一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用

摘要

本发明属于分子生物学制药技术领域，主要是一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用，基因工程重组方法生产修饰的鸡蛋清溶菌酶的方法。本发明的解决方法是从数十种不同品种的鸡蛋中分离获得了一种具有高活性的鸡蛋溶菌酶，通过基因克隆手段获得了该溶菌酶基因；经过PCR扩增、酶切等操作后将基因导入到真核表达载体pPIC6αA和pGAPZαA中，并转化到毕赤酵母X-33内进行重组鸡蛋清溶菌酶表达，然后提取、纯化出该高活性溶菌酶。本发明由于采用基因工程重组技术，发酵生产基因重组高活性鸡溶菌酶，可实现大批量的工业化生产，不受原材料来源的限制，其产品具有稳定、纯净、生物活性高的特点。可广泛应用于制药，食品，饲料，化妆品等多个领域。

权利要求

1.一种DNA分子，其特征在于：它编码具有鸡溶菌酶蛋白活性的多肽，所述DNA分子的核苷酸序列如附图1中新型鸡蛋溶菌酶序列表所示。

2.一种载体，其特征在于：它含有权利要求1所述的DNA分子，采用真核表达载体pPIC6αA或pGAPZαA与宿主细胞进行重组鸡蛋清溶菌酶的表达。

3.一种含有权利要求2所述载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞是大肠杆菌DH5a菌株。

4.一种含有权利要求2所述载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞是毕赤酵母X-33菌株。

说明书

一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学制药技术领域，是一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用，基因工程重组方法生产鸡溶菌酶的方法。

背景技术

[0002] 溶菌酶主要存在于动植物的组织液和某些微生物体内，如鼻粘液、眼泪、唾液、卵蛋白、枯草杆菌培养物和某些蔬菜中。该酶能水解细菌的细胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4-糖苷键，故又称胞壁质酶，即N-乙酰胞壁质糖苷聚糖水解酶。

[0003] 其中对鸡蛋清溶菌酶的研究最清楚，它是由129个氨基酸残基构成的一种碱性蛋白，分子量约为14KD，对热稳定，对碱不稳定，对革兰氏阳性细菌有较强的杀菌作用。可药用，具抗菌、清除局部坏死组织、止血、消肿、消炎等作用。在食品工业上可用作防腐剂，还可添加在牙膏中作为防治龋齿的药用牙膏。在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于分解细胞壁，制备无菌体提取液。

[0004] 目前，从鸡蛋清提取溶菌酶以及从霉菌中提取溶菌酶均已达工业化生产水平，市场销售的溶菌酶大多来源于鸡蛋蛋清中工业化提取的，价格较高。但随着国内外需求量的增大，市场上溶菌酶供不应求；同时溶菌酶的生产也受到原材料的限制，无法满足市场上溶菌酶的需求。因此，提高溶菌酶的产量与活性是一个急需解决的重要问题。

发明内容

[0005] 本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供了一种高活性鸡溶菌酶的基因克隆、表达与应用，通过发酵大批量生产溶菌酶的方法，本方法生产的溶菌酶是在筛选多种鸡蛋溶菌酶的基础上，获得了高生物活性、高表达的溶菌酶基因。

[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案。这种DNA分子，它编码具有鸡溶菌酶蛋白活性的多肽核苷酸序列，多肽核苷酸序列如附图1所示，载体含有上述的DNA序列。本发明采用真核表达载体pPIC6αA、pGAPZαA与毕赤酵母宿主菌X-33进行重组鸡蛋清溶菌酶的表达。

[0007] 本发明的解决方法是分离获得一种具有高活性的鸡蛋溶菌酶基因，经过PCR扩增、酶切等操作后，克隆到真核表达载体中，并转化整合到毕赤酵母基因组内进行表达，然后提取、纯化出高活性鸡蛋清溶菌酶。

[0008] 这种生产基因工程鸡溶菌酶的方法，具体步骤如下：

[0009] (a)、将筛选获得的LYS蛋白质的核苷酸序列可操作性的连接于表达调控序列，形成LYS表达载体，所述的核苷酸编码一多肽，所述的多肽具有溶菌酶活性；

[0010] (b)、将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成表达LYS蛋白的重组细胞；

[0011] (c)、在适合表达LYS多肽的条件下，培养、表达步骤(b)中的重组细胞；

[0012] (d)、分离纯化出LYS蛋白。

[0013] 本发明蛋白表达方法中的提取工艺为：工程菌种接种于BMGY培养基中，28℃，300rpm条件下摇床振荡培养36小时，离心收集菌体；重新悬浮、接种于含BMMY培养基的发酵罐中，流加100％甲醇诱导表达，控制溶氧度在30％以上，28℃条件下发酵100h，离心收集上清液，透析去离子，经过阳离子交换树脂层析柱，连续洗脱留取活性峰液，再透析去离子，经活性鉴定后分装冻干，即为成品。

[0014] 鸡蛋溶菌酶作为饲料添加剂的应用，其使用方法为：按重量百分比计，溶菌酶添加量为10000～100000U/kg。

[0015] 本发明有益的效果：由于采用基因工程重组技术，发酵生产基因重组鸡蛋清溶菌酶，能够较大批量的生产基因工程修饰的鸡蛋清溶菌酶，不受原材料来源的限制，显著提高溶菌酶的产量。其产品具有稳定、纯净、生物活性高的特点。

附图说明

[0016] 附图1是本发明多肽核苷酸序列示意图；

[0017] 附图2鸡蛋壳提取溶菌酶抑菌试验与Weatem-Blot分析结果

[0018] 附图3 pIC6αA-mLYS单拷贝表达载体构建策略

[0019] 附图4 pPIC6αA-mLYS多拷贝表达载体构建策略

[0020] 附图5 pGAPZαA-mLYS单拷贝表达载体构建策略

[0021] 附图6 pGAPZαA-mLYS多拷贝表达载体构建策略

具体实施方式

[0022] 下面结合实施例对本发明作进一步描述。

[0023] 一、获取鸡蛋溶菌酶基因

[0024] 1鸡蛋清溶菌酶的提取工艺

[0025] 将购买自全国各地的56种地方品种来源的鸡蛋作为原料提取鸡蛋清溶菌酶，工艺如下：

[0026] 1.1配制蛋清液纯蛋清中加入适量去离子水，搅拌混匀，过滤，测浓度，备用。

[0027] 1.2树脂吸附向制备的蛋清液中加入已经充分平衡后的阳离子吸附树脂，慢速搅拌，以树脂在液体中充分运动无死角为宜。室温下吸附2～3h，然后过滤将树脂蛋清分离，对树脂进行洗脱。

