 例如在以菌体作为试样时，例如可以列举通过SDS等表面活性剂或硫氰酸胍(GTC)等蛋白变性剂处理菌体以破坏结核菌的膜结构的方法、通过玻璃珠等物理压碎菌体的方法等。

[0099] 以痰作为试样时，作为前处理，可以通过美国疾病管理预防中心(Centers for Disease Control and Prevention，简称CDC)推荐的NALC(N-乙酰-L-半胱氨酸)-NaOH法(非专利文献13)进行样品的均质化。

[0100] 然后，可以通过一般的DNA制备法(酚/氯仿提取、乙醇沉淀法等，Rapid and simple method for purification of nucleic acids，J.Clin.Microbiol.，1990年3月；28(3)，495-503，Boom R，Sol CJ，Salimans MM，Jansen CL，Wertheim-van Dillen PM，van der Noordaa J)进行DNA的提取和纯化。

[0101] 从样品中分离、培养的培养菌用作检测人型结核菌的试样时的例子有例如收集小川培养基上的菌落，悬浮在灭菌蒸馏水中，离心分离收集菌体后，再悬浮在蒸馏水中，高压灭菌釜处理后，经菌体的粉碎处理(通过玻璃珠进行物理压碎等)，再离心分离回收上清液。从所得的上清液中可以提取纯化DNA。对于DNA的提取纯化，由于市售有各种试剂盒，因此可以使用这些试剂盒进行，也可以根据该领域中的常规方法(例如，酚/氯仿提取法、使用乙醇或异丙醇等使沉淀的方法等)进行。例如，可以使用(株)キァゲン制离子交换树脂类型的DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip等进行DNA的提取、纯化。

[0102] 作为本发明涉及的人型结核菌的检测方法，可以列举将含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5中所述的核酸序列的部分或全部，或含有其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物和/或探针的方法(使用本发明的引物和/或探针的方法)。

[0103] 例如，使用本发明的引物，使其与试样中的核酸杂交，通过DNA聚合酶等进行核酸扩增(例如PCR；专利文献6)使引物延伸，因为对于人型结核菌，可以使IS6110核酸序列的特异区域的序列扩增，通过测定所得引物延伸物，可以检测人型结核菌。

[0104] 作为本发明涉及的使用本发明的引物检测人型结核菌的检测方法的具体例子，可以列举“人型结核菌的检测方法，其特征在于：包括下述步骤(i)使用含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5中所述的核酸序列的部分或全部，或含有其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物(本发明的引物)，以试样中的核酸作为模板进行PCR，(ii)对于上述(i)所得的引物延伸物进行电泳，由其结果判断有无人型结核菌”。

[0105] 在上述方法中使用的本发明的引物的具体例子如前所述。

[0106] 优选地，可以列举以含有序列号1或2中所述的核酸序列的部分或全部、或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为正向引物，以含有序列号3或4中所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为反向引物。

[0107] 使用上述引物的PCR、及接下来进行电泳法的条件、操作方法等可以参照该领域中通常使用的常规方法。

[0108] 作为进行电泳并由其结果判断有无人型结核菌的方法，例如可以例举(a)通过确认目标碱基对数的引物延伸物部分来判断的方法、(b)通过使用标识探针的杂交来判断的方法等。

[0109] 作为(a)通过确认目标碱基对数的引物延伸物部分来判断的方法，例如可以列举使用序列号1所述的寡核苷酸作为正向引物，使用序列号3所述的寡核苷酸作为反向引物，进行PCR后，对所得的引物延伸物进行电泳，对确认有178个碱基对部分的试样判断为阳性的方法。

[0110] 另外，例如也可以是使用序列号2所述的寡核苷酸作为正向引物，使用序列号4所述的寡核苷酸作为反向引物，进行PCR后，对所得的引物延伸物进行电泳，对确认有182个碱基对部分的试样判断为阳性的方法。

[0111] 另外，例如也可以是使用序列号14所述的寡核苷酸作为正向引物，使用序列号5所述的寡核苷酸作为反向引物，进行PCR后，对所得的引物延伸物进行电泳，对确认有324个碱基对部分的试样判断为阳性的方法。

[0112] 作为通过使用(b)的标识探针的杂交进行判断的方法，例如，可以列举在进行电泳后，对于所得的电泳部分，进行使用标识物质标识的标识探针与本发明的核苷酸的杂交，通过检测该标识探针的标识，确认与该标识探针杂交的部分是否存在，以判断阳性的方法。

[0113] 例如，可以列举以使用序列号1所述的寡核苷酸作为正向引物，使用序列号3所述的寡核苷酸作为反向引物进行PCR的情况为例，PCR后，进行电泳，对于所得的部分，进行使用标识物质标识的标识探针与含有序列号6中所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交，通过检测该标识探针的标识，确认与该标识探针杂交的部分是否存在，以判断阳性的方法。

[0114] 另外，使用序列号2所述的寡核苷酸作为正向引物，使用序列号4所述的寡核苷酸作为反向引物进行PCR时，PCR后，进行电泳，对于所得的部分，进行使用标识物质标识的标识探针与含有序列号7所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交，通过检测该标识探针的标识，确认与该标识探针杂交的部分是否存在，以判断阳性的方法。

[0115] 另外，使用序列号14所述的寡核苷酸作为正向引物，使用序列号5所述的寡核苷酸作为反向引物进行PCR时，PCR后，进行电泳，对于所得的部分，进行使用标识物质标识的标识探针与含有序列号8所述的核酸序列的寡核苷酸的杂交，通过检测该标识探针的标识，确认与该标识探针杂交的部分是否存在，以判断阳性的方法。

[0116] 可以列举下述例子来详细说明本发明涉及的人型结核菌的检测方法：例如进行PCR以及电泳后，其中PCR使用序列号2所述的寡核苷酸作为正向引物，序列号4所述的寡核苷酸作为反向引物，通过确认目标碱基对数的引物延伸物部分的方法进行检测，如下所述。

[0117] 首先，根据前述方法，从应该检出人型结核菌的试样中得到纯化的DNA试样。另外，通过前述的方法，从本发明涉及的核苷酸，使用DNA合成仪，根据磷酰胺法，合成序列号2所示的序列(以下称为IS_F6)和序列号4所示的序列(以下称为IS_R6)的寡核苷酸。

