一种嵌合受体及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种新的scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体，该受体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。该嵌合受体对肿瘤特别是实体肿瘤有非常好的治疗效果。本发明还提供了编码上述嵌合受体分子的DNA分子，携有该嵌合受体的逆转录病毒，以及该嵌合受体的制备方法，及它在制备治疗抗肿瘤药物中的用途。

权利要求

1.一种scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体，其特征在于，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的嵌合受体。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，所述及的DNA分子含有SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。

4.一种逆转录病毒载体，其特征在于，所述的载体携有编码如权利要求1所述的scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的逆转录病毒载体，其特征在于，所述的载体用以下方法制备：在单链抗体的VL的C末端克隆入c-myc尾，将抗erbB2的单链抗体用VH和VL，CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3ζ链胞内段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，并与另两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的逆转录病毒载体。

6.一种制备权利要求1所述的嵌合抗体的方法，其特征在于，该方法包括：a)overlap PCR的方法获得抗erbB2的单链抗体用VH和VL；

b)PCR的方法获得CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3ζ链胞内段；

c)将步骤a)和b)中的片段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，与另两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的病毒液；

d)在小鼠T淋巴细胞的表达表面嵌合受体。

7.一种如权利要求1所述的cFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的嵌合受体在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述及的肿瘤是实体肿瘤。

说明书

一种嵌合受体及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明涉及一种新的嵌合受体以及该嵌合受体的制备方法和用途。

背景技术

[0002] 有效的抗肿瘤免疫需要机体的免疫系统能够识别肿瘤抗原，并最终利用免疫效应机制清除肿瘤细胞。在人们寻找肿瘤抗原的几十年中，发现大多数的肿瘤抗原是自身抗原，它们异位表达或过表达于肿瘤细胞，能诱导免疫系统产生忽视、克隆清除和免疫耐受，从而阻碍机体产生抗肿瘤免疫反应。

[0003] 另外，肿瘤细胞还能通过降低肿瘤抗原和MHC分子的表达、分泌免疫抑制性的细胞因子等机制逃脱机体的免疫监视。即使肿瘤抗原能够被识别，并诱导产生肿瘤特异性的CTL，也不能够完全清除肿瘤细胞，因为必须有足够数量的CTL迁移到肿瘤部位发挥细胞毒作用，并要克服肿瘤细胞逃脱免疫监视的各种机制。过继性免疫治疗是通过给荷瘤机体输注抗肿瘤免疫效应细胞，如致敏或激活的淋巴细胞来杀伤肿瘤。

[0004] 这些方法曾成功地应用于黑色素瘤和肾细胞癌的治疗，然而对于大多数实体肿瘤如卵巢癌、结肠癌、乳腺癌来说未取得满意的治疗效果，主要原因为分离和培养足够数量的肿瘤特异性的淋巴细胞非常困难。另外，实体肿瘤的屏障作用和注入体内肿瘤特异性抗体的快速清除，使得体液免疫在肿瘤免疫治疗中的作用受到很大的限制。

[0005] 为此，有研究者将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性和T淋巴细胞的杀伤作用相结合，利用基因工程技术，构建嵌合型的人工T细胞受体(CARs)，它包括识别肿瘤相关抗原的单链抗体、共刺激分子和T细胞的活化CD3ζ链，通过逆转录病毒载体，高效转染T淋巴细+胞，使T细胞能以MHC非限制性的方式识别并杀伤肿瘤细胞。越来越多的证据表明，CD4T+
细胞在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用，而肿瘤特异性的CD4T细胞的获得非常困难。由+ +
于嵌合型的T细胞受体不仅能转染CD8T细胞，还能转染CD4T细胞，且两者均能被相应的抗原分子激活，因此在抗肿瘤免疫中发挥重要的作用。

[0006] 据Hiroshi报道，用CARs修饰的Th1细胞与Tc1细胞相比，能分泌更多的IL-2和-/-IFN-γ等细胞因子，将Th1与Tc1联合应用，在BALB/c RAG-2 小鼠体内获得协同治疗肿瘤的效果。

发明内容

[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种新的scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体，以克服现有技术的不足；

[0008] 本发明要解决的第二个技术问题是提供编码上述嵌合受体分子的DNA分子，以克服现有技术的不足；

[0009] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种携有scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体的逆转录病毒；

[0010] 本发明要解决的第四个技术问题是提供一种scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体的制备方法；

