天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系及其构建方法

摘要

本发明设计一种天祝白山牦牛耳缘组织成纤维细胞系的建立及培养方法。利用组织快贴壁法，对培养基进行了改进，最终获得高活率、高纯度的天祝山白牦牛成纤维细胞系，其保藏编号为CGMCC No.1881，属于细胞生物学领域。冻存细胞质量稳定，适合大规模培养。本发明涉及的天祝白山牦牛成纤维细胞系可以为基因工程、细胞工程、免疫学和分子生物学等生命科学研究提供大量高品质材料；也可作为畜体细胞克隆育种的供体细胞；在农业上能丰富地方品种改良及地方优良品种的保存。

权利要求

1.一种高活率、高纯度天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系，其特征在于，其保藏编号为：CGMCC No.1881。

说明书

天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系及其构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系及其构建方法，具体是利用天祝山白牦牛耳缘组织细胞进行初代培养及传代培养获得高活率、高纯度天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系，属于细胞生物学领域。

背景技术

[0002] 为了保证人类社会的可持续性发展，联合国于1992年6月在巴西首都里约热内卢召开了“世界环境与发展大会”，会上各国首脑共同签署了《生物多样性公约》。截至2004年2月，全世界共有188个国家在公约上签了字，我国是首批签字国之一。这表明全世界绝大多数国家已确认生物多样性问题是全人类的大事。由于整个地球的生态平衡是靠生物多样性来维持的，没有生物多样性就没有生态平衡，地球的所有生命都将消失，地球将成为一个死亡的星球，当然更谈不上人类社会的发展。况且多样性是一切生命系统的要求，是生物发展的安全保障。没有多样性，生物就不能适应环境的变化，每个生物个体都会遭到同样的灭顶之灾。

[0003] 家畜多样性保护的重点是遗传多样性，家畜遗传多样性除生物多样性的一般意义外，还具有畜牧业可持续发展的特殊意义。日趋单一化的品种资源将会使畜禽失去对复杂多样的生态环境的适应力，成为畜牧业生产的不稳定根源。近年发生在欧洲的疯牛病、口蹄疫与二恶英等事件已给世界畜牧业敲响警钟。这就要求家畜本身的遗传特性不断变化以适应不断变化的需求。大家都知道，遗传特性不是人工可以随心所欲制造出来的。人们可以通过遗传育种的手段创造出家畜许多前所未有的新性状，但是这种创造必须要有一定的素材，所需的素材就是现有的遗传多样性，离开这些素材，谁也无能为力，至少在目前科学水平下是这样。遗传多样性是生物在进化过程中长期累积而成的，所谓遗传多样性就是形形色色的遗传变异。每一个遗传变异都是在一定的条件下发生的，条件包括内在遗传物质基础和外界的影响因素，还有一定的机遇条件，这些条件缺一不可。所以我们想人工创造一个我们想要的遗传变异是非常困难的，在目前的科学水平下几乎是不可能的。正因为这样，我们把现有的遗传多样性当作一种宝贵的资源，将它们保护起来，就是为了将来一旦需要的时候，可以利用这些素材通过遗传育种手段创造出适应人类社会需要的家畜性状，使畜牧业得到可持续性发展。

[0004] 如今饲养地方畜禽品种已经成为农民增收亮点之一。例如，据测算，目前我国土种鸡的年市场需求量在30亿只左右，可实现市场价值约720亿元。因此加强畜禽遗传资源保护和开发利用，有利于促进畜牧生产增长方式由数量型、速度型向质量型、效益型转变，是实现畜牧业战略性结构调整的有效途径。

[0005] 但是，近些年来，由于生态环境的不断恶化、国外畜禽品种的大量引进和集约化养殖等诸多因素的影响，导致我国很多优良地方畜禽品种的灭绝或处于濒临灭绝状态。我国的畜禽遗传资源多样性状况并不乐观，而且有不断恶化的趋势。畜禽种质资源的危机，意味着畜禽种质所携带基因的危机，甚至是基因的永远消失，意味着畜禽遗传资源多样性的衰退和丧失。品种的灭绝意味着细胞和分子生物学对其进行科学研究的基本材料的永远丧失，如果这些品种的种质资源在灭绝前未曾以任何方式保存下来，不仅永远丧失了其基因资源，而且使科学家们对于它们诸多未知的细胞和分子生物学机理的探索及通过体细胞克隆技术使之再现的愿望将永远成为谜和梦，同时也将是世界遗传资源遗产和生命科学理论宝库的巨大损失。因此，在全球性抢夺生物资源和保护生物多样性的今天，从我国畜禽种质资源保存的实际出发，通过构建重要、濒危畜禽品种群体细胞库的方式来保存其基因资源，具有重要意义。

[0006] 天祝山白牦牛以其色白而闻名。天祝山白牦牛特点不仅是毛色洁白无暇，而且它适于在高海拔(3000-5000米)空气稀薄的高山草原地区生话，耐力极强。皮下组织发达，脚部发育良好，肺大，气管短而粗，适应高山生态条件。

[0007] 天祝山白牦牛全身都是宝。除了与一般牦牛共有的优点外，它还有肉质鲜嫩、味道鲜美、蛋白质含量高，营养丰富等特点，其牛肉含蛋白质约21％，较其他牛肉高1～4个百分点，且球蛋白比例高，含脂肪较其他低3～8个百分点，每千克脂肪中含有胡萝卜素是普通牛肉的2.65倍；含钙、磷等矿物质1.15％，含有人体所需的多种微量元素和氨基酸，且比例合适，易于吸收；而热能值比其他牛肉高，对增强人体抗病力、细胞活力和器官功能均有显著作用，所产牛奶浓香，含油量高；白牦牛绒毛也是珍贵而独特的轻纺工业，牦牛绒现代称之为软黄金，绒毛纯白，易染色，无髓毛含量高达75％以上，绒纤维细，手感柔软、滑、直、强度大，性能与羊绒很相似，价格却比羊绒低很多，深受客户和加工厂家的青睐，前景十分乐观。历史上，白牦牛尾巴曾是贡品，经加工可为非常精美、实用的拂尘用品，今天人们做的更精致，还可做成戏剧用装饰品，如假发、胡须、缕穗等首选佳品等。