[0118] 制备含有各0.2～2.0μm的IS_F6和IS_R6、1.0～4.0mM MgCl2、80mMKCl、500μg/mL BSA、0.1％胆酸钠、0.005～0.2％Triton X-100(トリトンX-100、聚氧乙烯辛苯基醚、rohm-and-haas公司商品名)、分别为0.1～0.6mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和
10～80单位/mL的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，作为PCR用反应液。

[0119] 向PCR用反应液中添加1ng纯化的DNA试样使用作PCR用试样，通过DNA热循环仪，进行20-40次PCR。对PCR后所得的5μL反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。接着溴化乙锭染色后，用紫外线检测荧光。另外，分子量标记也与反应液一起迁移，通过比较相对迁移程度，计算出被检测的DNA片段的长度。在使用IS_F6作为正向引物和IS_R6作为反向引物的PCR中，预测IS6110的核酸序列中的182个碱基对的DNA片段(序列号7)被复制。其中，182个碱基对的荧光条带被确认的试样可以判断为阳性。

[0120] 作为本发明涉及的使用寡核苷酸作为引物的人型结核菌的检测方法的其他实施方式，可以列举将本发明的引物使用前述方法标识的标识引物，进行以试样中的核酸作为模板的PCR，在通过测定所得引物延伸物的标识可以检测到标识的情况下，判断人型结核菌阳性的方法。

[0121] 上述方法中，在进行PCR后，除去游离的标识引物，测定引物延伸物的标识，可以检测到标识时，判断为人型结核菌阳性。

[0122] 作为除去游离的标识引物的方法，可以列举通过使核酸沉淀的常规方法(乙醇沉淀法、使用异丙醇的沉淀法等)使进行PCR后所得的反应物中的引物延伸物沉淀，然后除去含有未沉淀的游离标识引物的上清液的方法。

[0123] 另外，也可以列举在适当的条件下，通过凝胶层析法处理进行PCR反应所得的反应物，分离引物延伸物和游离的标识引物的方法，通过电泳分离的方法等。

[0124] 对于本发明的人型结核菌的检测方法，也可以使用实时扩增检测体系(例如参照专利文献7、专利文献8的记载)。

[0125] 作为通过实时扩增检测体系的检测体系例子，可以列举实时PCR检测体系。

[0126] 例如，可以在本发明的人型结核菌的检测方法中使用TaqManTM实时PCR法(例如参照专利文献8的记载)、MGB Eclipse Probe System法(例如参照专利文献9的记载)、Molecular Beacons Probe Technology法(例如参照专利文献10的记载)、LUX Fluorogenic Primer法(InvitrogenCorporation)、Quenching probe-PCR(QP)法(例如参照专利文献11的记载)等各种实时PCR检测法。

[0127] 更加具体地，通过使用以FAM标识5′末端，TAMRA标识3′末端的探针的TaqManTM实时PCR法(例如参照专利文献8的记载)，可以高灵敏度且定量地检测目标的微量的DNA。

[0128] 即，使用含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5中所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物(本发明的引物)，使用含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8中所述的核酸序列的部分或全部或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的5′末端通过报告荧光染料被标识，3′末端通过猝灭染料被标识的寡核苷酸作为标识探针，试样中的核酸作为模板，进行PCR，通过检测从该标识探针游离的标识物质而进行的方法。

[0129] 上述TaqManTM实时PCR法的原理如下所示。可以使用通过荧光染料(报告分子)标识5′末端，猝灭染料标识3′末端的、在目标基因的特定区域杂交的寡核苷酸探针。该探针在通常的状态下，通过猝灭染料抑制报告分子的荧光。在完全使该荧光标识探针与目标基因杂交的状态下，从其外侧使用TaqDNA聚合酶进行PCR。如果通过TaqDNA聚合酶进行延伸反应，则荧光标识探针由于该核酸外切酶活性而自5′端水解，报告染料游离，发出荧光。实时PCR法通过实时地监测该荧光强度，可以正确地测定模板DNA的初期量。

[0130] 作为本发明涉及的实时PCR检测体系中使用的、通过荧光染料(报告分子)标识5′末端、猝灭染料标识3′末端的探针中使用的探针，可以是前述的本发明的探针，或由所述探针序列设计的探针。例如，可以列举由序列号6设计的序列号11所示的序列。另外，作为标识5′末端的报告荧光物质，可以列举FAM、HEX、TET等，其中优选FAM。作为标识3′末端的猝灭染料，可以列举TAMRA等荧光物质、BHQ、DABCYL等非荧光物质，其中优选TAMRA。

[0131] 作为本发明涉及的实时PCR检测体系中使用的正向引物的优选例子，可以列举含有序列号1或2中所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸，作为反向引物的优选例子，可以列举含有序列号3或4中所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸。

[0132] 实时PCR检测体系中所使用的其他的脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂，可以使用在通常的实时PCR中所使用的试剂，实时PCR技术除了使用本发明的引物和探针以外，也可以根据实时PCR的一般方法进行。

[0133] 阐述本发明涉及的通过实时PCR检测体系(TaqManTM实时PCR法)检测人型结核菌的检测方法的例子如下所示。

[0134] 首先，根据前述方法，从可以检测人型结核菌的试样中制得纯化的DNA试样。另外，使用DNA合成仪，通过磷酰胺(ホスホァミダィト)法合成序列号1所示的序列(IS_F5)、序列号3所示的序列(IS_R5)的寡核苷酸。

[0135] 另外，自通过使用IS_F5和IS_R5作为引物进行PCR而扩增的序列号6的寡核苷酸设计用作探针的序列(序列号11)，合成该序列的寡核苷酸。通过常规方法将报告染料FAM键合至该寡核苷酸的5′末端，将报告消光体TAMRA键合至该寡核苷酸的3′末端，制得荧光标识探针。