[0028] 1.3洗脱滤除蛋清液后的树脂，每次用树脂体积的1～1.5倍的去离子水搅拌洗涤，漂去上层泡沫，滤除洗水，重复洗涤数次，直至基本无泡沫为止；总用水量约为5～6倍的树脂体积。将水洗后的树脂分为数份(根据树脂量而定)，分别装入带熔沙滤片的玻璃交换柱中，用0.1M的NaCl冲洗，除去杂蛋白，直至用20％的三氯醋酸检查溶液不显浑浊为止；然后将交换柱自上而下串连，由上面第一柱加2M NaCl溶液，控制流速，流经树脂层进入第二柱。一次进行，流经最后一柱的流出液含有一定浓度的溶菌酶。再用2MNaCI溶液连续洗涤下，各柱中树脂所含溶菌酶一次自上而下地被洗脱干净。

[0029] 1.4浓缩、脱盐与冻干含酶洗脱液用中空纤维超滤膜装置浓缩脱盐，在NaCl含量合格后，将脱盐液送入冷冻干燥机干燥即为成品酶。

[0030] 2鸡蛋清溶菌酶生物学鉴定

[0031] 2.1溶菌酶抑菌活性检测

[0032] 2.1.1接种溶壁微球菌于LB(组成为：1％Trypton，0.5％Yeast Extract，1％NaCl，用NaOH调节pH至7.0)液体培养基中，28℃振荡过夜，4000rpm离心收集菌体，用少许pH6.2的0.1M PBS重悬菌体；

[0033] 2.1.2称量1gArgoase溶解于100mLpH 6.2的0.1MPBS(组成为：NaH2PO4·2H2O1.482g，Na2HPO4·12H2O29.011g，NaCl 9.0g，加双蒸水至1000ml)中，121℃高压灭菌
30min；

[0034] 2.1.3待冷却至50～60℃时，加入金黄色微球菌，调节OD600约为2.0左右；

[0035] 2.1.4浇制平板，冷凝后根据需要打制适当孔径的圆孔；

[0036] 2.1.5向圆孔内加各溶菌酶样品以及标准溶菌酶对照样品，37℃温箱孵育24h；

[0037] 2.1.6测定各样品加样孔周围形成的抑菌圈的直径，借以分析溶菌酶的抑菌活性，结果见附图2。

[0038] 2.2溶菌酶活力单位的测定

[0039] 2.2.1试验菌悬浮液的制备接种溶壁微球菌于试验菌斜面培养基上，28℃恒温培养48h。用灭菌蒸馏水将菌体洗下，4000rpm离心10min收集菌体，再用灭菌蒸馏水洗涤3次。最后用少量水调制成OD450为0.8左右的试验菌悬浮液冷藏备用。

[0040] 2.2.2标准酶液的配制准确称取16mg溶菌酶粉，用pH 6.2的0.1mol/L的PBS溶解，配成浓度为4mg/mL的酶溶液，再用同样缓冲液将此酶液依次稀释成2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/mL。

[0041] 2.2.3比浊测量取试验菌悬浮液3.0mL，置于比色皿中测定450nm下的OD450值，然后加入酶液0.2mL，迅速摇匀。从加入酶液起计时，每隔30s记录1次OD450。

[0042] 2.2.4溶菌酶酶活力的计算酶活力单位定义：在25℃和pH6.2条件下，OD450每分钟下降0.001为1个酶活力单位(1U)。由此得酶活力计算公式为：

[0043] 每mg酶的活力单位＝[OD450(零时)-OD450(60s时)]×1000/样品毫克数

[0044] 2.3溶菌酶Western Blot定性分析

[0045] 方法见“五、表达蛋白的鉴定”，结果见附图2。

[0046] 3鸡溶菌酶基因的克隆

[0047] 从56种不同品种的本地鸡蛋清中分离纯化了溶菌酶(步骤1)，并分析了它们的活性后，发现编号为26号的鸡蛋溶菌酶活性明显高于其它编码的鸡蛋溶菌酶，于是采用RACE方法克隆该溶菌酶基因，实施步骤如下：

[0048] 3.1采集该品种鸡输卵管细胞，迅速液氮冷冻，将冷冻组织研磨粉碎后抽提mRNA。方法为：

[0049] 将100mg冷冻组织在含液氮的研钵中，用研棒研磨，研磨过程中可加入液氮使组织保持冷冻状态，将组织碎末移入含3mL溶液D(4mol/L硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，0.5％月桂基肌酸钠，0.1mol/L β-巯基乙醇)的管中，用搅拌子室温下搅拌组织15～
30s；

[0050] 将混合物移入另一管中，每毫升组织液立即加入0.1mL 2mol/L的醋酸钠(pH4.0)，1mL酚，0.2mL氯仿一异戊醇，盖上管盖，倒置混匀；匀浆剧烈振荡10s，冰浴15min使核蛋白复合体彻底裂解；

[0051] 1000g，4℃离心20min，将上层含RNA的水相移入一新管中；

[0052] 加入与提取的RNA等量的异丙醇，充分混合液体，冰在-20℃沉淀RNA 1h或更长时间；10000g，4℃离心20min，收集沉淀的RNA；

[0053] 轻轻倒出异丙醇加入溶液D溶解RNA颗粒，每1mL第一步所使用的溶液加0.3mL溶液D；

[0054] 将溶液移至一微量离心管，旋涡振荡，并在-20℃用等量异丙醇沉淀RNA 1h或更长时间；在微量离心机上，于4℃最高转速离心10min收集RNA沉淀，用75％的乙醇洗涤沉淀2次，重复离心，吸去乙醇，吹干；

[0055] 加50～100μL DEPC处理过的水，将RNA储存于-70℃。

[0056] 3.2用抽提的mRNA作为模板，5’-RACE快速扩增cDNA，步骤如下：

[0057] 取1pg～100ng的poly(A)+RNA或1μg总RNA至一只新的试管中，用水调整体积至9μL，将RNA样品在75℃变性5min，将离心管迅速插入冰中冷却；

[0058] 配制20μL的RT-PCR反应体系：

[0059]

[0060] 注：基因特异反义引物1序列为5’-TCACAGCCGGCAGCCTCTGAT-3’