[0011] 本发明要解决的第四个技术问题是提供该嵌合受体的用途；

[0012] 本发明的技术方案是这样的：

[0013] 本发明提供了一种scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体，其特征在于，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

[0014] 本发明还提供了一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的嵌合受体。该DNA分子含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

[0015] 本发明还提供了一种逆转录病毒载体，其特征在于，所述的载体携有scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体。该载体用以下方法制备：将抗erbB2的单链抗体用VH和VL，CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3ζ链胞内段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，并与另外两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的逆转录病毒载体。

[0016] 本发明还提供了一种制备权利要求1所述的嵌合抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

[0017] a)overlap PCR的方法获得抗erbB2的单链抗体VH和VL；

[0018] b)PCR的方法获得CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3ζ链胞内段；

[0019] c)将步骤a)和b)中的片段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，与另外两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的病毒液；

[0020] d)在小鼠T淋巴细胞的表达表面嵌合受体。

[0021] 本发明还提供了scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其中所述及的肿瘤是实体肿瘤。

[0022] 在药物应用中，由scFv--anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体和药学上可接受的载体组成药物组合物，其中，药学上可接受的载体应当与本发明的嵌合受体相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；麦芽、明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇，海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；
和磷酸盐缓冲液等。

[0023] 本发明所提供的药物可根据需要制备成各种剂型并可由医师根据患者年龄、体重和大致疾病状况，给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。

[0024] 表达嵌合受体的T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用试验表明，HE染色显示输入T-CARs细胞的肿瘤部位有淋巴细胞的浸润和肿瘤的坏死。免疫组织化学染色示肿瘤部位、脾脏、淋巴结、胸腺有T-CARs细胞。该结果说明T-CARs细胞能够聚集到表达抗原的肿瘤部位和淋巴组织，以发挥杀伤肿瘤的作用和特异性的免疫功能的建立。

附图说明

[0025] 图1：scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体分子结构示意图；

[0026] 图2：表示小鼠CD28分子片段，利用RT-PCR法获得小鼠CD28分子(303-710bp)共408bp，其中1：DL2000 Marker，2：CD28片段；

[0027] 图3：表示小鼠Zeta链胞内段，利用RT-PCR法获得小鼠ZeTa链胞内段(228-563bp)共336bp，其中1：DL2000 Marker，2：Zeta链片段。

[0028] 图4：抗erbB2抗体的VH和VL片段，其中1：DL2000 Marker，2、3：VH片段，4、5：VL片段；

[0029] 图5：scFv-anti-erbB2，其中1：DL2000 Marker，2：scFv-anti-erbB2(825bp)。

[0030] 图6：CMMP-eGFP质粒图及CMMP-scFv-CD28-ζ的构建，由于pCMMP-eGFP质粒没有MCS，用Nco I/Not I做部分酶切，将eGFP部分置换为scFv，然后将CD28片段插入Xho I/Not I之间，Zeta链插入Not I/BamH I之间。

[0031] 图7：质粒CMMP-GFP被Nco I/Not I部分酶切，其中1：DL2000 Marker，2：LambdaDNA/HindIIIMarke，3：酶切产物(5922bp，将目的片段回收，并与ScFv、CD28、Zeta相连)

[0032] 图8：质粒CMMP-scFv-CD28-Zeta的酶切鉴定图，其中1：DL2000 Marker，2：pCMMP-scFv-CD28-ζ，3：pCMMP-GFP，4：Nco I+Not I酶切产物，有scFv和CD28切出，5：Not I+BamH I酶切产物，有ζ链切出，6：Xho I+Not I酶切产物，有CD28切出，7：Lamda DNA/HindHI Marker。

具体实施方式

[0033] 自从Eshhar，Z等第一次将识别hapten的scFv与CD3ζ链或FcεRIγ融合，构建CARs，转染到小鼠CTL杂交瘤后，具有识别并杀伤负载hapten的淋巴瘤细胞的功能。CARs的构建、转染及功能检测、动物实验等已有近十多年的探索历史。CARs不仅能识别广泛的肿瘤抗原，更重要的是CAR介导的杀伤作用不仅表现在杂交瘤细胞，还表现在小鼠和人的原代T细胞，以及病人来源的T细胞。