[0136] 使用上述制备的IS_F5作为正向引物，IS_R5作为反向引物，例如如下所示进行实时PCR。

[0137] 即，制备含有各1μM的引物IS_F5和引物IS_R5、100～1000nM荧光标识探针、1.0～4.0mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1％胆酸钠、0.005～0.2％TritonX-100、分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10～80单位/mL的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为反应液。向20μL反应液中加入1ng纯化的DNA试样作为TM
PCR用试样，加入到96孔反应板的孔中，使用TaqMan PCR专用实时PCR检测装置进行实时PCR。反应进行30～50个循环，测定每次循环报告染料的发光量。

[0138] 在人型结核菌的判断中，测定报告染料的发光量时，可以判断人型结核菌阳性。

[0139] 另外，在实时PCR法中，由于可以制作校正曲线，因此可以制得试样中的人型结核菌的基因组DNA的数目(拷贝数)。另外，由于该数目与人型结核菌的数目成比例，因此也可以得到试样中的人型结核菌的数目。校正曲线的制作方法可以参照实时PCR方法中通常进行的常规方法进行。例如，使用拷贝数已知的人型结核菌的基因组DNA试样作为标准，制备稀释系列的浓度(拷贝数)的PCR用DNA试样。接着，使用各稀释系列的PCR用DNA试样，根据上述方法进行实时PCR，测定报告染料的发光量。在各个稀释系列的PCR用DNA试样中，绘制相对PCR的各个循环数(x轴)测定的发光量的测定值(Rn、y轴)，制作成扩增曲线。接着，选择发光量呈指数函数地扩增的Rn部，引入临界线(Threshold line)(Th)。Th和各个PCR用DNA试样的扩增曲线的交叉点为临界循环(Thresholdcycle)(Ct)值。接着绘制相对使用的各个PCR用DNA试样的拷贝数的对数值(x轴)的Ct值(y轴)，对应各Ct所得的近似曲线可以作为校正曲线。

[0140] 对于定量试样中的人型结核菌的基因组DNA的数目(拷贝数)，首先，从可以检测人型结核菌的试样中分离纯化DNA，然后，对所得的DNA试样进行实时PCR，同样地制作扩增曲线。得到在制作校正曲线时的Th和所得扩增曲线交叉的Ct值。通过将该Ct值应用于校正曲线，由此可以获得试样中的人型结核菌的基因组DNA量(拷贝数)。

[0141] 另外本发明在核酸扩增步骤中，可以应用利用RNA转录产物的检测法。例如，可以列举NASBA(基于核酸序列的扩增)法(专利文献12)、3SR(自我维持的序列扩增)法(专利文献13)等，其中利用逆转录酶和RNA聚合酶的协同作用(逆转录酶和RNA聚合酶在协同地作用的条件下反应)的特定温度核酸扩增法适用于测定系统的自动化。

[0142] 另外，作为本发明的人型结核菌的检测方法，可以列举通过标识物质标识含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号6、序列号7或序列号8中所述的核酸序列的部分或全部、或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)作为标识探针，使该标识探针与试样中的核酸杂交，除去游离的标识探针后，检测杂交复合体的标识的方法。

[0143] 具体地，可以列举例如(a)将本发明的寡核苷酸结合在固相载体上，用作捕捉探针，使其与试样中的核酸杂交，使试样中的人型结核菌衍生的核酸固定在固相上的检测法(例如，参照专利文献15的记载)，(b)使用(a)的捕捉探针和本发明的标识探针，使其与试样中的核酸杂交，在固相载体上形成捕捉探针和人型结核菌衍生的核酸和标识探针的复合体，进行测定标识探针的夹心试验(例如，参照专利文献14的记载)的方法等。或者也可以使用(c)使用生物素标识的本发明的标识探针，与试样中的核酸杂交后，通过抗生物素蛋白结合载体捕捉试样中的人型结核菌衍生的核酸的方法。

[0144] 另外，在本发明的人型结核菌的检测方法中所使用的试剂中，可以使用通常在该领域中所使用的试剂类，例如缓冲剂等稳定剂、防腐剂等不会妨碍共存试剂等的稳定性、不会妨碍PCR或杂交反应的试剂。另外，其浓度也适宜选择通常在该领域中经常使用的浓度范围。

[0145] 如果列举缓冲液的具体例子，完全可以列举例如三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸缓冲液、良好缓冲液(グッド緩衝液)等在实施通常的PCR或杂交反应时所使用的缓冲液，其pH也没有特别的限制，通常优选5～9。

[0146] 另外，根据需要，可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、对TM应酶的基质(dNTP、rNTP等)、或者双链嵌入剂(溴化乙锭、SYBR Green等)或者FAM或TAMRA等标识检测物质等。

[0147] 作为本发明涉及的人型结核菌检测用试剂盒，可以列举“包含含有序列号1、序列号2、序列号3、序列号4或序列号5所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为引物(本发明的引物)的人型结核菌检测用试剂盒。”引物也可以为通过标识物质标识的引物。

[0148] 上述试剂盒还可以包含使用标识物质标识的本发明寡核苷酸作为标识探针。

[0149] 另外，可以列举“包含下述组成试剂的试剂盒，(1)含有序列号1或2所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为正向引物，(2)含有序列号3或4所述的核酸序列的部分或全部，或其互补序列的部分或全部，并且与人型结核菌的IS6110基因的核酸序列杂交的寡核苷酸作为反向引物”。

[0150] 上述试剂盒还可以包含使用标识物质标识本发明的寡核苷酸作为标识探针。

[0151] 另外，可以列举“包含本发明的寡核苷酸作为探针的人型结核菌检测用试剂盒”。所述探针也可以使用标识物质标识。

[0152] 组成这些试剂盒的组成试剂的优选方式和具体例子如前所述。

[0153] 另外，在本发明的人型结核菌的检测用试剂盒中，也可以含有例如缓冲剂等稳定剂、防腐剂等不会妨碍共存试剂等的稳定性、不会妨碍PCR或杂交反应的试剂。另外，其浓度也可以适合选择通常在该领域中经常使用的浓度范围。

[0154] 如果列举缓冲液的具体例子，完全可以列举例如三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸缓冲液、良好缓冲液等在实施常规PCR或杂交反应时所使用的缓冲液，其pH也没有特别的限制，通常优选5～9的范围。

[0155] 另外，根据需要，可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、对TM应酶的基质(dNTP、rNTP等)、或者双链嵌入剂(溴化乙锭、SYBR Green等)或者FAM或TAMRA等标识检测物质等。