[0008] 天祝山白牦牛长期生长在高海拔、空气稀薄、气候多变、枯草期长的自然条件下，具有极其顽强的抗性，对其它畜种难以生存的高山草原生态环境，表现出惊人的适应性。是牧区和半农半牧区牧民群众衣、食、住、行不可缺少的生产和生活资料。其独特的产品，丰富的营养成分和强身健体等保健功效，深受市场欢迎。但有限的产品数童已远远不能满足市场的需求。由于经济条件限制，气侯干旱、草原退化、管理粗放、近亲繁殖等影响，造成其品种质量不同程度的退化。为国家保护、保存和发展珍稀的天祝山白牦牛品种，建立优良畜种遗传基因库，具有十分重要的现实意义和深远的历史意义。

[0009] 近年来，由于体外培养细胞在遗传资源保存和生命科学研究等诸多方面具有巨大的科学价值和应用价值，已引起各国政府高度重视。日本大阪发酵所(IFO)、德国培养物保藏所(DSM)等都在逐渐扩大保藏范围，将细胞培养物也列入保藏对象。

[0010] 随着生物技术的发展，迫切需要大规模的细胞培养，以便获得大量有用的细胞表达产物。目前，低温冷冻保存技术的发展和完善，使得任何体外培养物都可以在保持其活力的基础上无限期地得以保存。但是，大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中细胞死亡主要原因是细胞凋亡。随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入，预防并控制细胞凋亡发生成为大规模细胞培养过程的重要制约环节和研究热点。

[0011] 目前，常采用EB病毒转化法、贴壁培养法和酶消化法进行禽类品种体外细胞的大量培养，但对比试验结果表明：EB病毒转化法对于禽类品种的体外细胞培养并不适用，其培养的细胞活率及纯度均不能达到所需标准，EB病毒转化法对于人类和灵长类动物的细胞培养效果要优于禽类细胞培养；酶消化法和贴壁培养法获得的原代细胞分别经传代后接种，细胞群体倍增时间(PDT)分别为35.9h和48h。但前者操作步骤繁杂，不适合于体外大规模化细胞的培养，后者简单易行，适合于体外大规模化细胞的培养。因此建立细胞系以采用后者为佳。对于禽类细胞保藏而言，细胞纯度及活性均有较高的要求，因此，现在急需对其方法改进使天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞达到高细胞活率、高纯度的标准以得到很好的保藏并延续下去。

发明内容

[0012] 本发明的目的是提供天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系，其保藏号为：CGMCCNo.1881。

[0013] 本发明的另一目的在于提供上述细胞系的培养方法。

[0014] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

[0015] 天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系，并在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，CGMCC(地址：北京市海淀区中关村北一条13号；邮编：100080；电话：[phone])，保藏日：2006年12月1日，保藏号：CGMCC No.1881，建议的分类命名为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系。该天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系具有以下特征：改进的培养液使细胞能在体外长期生长和稳定传代，并具有下列生物学特征和遗传学特性：(1)细胞呈典型的成纤维状、梭形或不规则三角形；(2)复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定；(3)生物学特性检测各项指标均达到美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)细胞系鉴定标准；(4)外源基因能在所建细胞系内高效表达，其转染效率高达60.2％；(5)用端粒酶重复扩增PCR(TRAP-PCR)来检测细胞的端粒酶活性。其端粒酶活性应保持在较高水平；(6)在培养液中加入0.5μmol/L亚硒酸钠，细胞端粒平均荧光强度与不加硒的细胞相比有明显提高(P＜0.05)，说明补充亚硒酸钠能促进细胞端粒的延长，进而使细胞稳定生长。

[0016] 天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，该方法包括下述步骤：

[0017] (1)初代培养：

[0018] 无菌条件下，将天祝山白牦牛耳缘组织块置于小培养皿内，刮去组织块表面采样3
时未剪净的毛，用PBS液漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm 的组织块；将组织块移入培养瓶，倒置培养瓶，并在饱和湿度、37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3h；组织块完全贴壁后加入培养液6～10ml(培养液为DMEM补加10％胎牛血清，0.5μmol/L亚硒酸钠)；

[0019] (2)传代培养：弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，

[0020] 用胰蛋白酶消化3～5min后加入培养液6～10ml终止消化；消化后1∶2分瓶，放入饱和湿度、37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中继续培养至汇合度达80-90％后，细胞用于传代培养或冷冻保存；

[0021] (3)细胞冻存：

[0022] A、细胞冻存24h之前弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6～10ml，继续培养24h；

[0023] B、胰蛋白酶消化，振荡至80-90％的细胞脱落，加入培养液6～10ml终止消化；

[0024] C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；

[0025] D、收集：1000rpm离心6～10min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬(冻存液成分：10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM)；

[0026] E、将冻存液内的细胞分装入灭菌的冻存管中封口、标记；

[0027] F、预冻：将冻存管放4℃20～30min，然后转入程序降温盒中-70℃预冻4～8h；

[0028] G、冻存：将-70℃预冻的细胞迅速投入液氮柜中，即完成细胞冻存。

[0029] 上述高活率、高纯度天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系的培养方法。其中，根据实际需要可以将步骤(4)冻存的细胞进行细胞复苏，具体步骤为：将冻存管从液氮中取出置入42℃水浴中，连续晃动1min后，将细胞移入加有培养液的培养瓶中吹打均匀，放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养即可。

[0030] 本发明的优点与效益：本发明对于贴壁培养方法及培养液成分的改进调整，可以使培养出的成纤维细胞无上皮细胞等杂质细胞，细胞纯度与现有技术相比有大幅提高；对于冻存条件的改进使复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定，且细胞冻存后的细胞活率可达到93.2％～
98.7％，且细胞传代生长稳定，与现有细胞培养技术相比有显著提高，适合大规模培养。对于培养液的调整及培养方法的改进，通过端粒、端粒酶的检测，细胞的活性优于未调整的培养基，同时还可以使成本大幅降低。本发明在培养方法、培养液的改进等各方面弥补了现有体细胞保存不理想的状况，天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系活率及纯度的提升也使重要、濒危天祝山白牦牛品种的基因资源以体外培养细胞的形式得以长期保存。本发明所述的高活率及高纯度的天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系可以为医学、细胞和分子生物学等生命科学研究提供大量的高品质材料；并可以作为家畜体细胞克隆育种的供体细胞；在农业上可以丰富地方家畜品种改良以及地方优良家畜品种保种的手段。

[0031] 下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。

附图说明

[0032] 图1为天祝山白牦牛耳缘组织原代细胞显微镜下图；

[0033] 图2为天祝山白牦牛耳缘组织继代I细胞显微镜下图；

[0034] 图3为被支原体污染的天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞对照图；

[0035] 图4为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞支原体检测阴性结果图示；

[0036] 图5为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞生长曲线图；

[0037] 图6为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞核型图示；

[0038] 图7为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞乳酸脱氢同功酶电泳图示；

[0039] 图8为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞苹果酸脱氢酶电泳图示；

[0040] 图9为外源基因在天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞中表达24h图示(pEGFP-N3荧光蛋白质粒转染)；