[0061] 37℃反应60min。

[0062] 去除过剩的寡核苷酸或随机六核苷酸引物可用水将反应液中止体积稀释至2mL，然后用Centricon-100微量浓缩器，500～1000g，4℃离心20min，转移残留的液体到一支新的0.5mL离心管，用旋转真空抽干使体积浓缩至10μL。

[0063] 加入10μL体积的如下试剂至反转录cDNA中：

[0064]

[0065] 反应管孵育在37℃水浴中反应15min。

[0066] 在80℃放置3min使末端转移酶失活，使带有dA尾的cDNA样品用TE pH 7.6稀释至终体积1mL。按以下次序，将各成分加入在一只0.5mL灭菌离心管中、扩增管孔内，建立PCR系列反应管：

[0067]

[0068] 注：(dT)17-接头引物序列为5’-GACTCGAGTCGACATCGA-3’

[0069] 接头引物序列为5’-GACTCGAGTCGACATCG-3’

[0070] 基因特异性引物2序列为5’-AAAGAAAAGTCTTTGGACGATGTGAG-3’

[0071] 如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油(约50μL)，防止样品在PCR反应多个加热于冷却的循环中蒸发。

[0072] 按以下方法进行PCR扩增：

[0073]

[0074] 抽取每种扩增样品5～10μL，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker来判断扩增片段的大小，凝胶用golden view染色。

[0075] 从扩增的DNA产物中分离掉残余的热稳定DNA聚合酶和dNTP，方法为：将2mL TE(pH 8.0)在Centricon-100浓缩器的贮液腔内，用移液器小心地从上层矿物油下面抽取反应液，用1000g室温离心30min。转移浓缩管内的残留浓缩液至另一新的离心管内，即为该溶菌酶基因，命名为LYS(hen lysozyme gene)。

[0076] 二、提取的溶菌酶基因的鉴定

[0077] 将以上方法获得的溶菌酶基因通过DNA测序仪进行基因测序，结果如下：

[0078] <110>李浙烽

[0079] <120>新型鸡蛋溶菌酶序列表

[0080] <140>

[0081] <141>2006-12-17

[0082] <160>1

[0083] <1 70>Patentln Version 3.2

[0084] <210>1

[0085] <211>390(核苷酸)

[0086] <212>cDNA

[0087] <213>鸡蛋清(Hen Egg White)

[0088] <220>

[0089] <221>CDS

[0090] <222>(36)...(51)...(87)...(111)...(168)...(186)...(204)...(231)...(258)...(294)...(303)...(31 5)...(351)...(387)

[0091] <223>n＝a或g或c或t

[0092] <400>1

[0093] aaagtctttg gacgatgtga gctggcagca gctttgaagcgtcacggaat ggatgggtat 60[0094] cggggataca gcctgggaaa ctggatgtgtgccgcaaaat tcgagagtgg tttcaacacc 120[0095] caggctacaa accgtaacac cgatgggagtaccgactacg gaatcttcca gatcaacagc 180[0096] cgctactggtgcaacgatgg caagacccca ggctccagga acctgtgcca catcccgtgc 225[0097] tcagccctgc tgagcgacga cataacagcg agcgtgaact gcgcgaagaa gatcgtcagc 270[0098] ggtggaaacg gcatcaacgcgtgggtcgcc tggcgcaacc gctgcaagaa caccgacgtc 360[0099] caggcgtgga tcagaggctg ccgggtgtga 3 90

[0100] <220>

[0101] <221>PRT

[0102] <222>(37)...(62)...(101)

[0103] <400>1

[0104] Lys Val Phe Gly Arg Cys Glu Leu Ala Ala Ala Leu Lys Arg His Gly Met Asp Gly Tyr 20[0105] Arg Gly Tyr Ser Leu Gly Asn Trp Met Cys Ala Ala Lys Phe Glu Ser Gly Phe Asn Thr 30[0106] Gln Ala Thr Asn Arg Asn Thr Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser 60[0107] Arg Tyr Trp Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ser Arg Asn Leu Cys His Ile Pro Cys 75[0108] Ser Ala Leu Leu Ser Asp Asp Ile Thr Ala Ser Val Asn Cys Ala Lys Lys Ile Val Ser 90[0109] Gly Gly Asn Gly Ile Asn Ala Trp Val Ala Trp Arg Asn Arg Cys Lys Asn Thr Asp Val 120[0110] Gln Ala Trp Ile Arg Gly Cys Arg Val End 130

[0111] <220>

[0112] <120>已报道的鸡蛋溶菌酶序列表

[0113] <160>390bp

[0114] <170>Patentln Version 3.2

[0115] <210>l

[0116] <211>390(核苷酸)

[0117] <212>cDNA

[0118] <213>鸡蛋清(Hen Egg White)

[0119] <221>n＝a或g或c或t

[0120] <222>

[0121] <400>1

[0122] aaagtctttg gacgatgtga gctggcagcg gctatgaagc gtcacggact tgataactat 60[0123] cggggataca gcctgggaaa ctgggtgtgtgccgcaaaat tcgagagtaa cttcaacacc 120[0124] caggctacaa accgtaacac cgatgggagtaccgactacg gaatcctaca gatcaacagc 180[0125] cgctggtggt gcaacgatgg caggacccca ggctccagga acctgtgcaa catcccgtgc 240[0126] tcagccctgc tgagctcaga cataacagcg agcgtgaact gcgcgaagaa gatcgtcagc 300[0127] gatggaaacg gcatg aacgc gtgggtcgcc tggcgcaacc gctgcaaggg caccgacgtc 360[0128] caggcgtgga tcagaggctg ccggctgtga 390

[0129] 与已报道的鸡蛋溶菌酶基因比较，结果如下：

[0130] 1与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第12位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的蛋氨酸(Met，ATG)突变为亮氨酸(Leu，TTG)；

[0131] 2与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第17位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的亮氨酸(Leu，CTT)突变为蛋氨酸(Met，ATG)；

[0132] 3与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第29位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的丙氨酸(Val，GTG)突变为蛋氨酸(Met，ATG)；

[0133] 4与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第37位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的天门酰氨(Asn，AAC)突变为甘氨酸(Gly，GGT)；

[0134] 5与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第56位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的亮氨酸(Leu，CTA)突变为苯丙氨酸(Phe，TTC)；

[0135] 6与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第62位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的色氨酸(Trp，TGG)突变为酪氨酸(Tyr，TAT)；