[0156] 以下列举实施例，更加具体地说明本发明，但本发明不会因此而受到任何的限制。实施例

[0157] 实施例1

[0158] (1)合成结核菌检测用PCR引物

[0159] 使用 ABI公 司DNA合 成仪 392型，通过 磷 酰 胺法，合 成 序列 号2所示的 序 列(ACCTCACCTATGTGTCGACC，以下 称 为IS_F6)和 序 列号4 所示 的 序 列(AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG，以下称为IS_R6)的寡核苷酸。合成方法参照ABI公司手册，通过在55℃下对寡核苷酸的氨水溶液加热一晚实施各种寡核苷酸的脱保护。接着，通过Pharmacia公司生产的使用FPLC的阴离子交换柱色谱，对合成的寡核苷酸纯化。

[0160] (2)制备试样

[0161] 使用如下所示的细菌，通过下述的方法提取、纯化DNA，得到DNA试样。细菌每一种都有临床分离株，培养后，通过菌落的形状和历来的各种生化试验等就可以鉴别出菌种来。

[0162] 首先，对于分枝杆菌(Mycobacterium)属细菌，使小川培养基上的菌落悬浮在纯化水上，高压灭菌釜处理(120℃·2个大气压、20分钟)后，经菌体的粉碎处理(通过直径2mm玻璃珠进行物理压碎)，离心分离，得到上清液。由所得的上清液，使用(株)キァゲン制的离子交换树脂型DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip进行DNA的提取、纯化。另外，对于大肠杆菌，根据大肠杆菌的DNA提取方法的常规方法提取和纯化DNA。

[0163] 所得的纯化DNA最后配制成1ng/μL(10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.9)，作为DNA试样。

[0164] a：大肠杆菌(Escherichia coli)

[0165] b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，人型结核菌)

[0166] c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)

[0167] d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

[0168] e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)

[0169] f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)

[0170] g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)

[0171] h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)

[0172] i：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)

[0173] j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)

[0174] k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)

[0175] l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)

[0176] m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)

[0177] n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)

[0178] o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)

[0179] p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)

[0180] q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)

[0181] r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)

[0182] s：peregrinum分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)

[0183] (3)PCR

[0184] 使用上述(1)制备的IS_F6作为正向引物，IS_R6作为反向引物，如下所述进行PCR。

[0185] 首先，制备含有各1μM的引物IS_F6和引物IS_R6、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100(トリトンX-100、聚氧乙烯辛苯基醚、rohm-and-haas公司商品名)、分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和40单位/mL的Taq DNA聚合酶(株)ニッボン·ジ一ン制)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，作为PCR用反应液。

[0186] 在20μL的PCR用反应液中添加1ng DNA试样用作PCR用试样，通过MJ Research公司的DNA热循环仪(DNA Engine PCT200)，在下述反应条件下进行30个循环的PCR。

[0187] PCR反应条件：

[0188] 热变性：94℃、0.5分钟

[0189] 退火：55℃、1分钟

[0190] 聚合反应：75℃、0.5分钟。

[0191] (4)检测

[0192] 5μL上述(3)所得的PCR后的反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。电泳的电学条件为恒电压100V，进行30分钟。操作方法和其他条件参照生物实验说明的第2卷，p53-63(秀润社、中山广树著)中所述的一般使用的方法。接着，溴化乙锭染色后，使用UV样本摄影装置FAS-III系统(东洋纺织(株)制)通过紫外线检测荧光。另外，分子量标记也与反应液一起迁移，通过比较相对迁移程度，计算出被检测的DNA片段的长度。另外，分子量标记使用X174/HaeIII消化(标记4、(株)ニッボン·ジ一ン制)。

[0193] (5)结果

[0194] 所得的电泳结果如图1所示。

[0195] 在图1中，各泳道的数字分别表示分别使用以下的试样时的结果。

[0196] M4：分子量标记(标记4)

[0197] a：大肠杆菌(Escherichia coli)

[0198] b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，人型结核菌)

[0199] c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)

[0200] d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

[0201] e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)

[0202] f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)

[0203] g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)

[0204] h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)

[0205] i：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)

[0206] j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)

[0207] k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)

[0208] l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)

[0209] m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)

[0210] n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)

[0211] o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)

[0212] p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)

[0213] q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)

[0214] r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)

[0215] s：peregrinum分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)

[0216] 通过使用正向引物IS_F6和反向引物IS_R6进行PCR，预计IS6110的核酸序列中的182个碱基对的DNA片段(序列号7)被复制。因此，182个碱基对的荧光条带被证实则判断为阳性。

[0217] 由图1的结果可以明白：使用本发明的引物IS_F6和引物IS_R6进行PCR，结果仅使用结核分枝杆菌作为试样时(b)可确认182个碱基对的荧光条带，可以判断为阳性。与之相反，使用其他的分枝杆菌属细菌或其他属的细菌即大肠杆菌试样作为试样时(a和c～s)，不能证实相应的荧光条带，完全可以判断为阴性。

[0218] 如上，通过在PCR中使用本发明的寡核苷酸作为引物，判断可以特异地检测人型结核菌。另外，可以预期通过PCR等的核酸扩增具有高灵敏度，不必要分离细菌，就可以直接在检测中使用临床材料，对人型结核菌的检测最长也就1日以内即可以结束，而通过现有的培养细菌的检测方法则需要花数周时间在培养上。

[0219] 实施例2

[0220] (1)合成结核菌检测用PCR引物

[0221] 使用与实施例1(1)相同的仪器，在相同的操作下，合成序列号1所示的序 列(TGGGTAGCAGACCTCACCTAT，以下 称为IS_F5)和 序列号3所 示的序 列(CGAGTACGCTTTCTTGTTGG，以下称为IS_R5)的寡核苷酸。

[0222] (2)制备试样

[0223] 使用实施例1(2)中所得的DNA试样。

[0224] (3)PCR

[0225] 上述(1)制备的IS_F5用作正向引物、IS_R5用作反向引物，如下所述进行PCR。

[0226] 首先，制备含有各1μM的引物IS_F5和引物IS_R5、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和40单位/mL的Taq DNA聚合酶(株)ニッボン·ジ一ン制)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，作为PCR用反应液。