[0041] 图10为外源基因在天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞中表达48h图示(pEGFP-N3荧光蛋白质粒转染)；

[0042] 图11为TRAP-ELIDA法测定反应产物中PPi含量直方图；

[0043] 图12焦磷酸钠酶联发光值标准曲线图；

[0044] 图13天祝山白牦牛的荧光直方图图A，图B天祝山白牦牛细胞端粒特异性的FITC荧光图；

[0045] 图14天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞端粒长度直方图；

[0046] 图15为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞为供体的异种核移植的重组胚；

[0047] 图16为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞为供体的异种核移植的二细胞胚胎；

[0048] 图17为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞为供体的异种核移植的桑椹胚期胚胎；

[0049] 图18为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞为供体的异种核移植的囊胚期胚胎；

[0050] 图19为天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞为供体的异种核移植的孵化囊胚。

具体实施方式

[0051] 实施例中所用的主要仪器及试剂来源：

[0052] 天祝山白牦牛耳缘组织来源：甘肃省天祝县。

[0053] 主要仪器设备

[0054] 1、激光扫描共聚焦显微镜：尼康TE-2000-E；

[0055] 2、细胞融合仪：美国BTX ECM-2001；

[0056] 3、显微操作仪：日本尼康NT-88-V3；

[0057] 4、CyFlow ML流式细胞仪：德国PARTEC公司；

[0058] 5、浮雕相差显微镜，Olympus IX-71；生物显微镜，Olympus CX31；倒置相差荧光显微镜：Olympus IX-71；

[0059] 6、-70℃超低温冰箱：美国kelvinator；

[0060] 7、电动移液器：德国Accu-jet；

[0061] 8、颇尔超纯水器：Pall-pruelab_plus；

[0062] 9、CO2培养箱：Heraeus BB16UV；

[0063] 10、液氮贮存器：四川东亚YES-50B-125F；

[0064] 11、电泳仪：北京六一厂DYY-6C；

[0065] 12、电泳槽：北京六一厂DYC-24A；

[0066] 13、高性能无菌实验台：哈尔滨DL-CJ-2N；

[0067] 14、低速离心机：CENTERIGUGETDL-40B；

[0068] 15、紫外可见分光光度仪：Perkin Elmer；

[0069] 16、BPCL微弱发光仪：中科院生物物理所；

[0070] (二)主要试剂

[0071] 1、DMEM(Dulbecco’s改良Eagle’s培养基)，脂质体Lipofectin，Trizol：Gibco公司；

[0072] 2、载体pEGEP-N3：Clontech；

[0073] 3、胰蛋白酶(Trypsin 1:250)，吉姆萨(Giemsa)：Amresco；

[0074] 4、特级胎牛血清(Defined FBS)：Hyclone；

[0075] 5、台盼蓝(Trypan Blue)，DMSO，秋水仙素(Colchicine)，EDTA，Triton(曲拉通)X-100＞99％，TEMED，Bis(甲叉双丙烯酰胺)98％，过硫酸铵(Ammonium Persulfate)，PMS，NAD，噻唑蓝(Thiazolyl Blue)，牛血清白蛋白(BSA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP，分子量360000)，腺苷脱氨基酶(ADA)、腺苷-5′-磷硫酸盐(adenosine-5′-phosphosulfate)，细胞松弛素B(CCB)，ATP-硫酸化酶：Sigma；

[0076] 6、甘油：分析纯华绿渊；

[0077] 7、Tris，Taq DNA聚合酶，荧光素，荧光素酶，Moloney鼠白血病病毒反转录酶(MMLV反转录酶)：Promega；

[0078] 8、丙烯酰胺＞99％(Acr)，甘氨酸＞99％(Clycine)：NOVON；

[0079] 9、PEG：Mylab；

[0080] 10、三磷酸脱氧核苷(dNTP)：Roche；

[0081] 11、引物：上海生工生物技术公司合成；

[0082] 12、氰酸荧光素(FITC)标记的(C3TA2)3端粒DNA序列特异性肽核酸(PNA)探针[FITC-(C3TA2)3PNA probe]：大连TaKaRa

[0083] 成纤维细胞培养所用液体配制：

[0084] 10、DMEM原液：超纯三蒸水溶解9.6g的DMEM，2.2g的NaHCO3，加水定容至1L，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤除菌后，500ml/瓶分装，4℃贮存；

[0085] 12、细胞培养液：DMEM培养液中加入终浓度为10％(体积比)FBS，0.5μmol/L亚硒酸钠，0.22μm滤膜过滤除菌后，500ml/瓶分装，4℃贮存。

[0086] 13、双抗贮存液：100万IU的链霉素4支，80万IU的青霉素5支溶于400ml灭菌去离子水中。

[0087] 14、1×PBS 缓 冲 液：NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na2HPO4·12H2O 1.45g，KH2PO40.10g，加三蒸水定容至500ml，pH为7.2，高压灭菌密封后4℃贮存。

[0088] 15、0.25％(质量体积比)胰蛋白酶溶液：1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤除菌后，分装，-20℃贮存。

[0089] 16、0.9％(质量比)生理盐水：0.45g NaCl溶于500ml三蒸水，高压灭菌30min。

[0090] 17、细胞冻存液：将50ml DMSO加入450ml培养液(含体积比15％FBS的培养液)中，用0.22μm滤膜过滤除菌，以100ml/瓶分装，贮存于-20℃冰箱。

[0091] 微生物检测所用液体配制：

[0092] 18、大豆胰蛋白胨：3g大豆胰蛋白胨，加100ml三蒸水，调pH至7.3，高压灭菌15～20min，分装到15×150mm的玻璃管中。

[0093] 19、麦芽汁：2g麦芽汁加100ml三蒸水，调pH至3～4，高压灭菌15～20min，分装到15×150mm的玻璃管中。

[0094] 20、DAPI染液：三蒸水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。

[0095] 21、封片液：22.2ml 0.1M的柠檬酸，27.8ml 0.2M的Na2HPO4溶于50ml甘油中，NaOH调节pH至5.5，贮存于4℃。

[0096] 22、固定液：冰醋酸与甲醇以体积比1∶3的比例(现用现配)。

[0097] 染色体标本制备所用液体配制：

[0098] 23、秋水仙素贮存液：10mg秋水仙素溶于10ml三蒸水中。

[0099] 24、稀释液：三蒸水将贮存液稀释10倍至终浓度为100μg/ml。

[0100] 25、低渗KCl溶液：0.5g的KCl溶于100ml三蒸水。

[0101] 26、固定液：冰醋酸与甲醇按体积比1∶3的比例配制。

[0102] 27、Giemsa染色液

[0103] 原液：将1g Giemsa染粉倒入研钵，加几滴甘油，在研钵内研磨至无颗粒为止，然后加甘油至33ml，放在56℃保温箱2h后，加入45ml甲醇搅拌均匀，棕色瓶中贮存备用。