[0034] 采用CARs转染的T淋巴细胞过继性地治疗肿瘤与其它的免疫治疗策略比较有许多优点：1、只要有针对肿瘤抗原的抗体存在，利用基因工程技术较容易得到针对该肿瘤抗原的特异性的嵌合受体；2、CARs功能的发挥不受MHC的限制，因此，针对同一抗原的CARs能应用于不同的宿主。3、不同于TCR，CARs不仅能识别蛋白抗原，还能识别糖类和脂类抗原，而这两种抗原正是常见的肿瘤抗原。4、没有与内源性TCR的α和β链形成交联的可能。5、通过CARs介导的肿瘤细胞毒作用主要是通过穿孔素和Fas-Ligand依赖性途径发挥，细胞因子IFN-γ、IL-2的分泌对于CARs修饰的T细胞的体内功能的发挥非常重要。6、没+ +有IL-2的毒性作用。7、由于CARs不仅能转染CD8T细胞，还可以转染CD4T细胞，且两者均能被相应的抗原分子激活。

[0035] erbB2癌基因是表皮生长因子受体家族成员，是具有酪氨酸激酶活性的，分子量为185kDa的跨膜糖蛋白。Her2/neu普遍表达于上皮性肿瘤，过表达于约30％的卵巢癌和乳腺癌，并且这种过表达往往预示着肿瘤的高度恶性和不良预后。由于在乳腺癌和卵巢癌患者体内能检测到抗erbB2特异性的抗体和T淋巴细胞，因此，erbB2是肿瘤免疫治疗的一个很好的靶分子。

[0036] 我们构建了anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体分子，通过逆转录病毒载体转染到小鼠T淋巴细胞表面，验证其在体外的肿瘤抗原特异性的杀伤、增殖和细胞因子的分泌功能，以及其在同系小鼠体内的过继性免疫治疗效果。

[0037] 下面将结合实施例进一步详细地描述本发明，然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

[0038] 实施例1

[0039] 构建携有scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体的逆转录病毒载体

[0040] 首先利用基因工程技术，构建携有scFv-anti-erbB2-CD28-ζ嵌合受体的逆转录病毒载体，抗erbB2的单链抗体VH和VL经overlap PCR的方法获得，CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段以及CD3ζ链胞内段分别用PCR的方法获得。CD28分子的胞外段部分主要功能是保持单链抗体和细胞膜之间的距离，维持单链抗体的空间构象，CD28分子的胞内段和ζ链的胞内段分别发挥共刺激功能和信号传递的功能。将上述片段依次装入逆转录病毒载体pCMMP中，与另外两个辅助载体pHDM.G和pMD.MLVgag.pol共同转染293T细胞，包装获得病毒颗粒，经离心浓缩后获得高滴度的病毒液，在NIH3T3细胞中检测病毒的8
滴度为(2.1±1.1×10IP/ml)。

[0041] 实施例2表达在小鼠T淋巴细胞表面的嵌合受体体外功能的检测

[0042] 将嵌合受体表达在小鼠T淋巴细胞的表面，并进行体外功能的检测。首先无菌取小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，将获得的小鼠脾细胞悬液经贴壁去除单核细胞、巨噬细胞，DC，+纤维细胞等，在抗体或ConA刺激下培养7天后，CD3T细胞基本达85％-90％以上，其中+ + + +
CD8T细胞约占55％，CD4T细胞约占45％。用免疫磁珠分选CD4 和CD8T细胞，纯度均达
90％以上。用浓缩后的病毒液感染刺激后的T细胞，利用抗Her2-Ig蛋白，通过流式细胞术+ +
检测病毒对T细胞的感染效率，CD4 和CD8T细胞的感染效率为35％-45％，二者感染效率无差别。

[0043] 对基因修饰的T细胞，我们进行了下列实验：

[0044] 1、首先检测基因修饰的T细胞对抗原的结合能力，将T-CARs，T-mock分别与Her2/Ig作用后，流式细胞术检测发现Her2/Ig与T-CARs的结合率为40％±5％。

[0045] 2、检测基因修饰的CD4+、CD8+T和CD3+T细胞的细胞毒活性。结果表明，CD8+T-CARs、+ + +CD4T-CARs和CD3T-CARs能杀伤表达erbB2的D2F2/E2、SK-BR-3肿瘤细胞，CD8T-CARs的+ + + +
细胞毒性明显强于CD4T-CARs细胞，CD3T-CARs的杀伤效率介于CD8T-CARs和CD4T-CARs+
之间，更接近于CD8T-CARs。这种杀伤作用对不表达erbB2的肿瘤细胞或抗体封闭的erbB2+
阳性细胞无效。说明细胞毒性是抗原依赖的、CARs介导的作用，CD8T-CARs细胞的细胞毒功能最强。