[0227] 向20μL的PCR用反应液中添加1ng DNA试样用作PCR试样，使用与实施例1(3)中使用的相同仪器，在同样的反应条件下进行PCR。

[0228] (4)检测

[0229] 在与实施例1(4)同样的方法下，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，通过紫外线检测荧光。

[0230] (5)结果

[0231] 所得的电泳结果如图2所示。

[0232] 在图2中，各泳道数字分别表示分别使用以下试样时的结果。

[0233] M4：分子量标记(标记4)

[0234] a：大肠杆菌(Escherichia coli)

[0235] b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，人型结核菌)

[0236] c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)

[0237] d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

[0238] e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)

[0239] f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)

[0240] g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)

[0241] h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)

[0242] i：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)

[0243] j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)

[0244] k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)

[0245] l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi))

[0246] m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)

[0247] n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)

[0248] o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)

[0249] p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)

[0250] q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)

[0251] r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)

[0252] s：peregrinum分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)

[0253] 另外，通过使用正向引物IS_F5和反向引物IS_R5的PCR，预计IS6110的核酸序列中的178个碱基对的DNA片段(序列号6)被复制。因此，178个碱基对的荧光条带被证实则判断为阳性。

[0254] 比较例1

[0255] 基于公知的IS6110序列，通过使用所制备的引物序列的检测法(特表平11-514522号公报：专利文献11)进行人型结核菌的检测。

[0256] (1)合成结核菌检测用PCR引物

[0257] 特表平11-514522中公开的引物序列中，合成“TTCGGACCACCAGCACCTAACC”(序列号9、以下称为IS_F2)和“CCTTCTTGTTGGCGGGTCCAG”(序列号10，以下称为IS_R2)的寡核苷酸。

[0258] 合成使用与实施例1(1)同样的仪器，在同样的操作下进行。

[0259] (2)制备试样

[0260] 使用实施例1(2)所得的DNA试样。

[0261] (3)PCR

[0262] 上述(1)制备的IS_F2用作正向引物、IS_R2用作反向引物，如下所述进行PCR。

[0263] 首先，制备含有各1μM的引物IS_F2和引物IS_R2、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和40单位/mL的Taq DNA聚合酶(株)ニッボン·ジ一ン制)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，作为PCR用反应液。

[0264] 向20μL的PCR用反应液中添加1ng DNA试样用作PCR用试样，使用与实施例1(3)中使用的相同仪器，在同样的反应条件下进行PCR。

[0265] (4)检测

[0266] 在与实施例1(4)同样的方法下，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，通过紫外线检测荧光。另外，分子量标记使用λ/Hind III消化(标记1)(M1泳道)或X174/HaeIII消化(标记4)(都是(株)ニッボン·ジ一ン制)。

[0267] (5)结果

[0268] 所得的电泳的结果如图3-1所示。

[0269] 在图3-1中，另外，各泳道的数字分别表示使用各个以下试样时的结果。

[0270] M1：分子量标记(标记1)

[0271] M4：分子量标记(标记4)

[0272] a：大肠杆菌(Escherichia coli)

[0273] b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，人型结核菌)

[0274] c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)

[0275] d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

[0276] e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)

[0277] f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)

[0278] g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)

[0279] h：斯氏分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)

[0280] i：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)

[0281] j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)

[0282] k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)

[0283] l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi))

[0284] m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)

[0285] n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)

[0286] o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)

[0287] p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)

[0288] q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)

[0289] r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)

[0290] s：peregrinum分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)

[0291] 另外，预计通过使用正向引物IS_F2、反向引物IS_R2进行PCR所复制的是IS6110的核酸序列中的197个碱基对的DNA片段。因此，197个碱基对的荧光条带被证实则判断为阳性。

[0292] 如从实施例2中所得的图2的结果可以明白：使用本发明的引物IS_F5、引物IS_R5时，仅仅使用人型结核菌(b)作为试样时可以证实178个碱基对的荧光条带，可以判断为阳性。对此，在使用其他的分枝杆菌属细菌或其他属细菌大肠杆菌作为试样时(a和c～s)，没有观察到相应的荧光条带，完全可以判断为阴性。

[0293] 另一方面，如从比较例1中所得的图3-1的结果可以明白，使用公知的引物IS_F2、引物IS_R2进行PCR时，可以判断人型结核菌作为试样时为阳性，除此之外，在使用无色分枝杆菌作为试样(m)和次要分枝杆菌作为试样时(o)，也可以证实具有显著的条带，这被判断为假阳性。在图3-1中将使用无色分枝杆菌作为试样时(m)的条带以虚线围成的圆表示。另外，将使用次要分枝杆菌作为试样时(o)的条带以箭头指向的虚线圆圈表示。

[0294] 即，在比较例1的方法中，判定为：难以特异地检测人型结核菌。

[0295] 因此，从比较例1的电泳结果尤其注意到了被判断为与人型结核菌的阳性条带和扩增片段大小非常相似的次要分枝杆菌试样(o)。图3-1中箭头处，尤其显示了该条带。为了进一步分析该PCR产物，在切下迁移部分的PCR产物、进行DNA纯化后，使用ABI公司的序列试剂盒根据PCR-直接序列法进行序列分析。

[0296] 所得的序列如图3-2所示。图3-2所示的序列中，部分(b)的人型结核菌衍生的PCR产物的序列作为第一核苷酸序列(1st NucleotideSequence)，序列表的上段所示(序列号12)。另外，由部分(o)所得的次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)衍生的PCR产物的序列作为第二核苷酸序列(2nd Nucleotide Sequence)，序列表的下段所示(序列号13)。

[0297] DNA片段的序列分析结果证实了这是次要分枝杆菌(Mycobacteriumtriviale)衍生的核酸序列，对于人型结核菌特有的IS6110的核酸序列而言，其仅与比较例1使用的引物IS_F2和引物IS_R2的序列部位一致。因此，使用该公知的引物IS_F2、引物IS_R2进行PCR时，发现人型结核菌以外的核酸序列也扩增，证实了在引物的设计上存在明显的缺点。