[0104] 工作液：磷酸缓冲液将Giemsa原液稀释10倍至终浓度为10ml。

[0105] 28、磷酸缓冲液的配制：KH2PO40.34g加入100ml去离子水(用NaOH调pH 6.8)[0106] 脂质体转染细胞所用液体配制：

[0107] 29、质粒DNA(DsRed和EGFP-N3)，脂质体Lipofectamine，不含血清的DMEM培养液，含血清的DMEM培养液，pH 7.4的PBS。

[0108] 同工酶分析所用液体配制：

[0109] 30、0.9％ (质 量比 )NaCl-0.06mmol EDTA溶 液：分 别称 取0.9g NaCl 和0.0223gEDTA溶于100ml三蒸水中即可。

[0110] 31、蛋 白 提 取 液：将5ml TritonX-100 加 入 75ml 0.9 ％( 质 量 比 )NaCl-0.06mmolEDTA溶液中即得蛋白提取液，将其贮于4℃冰箱保存。TritonX-100∶0.9％(质量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液＝1∶15。

[0111] 32、40％(质量体积比)蔗糖溶液：将40g蔗糖溶于100ml水中。

[0112] 33、胶溶液的配制

[0113] A液：1mol/L HCl 48.0ml，Tri s 36.6g，TEMED 0.23ml，用浓盐酸调至pH 8.9[0114] B液：Acr 40.0g，Bis 2g

[0115] C液：过硫酸铵0.14g(现配现用)

[0116] D液：1mol/L HCl 48.0ml，Tris 5.98g，TEMED 0.46ml，用浓盐酸调至pH 6.7[0117] E液：Acr 10.0g，Bis 2.5g

[0118] F液：核黄素4.0mg

[0119] G液：蔗糖40.0g

[0120] 34、聚丙稀酰胺凝胶溶液浓度，见表1

[0121] 表1

[0122]

[0123] 35、电极缓冲液的配置：6g Tris，28.8g甘氨酸溶于1000ml蒸馏水，pH调至8.7[0124] 36、电泳指示剂：分别秤称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖溶于100ml水中。

[0125] 37、LDH染色液配制(染色前1h配制)

[0126] 乳酸钙100mg+0.05M Tris-HCl(pH 8.0)20ml

[0127] 噻唑蓝5mg+三蒸水1.0ml

[0128] PMS 2.5mg+三蒸水1.0ml

[0129] 辅酶I(NAD)10mg

[0130] 染色前，将以上保温试剂混合后，倒入20ml 2％(体积比)琼脂溶液中，混匀。

[0131] 38、MDH染色液配制(染色前1h配制)

[0132] DL-苹果酸350mg溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)中

[0133] 噻唑蓝15mg+三蒸水1.5ml

[0134] PMS 5mg+三蒸水1.0ml

[0135] 辅酶I(NAD)10mg

[0136] 将以上混合后，倒入25ml 2％(体积比)琼脂溶液中。

[0137] 39、固定液的配制：乙醇10ml，乙酸40ml，甘油20ml，加水至80ml。

[0138] 40、溴酚蓝溶液得配制：分别称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖溶于100ml水中。

[0139] 细胞凋亡检测所用液体配制：

[0140] 41、固定液

[0141] 冰醋酸与无水甲醇以体积比1∶3的比例混合，4℃贮存备用(现用现配)。

[0142] 42、DAPI染液：三蒸水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。

[0143] 43、封片液的配制：将22.2ml 0.1mol/L柠檬酸与27.8ml 0.2mol/L Na2HPO4加入到50ml甘油中，用NaOH调pH至5.5，4℃贮存备用。

[0144] 44、0.25％胰酶：称取250mg胰蛋白酶粉末，溶于100mL无钙镁的PBS中，搅拌混匀，过滤除菌，于-20℃保存备用。

[0145] 45、0.2％台盘蓝染液：称取200mg台盘蓝，溶于100mL超纯水中，混匀溶解。

[0146] 端粒酶活性和端粒长度的检测所用液体配制：

[0147] 46、10×TRAP缓 冲 液：200mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，15mmol/L MgCl2，680mmo/LKCl，0.05％Tween-20，10mmol/L EGTA.

[0148] 47、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)：10mM Tris-Hcl pH7.5，1mMMgcl2，1mM EGTA，0.5％CHAPS“3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸”，5mMβ-巯基乙醇，10％甘油，0.1mM PMSF)

[0149] 48、ELIDA混合物：含有0.1mol/L Tris-乙酸盐、2mmol/L EDTA、10mmol/L乙酸镁、0.1％BSA、1mmol/L二硫代苏糖醇、0.4g/L PVP、5mg/L荧光素、5μmol/L腺苷-5′-磷硫酸盐、66IU/L ATP-硫酸化酶和4mg/L荧光素酶)

[0150] 49、洗液1：含有70％去离子甲酰胺、10mmol/L Tris-HCl、0.1％BSA和Tween-20；

[0151] 50、洗液2：含有0.1％BSA和Tween-20的PBS。

[0152] 供体核异种核移植重组胚发育的检测所用液体配制

[0153] 51、细胞松弛素(CCB)液：1mg的细胞松弛素B溶于0.5mL的DMSO中，过滤除菌，制成浓缩液，用时在10ml SOF液中加此液37.5μL及得CCB液。

[0154] 52、5μg/mL Hoechst33342：称取0.005g的Hoechst33342溶于10ml水中，过滤除菌，制成浓缩液用时500μL培养液中加5μL上述浓缩液。

[0155] 53、5μM/L离子霉素激活：1mg的离子霉素溶于0.5mL的DMSO中，过滤除菌，制成浓缩液，用时加于SOF中。

[0156] 54、2mM/L的6-DMAP：称取0.0065g的6-DMAP溶于20mL的SOF中

[0157] 55、SOF胚胎液：NaCL 0.6355g，NaHCO30.2106g，KCL 0.0355g，葡萄糖0.1g，[0158] 磷酸二氢钾0.0162g，硫酸镁0.0293g，二水氯化钙0.025g，BSA 4mg/mL。