[0136] 7与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第68位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的亮氨酸(Leu，CTG)突变为丙氨酸(Val，ATT)；

[0137] 8与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第77位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的天门酰氨(Asn，AAC)突变为异亮氨酸(Ile，ATT)；

[0138] 9与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第86位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的亮酰氨(Leu，CTA)突变为苯丙氨酸(Phe，TTC)；

[0139] 10与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第98位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的异亮氨酸(Ile，ATT)突变为异亮氨酸(Ile，ATT)；

[0140] 11与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第101位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的天门冬氨酸(Asp，GAT)突变为甘氨酸(Gly，GGT)；

[0141] 12与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第105位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的蛋氨酸(Met，ATG)突变为异亮氨酸(Ile，ATC)；

[0142] 13与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第117位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的甘酰氨(Gly，GGC)突变为天冬酰氨(Asn，AAC)；

[0143] 14与已有报道的鸡蛋溶菌酶基因序列比较，在第129位氨基酸处发生了氨基酸突变，由原有的亮氨酸(Leu，CTG)突变为丙氨酸(Val，ATT)。

[0144] 三重组表达质粒的构建

[0145] 1诱导表达型单拷贝质粒的构建

[0146] 1.1表达系统 采用真核表达载体pPIC6αA与毕赤酵母宿主菌X-33进行重组溶菌+酶基因的表达。pPIC6αA属甲醇正表型(Mut)质粒，含有分泌因子α-factor，可将表达蛋白分泌至细胞外，便于纯化。

[0147] 1.2表达基因的准备设计一对引物P1/P2(P1序列为：5’-GGGGTCGAGAAAAGAAAAGTCTTTGGACGATGTGAG-3’；P2序列为：5’-GGGGCTAGATCACAGCCGGCAGCCTCTGAT-3’)对提取的鸡蛋溶菌酶基因进行PCR扩增，添加5’端和3’端的酶切位点；发应体系如下：

[0148]

[0149] 反应条件为：94℃，5min；(94℃，45s；60℃，45s；72℃，45；32个循环)；72℃，10min。

[0150] 取全部PCR反应产物经1.5％琼脂糖电泳，100v，30min；紫外灯下切下含有扩增产物片断的凝胶块，经PCR产物凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用Xho I和Xba I对扩增产物进行双酶切反应，反应体系如下：

[0151]

[0152] 37℃酶切过夜(约14h)，去除两端的保护碱基，形成粘性末端；经1％琼脂糖电泳后，再次经纯化回收试剂盒回收含有表达基因的酶切片断。

[0153] 1.3表达载体的准备对pPIC6αA质粒DNA经XhoI和XbaI双酶切反应，反应体系如下：

[0154]

[0155] 37℃酶切过夜(约14h)，切除两端的保护碱基，形成粘性末端；经1％琼脂糖电泳后，再次经纯化回试剂盒回收线性表达载体。

[0156] 1.4重组表达质粒pPIC6αA-mLYS将纯化回收的含有表达基因的酶切片断和线性表达载体片断按摩尔比10∶1的摩尔比例混合，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，反应体系如下：

[0157]

[0158] 16℃连接过夜(约14h)，取2μL连接产物转化大肠杆菌(DH5a)感受态细胞，转化方法为：(1)取2μL连接反应产物加入80μL感受态细胞内，用中指轻弹混匀；(2)冰浴40min后，取出置42℃水浴热激1min；(3)再次冰浴5min，(4)取出，开盖，加入320μLSOC培养基(组成为1％Trypton，0.5％Yeast Extract，0.05％NaCI，2％Glucose)；(4)置
37℃振荡摇床内，125rpm，培养1h；(5)分别取10μL，50μL，100μL涂布含100μg/mL Blasticidin抗性的LB固体平板培养基，37℃温箱内培养16～20h。

[0159] 挑取5～10个克隆分别接种于含有Blasticidin的LB液体培养基中，37℃振荡过夜，收集菌体，按照常规方法小量抽提质粒DNA，经酶切鉴定确定阳性克隆，方法同表达载体构建部分。(重组质粒pPIC6αA-mLYS的构建策略见附图3)

[0160] 2诱导表达型多拷贝质粒的构建

[0161] 2.1提取pPIC6αA-LYS质粒DNA，经Bg1 II和BamH I双酶切过夜，反应体系如下：

[0162]

[0163] 37℃酶切过夜(约14h)，切除两端的保护碱基，形成粘性末端；经1.5％琼脂糖电泳后，经纯化回收试剂盒回收大小约为400bp的酶切片断AOX-LYS fragment。

[0164] 2.2提取pPIC6αA-LYS质粒DNA，经BamH I单酶切过夜，酶切体系如下：

[0165]

[0166] 37℃酶切过夜(约14h)，将pPIC6aA-LYS酶切成线性质粒；经1.5％琼脂糖电泳后，经纯化回收试剂盒回收酶切产物pPIC6aA-LYS linear。

[0167] 2.3将Bg1 II和BamH I双酶切片断AOX-LYS在T4 DNA Ligase作用下连接过夜，因为Bg1 II和BamH I的识别位点中共有四个相同的碱基，所以Bg1 II和BamH I也能发生连接，连接反应体系如下：

[0168]

[0169] 16℃连接过夜(约14h)，连接产物(multicopyAOX-LYS，mAOX-LYS)置65℃水浴30min，使liagse失活。

[0170] 2.4将以上连接产生的头对尾、头对头和尾对尾连接多拷贝片断，在Bg1 II和BamH I内切酶的作用下酶切过夜，酶切体系如下：

[0171]

[0172] 37℃酶切过夜(约14h)，去除头对头和尾对尾的连接方式，经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒纯化回收最大的片断(mAOX-LYS头对尾连接方式)；

[0173] 2.5将获得的多拷贝片断与步骤2.2中的线性表达载体按摩尔比10∶1的摩尔比例混合，经T4 DNA连接酶连接过夜，连接体系如下：

[0174]

[0175] 16℃连接过夜(约14h)，形成pPIC6aA-mLYS多拷贝表达载体(见附图4)；

[0176] 2.6将以上构建的多拷贝表达载体转化E.Coli DH5α，抽提质粒DNA，用于转化酵母。

[0177] 3连续表达型单拷贝质粒的构建

[0178] 3.1抽提pPIC6αA-mLYS质粒DNA，经Xho I和Xba I双酶切，酶切体系如下：

[0179]