[0298] 由上可知：使用本发明的寡核苷酸作为引物，通过PCR进行人型结核菌的检测，与使用现有技术的引物进行结核菌的检测法相比，可以排除假阳性的判断，在特异地且高精度地检测人型结核菌方面，与现有技术的引物和使用它们的人型结核菌的检测法相比，非常优异。

[0299] 实施例3

[0300] 通过实时PCR扩增体系检测结核菌

[0301] (1)合成结核菌检测用PCR引物

[0302] 使用与实施例1(1)相同的仪器，在同样的操作下，合成IS_F5和IS_R5的寡核苷酸。

[0303] (2)制作结核菌检测用探针

[0304] 由通过使用IS_F5和IS_R5作为引物进行PCR扩增所得的序列号6的寡核苷酸序列，设计用作探针的序列“ACCGACGCCTACGCTCGCAG”，合成该序列的寡核苷酸(以下称为IS_F5R5_FAMTAM。序列号11)。在该寡核苷酸的5′末端结合报告染料FAM，3′末端结合报告消TM光体TAMRA，得到标识的寡核苷酸探针(TaqMan fluorescent probe、applied biosystems japan公司制)。

[0305] (3)制备PCR用DNA试样

[0306] 对于实施例1(2)中制备的结核分枝杆菌试样所得的DNA试样，通过测定其吸光度测定试样中的DNA量。所得的DNA量通过与已知的结核分枝杆菌的基因组DNA量比较，确8
定试样中的基因组DNA量(基因组拷贝数)。得到10 个拷贝/μL的基因组DNA。

[0307] 接着使用10mM pH8.9的Tris-HCl缓冲液，制备稀释成105，104，103，102，10，5，2个拷贝/μL的稀释系列的DNA试样作为PCR用DNA试样。

[0308] (4)实时PCR

[0309] 上述(1)制备的IS_F5用作正向引物，IS_R5用作反向引物，如下所述进行实时PCR。

[0310] 即，制备含有各1μM的引物IS_F5和引物IS_R5、195nM上述(1)制备的荧光标识探针IS_F5R5_FAMTAM、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和40单位/mL的Taq DNA聚合酶(株)ニッボン·ジ一ン制)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)作为反应液。

[0311] 向20μL反应液中添加1μL各稀释系列的DNA试样作为PCR用试样，将其加入到96孔反应板(微扩增光学96孔反应板、ァプラィドバィォシステムズジャパン社制)的孔TM
中，使用TaqMan PCR专用热循环检测器(ABI7000、ァプラィドバィォシステムズジャパン社制)进行实时PCR。反应在95℃保温10分钟后，在95℃反应15秒钟和60℃反应1分钟并循环进行50个循环，测定每次循环的报告染料的发光量。另外，通过使用测定时所用热循环仪将供测定的96孔反应板每一板的相对荧光强度比数值化的功能求得发光量。

[0312] (5)结果和分析

[0313] 按照实时PCR法进行的常规方法制成校正曲线。

[0314] 即，对各PCR用DNA试样，相对PCR循环数(x轴)绘制报告染料的发光量(Rn、y轴)而制作扩增曲线。接着，选择发光量随指数函数扩增的Rn部，引出临界线(Th)。Th和各PCR用DNA试样的发光量交叉的点为临界循环(Ct)值。接着，相对使用的各PCR用DNA试样的基因组拷贝数(x轴、对数值)绘制Ct值(y轴)，对各个Ct值，所得的近似曲线为校正曲线。所得的校正曲线如图4所示。

[0315] y＝-3.555x+39.13

[0316] R2＝0.996

[0317] 由以上可知：由于通过实时PCP可以检测发光，那么在PCR中使用本发明的寡核苷酸作为引物，由该扩增区域的序列设计标识引物，通过进行实时PCR，可以检测人型结核菌。

[0318] 另外，从可以制作校正曲线看出：通过使用本发明的引物和探针的实时PCR法，可以进行人型结核菌的定量。另外，从图4可以看出：在使用本发明的引物和探针的实时PCR法中，在人型结核菌基因组DNA的初期量为2个拷贝的情况下，也可以进行人型结核菌的检测。

[0319] 另外，在利用实时PCR法时，由于实时地监视该荧光强度，可以正确地测定模板DNA的初期量，有效地进行人型结核菌的检测。

[0320] 实施例4

[0321] 利用使用多个引物对在一支管中同时地扩增多个片段的多重PCR(multiplex PCR)反应，尝试进行以人型结核菌、鸟分枝杆菌(M.avium))、胞内分枝杆菌(M.intracellulare))和堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii))为对象的结核病与非结核性抗酸菌病(non-tuberculosis Mycobacteriosis，NTM症)的同时诊断(识别诊断)。

[0322] (1)引物的合成

[0323] (i)合成结核菌检测用PCR引物

[0324] 在与实施例1(1)同样的操作下，制备IS_F5(序列号1)和IS_R6(序列号4)，分别作为正向引物、反向引物。

[0325] (ii)合成鸟分枝杆菌(M.avium)检测用PCR引物

[0326] 在与实施例1(1)同样的操作下，制备特开平11-69999号公报权利要求5所述的“鸟19千道尔顿蛋白质基因区域中特异的寡核苷酸引物”MAV19K F1(CGGCTGTTCGAGTGGCAACAAGTC，本发明说明书中序列号15所示。以下称为“鸟分枝杆菌(M.avium)检测用引物-Fw”)，和MAV19K R1(CCGTCGATGATGACCTTGGTCCC，本发明说明书中序列号16所示。以下称为“鸟分枝杆菌(M.avium)检测用引物-Rv”)，分别作为正向引物和反向引物。

[0327] (iii)合成胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用PCR引物

[0328] 在与实施例1(1)同样的操作下，制备特开平11-69999号公报权利要求6所述的“胞内核糖体蛋白质s1基因区域中特异的寡核苷酸引物”rps1F1(CGGGACAAGGTCGCCAAGGTCAAGA，本发明说明书中序列号17所示。以下称为“胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用引物-Fw)”，和rps1R1(GGGATGTAGGCCGTCACCTCAAC，本发明说明书中序列号18所示。以下称为“胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用引物-Rv”，分别作为正向引物和反向引物。