[0159] 实施例1高细胞活率高纯度天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系的构建[0160] (1)初代培养：

[0161] 无菌条件下，将采自天祝县天祝山白牦牛耳缘组织块置于小培养皿内，刮去组织3
块表面采样时未剪净的毛，用PBS液漂洗3～4次后剪切成0.5～1.5mm 的组织块；将组织块移入培养瓶，倒置培养瓶，并在饱和湿度、37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养2～
3h；组织块完全贴壁后加入培养液6～10ml(培养液为DMEM补加10％胎牛血清，0.5μmol/L亚硒酸钠)；

[0162] (2)传代培养：弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，用胰蛋白酶消化3～5min后加入培养液6～10ml终止消化；消化后1∶2分瓶，放入饱和湿度、37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中继续培养至汇合度达80-90％后，细胞用于传代培养或冷冻保存；

[0163] (3)细胞冻存：

[0164] A、细胞冻存24h之前弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6～10ml，继续培养24h；

[0165] B、胰蛋白酶消化，振荡至80-90％的细胞脱落，加入培养液6～10ml终止消化；

[0166] C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；

[0167] D、收集：1000rpm离心6～10min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬(冻存液成分：10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM)；

[0168] E、将冻存液内的细胞分装入灭菌的冻存管中封口、标记；

[0169] F、预冻：将冻存管放4℃20～30min，然后转入程序降温盒中-70℃预冻4～8h；

[0170] G、冻存：将-70℃预冻的细胞迅速投入液氮柜中，即完成细胞冻存。

[0171] (4)细胞复苏：将冻存管从液氮中取出置入42℃水浴中，晃动1min后，将细胞移入加有培养液的培养瓶中吹打均匀，放入饱和湿度、37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养即可。

[0172] 实施例2天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系生物学特性的检测

[0173] 对实施例1培养的天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系进行生物学特性检查，方法及结论如下。

[0174] 一、细胞形态学观察

[0175] 方法：细胞在体外培养过程中，对细胞进行常规检查，观察细胞生长状态、培养液颜色变化情况以及细胞是否发生污染。

[0176] 结论：如图1、图2所示，当细胞生长状态良好时，其形态为典型的成纤维状，呈现梭形或不规则三角形。对细胞群体的全貌观察，所培养的细胞均呈放射状、火焰状或漩涡状走势，证明细胞生长健康旺盛。

[0177] 1、细菌、真菌检测

[0178] 方法：

[0179] (1)取冻存细胞量0.5％的冻存细胞，于8ml无抗培养液中混匀，细胞悬液以1000rpm离心20min，并重复两次，以消除抗生素的影响。再重悬于2ml无抗生素的培养液中。

[0180] (2)将细胞以0.5ml接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

[0181] (3)设对照为：

[0182] A.阳性对照：枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌分别接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中培养，置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

[0183] B.阴性对照：胰蛋白豆胨培养基和麦芽汁培养基，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。

[0184] 结论：肉眼观察接种有天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞的大豆胰蛋白胨培养液和麦芽汁培养液，均呈现清亮透明状，将试管置于显微镜下观察，除动物细胞呈圆形的透明状亮点漂浮在培养液中，无其它异物。证明在细胞培养冻存及细胞复苏的整个过程中，细胞未被细菌、真菌污染。

[0185] 2、病毒检测

[0186] 方法：

[0187] (1)接种待检测细胞培养物，用无抗生素的培养液培养至致密单层。

[0188] (2)采集新鲜的肝素抗凝全血(鸡血、豚鼠血)，1000rpm离心10min，弃上清。沉积的红细胞用PBS洗涤3次，用0.9％NaCl溶液悬浮，制成0.5％(V/V)的红细胞悬液。

[0189] (3)待检细胞弃除培养液，用0.9％NaCl溶液冲洗单层细胞2～3次。

[0190] (4)分别加0.5ml新鲜配制的鸡、豚鼠红细胞悬液于待检细胞瓶中，于4℃放置20min。

[0191] (5)观察红细胞凝集和吸附现象，不呈现红细胞吸附的细胞，需重复进行(2)～(4)的操作。

[0192] 结论：

[0193] 由于病毒表面有血凝素，能结合某些物种的红细胞，出现红细胞凝集现象。被这些病毒感染的细胞能够将鸡、豚鼠的红细胞吸附在其表面上。检测结果：在无抗生素的条件下常规培养天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞，在相差显微镜观察，鸡的红细胞呈椭圆状悬浮在成纤维细胞上方，未出现凝集现象；豚鼠的红细胞呈圆形悬浮在上方，也未出现凝集现象。检测结果为阴性，证明该培养方法培养的细胞在培养过程中没有因为病毒而造成细胞损伤。

[0194] 3、支原体检测

[0195] 方法：

[0196] (1)标本：将成纤维细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/ml。

[0197] (2)培养：被检细胞在不含抗生素的培养液中传代培养3次以上(不低于3次)，在最后一次传代培养增殖期中换新鲜培养液，继续培养2～3d。

[0198] (3)接种：阴性对照皿加细胞培养液2ml；待检皿内加入待检样品2ml，在盖片上培养的细胞汇合之前，从瓶中取出(如细胞完全汇合，影响对支原体的观察)。

[0199] (4)漂洗：将细胞盖片置于碟皿中，用PBS漂洗，冷风吹干。

[0200] (5)固定：用固定液浸泡盖玻片，固定细胞10min后，重复步骤(4)。

[0201] (6)染色：将配制好Hoechst 33258染液滴加到固定好的细胞上，室温下染色30min。

[0202] (7)漂洗：用PBS浸洗染色后的盖玻片3次，每次3～5min，冷风吹干。

[0203] (8)制片：将一滴含1％甘油的PBS加到染色后的细胞表面，将有细胞的盖玻片面朝下覆盖在载玻片上。

[0204] (9)观察：以100×～400×荧光显微镜观察，打开光源10min后，以330～380nm紫色荧光激发，观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或丝状点的荧光物产生。

[0205] 结论：

[0206] Hoechst 33258荧光染料能透过完整的细胞膜，嵌入DNA中，使之发出明亮的蓝色荧光。支原体内也含有DNA，亦能着色，在荧光显微电镜下观察可看到蓝色荧光。因此，在阳性对照中，除细胞核部位有蓝色荧光外，在细胞表面及周围也能看到蓝色点状或丝状荧光。而且在细胞表面同时有支原体DNA荧光染色颗粒和丝状小点，如图5所示。检测结果显示：
如图6所示，体外培养天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞制片后，在倒置荧光显微镜下，用
380nm的紫色荧光激发，可以发现整个视野内可见的细胞表面均为光滑样，细胞核呈圆状或椭圆状，细胞核中的DNA发出蓝色荧光，且细胞周围无丝状或颗粒状小点。证明本细胞没有支原体污染。