[0046] 3、检测了基因修饰的T细胞的增殖能力，结果表明，CD3+T-CARs细胞受D2F2/E2、SK-BR-3刺激后，均能不同程度地增殖，而T-mock受同样刺激并不增殖；T-CARs或T-mock-受erbB2 的肿瘤细胞刺激后均不增殖。说明T细胞的增殖是抗原依赖性的，CARs介导的作用。

[0047] 4、检测细胞因子的分泌，结果表明T-CARs与表达erbB2抗原的肿瘤细胞D2F2/E2或SK-BR-3共孵育后，上清经ELISA检测有GM-CSF和IFN-γ的分泌，T-CARs与MCF-7、+D2F2/E2-mask细胞或T-mock细胞与任何肿瘤细胞共孵育均无细胞因子的分泌。CD4T-CARs+ + +
分泌的细胞因子量显著高于CD8T-CARs，CD3T-CARs分泌的细胞因子介于CD4T-CARs和+ +
CD8T-CARs之间。说明抗原依赖性的CD4T-CARs主要通过分泌Th1型细胞因子来发挥抗肿瘤作用。

[0048] 实施例3表达嵌合受体的T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用

[0049] 观察表达嵌合受体的T细胞在小鼠体内的抗肿瘤作用。D2F2/E2是表达人的erbB25
抗原的BALB/c小鼠的乳腺癌细胞株，分别将1×10 个D2F2/E2细胞背部皮下接种BALB/c裸鼠和BALB/c小鼠，随机分3组，每组10只，设空白病毒对照组、单纯肿瘤组和治疗组。在
6
接种肿瘤的同时、第二天两次经尾静脉注射T细胞，数量均为5×10，观察60天，并测量肿瘤大小。

[0050] 结果显示，所有单纯肿瘤组、空白病毒对照组小鼠均生长肿瘤，BALB/c裸鼠治疗组成瘤率80％(8/10)，而在BALB/c小鼠治疗组中，成瘤率30％(3/10)。在未长肿瘤的小鼠5
中，再次接种1×10 个D2F2/E2细胞，观察30天，裸鼠全部长肿瘤，而BALB/c小鼠未长肿+
瘤。将未长肿瘤的BALB/c小鼠处死，免疫磁珠分选CD3T细胞，分别与D2F2/E2或D2F2/D2-mask细胞作用，发现有对D2F2/E2和D2F2/E2-mask肿瘤细胞的杀伤和细胞因子的分泌功能。说明在未长肿瘤的小鼠体内产生了对D2F2/E2特异性而不仅是erbB2抗原特异性的抗肿瘤作用，这种作用是由BALB/c小鼠自身的T细胞产生的。

[0051] 为了检测输入到体内的T-CARs细胞分布情况，我们利用了两只肿瘤大小为200mm37
的荷瘤BALB/c小鼠，分别尾静脉注射1×10 个T-mock和T-CARs细胞，48h后将小鼠处死，取脾脏、肿瘤、淋巴结、胸腺组织，固定后做切片，HE染色显示输入T-CARs细胞的肿瘤部位有淋巴细胞的浸润和肿瘤的坏死。免疫组织化学染色示肿瘤部位、脾脏、淋巴结、胸腺有T-CARs细胞。该结果说明T-CARs细胞能够聚集到表达抗原的肿瘤部位和淋巴组织，以发挥杀伤肿瘤的作用和特异性的免疫功能的建立。

[0052] 实施例4表达抗erbB2的CARs的T淋巴细胞受相应的抗原刺激后，诱导免疫突触的形成以及人工的CARs参与到免疫突触

[0053] 利用共聚焦显微镜观察表达抗erbB2的CARs的T淋巴细胞受相应的抗原刺激后，是否能诱导免疫突触的形成以及人工的CARs是否参与到免疫突触中。结果表明，转染CARs的T细胞受Her2/Ig刺激后，CARs与膜筏共同形成帽状结构，转染CARs的T细胞受无关抗原人的免疫球蛋白IgG刺激后，无帽状结构的形成；T-mock细胞受Her2/Ig或人的IgG刺激均无帽状结构的形成。说明表达CARs的T细胞受相应抗原刺激后能与膜筏共同形成免疫突触，从而激活T细胞，发挥杀伤和分泌细胞因子的功能。

