一种三磷酸胞苷二钠的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种三磷酸胞苷二钠的制备方法。其特点是：以胞苷酸(CMP)为原料经酶促转化，再经离子交换柱层析、分离纯化而成。酶促转化反应机理：发酵啤酒酵母获得酶促转化反应所需要的酶液，啤酒酵母能产生多种生物酶，其中有很强糖酵解能力的糖酵解酶和磷酸化酶，糖酵解酶酵解葡萄糖产生的生物能，经ATP转移到胞苷酸，再在磷酸化酶的作用下使胞苷酸与磷酸根结合形成胞苷三磷酸。经过工艺优化，已经形成一个成本低、操作简便、收率高、成品纯度高的生产工艺，主要过程是：获得酶液，加入主料胞苷酸以及反应所需的适量的磷酸二氢钾等盐和葡萄糖进行酶促转化，再经沉淀、离子交换柱层析、分离纯化、精制、真空干燥而制得成品。

权利要求

1.一种三磷酸胞苷二钠的制备方法，主要步骤包括：

1)发酵啤酒酵母获得酶促转化反应所需要的粗酶液；

2)溶解胞苷酸、磷酸二氢钾、氯化镁、匍萄糖，制备底物溶液，将反应缸升温至37℃，搅拌下加入粗酶液，反应缸保温30-32℃使胞苷酸转化；

3)转化完毕后加入硅藻土，搅拌，离心，得离心上清液；

4)在离心上清液中加入强酸性阳离子交换树脂，搅拌，加酸调pH为1.2-4.0，静置，过滤，得滤液；

5)上步骤滤液中加入乙醇，至含醇量达95％，静置，过滤，收取滤饼；

6)离子交换柱层析：将滤饼加水溶解，过滤，调pH为2.0-2.5，上树脂分离柱，当下水口流出液中的三磷胞苷浓度为进样前的70％左右时停止进样，用浓度梯度氯化钠溶液洗脱；

7)上述洗脱液中，加入药用活性炭，搅拌，过滤，收集滤液；

8)上述滤液调pH为3-4，加入药用酒精，放置使沉淀，收集沉淀；

9)抽滤，以去掉三磷酸胞苷二钠部分水份，即得三磷酸胞苷二钠纯品；

10)真空干燥及包装。

2.权利要求1所述的方法在制备用于治疗脑震荡及其后遗症、脑出血后遗症、植物神经紊乱、神经官能症以及心功能不全、进行性心肌萎缩的药物中的应用。

说明书

一种三磷酸胞苷二钠的制备方法及应用

技术领域：

[0001] 本发明涉及生化药物领域。发明的核心在于提供了一种三磷酸胞苷二钠制备方法及其在制备用于治疗脑震荡及其后遗症、脑出血后遗症、植物神经紊乱、神经官能症以及心功能不全、进行性心肌萎缩、肝炎的药物中的应用。技术背景：

[0002] 胞嘧啶核苷三磷酸(Cytidine 5′-triphosphate，CTP)又称胞三磷，是存在于人体内的核苷酸类物质，是生命活动不可缺少的物质，在机体的正常代谢中起着重要作用，近年来用于临床的药用CTP为三磷酸胞苷二钠(cytidine 5′-triphosphate disodium)，其化学名称为胞嘧啶核苷-5′-三磷酸酯二钠盐，其分子式为C9H14N3Na2O14P，分子量为527.14，是一种治疗脑血管疾病的核苷酸类药物。

[0003] 作为神经系统用药，三磷酸胞苷二钠具有三大药理作用，一是神经营养，二是调节物质代谢，三是抗血管硬化。由于有这三重作用，使得三磷酸胞苷二钠在脑血管意外和脑损伤的治疗方面有着独特的优势。本品作为神经系统用药，其药理作用温和、疗效明确、毒副作用小、透膜作用强。在机体中参与核酸及磷脂的合成代谢，促进蛋白质的合成。可以调节和促进神经细胞、神经胶质细胞及血管壁细胞膜性结构的合成与构建，特别是突触内重要成分的新陈代谢。能够对抗由兴奋性氨基酸、自由基引起的神经细胞损伤。具有营养神经，支持神经细胞存活、延缓死亡，提高神经细胞抗损伤能力，再生和修复能力，增强神经细胞活性，促进神经突起生长，并改善支配血管的神经功能，起到缓解脑血管硬化的作用。因而对急性缺血性脑卒中和出血性脑卒中有独到的疗效。