[0207] 三、细胞生长曲线绘制

[0208] 方法：

[0209] (1)悬液制备

[0210] 取待测生长状态良好的细胞，增至接近汇合时，用常规方法消化细胞制成细胞悬液，并计数。

[0211] (2)接种

[0212] 向24孔培养板内分别接种相同数量的细胞，一般1～2×104个/ml，于37℃CO2培养箱中继续培养。

[0213] (3)计数检测

[0214] 从接种时间算起，每隔24h计数3孔内的细胞密度，用血球计数板计算细胞总数，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8组结束。

[0215] (4)绘图

[0216] 以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得培养细胞的生长曲线。

[0217] 结论：

[0218] 通过对所培养的天祝山白牦牛体外培养细胞用常规方法制备细胞悬液，计数，接种24孔培养板，每孔1ml细胞悬液，对接种于24孔培养板的细胞进行连续7d定时记数，记录各次细胞密度，绘制而成培养细胞生长曲线如图7所示，接种后第2d细胞数开始增加，第3d进入对数生长期，第6d细胞生长缓慢，细胞生长期总体趋势均呈S型，细胞接种后均有
24h的潜伏期，此期为细胞的适应阶段，是细胞由于接种时胰酶消化而致的损伤后的修复时期，此后细胞呈指数增殖，即指数生长期，最后进入停滞期，细胞生长缓慢，几乎停止，可见有细胞漂浮。而细胞分裂指数(MI)最高值(培养第2d)在进入对数生长期前出现，并在培养第2～4d时维持于一个较高的水平，随后下降到初始水平。本发明方法培养的天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系的纯度98.9％与现有技术培养细胞平均纯度91％相比有显著提高；且细胞群体倍增时间(PDT)为24h，与现有技术胶原酶消化技术和现有贴壁培养法获得的PDT-35.9h和48h相比具有显著的提高，证明细胞纯度高、生命力旺盛。

[0219] 四、细胞活率测定

[0220] 方法：

[0221] 检测冻存细胞的存活率可采用台盼蓝拒染试验，将待检细胞复苏后制成细胞悬液，取10μl细胞悬液加入10μl 1％台盼蓝染液，混匀。血球计数板计数，健康活细胞胞体完整，细胞透明，不着色，凡着色呈蓝色者为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞存活率。统计二种细胞总数，以活细胞占细胞总数的百分比反映细胞活力。

[0222] 结论：

[0223] 细胞冻存前后对天祝山白牦牛耳缘组织细胞进行细胞活率测定。结果表明：冻存前细胞活率在95.8～98.7％之间，冻存后细胞活率为93.2％～96.7％，与现有细胞培养技术冻存后细胞活78.6％相比有显著的提高。且复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定。

[0224] 五、核型的制备

[0225] 方法：

[0226] 1、加秋水仙素：取对数生长期的细胞培养物，加秋水仙素到培养液内，终浓度为0.1～0.4μg/ml。

[0227] 2、在37℃培养箱中继续培养1～4h，使大部分细胞处于分裂中期。

[0228] 3、采集分裂相细胞：加0.25％胰蛋白酶溶液用常规方法消化，然后加培养液，终止胰蛋白酶对细胞的作用。转入15ml离心管，以1000rpm离心8min，收集细胞。

[0229] 4、低渗：将沉淀细胞用预热至37℃、0.075M KCl溶液2ml，重悬，吹打均匀后，继续加KCl溶液至10ml，放入37℃温箱中温育15min。

[0230] 5、预固定：悬液中加入新鲜固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)1ml，轻轻打匀。

[0231] 6、固定：将悬液以1000rpm离心8min，去掉上清夜，加入新鲜固定液5ml，打匀，室温静置20min。

[0232] 7、重固定：重复2次，离心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5ml，混匀。

[0233] 8、滴片：滴2～3滴细胞悬液于45°倾斜载玻片，使细胞分散均匀，室温下干燥。

[0234] 9、染色：用磷酸盐缓冲液(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色10min，自来水冲洗，空气干燥。

[0235] 10、镜检：油镜观察可见中期分裂相细胞和铺展的染色体，细胞质被染成蓝色，细胞核被染成淡紫色。

[0236] 11、染色体照片及数据处理：每个品种统计100个分裂相以确定染色体数目，按Denver(1960)会议和Leven标准(1964)测量并计算染色体的三个参数即：相对长度、臂比值和着丝点指数，并确定染色体着丝点类型。三个参数的计算公式如下：

[0237]

[0238]

[0239]

[0240] 12、封片：过二甲苯两次后，用中性树胶盖玻片封片。

[0241] 结论：

[0242] 细胞系质量的国际标准是二倍体细胞的出现率达到85％以上，在本试验中，对100个天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞的染色体数目计数，只对其是否为整二倍体进行计算，分别以第1～3代的细胞为研究对象。统计结果为：细胞染色体中二倍体占主体，为
95％以上，说明所建天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系达到优质细胞的标准，细胞遗传性能稳定。

[0243] 天祝山白牦牛二倍体染色体数目为2n＝60，58条常染色体和2条性染色体，雄性为XY，雌性为XX，如图6。具体数据见表2，

[0244] 表2天祝山白牦牛染色体参数

[0245]

[0246]

[0247] 注：染色体按臂比指数划分：1.0-1.6为中央着丝粒染色体(M)，1.7-2.9为亚中央着丝粒染色体(SM)，3.0-6.0为近端着丝粒染色体(ST)，指数≥7.0为端着丝粒染色体(T)[0248] 六、同工酶分离

[0249] 方法：采用不连续梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法。

[0250] 1、收集细胞，用PBS重新悬浮，记数；

[0251] 2、清洗。用PBS洗细胞3次，离心弃去上清夜；

[0252] 3、用蛋白提取液重新悬浮细胞，密度达5×107个/ml，轻轻吹打均匀；

[0253] 4、将细胞悬液移到1.5ml离心管中，4℃以10000rpm离心2min收取上悬液，分装后将上悬液置-70℃贮存备用；

[0254] 5、上悬液加入等量40％蔗糖溶液，混匀即为样品液；

[0255] 6、用微量加液器向每个样品槽加样20～50μl，再用稀释10倍的电极缓冲液把每个样品槽补充满，然后向上下槽缓缓加入电极缓冲液。在上槽中加入1～2滴溴酚蓝，放入4℃冰箱；