[0329] (iv)合成堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用PCR引物

[0330] 在与实施例1(1)同样的操作下，制备特开平11-155589号中所述的由堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的KATS2序列所设计的引物即图1所示引物15的、沿5′方向移动1碱基的序列(GTCCCTGGCTGCTCTTGA，本发明说明书中序列号19所示。以下称为“堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用引物-Fw)”，和引物(Primer)E3(GCTGGTGGAGATGGAGATGTT，本发明说明书中序列号20所示。以下称为“堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用引物-Rv”，分别作为正向引物和反向引物。

[0331] (2)制备试样

[0332] 使用实施例1(2)中所得的人型结核菌、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的DNA试样。

[0333] (3)PCR

[0334] 制备含有最终浓度为各1μM的上述(1)合成的正向引物和反向引物、10mM Tris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1％ 胆酸钠、0.1 ％TritonX-100，分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和40单位/mL的Taq DNA聚合酶(ニッポンジ一ン制)的溶液，作为PCR反应用溶液。

[0335] 向20μL的PCR用反应液中，如下面表1所述分别添加1μL(0～1000个拷贝)DNA试样，制备PCR用试样(1)～(7)，对于各个试样，使用与实施例1(3)中使用的仪器相同的仪器，在同样的反应条件下进行PCR。另外，在表1中，avium表示鸟分枝杆菌(M.avium)、intracellulare表示胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、kansasii表示堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)。另外，×分别表示不加DNA试样的情况，O分别表示加入DNA试样的情况，O下()内的数字表示加入的DNA试样的浓度(拷贝数)。

[0336] [表1]

[0337]

[0338] (4)检测

[0339] 在与实施例1(4)同样的方法下，进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，通过紫外线检测荧光。

[0340] (5)结果

[0341] 图5表示所得的电泳结果。

[0342] 在图5中，各泳道的数字分别表示分别使用前述表1中的7种DNA试样(1)～(7)时的结果。

[0343] 另外，在DNA试样中存在人型结核菌的DNA试样时，通过使用IS_F5引物和IS_R6引物进行PCR，预期可得到193bp的扩增产物。存在鸟分枝杆菌(M.avium)的DNA试样时，通过使用鸟分枝杆菌(M.avium)检测

[0344] 用引物Fw和鸟分枝杆菌(M.avium)检测用引物Rv进行PCR，预期可得到106bp的扩增产物。另外，存在胞内分枝杆菌(M.intracellulare)的DNA试样时，通过使用胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用引物Fw和胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用引物Rv进行PCR，预期可得到160bp的扩增产物。存在堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的DNA试样时，通过使用堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用引物Fw和堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用引物Rv进行PCR，预期可得到235bp的扩增产物。其中，在图5的电泳模式旁，结合电泳方向，表示各扩增产物部分出现的顺序。“kansasii”表示堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，“TB”表示人型结核菌，“intra”表示胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，“avium”表示鸟分枝杆菌(M.avium)。

[0345] 如从图5可以看出：人型结核菌、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的DNA试样全部加入到同一管中，一次进行PCR时，完全可以证实各细菌存在时被扩增和预测的各扩增产物的4条荧光条带(泳道(2)、(5))。另外，通过可以证实泳道(5)中的人型结核菌的条带，因此即使DNA试样的浓度为行(2)时的1/100，也可以高灵敏性地进行结核菌的检测。

[0346] 仅仅使用人型结核菌的DNA试样进行PCR时，即使鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用的引物存在时，也可以只观察到使用本发明涉及的人型结核菌检测用引物IS_F5和IS_R6进行PCR反应获得的193bp的荧光条带(泳道(3))。

[0347] 另一方面，在使用不含有人型结核菌DNA试样的试样进行PCR时(泳道(4)、(6))，分别使用各个DNA试样进行PCR可以证实，使用鸟分枝杆菌(M.avium)检测用引物Fw/Rv进行PCR反应获得的106bp的荧光条带，使用胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用引物Fw/Rv进行PCR反应获得的160bp的荧光条带和使用堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用引物Fw/Rv进行PCR反应获得的235bp的荧光条带，但是没有检测到在存在人型结核菌时应该可以证实的193bp荧光条带。

[0348] 由以上可以看出：如果使用本发明的引物，即使多种DNA试样存在于同一管内，也可以特异地检测人型结核菌。另外，通过使用一管反应进行PCR，可以一次进行人型结核菌、非结核性抗酸菌病的病原菌MAC群(鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌)还有堪萨斯分枝杆菌的分别4种病原体衍生的基因组DNA的检测。

[0349] 实施例5

[0350] 在实时PCR扩增体系中使用荧光标识探针进行多重PCR，尝试同时诊断人型结核菌和鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)为对象的结核病和非结核性抗酸菌病(non-tuberculosis Mycobacteriosis，NTM症)。

[0351] (1)PCR用引物

[0352] (i)结核菌检测用PCR引物

[0353] 与实施例1(1)同样的操作，制备IS_F5(序列号1)和IS_R5(序列号3)，分别作为正向引物、反向引物。

[0354] (ii)鸟分枝杆菌检测用PCR引物使用与实施例4(1)(ii)相同的引物。

[0355] (iii)胞内分枝杆菌检测用PCR引物使用与实施例4(1)(iii)相同的引物。

[0356] (iv)堪萨斯分枝杆菌检测用PCR引物使用与实施例4(1)(iv)相同的引物。

[0357] (2)探针的制备

[0358] (i)制备结核菌检测用探针

[0359] 由通过使用IS_F5和IS_R5作为引物进行PCR而扩增的序列号6的寡核苷酸序列，设计用作探针的序列“ACCGACGCCTACGCTCGCAG”，合成该序列的寡核苷酸(以下称为IS_F5R5_FAMTAM。序列号11)。在该寡核苷酸的5′末端结合报告染料FAM，3′末端结合报告TM消光体TAMRA，得到标识的寡核苷酸探针(TaqMan fluorescent probe、ァプラィドバィォシステムズジャパン社制)。