[0054] 通过逆转录病毒载体转染CARs到小鼠T淋巴细胞，使之能以MHC非限制性的方式+在体内和体外识别并杀伤肿瘤细胞。输入到体内的T-CARs细胞中，CD8T-CARs细胞的功能+
主要是直接发挥杀伤肿瘤的作用；CD4T-CARs细胞则可以通过分泌细胞因子如GM-CSF和IFN-γ来发挥作用。以往研究表明，GM-CSF和IFN-γ有抗肿瘤的作用，IFN-γ还有抗肿瘤血管形成的作用，GM-CSF能促进DC的成熟。最后我们利用共聚焦显微镜从膜微结构的改变来阐述人工的嵌合受体发挥功能的物质基础，在受到相应抗原刺激后，T细胞形成免疫突触，嵌合受体参与到免疫突触中，现已证明，许多参与T细胞活化的膜表面分子和信号传导分子位于膜筏中，膜筏的重排和聚集被证明是T细胞活化的重要机理。因此，我们认为，表达CARs的T细胞的功能的发挥也是通过形成免疫突触来完成的。

[0055] 序列表

[0056] <110>上海中信国健药业有限公司

[0057] <120>一种嵌合受体及其制备方法和用途

[0058] <160>2

[0059] <170>PatentIn version 3.1

[0060] <210>1

[0061] <211>622

[0062] <212>PRT

[0063] <213>人工序列

[0064] <220>

[0065] <221>misc_feature

[0066] <222>(1)...(622)

[0067] <223>嵌合受体氨基酸序列

[0068] <400>1

[0069] Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser[0070] 5 10 15[0071] Val Ile Ile Ser Arg Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly[0072] 20 25 30[0073] Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly[0074] 35 40 45[0075] Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly[0076] 50 55 60

[0077] Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr[0078] 65 70 75 80[0079] Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr[0080] 85 90 95[0081] Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Mer Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp[0082] 100 105 110[0083] Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala[0084] 115 120 125[0085] Met Asp Tyr Trp Gly Gln Cys Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly[0086] 130 135 140

[0087] Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln[0088] 145 150 155 160[0089] Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val[0090] 165 170 175[0091] Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp[0092] 180 185 190[0093] Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala[0094] 195 200 205[0095] Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser[0096] 210 215 220

[0097] Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe[0098] 225 230 235 240[0099] Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly[0100] 245 250 255[0101] Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala[0102] 260 265 270[0103] Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val[0104] 275 280 285[0105] Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser[0106] 290 295 300

[0107] Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu[0108] 305 310 315 320[0109] His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu Val Cys Val Val Tyr Gly Asn[0110] 325 330 335[0111] Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp[0112] 340 345 350[0113] Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr[0114] 355 360 365[0115] Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro[0116] 370 375 380

[0117] Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val[0118] 385 390 395 400[0119] Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys[0120] 405 410 415[0121] Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser[0122] 420 425 430[0123] Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg[0124] 435 440 445[0125] Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro[0126] 450 455 460

[0127] Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe[0128] 465 470 475 480[0129] Ala Ala Tyr Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu[0130] 485 490 495[0131] Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe[0132] 500 505 510[0133] Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln[0134] 515 520 525[0135] Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu[0136] 530 535 540

[0137] Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly[0138] 545 550 555 560[0139] Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu[0140] 565 570 575[0141] Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly[0142] 580 585 590[0143] Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser[0144] 595 600 605[0145] Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala[0146] 610 615 620

[0147] <210>2

[0148] <211>1878

[0149] <212>DNA

[0150] <213>人工序列

[0151] <220>

[0152] <221>misc_feature

[0153] <222>(1)...(1878)