[0256] 7、接通电源，上槽为负极，下槽为正极，调节电压为120V维持1h，再调至220V，待溴酚蓝迁移至下端0.5～1cm处停止电泳，约5h；

[0257] 8、电泳完毕，分别收集上下槽缓冲液用10ml注射器吸满水，装上10cm长的细穿刺针头，沿玻璃内侧插入，边注水边前进，借助水的润滑作用和针头的刮切作用，使胶与玻璃板分离，然后轻轻拿起上层玻璃板，切去浓缩胶，再用蒸馏水漂洗两次后，浸入染色液中置37℃温箱中保温染色30～60min，胶条染色后用凝胶固定液固定后照相；

[0258] 9、用相对迁移率(Rf)表示，即区带泳动距离(d)与指示染料泳动距离(D)之比，计算公式为Rf＝d/D×100％。区带泳动距离一律按区带后缘的距离测量。

[0259] 结论：

[0260] 如图7所示，天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞的乳酸脱氢同工酶酶谱从“阳极”到“阴极”分别为LDH1，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5酶活性强弱依次为LDH5＞LDH4＞LDH3＞LDH2＞LDH1。如图8所示，天祝山白牦牛的苹果酸脱氢酶谱各呈现2条区带，即sMDH(细胞质型)区带组和mMDH(线粒体型)区带组，且后者比前者泳动速度慢。LDH和MDH基因的表达受遗传基因和代谢物的双重控制，电泳速度快的区带本身分子量小。若细胞被污染，则会因为每个品种的迁移率不一样，结果就可能出现比现在更多数目的区带。利用天祝山白牦牛体外培养成纤维细胞进行乳酸脱氢同工酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)谱系分析可以得到清晰的特征谱系，表明所培养的体细胞遗传性能稳定，纯度高，没有与其他品种的细胞之间发生交叉污染。

[0261] 七、外源基因在培养细胞中的表达

[0262] 方法：

[0263] 1、荧光蛋白报告质粒(pEGFP-N3)的制备及鉴定：按照Plasmid Midi Kit质粒提取盒说明书，提取、纯化pEGFP-N3荧光蛋白基因质粒。将所得质粒溶于TE(PH8.0)低盐溶解液中，用紫外分光光度计测定其质粒浓度(质粒浓度[μg/ml]＝OD260×50μg/ml×稀释倍数)，得到的pEGFP-N3荧光蛋白质粒浓度为0.31μg/ml质粒DNA，OD260/OD280值在1.80～1.86之间，实验结果表明所提取质粒较纯，无RNA、无水乙醇和蛋白质等杂质。再用Nhe I和Xba I双酶切后，用1％琼脂糖电泳鉴定酶切结果，可以得到约750bp和4kb两条谱带。根据荧光蛋白质粒酶切图谱分析所获质粒确为所需pEGFP-N3荧光蛋白质粒。

[0264] 2、脂质体介导法转染成纤维细胞

[0265] (1)、于转染前一天，用胰蛋白酶溶液消化细胞培养物，将细胞接种到6孔(或5
35mm)的培养板内，每孔1～2×10 细胞，加2ml含血清培养液；

[0266] (2)、置37℃的CO2培养箱中培养细胞达到70～80％的汇合程度；

[0267] (3)、转染前，在倒置显微镜下观察，挑取生长旺盛、形态好的细胞用于转染；

[0268] (4)、将待转染的细胞不含血清的培养液漂洗细胞两次；

[0269] (5)、合并溶液A和B，轻轻混合后于室温下静置45min，然后加入0.8ml不含血清的培养液；

[0270] (6)、将DNA、脂质体和不含血清的培养液的混合物滴加在培养版中待转染的细胞表面，于CO2培养箱中继续培养5～24h；

[0271] (7)、倒掉转染夜，加入含血清的培养液，于培养箱中继续培养细胞；

[0272] (8)、在相应颜色荧光激发下观察三种荧光蛋白的表达结果，计算转染效率。

[0273] 结论：

[0274] 如图10、图11所示，天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞的转染峰出现在转染48h后，为绿色荧光细胞的荧光强度达最强，转染率为55.5％；转染72h后阳性细胞和荧光强度均逐渐减少、减弱。表明本细胞系外源基因表达率远高于其它细胞系外源基因表达率30～40％。

[0275] 八、细胞凋亡检测

[0276] (1)将细胞以4.0×105个/ml密度接种于12孔培养板中，每孔3ml，37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁。

[0277] (2)DAPI染色：倒掉细胞的培养基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液冲洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆盖细胞，37℃温育15min，再倒掉染色液，用甲醇冲洗一次。

[0278] (3)激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

[0279] 结论：

[0280] 体外培养的正常细胞经过若干增殖传代后，细胞停止生长并不可逆地进入一个增殖静止阶段，称老化期。随着细胞生物学研究的不断深入，人们认识细胞老化的主要原因是细胞凋亡的产生。细胞凋亡时，激活了核酸内切酶，切割连接区DNA，从而产生长度为180～200bp左右的寡核苷酸碎片，形成凋亡小体。因此常用DNA的特异性荧光染料DAPI，以非嵌入式与DNA的A-T碱基区结合，从而对细胞核染色。染色后，激光扫描共聚焦显微镜下活细胞核呈弥散均匀的蓝色荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色颗粒块状荧光。

[0281] 共聚焦显微镜下，观察统计100～200个细胞，计算凋亡率∶凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数×100％；结果显示仅有极少数细胞的细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色颗粒块状荧光，凋亡率仅为0.5％，该情况与其它细胞系0.5％的细胞凋亡率相比，属正常凋亡现象。

[0282] 九、端粒酶活性和端粒长度的检测

[0283] (一)端粒酶活性检测

[0284] 方法：端粒重复序列扩增-焦磷酸根酶联发光法(TRAP-ELIDA)

[0285] (1)用0.25％胰酶消化生长状况良好的细胞；

[0286] (2)用冰冷的0.9％NaCl生理盐水洗两次，再加入定量体积的生理盐水配成细胞悬液；

[0287] (3)台盼蓝染色法计数细胞，活细胞占总细胞的比例大于98％。取含2×106个细胞的悬液，1000rpm室温离心获得沉降的细胞；

[0288] (4)加200μL CHAPS裂解液，冰上反应30min，离心取上清液，测定总蛋白质含量，调节蛋白质浓度为2g/L。

[0289] (5) 取 所 得 上 清 液 1.0μL，加 入 TRAP 缓 冲 液、dNTP 和 TS 引 物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)，使终体积为25μL；