[0180] 37℃酶切过夜(约14h)，经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒纯化回收含mLYS的酶切片断；

[0181] 3.2抽提pGAPZαA质粒DNA，经Xho I和XbaI双酶切，体系如下：

[0182]

[0183] 37℃酶切过夜(约14h)，经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒纯化回收pGAPZaA线性片断；

[0184] 3.3将步骤3.1与3.2的回收片断按10∶1的摩尔比例混合，经T4 DNA ligase连接，体系如下：

[0185]

[0186] 16℃连接过夜，得pGAPZαA-mLYS(见附图5)。

[0187] 3.4取2μL连接产物，转化E.Coli DH5α，方法同前；抽提质粒DNA，用于转化酵母。

[0188] 4连续表达型多拷贝质粒的构建

[0189] 4.1提取pGAPZαA-LYS多拷贝质粒DNA，经Bg1 II和BamH I双酶切过夜，胶回收试剂盒含LYS的酶切片断；

[0190]

[0191] 37℃酶切过夜(约14h)，经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒纯化回收GAP-LYS片断。

[0192] 4.2将以上Bg1 II和BamH I双酶切片断在T4 DNA Ligase作用下连接过夜，因为Bg1 II和BamH I的识别位点中共有四个相同的碱基，所以Bg1 II和BamH I也能发生连接，连接反应体系如下：

[0193]

[0194]

[0195] 16℃连接过夜(约14h)，连接产物(multicopy GAP-LYS，mGAP-LYS)置65℃水浴30min，使liagse失活。

[0196] 4.3将以上连接产生的头对尾、头对头和尾对尾连接多拷贝片断，在Bg1 II和BamH I内切酶的作用下酶切过夜，酶切体系如下：

[0197]

[0198] 37℃酶切过夜(约14h)，去除头对头和尾对尾的连接方式，经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒纯化回收最大的片断(mGAP-LYS头对尾连接方式)；

[0199] 4.4抽提pGAPZαA-mLYS质粒DNA，经BamH I酶切，体系如下：

[0200]

[0201] 37℃酶切过夜(约14h)，经1.5％琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒纯化回收pGAPZaA-mLYS linear片断。

[0202] 4.5将获得的多拷贝片断与步骤4.4中的线性表达载体按摩尔比10∶1的摩尔比例混合，经T4 DNA Ligase连接过夜，连接体系如下：

[0203]

[0204]

[0205] 16℃连接过夜(约14h)，形成pGAPZaA-mLYS多拷贝表达载体(见附图6)；

[0206] 4.5将以上构建的多拷贝表达载体转化E.Coli DH5α，抽提质粒DNA，用于转化酵母。

[0207] 四重组mLYS工程菌株的构建

[0208] 通过以上步骤将鸡蛋溶菌酶基因构建到真核表达载体pPIC6αA和pGAPZαA内，得到的重组表达载体，为得到真核表达的溶菌酶，需将重组表达质粒分别转化E.Coli DH5α和酵母X-33，方法如下：

[0209] (一)大肠杆菌转化方法

[0210] 1大肠杆菌感受态的制备

[0211] 1.1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10mL LB液体培养基的50mL离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)

[0212] 1.2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。

[0213] 1.3以1％的比例将这10mL菌液接种到1000mL LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3h，每30min测一次OD600，当OD值达到0.3～0.4时，停止培养。

[0214] 1.4.将菌液在冰上预冷30min，随后将菌液分装到500mL预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10min。

[0215] 1.5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10min。

[0216] 1.6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。

[0217] 1.7.弃上清，往离心杯中加入少量10％甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10％甘油，4℃，4000rpm，离心10min。

[0218] 1.8.弃上清，每个离心杯中加入5mL 10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300μL/管分装于1.5mL的离心管中，-80℃冰箱中保存。同时取100μL感受态加0.01ng pUC18直接电穿孔转化，检测转化效率。

[0219] 1.9.次日观察转化子生长情况，并记录。

[0220] 2电击转化大肠杆菌转

[0221] 2.1.用无水乙醇清洗浸泡在无水乙醇中的电击杯，于超净台吹干。将连接产物和0.1cm的电击杯一起置于冰上预冷。准备800μL无抗LB，于冰上预冷。

[0222] 2.2.从-70℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。

[0223] 2.3.取1μL连接产物加入到100μL感受态中，混匀后转入电击杯中。轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部。

[0224] 2.4.打开电转仪，将电击杯放入。

[0225] 2.5.按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入800μL的LB液体培养基，重悬细胞后，转移到1.5mL的离心管中。

[0226] 2.6.37℃，220～250rpm复苏1小时。

[0227] 2.7.5000rpm，5min，弃上清剩100μL，涂板，放于37℃过夜培养，次日查看转化结果。

[0228] 3阳性克隆的筛选

[0229] 3.1从转化的平板上选取10～20个克隆，最好标记，用于Cloning PCR检测；

[0230] 3.2CloningPCR反应体系如下(以TaKaRaTaqDNApolymerase反应为例)：

[0231]

[0232] 3.3 PCR反应条件：94℃，5min；(94℃，45s；58℃ 45s；72℃，30s；34个循环)；72℃，10min。取5μL经1.5％琼脂糖电泳检测。

[0233] (二)酵母转化方法

[0234] 1酵母X-33感受态制备

[0235] 1.1.挑取酵母单菌落，接种至含有5mLYPD培养基(组成为：2％Trypon，2％D-Glucose，1％YeastExtract)的50mL三角瓶中，28℃，250-300rpm培养过夜；

[0236] 1.2.取100-500μL的培养物接种至含有500mL新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28℃，250-300rpm培养过夜，至OD600达到1.3～1.5；

[0237] 1.3.将细胞培养物于4℃，3500rpm离心5min，用500mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