[0004] 三磷酸胞苷二钠也是一种中枢兴奋药，它是体内的一种高能化合物，参与体内核酸和磷脂的合成及代谢，尤其是对神经细胞具有直接和间接作用，在脑梗塞时，缺血半暗带区的神经细胞的完整性、代谢均受影响，三磷酸胞苷二钠则能直接参与神经细胞的代谢，对受损的神经细胞体具有修复功能，使脑细胞线粒体、内质网等功能得以恢复，神经细胞的兴奋性、传导性得到改善，促进了脑代谢，增强了脑干网状上行激活系统功能。从试验观察证实，三磷酸胞苷二钠对急性脑梗塞疗效显著、副作用少，能明显降低致残率，是当前治疗急性脑梗塞较理想的药物。

[0005] 研究表明三磷酸胞苷二钠在治疗充血性心力衰竭的安全有效。三磷酸胞苷二钠可提高心肌细胞生物膜性结构的稳定性和重建能力，在充血性心力衰竭中可能对改善心肌细胞类的稳定性，增加心肌收缩力有关。本药对充血性心力衰竭的临床症状改善等有积极意义。

[0006] 目前，三磷酸胞苷二钠主要用于脑血管意外及其后遗症；脑震荡、外伤性昏迷、颅脑手术后功能障碍；神经官能症；脑血管硬化、老年性痴呆；外周神经损伤；儿童脑发育不全。

[0007] 近年随着三磷酸胞苷二钠需求量的增大，现有厂商供应已不能满足市场需求。

[0008] 近些年，该药品的临床用量增加明显。发明内容：

[0009] 本发明针对目前CTP生产需求的特点，发明了一种可以实现大规模制备的生产工艺，以满足临床用药需求。

[0010] 本发明技术方案主要步骤包括：

[0011] 1)发酵啤酒酵母获得酶促转化反应所需要的粗酶液；

[0012] 2)溶解胞苷酸、磷酸二氢钾、氯化镁、葡萄糖，制备底物溶液，将反应缸升温至37℃，搅拌下加入粗酶液，反应缸保温30-32℃使胞苷酸转化；

[0013] 3)转化完毕后加入硅藻土，搅拌，离心，得离心上清液；

[0014] 4)在离心上清液中加入强酸性阳离子交换树脂，搅拌，加酸调pH为1.2-4.0，静置，过滤，得滤液；

[0015] 5)上步骤滤液中加入乙醇，至含醇量达95％，静置，过滤，收取滤饼；

[0016] 6)离子交换柱层析：将滤饼加水溶解，过滤，调pH为2.0-2.5，上树脂分离柱，当下水口流出液中的三磷胞苷浓度为进样前的70％左右时停止进样，用浓度梯度氯化钠溶液洗脱；

[0017] 7)上述洗脱液中，加入药用活性炭，搅拌，过滤，收集滤液；

[0018] 8)上述滤液调pH为3-4，加入药用酒精，放置使沉淀，收集沉淀；

[0019] 9)抽滤，以去掉三磷酸胞苷二钠部分水份，即得三磷酸胞苷二钠纯品；

[0020] 10)真空干燥及包装。

[0021] 本发明的技术过程不同于现有的任何生产工艺，且已经成为一个创新性的工艺过程组合，具体流程如下：

[0022] 1、酵母发酵

[0023] 培养基：

[0024] (1)种子培养基成分为：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母粉1％。(斜面培养基另外加入1％琼脂)。