[0290] (6)将混合物于30℃反应30min，然后于90℃加热3min。再加入CX引物(5′-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3′)和Taq DNA聚合酶，在PCR仪上于94℃、30s，55℃、40s，72℃、1min，循环33次；最后于72℃延伸2min；

[0291] (7)混合物中加2μg ADA，于37℃培养30min，再将其于90℃加热4min，以使ADA失活。反应产物稀释5倍，取2μL加入到95μL ELIDA混合物中；

[0292] (8)在室温下于BPCL微弱发光仪上记录前6s的发光点数。

[0293] 结论：细胞除了能在体外长期传代外，还应具有很高的端粒酶活性。用端粒酶重复扩增PCR(TRAP-PCR)来检测细胞的端粒酶活性。其端粒酶活性应保持在一个较高的水平。焦磷酸根(PPi)的摩尔数等于用荧光素酶系统检出的ATP量。设1μg端粒重复序列等于
3.24nmol核苷，则ELIDA混合物中1pmol的PPi来源于310pg端粒重复序列的延长。端粒酶活性用pg DNA/μg蛋白质表示。

[0294] 对各细胞提取液采用TRAP-ELIDA法测定反应产物中PPi含量。图11表明：各组细胞提取液的发光值随培养介质中亚硒酸钠浓度的不同而显著不同。与不加硒的对照组相比，补硒细胞提取液的发光值显著性增高(P＜0.01)，而且随着硒浓度的增大，发光值增大。根据焦磷酸钠酶联发光值标准曲线(图12)，将各细胞提取液的发光值换算成端粒酶活性，则补充0.0和2.5μmol/L亚硒酸钠的细胞端粒酶活性分别为(0.0±34.8)和(350.1±32.8)ng DNA/μg蛋白质。对照组天祝山白牦牛细胞的端粒酶活性较低，而补充亚硒酸钠的细胞，端粒酶活性显著增大。

[0295] (二)流式荧光原位杂交法(Flow-Fish)检测端粒长度的变化

[0296] (1)取补硒生长状况良好的5×105细胞悬液，置1.5mL EP管中，离心去培养介质；

[0297] (2)细胞重新悬浮于100μL杂交液中，加入FITC-(C3TA2)3PNA探针；

[0298] (3)阴性对照组以相同体积的三蒸水代替FITC-(C3TA2)3PNA探针；

[0299] (4)将样品变性后置暗处室温杂交2h；

[0300] (5)细胞用洗液1洗两次，洗液2洗一次；

[0301] (6)将细胞重悬于300μL含碘化丙锭(PI)的磷酸缓冲液中，于4℃下放置过夜；

[0302] (7)于FACSort流式细胞仪上，由FL-2通道测定PI荧光强度，FL-1通道测定端粒FITC线形范围内的荧光强度；

[0303] (8)为进行数据分析，细胞控制为单一二倍体细胞。端粒平均荧光强度表示与FITC-(C3TA2)3PNA探针杂交细胞的平均荧光强度减去无探针杂交细胞的平均荧光强度。端粒长度与端粒平均荧光强度成正比，因此用端粒平均荧光强度检测端粒长度的变化。

[0304] 结论：

[0305] 端粒是存在于真核细胞线形染色体末端的一段特殊的DNA-蛋白质复合物，通过对染色体末端限制性片段TRF(terminal restriction fragments)的分析发现正常细胞分裂1次，染色体端粒减少几十至200核苷酸，当缩短到一定程度，即不能维持染色体的稳定，导致细胞最终死亡。为了实现细胞的高活性，在培养基加入0.5μmol/L亚硒酸钠目的维持细胞的端粒长度。通过Flow-Fish法检测细胞端粒长度变化的原理在于细胞端粒由高度重复序列T2AG3组成，其长度越长，所含重复序列数目越多，所结合的FITC-(C3TA2)3PNA探针就越多，其荧光也就越强。因此对同一种细胞而言，Flow-Fish法检测的单个细胞端粒平均荧光强度与端粒长度成正比。天祝山白牦牛的荧光直方图见图13A。基于PI荧光和前向散射光(FSC)而控制检测细胞在R1区(即二倍体细胞区)，测定该区细胞端粒特异性的FITC荧光[图13B]。端粒平均荧光为与FITC-(C3TA2)3PNA探针杂交的细胞的平均荧光减去阴性对照细胞(即与不含探针杂交液作用的细胞)的平均荧光的差值。由图14可知，在天祝山白牦牛培养基中分别加入0.5亚硒酸钠，细胞端粒平均荧光强度与不加硒的细胞相比有明显提高(P＜0.05)。说明补充亚硒酸钠能促进细胞端粒的延长。

[0306] 十、作为供体核异种核移植重组胚发育的检测

[0307] (1)挑选排出第一极体成熟绵羊卵母细胞，CCB孵育15min；

[0308] (2)、吸出极体及附近部分细胞质连同中期染色体进行去核；

[0309] (3)、5μg/mL Hoechst33342平衡10min，荧光显微镜挑选完全去核的卵母细胞；

[0310] (4)、0.25％胰蛋白酶消化血清饥饿3d后的天祝山白牦牛作为供体细胞，通过显微操作将供体细胞注入透明带下于完全去核的卵母细胞通过电融合构建重组胚；

[0311] (5)、构建好的重组胚用5μM/L离子霉素激活5min后，移入含2mM/L的6-DMAPSOF内再激活4h，激活后的重组胚放入四孔培养板(Nunc)内培养，培养7～8d后统计发育的囊胚数；

[0312] (6)、重组胚核型分析

[0313] 结论：供体细胞是体细胞核移植的重要元件之一，其状态是影响重组胚发育的非常重要的因素。供体细胞携带着胚胎后期发育的所有遗传物质，并在去核卵母细胞中完成重新编程的这一过程。

[0314] 以天祝山白牦牛作为供体核，绵羊的去核卵母细胞作为受体胞质构建重组胚，如图15，检验天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞发育能力，结果表明，天祝山白牦牛作为供体细胞能在绵羊去核卵母细胞中得到重新程序化，本方法获得的天祝山白牦牛耳缘组织成纤维细胞系构建的异种核移植重组胚囊胚率(34％)，如图18，较现有技术培养细胞构建的异种核移植的重组胚的活率7.3％～20％相比有显著的提高，经核型分析可判定重组胚的遗传物质来自天祝山白牦牛体细胞，与核供体细胞的染色体类型一致。图16是核移植二细胞胚胎，图17核移植后桑椹胚，图19核移植孵化囊胚。