[0360] (ii)制作鸟分枝杆菌检测用探针

[0361] 由通过用作PCR引物的鸟分枝杆菌(M.avium)检测用引物Fw和鸟分枝杆菌(M.avium)检测用引物Rv而扩增的寡核苷酸序列，设计用作探针的序列“CAGCTCGAGCACCAGTGCGTCGG”，合成该序列的寡核苷酸(以下称为Mab_F1R1m2_Cy5BHQ。序列号21)。在该寡核苷酸的5′末端结合报告染料Cy5，3′末端结合报告消光体BHQ2，得到标识的寡核苷酸探针(实时PCR用两端修饰的探针，SIGMA GENOSYS公司制)。

[0362] (iii)制作胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用探针

[0363] 由通过用作PCR引物的胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用引物Fw和胞内分枝杆菌(M.intracellulare)检测用引物Rv而扩增的寡核苷酸序列，设计用作探针的序列“CTGGCTCGTCAGCTTCACGCG”，合成该序列的寡核苷酸(以下称为Int_F1R1m_VICMGB。序列号22)在该核苷酸的5′末端结合报告染料VIC，3′末端结合报告消光体MGB，得到标识TM的寡核苷酸(TaqMan fluorescent probe、ァプラィドバィォシステムズジャパン社制)。

[0364] (iv)制作堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用探针

[0365] 由通过用作PCR引物的堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用引物Fw和堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)检测用引物Rv而扩增的寡核苷酸序列，设计用作探针的序列“ATCGTATCCACCATCCTCGACAGCGT”，合成该序列的寡核苷酸(以下称为KATS2_TAMBHQ2。序列号23)。在该核苷酸的5′末端结合报告染料TAMRA，3′末端结合报告消光体BHQ2，得到标识的寡核苷酸(实时PCR用两端修饰的探针，SIGMA GENOSYS社制)。

[0366] (3)制备试样

[0367] 对实施例1(2)所得的人型结核菌、鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)的DNA试样，通过测定吸光度以测定试样中的DNA量。所得的DNA量通过与已知的结核分枝杆菌的基因组DNA量比较，确定试8
样中的基因组DNA量(基因组拷贝数)。得到10 个拷贝/μL的基因组DNA。

[0368] 接着，使用10mM pH8.9的Tris-HCl缓冲液，制备稀释成105，104，103，102，10，5，2个拷贝/μL的稀释系列的试样作为PCR用DNA试样。

[0369] (4)实时PCR检测

[0370] 制备含有最终浓度分别为1μM的上述(1)合成的各个正向引物和反向引物、最终浓度分别为195nM的各个荧光标识探针、10mMTris-HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/mL BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100，分别为0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和40单位/mL Taq DNA聚合酶(ニッポンジ一ン制)的溶液，作为反应液。

[0371] 向20μL反应液中加入各稀释系列的1μLDNA试样作为PCR用试样，将其加入到96孔反应板(微扩增光学96孔反应板、ァプラィドバィォシステムズジャパン社制)的孔TM
中，使用TaqMan PCR专用热循环·检测仪(ABI7500、ァプラィドバィォシステムズジャパン社制)进行实时PCR。反应在95℃保温10分钟后，在95℃反应15秒钟和60℃反应1分钟并循环进行50次，测定每次循环的报告染料的发光量。

[0372] 另外，通过使用测定时所用热循环仪将供测定的96孔反应板每一板的相对荧光强度比数值化的功能求得发光量。

[0373] (5)结果与分析

[0374] 由于各菌体检测用引物的报告染料各不相同，因此如果监测来自各个循环的每种报告染料的不同荧光4波长的发光量，可以证实以人型结核菌衍生的基因组序列作为靶标的DNA片段的扩增、以及非结核性抗酸菌病的病原体MAC群(鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌)还有堪萨斯分枝杆菌的4种病原体衍生的基因组DNA的扩增。

[0375] 因此，测定各个报告染料的发光量，通过与实施例3(5)同样的方法，可以制作成表示来自各菌的基因组DNA的稀释系列和各报告染料的发光量的关系的扩增曲线。由所得的扩增曲线，通过与实施例3(5)同样的方法，绘制相对基因组的拷贝数(x轴、对数表示)的Ct值(y轴)，相对各个Ct值所得的近似曲线作为校正曲线。

[0376] 结果如图6所示。

[0377] 从图6的结核菌(M.tuberculosis)DNA的结果(校正曲线)可以看出：由于可以检测人型结核菌检测用引物的报告染料的发光，那么本发明涉及的寡核苷酸作为引物用于PCR时，通过由形成该扩增区域的序列设计标识引物，进行实时PCR，即使在同一管中存在来自于人型结核菌以外的多种细菌的DNA，也可以检测人型结核菌。

[0378] 另外，由于可以制作成校正曲线，通过使用本发明的引物和探针的实时PCR法，可以定量人型结核菌。另外，由图6可以看出：在使用本发明的引物和探针的实时PCR法中，即使人型结核菌的基因组DNA初期量以2个拷贝存在的条件下(2个拷贝/反应)，也可以检测人型结核菌。

[0379] 另外，利用实时PCR法时，通过实时地监测其荧光强度，可以正确地定量模板DNA的初期量，有效地检测人型结核菌。

[0380] 此外，即使混合(并发感染)有分别来自非结核性抗酸菌病的病原菌MAC群(鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌)和堪萨斯分枝杆菌的基因组DNA时，也可以相互不干涉彼此的扩增反应，维持各校正曲线的线性，通过1管反应监测分别来自4种病原体的基因组DNA。这时的检测灵敏度对于任一种菌种都可以显示2个拷贝/反应。即，对于多种细菌混合的样品，通过进行实时PCR，也可以一次地进行人型结核菌的检测和非结核性抗酸菌的鉴定。

[0381] 工业实用性

[0382] 根据本发明涉及的人型结核菌的检测方法，与现有技术中的以IS6110作为靶标的结核菌检测法相比，可以排除诊断上的假阳性，更特异地和高灵敏度地检测人型结核菌。

[0383] 另外，使用本发明涉及的引物和探针，通过实时PCR，进行人型结核菌的检测时，由于该检测方法对人型结核菌是特异的，因此对于一种试样，可以进行人型结核菌的检测和非结核性抗酸菌的同时诊断(识别诊断)。