[0025] (2)发酵培养基成分为：葡萄糖10％，蛋白胨1％，酵母粉1％，磷酸二氢钾0.4％，磷酸氢二钾0.2％，七水硫酸镁0.02％。

[0026] 种子培养：种子斜面培养9天后，用无菌水制成悬浮液，接种于种子培养基中培养，然后进行二级种子扩大培养。

[0027] 发酵过程：向发酵罐中投入培养液。灭菌后调节pH值约4-6。将上述二级种子液接入发酵罐中，搅拌下培养。培养过程中流加葡萄糖和酵母粉。

[0028] 2、制备粗酶液

[0029] 发酵结束后调节pH值，使酵母落泡沉淀，离心发酵液，收集上清液。

[0030] 3、酶促转化

[0031] 溶解主料胞苷酸，加入磷酸二氢钾、氯化镁和葡萄糖，搅拌下再加入酶液，反应缸保温30-32℃使胞苷酸进行酶促转化，反应完毕后调pH5.0终止转化反应。加入硅藻土，搅拌，以去掉蛋白质。然后将转化液，离心得离心上清液。

[0032] 在离心上清液中加入阳离子交换树脂搅拌吸附，调pH为1.2-4.0，静置，过滤，得滤液。滤液中加入乙醇，至含醇量达60％以上，静置。再过滤，收取滤饼。

[0033] 4、离子交换层析

[0034] 将上工序滤饼加水溶解稀释，过滤，得滤液。滤液调pH为2.0-2.5后，上树脂分离柱，进行吸附。检测从分离柱下口流出的溶液，吸附饱和时停止进样，用梯度氯化钠溶液进行洗脱。

[0035] 5、纯化

[0036] 为进一步纯化三磷酸胞苷二钠，在洗脱下来的三磷酸胞苷二钠溶液中加入药用活性炭，搅拌脱色，过滤。

[0037] 6、精制

[0038] 向三磷酸胞苷二钠液中按1∶2-20比例加入药用酒精，收集沉淀。抽滤除去水分。

[0039] 7、真空干燥及包装。

[0040] 本发明所需设备：

[0041] 反应罐、离心机、恒流泵、不锈钢滤器、布氏滤斗、多用真空泵、料桶、各种玻璃仪器等。树脂分离柱、恒流泵、不锈钢桶、抽滤瓶、布氏漏斗、真空干燥机等。

[0042] 我们对上述工艺制备的20030501批样品进行了质量检查(标准参考中国药典)，检查结果如下：

[0043] 表1.20030501批质量检查结果

[0044]

[0045] 对20030501批样品的稳定性研究。检测指标的方法参考中国药典规定的标准方法。

[0046] 本法制备的三磷酸胞苷二钠三批，批号：20030501、20030601、20030602。将本品按市售包装置于温度6℃±2℃，RH60％±10％条件下，放置6个月，每3个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月、18个月按稳定性重点考察项目检测，结果如表2。

[0047] 表2.长期试验考察结果(6℃±2℃，RH60％±10％)

[0048]

[0049] 结果表明，三批三磷酸胞苷二钠原料在长期试验条件下放置18个月，各项指标均无明显改变，说明本品稳定性良好。

[0050] 综上所述，本发明提供了一个三磷酸胞苷二钠的制造方法。该方法不同于现有文献报道的任何技术组合，明很好地体现了新颖性、创造性和实用性的专利要素。

[0051] 为了更好地说明本专利的实施过程，我们列举如下实施例。需要说明的是，所列举的实施例是本发明思路和精神的具体体现之一，并不是对发明专利说明书内容的范围限制，更不是对权利要求的细化。

[0052] 实施例1、20030501批样品的制备

[0053] 1、酵母发酵过程

[0054] 向300L发酵罐中投入100L培养液。121摄氏度灭菌30min后，冷却到30摄氏度，调节pH值为5.5，。按10％-20％的接种量将上述二级种子液接入发酵罐中，30摄氏度，通气量为5L/min，搅拌100rpm下培养48hr。培养过程中当发酵液溶解氧停止下降或呈上升趋势时，泵入一定量的葡萄糖和酵母粉。

[0055] 发酵结束将保温28--30摄氏度，调节pH值为7.0，1hr后，酵母开始落泡沉淀，用连续流离心机离心发酵液，收集上清液。

[0056] 2、酶促转化

[0057] 将10公斤主料胞苷酸倒入塑料桶内，加入适量纯化水溶解，调pH7.0，搅匀后加入