[0238] 1.4.按步骤3离心，用250mL的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

[0239] 1.5.按步骤3离心，用20mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

[0240] 1.6.按步骤3离心，用1mL的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5mL；

[0241] 1.7.立即用于转化试验，一般不作冻存保存。

[0242] 2转化重组表达质粒的制备

[0243] 2.1.选取已经过鉴定的表达载体阳性克隆的大肠杆菌菌株，接种于含有合适抗性LB液体培养基中，37℃振荡过夜；

[0244] 2.2.离心收集菌体，按照常规方法抽提5～10μg的含mLYS的重组表达载体质粒DNA；

[0245] 2.3.用BstX1将重组质粒DNA酶切过夜，形成线性重组表达质粒；

[0246] 2.4.乙醇沉淀方法浓缩线性重组表达质粒至5～10μL。

[0247] 3电击转化毕赤酵母X-33

[0248] 3.1.将5～10μL的线性化DNA(5～10μg)，加入80μL的上述步骤制得的毕赤酵母X-33感受态细胞中，转至0.2cm冰预冷的电转化杯内；

[0249] 3.2.将电转化杯冰浴5min，并轻弹电转化杯，使DNA与感受态细胞充分混合；

[0250] 3.3.根据电转化仪提供的资料，设定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；

[0251] 3.4.电击完毕后，加入1mL冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的EP管中，28℃静置1h；

[0252] 3.5.取200～600μL转化菌体悬液涂布于多块含有适当抗性MD或RDB平板上；

[0253] 3.6.将平板到置于28℃培养箱内，培养24h左右。

[0254] 4筛选与鉴定阳性克隆转化株

[0255] 4.1.模板的处理：

[0256] 4.1.1.待平板上的菌落生长约24h，有明显的菌落形成后；

[0257] 4.1.2.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物(这样做可以鉴定非定向克隆的方向)；

[0258] 4.1.3.用半根灭菌的牙签(节约，而且好用)挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5mL离心管，对PCR管和1.5mL离心管编号；

[0259] 4.1.4.PCR扩增，1.5％agarose电泳；

[0260] 4.1.5.对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5mL离心管中的半截牙签扔到5mLYPD培养基中，28℃培养，8～12h，对鉴定过的菌株做stock，用于诱导表达分析。

[0261] 4.2.PCR反应体系(以TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例)：

[0262]

[0263] 4.3 PCR反应条件：94℃，5min；(94℃，45s；58℃ 45s；72℃，30s；34个循环)；72℃，10min。取5μL经1.5％琼脂糖电泳检测，观察扩增产物片断的大小。

[0264] 经过以上鉴定，证实目的基因已经成功整合到酵母基因组后，鉴定获得阳性克隆株即为重组鸡蛋溶菌酶基因工程表达菌(Recombinant LYS Yeast strain)。

[0265] 五溶菌酶的表达

[0266] (一)溶菌酶的诱导表达

[0267] 1摇瓶诱导表达

[0268] 1.1.挑选一经过鉴定的pPIC6αA-LYS单拷贝或多拷贝酵母工程菌株，接 种 于 装 有25mL BMGY培 养 基(组 成 为：1 ％YeastExtract，2 ％peptone，
100mMpotassiumphosphate，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％biotin，1％glycerol)的250mL摇瓶中，于28℃，250-300 rpm培养至OD600＝1.1～1.3；

[0269] 1.2.室温下1500～3000g 离心5min，收集 菌体，用BMMY(组 成为：1 ％YeastExtract，2％peptone，100mMpotassium phosphate，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5 ％biotin，0.5％methanol)重悬菌体，使OD600＝1.0左右(约100～200mL)；

[0270] 1.3.将步骤1.2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布封口，于28℃，250-300 rpm的摇床上继续生长；

[0271] 1.4.每24h向培养基中添加0.5～1.0％体积的100％甲醇，诱导表达；

[0272] 1.5.按开始诱导时间为起点分别取菌液样品，每次取样量为1mL，置于1.5mLEP管中。时间点一般取：0、 6、12、24、36、48、60、72、84和96h；

[0273] 1.6.将取样最大转速离心2～3min，收集上清液氮或干冰速冻后，于-80℃保存备用，用于分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

[0274] 2发酵诱导表达

[0275] 2.1.挑选一株经过鉴定的pPIC6αA-LYS单拷贝或多拷贝酵母工程菌株，接种于装有25mL YPD培养基的250mL摇瓶中，于28℃，250-300rpm培养至OD600＝1.1～1.3；离心收集菌体，用25％～50％体积的去离子水重悬细胞；

[0276] 2.2.将配制好的上罐发酵基本培养基(每升含：85％H3PO4 26.7mL，CaSO4 0.93g，K2SO4 18.2g，MgSO4·7H2O14.9g，KOH 4.13g，甘油40.0g，PTM1 trace salts 4.35mL)加入到发酵罐中(约50％发酵罐体积)，同热蒸汽对罐体全面消毒，121℃灭菌30min，冷却至28℃，添加氨水调节pH至5～6；

[0277] 2.3.接种重悬的工程菌细胞，在28℃，500rpm，空气通入率为2L/min以上条件下培养；

[0278] 2.4.培养24h后，以18 mLL-1h-1的速率添加含1.2％PTM1的50％甘油，持续约6.5h；

[0279] 2.5.开始添加含1.2％PTM1的100％甲醇以取代1.2％PTM1的50％甘油开始诱-1 -1导，在起初的3h内，甲醇添加速率为1mLL h 使细胞适应甲醇的生长环境；然后增加持续-1 -1 -1 -1
2h到7.2 mLL h 持续2h；最后甲醇添加量增加到10mLL h 一直持续到诱导结束，总共诱导的时间为100h。

[0280] 2.6.放罐，收集发酵液，4000rpm离心收集发酵上清液用于纯化表达蛋白。

[0281] (二)溶菌酶的持续表达

[0282] 1摇瓶持续表达

[0283] 1.1.挑选一株经过鉴定的pGAPZαA-LYS单拷贝或多拷贝酵母工程菌株，接种于装有5mL YPD培养基的15mL试管中，于28℃，250-300 rpm培养至OD600＝1.1～1.3；

[0284] 1.2.按1％比例重新接种于含50mLYPD的250mL摇瓶中，于28℃，250-300 rpm培养，开始表达；

[0285] 1.3.按开始表达时间为起点分别取菌液样品，每次取样量为1mL，置于1.5mLEP管中。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；

[0286] 1.4.将收集的表达取样最大转速离心2～3min，收集上清，液氮或干冰速冻后，于-80℃保存备用，用于分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。

[0287] 2发酵持续表达

[0288] 2.1.挑选一经过鉴定的pGAPZαA-LYS单拷贝或多拷贝酵母工程菌株，接种于装有25mL YPD培养基的250mL摇瓶中，于28℃，250-300 rpm培养至OD600＝1.1～1.3；离心收集菌体，用25％～50％体积的去离子水重悬细胞；