[0154] <223>嵌合受体基因序列

[0155] <400>2

[0156] TCCATGGATT TTCAGGTGCA GATTTTCAGC TTCCTGCTAA TCAGTGCCTC AGTCATAATA 60[0157] TCCAGAGGAG AGGTTCAGCT GGTGGAGTCT GGCGGTGGCC TGGTGCAGCC AGGGGGCTCA 120[0158] CTCCGTTTGT CCTGTGCAGC TTCTGGCTTC AACATTAAAG ACACCTATAT ACACTGGGTG 180[0159] CGTCAGGCCC CGGGTAAGGG CCTGGAATGG GTTGCAAGGA TTTATCCTAC GAATGGTTAT 240[0160] ACTAGATATG CCGATAGCGT CAAGGGCCGT TTCACTATAA GCGCAGACAC ATCCAAAAAC 300[0161] ACAGCCTACC TGCAGATGAA CAGCCTGCGT GCTGAGGACA CTGCCGTCTA TTATTGTTCT 360[0162] AGATGGGGAG GGGACGGCTT CTATGCTATG GACTACTGGG GTCAAGGAAC CCTGGTCACC 420[0163] GTCTCCTCGG GTGGCGGTGG CTCCGGCGGT GGTGGGTCGG GTGGCGGCGG ATCTGACATC 480[0164] CAGATGACCC AGTCCCCGAG CTCCCTGTCC GCCTCTGTGG GCGATAGGGT TACCATCACC 540[0165] TGCCGTGCCA GTCAGGATGT GAATACTGCT GTAGCCTGGT ATCAACAGAA ACCAGGAAAA 600[0166] GCTCCGAAAC TACTGATTTA CTCGGCATCC TTCCTCTACT CTGGAGTCCC TTCTCGCTTC 660[0167] TCTGGCTCCA GATCTGGGAC GGATTTCACT CTGACCATCA GCAGTCTGCA GCCGGAAGAC 720[0168] TTCGCAACTT ATTACTGTCA GCAACATTAT ACTACTCCTC CCACGTTCGG ACAGGGTACC 780[0169] AAGGTGGAGA TCAAACGTAT GCTCAGGCTG CTCTTGGCTC TCAACTTATT CCCTTCAATT 840[0170] CAAGTAACAG GAAACAAGAT TTTGGTGAAG CAGTCGCCCA TGCTTGTAGC GTACGACAAT 900[0171] GCGGTCAACC TTAGCTGCAA GTATTCCTAC AATCTCTTCT CAAGGGAGTT CCGGGCATCC 960[0172] CTTCACAAAG GACTGGATAG TGCTGTGGAA GTCTGTGTTG TATATGGGAA TTACTCCCAG 1020[0173] CAGCTTCAGG TTTACTCAAA AACGGGGTTC AACTGTGATG GGAAATTGGG CAATGAATCA 1080[0174] GTGACATTCT ACCTCCAGAA TTTGTATGTT AACCAAACAG ATATTTACTT CTGCAAAATT 1140[0175] GAAGTTATGT ATCCTCCTCC TTACCTAGAC AATGAGAAGA GCAATGGAAC CATTATCCAT 1200[0176] GTGAAAGGGA AACACCTTTG TCCAAGTCCC CTATTTCCCG GACCTTCTAA GCCCTTTTGG 1260[0177] GTGCTGGTGG TGGTTGGTGG AGTCCTGGCT TGCTATAGCT TGCTAGTAAC AGTGGCCTTT 1320[0178] ATTATTTTCT GGGTGAGGAG TAAGAGGAGC AGGCTCCTGC ACAGTGACTA CATGAACATG 1380[0179] ACTCCCCGCC GCCCCGGGCC CACCCGCAAG CATTACCAGC CCTATGCCCC ACCACGCGAC 1440[0180] TTCGCAGCCT ATCAGAGCTT TGGCCTGCTG GATCCCAAAC TCTGCTACCT GCTGGATGGA 1500[0181] ATCCTCTTCA TCTATGGTGT CATTCTCACT GCCTTGTTCC TGAGAGTGAA GTTCAGCAGG 1560[0182] AGCGCAGACG CCCCCGCGTA CCAGCAGGGC CAGAACCAGC TCTATAACGA GCTCAATCTA 1620[0183] GGACGAAGAG AGGAGTACGA TGTTTTGGAC AAGAGACGTG GCCGGGACCC TGAGATGGGG 1680[0184] GGAAAGCCGC AGAGAAGGAA GAACCCTCAG GAAGGCCTGT ACAATGAACT GCAGAAAGAT 1740[0185] AAGATGGCGG AGGCCTACAG TGAGATTGGG ATGAAAGGCG AGCGCCGGAG GGGCAAGGGG 1800[0186] CACGATGGCC TTTACCAGGG TCTCAGTACA GCCACCAAGG ACACCTACGA CGCCCTTCAC 1860[0187] ATGCAGGCCT AAGGATCC 1878