[0289] 2.2.将配制好的上罐发酵基本培养基(每升含：85％磷酸26.7mL，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾4.13g，甘油40.0g，PTM1 trace salts 4.35mL)加入到发酵罐中(约50％发酵罐体积)，同热蒸汽对罐体全面消毒，121℃灭菌30min，冷却至28℃，添加氨水调节pH至5～6；

[0290] 2.3.接种重悬的工程菌细胞，在28℃，500rpm，空气通入率为2L/min以上条件下培养；

[0291] 2.4.培养24h后，以18 mLL-1h-1的速率添加含1.2％PTM的50％甘油，至表达结束，总共诱导时间约100h；

[0292] 2.5.放罐，收集发酵液，4000rpm离心收集发酵上清液用于纯化表达蛋白。

[0293] 六表达蛋白的鉴定

[0294] 1 SDS-PAGE电泳检测溶菌酶

[0295] 1.1样品的制备取离心后的发酵液样品50μL加等体积2×Loading Buffer(0.5M pH 6.8 Tris-Cl 5mL，20％SDS 4mL，β-mercaptoethanol 1mL，50％甘油4mL，溴酚兰4mg，ddH20 6mL)，充分混匀后，煮沸5min；

[0296] 1.2 SDS-PAGE凝胶配制，按以下比例配制浓缩胶和分离胶：

[0297]

[0298] 1.3上样取制备好的样品20μL上样至加样孔内，同时加样分子量标准和溶菌酶标准作对照；

[0299] 1.4电泳40～50v恒压电泳至样品通过上层胶，在溴酚蓝进入下层胶时改用高电压恒压电泳(90～100v)。在溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

[0300] 1.5染色与脱色电泳结束后，将凝胶放入0.05％考马斯亮蓝R250(内含20％磺基水杨酸)染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。用7％乙酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。

[0301] 2 Western-blot检测溶菌酶

[0302] 2.1蛋白样品制备 同SDS-PAGE电泳检测溶菌酶部分，步骤同上1.1；

[0303] 2.2电泳同SDS-PAGE电泳检测溶菌酶部分，步骤同上1.2～1.4；

[0304] 2.3转膜 选用PVDF膜，在超纯水中浸泡10min，转至Bloting-Buffer(组成为：20 mMTris-base，150mMglycine，20％methanol，0.1％SDS)中浸泡15min以上；取下凝胶块置于bloting-buffer中；打开Bio-Rad的标准湿式转膜装置，依次摆放湿润的厚滤纸、薄滤纸、PVDF膜、凝胶块、薄滤纸、厚滤纸，确保各层之间没有气泡，接通电流，设定转膜电流为
50mA/块，转膜时间为60min。

[0305] 2.4封闭转膜完毕后，立即把PVDF膜放置到预先准备好封闭液(5％脱脂奶粉溶解于TBST，TBST组成为8.8 g ofNaCl，0.2g ofKCl，3g ofTris base，500ul Tween-20，调节pH至7.4，加ddH2O至1L)中，封闭过夜。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

[0306] 2.5一抗孵育按1∶10000比例将一抗溶于封闭液中制得一抗稀释液，然后将封闭后的PVDF膜转至一抗稀释液中，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时，回收一抗。加入Western洗涤液(TBST)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10min。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10min，共洗涤1h。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

[0307] 2.6二抗孵育按1∶10000比例将一抗溶于封闭液中制得一抗稀释液，然后将一抗杂交后的PVDF膜转至二抗稀释液中，室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入Western洗涤液(TBST)，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10min。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10min，共洗涤1h。

[0308] 2.7蛋白检测将PVDF膜取出置于保鲜膜上，加入荧光测试剂，轻轻摇摆1min，使充分接触荧光测试剂。压片可以采用专用的压片暗盒进行。洗片时使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。X光片推荐选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMATBT胶片。

[0309] 3溶菌酶抑菌活性检测

[0310] 同鸡蛋清提取溶菌酶的活性检测方法。

[0311] 4溶菌酶活力单位的测定

[0312] 同鸡蛋清提取溶菌酶的活力单位测定方法。

[0313] 七表达蛋白的浓缩纯化

[0314] 1发酵结束后，4000rpm离心发酵液，收集上清；

[0315] 2透析将发酵液上清装入透析袋内，对去离子水透析去盐，4℃透析24h；透析过的发酵上清用0.45μm的滤膜过滤，然后用NaOH调节pH至8.0；

[0316] 3装CM-Sephrose FF层析柱以每升发酵液10mL CM-Sephrose FF装柱，用0.05M Tris-Cl pH 8.0平衡柱子5～8个柱床体积；

[0317] 4上样将发酵液以10～100mL/min的流速上柱；

[0318] 5清洗上样结束后，用0.05M Tris-Cl pH 8.0洗脱未结合蛋白，共洗脱4个柱床体积；

[0319] 6洗脱用含有0.15～0.20M NaCl的0.05M Tris-Cl pH 8.0溶液洗脱；

[0320] 7透析将洗脱液对去离子水4℃透析24h；

[0321] 8冻干将透析过的洗脱液在冻干机上冻干，得到基本纯的溶菌酶干粉，如果需要进一步的纯化可对获得干粉进行重结晶。

[0322] 八溶菌酶的用途

[0323] 1用于食品添加剂

[0324] 我国冷却肉的生产和推广已受到高度的重视，并已开始批量生产。溶菌酶可以作为冷却肉生产过程中实用的高效、纯天然保鲜剂。马美湖等(2002)按溶菌酶1～5g，乙酸1～2g，乳酸1～2g，抗坏血酸1～4g，蒸馏水1000mL的组成配制成溶菌酶保鲜剂，对冷冻进行保鲜处理。结果表明：肉的色泽变化情况、肉的气味、肉的弹性、粘度的变化、汁液渗出量、pH值的变化、系水力(率)、蒸煮损失的变化、肉汤试验、酸价测定、H2S试验、挥发性盐基氮(TVB值)、冷藏期间细菌总数等检测指标均有明显的提高，其保鲜效果可以达到国家有关标准规定的一级鲜度标准。

[0325] 目前，我国液态乳制品发展很快，溶菌酶应用于乳制品中可起到防腐的效果，尤其适用于巴氏杀菌奶，可有效地延长保存期。由于溶菌酶具有一定的耐高温性能，也可适用于超高温瞬间杀菌奶。添加剂量为300～600mg/kg，其方法为包装前添加，超高温瞬间杀菌奶也可以在杀菌前添加。新鲜的牛乳中含有少量的溶菌酶，约含0.13mg/mL，而人乳中含有40mg/mL溶菌酶。若在鲜乳或奶粉中加入一定量的溶菌酶，则不但有防腐保鲜剂的作用，而且可达到强化婴儿乳品的目的，有利于婴儿的健康。

[0326] 酿造酒的酒精含量较低时，有些微生物可在其中生长，而引起变质。例如，清酒的酒精含量为15％～17％，大部分微生物不能在其中生长，但部分乳酸菌，则可在清酒中生长，并生成乳酸和产生不愉快的味道。若在清酒中加入15mg/kg的溶菌酶，即可起到良好的防腐效果。

[0327] 茶汤属低酸性饮料，pH值一般为5～7，引起茶饮料变质的微生物主要为细菌，为保证茶饮料安全性及贮藏性，必须对茶饮料进行杀菌处理。由于茶汤组分的复杂性和体系的不稳定性，尤其是绿茶茶汤氧化还原电位低，体系不稳定，因此经热加工处理后对其品质的影响很大。所以溶菌酶可作为一种有效的保鲜剂，在茶饮料中添加10000～50000U/L的溶菌酶可有效抑制茶饮料中细菌的增值，保持茶饮料的营养、风味和保质期。

[0328] 一些新鲜水产品(如：虾、鱼等)在含甘氨酸(0.1M)、溶菌酶(0.05％)和食盐(3％)的混合液中浸渍5min后沥去水分，保存在5℃的冷库中，9d后无异味、色泽无变化。另外在其他食品如：香肠、奶油、生面条、饮料等食品中加入溶菌酶均可起到良好的保鲜作用。

[0329] 2用作饲料添加剂

[0330] 仔猪腹泻是集约化养猪生产条件下的一种典型的多因素性疾病。该病是目前引起仔猪死亡最严重的仔猪疾病之一，据调查仔猪因腹泻死亡占仔猪死亡总数的39.8％。严重威胁着养猪业的健康发展，导致饲料报酬率较低、仔猪成活率下降、生长缓慢、生长发育停滞(即所谓的僵猪)，甚至死亡。同时随着抗生素的普遍大剂量使用，产生的耐药性越来越严重，因此效果并不理想。抗生素的使用所带来的危害日益严重，一些发达国家已把严格控制甚至禁止抗生素在饲料行业的使用纳入法律法规。在饲料中添加300～500g/吨的溶菌酶，可有效治疗仔猪腹泻，与对照组相比，平均腹泻率下降了50％。

[0331] 奶牛乳房炎是奶牛的一种常见多发性疾病，发生乳房炎的奶牛产奶量下降，生鲜牛奶品质显著降低。病情严重时造成奶牛患病乳区废弃而失去泌乳能力被淘汰。目前对奶牛乳房炎的临床治疗普遍采用抗生素治疗的方法，采用抗生素治疗在治疗期和休药期内，所产的牛奶不能被人食用而弃掉，严重影响了奶牛养殖的经济效益。溶菌酶作为一种有效的抗菌剂，在单独使用或与其他成分共同使用时可有效抑制乳房炎病原菌的生长。采用10～50μL鸡蛋清溶菌酶(5000U/mL)对分离出的7株乳房炎致病菌表现出良好的抑菌效果。将中草药制剂和溶菌酶制剂复合使用效果明显，尤其是溶菌酶活力较高试验组抑菌效果更加明显。

[0332] 在肉仔鸡中添加4～100mg/kg溶菌酶，结果表明可有效降低饲料消耗，提高日增重。试验组平均增重比对照组提高2％～2.8％，饲料消耗量降低2.1％～5.2％，存活率提高14％～17％，饲料报酬提高5.0％～8.8％，饲喂效果明显。

[0333] 3用于医疗卫生

[0334] 荣晓花等(1999)报道溶菌酶具抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力等多种药理作用。它能直接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白A和补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等，并能够增强抗生素和其他药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎和修复组织的目的。溶菌酶是一种碱性蛋白质，在体内近于中性的pH环境下带有大量正电荷，可与带负电荷的病毒蛋白直接作用，和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使侵入体内的病毒失活。作为机体非特异免疫因子之一，溶菌酶参与机体多种免疫反应，改善和增强巨噬细胞吞噬和消化功能，激活其他白细胞吞噬功能，从而增强机体的抵抗力。临床上常用于五官科各种炎症、扁平疣及传染性疣等各种皮肤病以及带状疱疹、腮腺炎、鸡水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治疗。另外，人体溶菌酶还可作为多种疾病的诊断指标。

[0335] 4用于日用化工

[0336] 溶菌酶作为一种蛋白质，其用量在化妆品中应用不受限制，能真正做到无毒、无残留， 是一种绿色防腐剂。因此，溶菌酶不仅可以用在食品防腐方面代替化学合成的食品防腐剂，也可作为化妆品的领域。郝杰等(2004)报道参考CTFA化妆品评价标准，研究了海洋溶菌酶的抑菌试验，通过测定第7d、14d、28d样品中含细菌或霉菌数量，以评价防腐体系对微生物的抑杀效果。结果表明：海洋溶菌酶在45℃以下、pH4～10内均具有良好的稳定性，受日化产品中常见金属离子影响小，与护肤化妆品中常规成分配伍性良好，且广谱杀菌，并且对参试的金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、大肠埃希氏菌等18株受试菌株均有抑制作用，防腐效果达到国内外化妆品防腐标准。

[0337] 溶菌酶还可以用于还可以有效的治疗和预防感染性炎症、非感染性炎症。对口腔疾患，特别是牙槽化脓等牙周疾病的预防，控制及治疗起到了非常重要的作用。研究表明在牙膏中添加0.05～5％的溶菌酶及若干种表面活性剂，可使之成为无碍牙膏机能的预防牙槽化脓等疾病的保健牙膏。

[0338] 5用于生物工程

[0339] 溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以溶菌酶处理革兰氏阳性细菌可得到原生质体，因此溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程必不可少的工具酶。国外多用于菌体内容物质的提取，只要把对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶菌酶处理，再结合使用超声波、冷冻离心等手段，就可得到无细胞提取液，进一步精制，可得到所需的菌体物质。因此生物工业的发展对溶菌酶制剂的需求量将与日俱增。

[0340] 酶制剂产业是当今中国最具发展潜力的新兴产业之一，随着基因工程、发酵技术等的发展，酶制剂在食品保鲜中将有更广阔的应用前景。