疼痛的治疗和预防中神经胶质细胞来源的BDNF的调节

摘要

描述了用于治疗或预防疼痛和减轻伤害感受的方法和产品，包括通过施用活性剂如P2X受体抑制剂、TNP-ATP、BDNF反义分子或者BDNFsiRNA来调节哺乳动物宿主中神经胶质细胞来源的脑源性神经营养因子(BDNF)表达。还描述了用于鉴定或表征用于治疗或预防疼痛和减轻伤害感受的化合物的相关方法。

权利要求

1.鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：(a)将受试化合物与表达BDNF或者具有BDNF活性的神经胶质细胞接触；和(b)确定在所述受试化合物存在下，所述BDNF表达或者活性是否降低；

其中所述降低表明所述受试化合物可以用于治疗或预防疼痛。

2.权利要求1的方法，其中所述神经胶质细胞是受刺激的神经胶质细胞。

3.权利要求2的方法，其中所述受刺激的神经胶质细胞在步骤(a)之前已经接触ATP。

4.权利要求2的方法，其中所述受刺激的神经胶质细胞对于外周神经或者神经束损伤是突触后的。

5.权利要求1的方法，其中所述受试化合物选自dsRNA、siRNA、siRNA样分子、反义寡核苷酸和核酶。

6.鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：(a)将受试化合物与神经胶质细胞接触，所述神经胶质细胞包含第一种核酸，该核酸包含与BDNF基因正常结合的可转录调节的元件，该第一种核酸有效连接包含能够编码报道蛋白的报道基因的第二种核酸；和(b)确定在所述受试化合物存在下报道基因表达或者报道蛋白活性是否降低；

其中所述报道基因表达或者报道蛋白活性降低表明所述受试化合物可以用于治疗或预防疼痛。

7.鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，所述方法包括：(a)将受试化合物与能够分泌BDNF多肽的神经胶质细胞接触；和(b)确定在所述受试化合物存在下所述BDNF多肽的分泌是否降低；

其中所述BDNF多肽的分泌降低表明所述受试化合物可以用于治疗和预防疼痛。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述神经胶质细胞选自小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

说明书

疼痛的治疗和预防中神经胶质细胞来源的BDNF的调节

[0001] 相关申请的交叉参考

[0002] 本申请根据U.S.C§119(e)要求2004年10月22日申请的美国临时申请号60/620,722的优先权，将该临时申请的内容完整引入本文作为参考。
发明领域

[0003] 本发明涉及神经胶质细胞来源的BDNF(脑衍生神经营养因子)的调节，尤其涉及神经胶质细胞来源的BDNF的调节，用以治疗和预防受试者中的疼痛。本发明还涉及鉴定或者表征可以用于治疗或预防疼痛的化合物的方法。

[0004] 发明背景

[0005] 对疼痛治疗和预防的新的和改进的方法和药剂的需要在医学受到大量关注。现在使用的治疗法主要集中在治疗疼痛的症状而不治疗疼痛的实际原因。此外，这些治疗法不一定是特异的并且可以引起许多不希望的副作用。

[0006] 仍然需要更好地定义涉及痛觉的机理。仍然需要基于新发现的伤害感受机理，提供新的和特异性治疗法，其可以通过在实际疼痛来源处的干预治疗或者预防疼痛。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明涉及调节(例如，减少)神经胶质细胞来源的BDNF以治疗或预防疼痛。本发明还涉及鉴定或表征能够调节(例如，减少)神经胶质细胞来源的BDNF的化合物。

[0009] 第一方面，本发明提供了治疗或预防受试者中疼痛的方法，该方法包括减少受试者中神经胶质细胞来源的BDNF。

[0010] 另一方面，本发明提供了减轻受试者中的伤害感受的方法，该方法包括减少受试者中神经胶质细胞来源的BDNF。

[0011] 再一方面，本发明提供了用于治疗或者预防受试者中疼痛的组合物，该组合物包含(a)能够减少所述受试者中神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂；和(b)可药用载体。

[0012] 另一方面，本发明提供了包含本文描述的组合物以及关于其用于治疗或预防疼痛的使用说明书的包装。在再一方面，本发明提供了包含(a)能够减少受试者中神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂；和(b)其用于治疗或预防所述受试者中疼痛的使用说明书的包装。

[0013] 在再一方面，本发明提供了本文描述的组合物用于治疗或预防受试者中疼痛和/或制备用于治疗或预防疼痛的药物的用途。在再一方面，本发明提供了能够减少受试者中神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂用于治疗或预防所述受试者中疼痛的用途和/或能够减少神经胶质细胞来源的BDNF用于制备治疗或预防受试者中疼痛的药物的用途。

[0014] 在再一个实施方案中，本发明提供了鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，该方法包括(a)将受试化合物与表达BDNF或者具有BDNF活性的神经胶质细胞接触，和(b)确定在受试化合物存在下BDNF表达或者活性是否降低；其中降低表明该受试化合物可以用于治疗或预防疼痛。

[0015] 在再一个实施方案中，本发明提供了鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，该方法包括(a)将受试化合物与神经胶质细胞接触，所述神经胶质细胞包含第一种核酸，该核酸包含与BDNF基因正常结合的可转录调节的元件，该第一种核酸有效连接包含能够编码报道蛋白的报道基因的第二种核酸，和(b)确定在受试化合物存在下报道基因表达或者报道蛋白活性是否降低；其中报道基因表达或者报道蛋白活性降低表明该受试化合物可以用于治疗或预防疼痛。

[0016] 在另一实施方案中，本发明提供了鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，该方法包括(a)将受试化合物与能够分泌BDNF多肽的神经胶质细胞接触，和(b)确定在受试化合物存在下所述BDNF多肽的分泌是否降低；其中BDNF多肽的分泌降低表明该受试化合物可以用于治疗和预防疼痛。

[0017] 在另一实施方案中，本发明提供了鉴定或表征用于治疗或预防疼痛的化合物的方法，该方法包括(a)将受试化合物与神经胶质细胞接触；和(b)确定在受试化合物存在下所述神经胶质细胞的刺激是否降低；其中所述神经胶质细胞的刺激降低表明该受试化合物可以用于治疗和预防疼痛。

[0018] 在一个实施方案中，本发明提供了能够减小选自：(a)神经胶质细胞中的BDNF表达，(b)BDNF从神经胶质细胞的释放或分泌，(c)神经胶质细胞的刺激，(d)神经胶质细胞来源的BDNF活性，和(e)(a)到(d)的任一组合的参数的方法或活性剂。

[0019] 在另一实施方案中，神经胶质细胞选自小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，在另一实施方案中，神经胶质细胞位于所述受试者的中枢神经系统中。在另一实施方案中，神经胶质细胞是受刺激的神经胶质细胞，在另一实施方案中，受刺激的神经胶质细胞已经与ATP接触和/或受刺激的神经胶质细胞对于外周神经或者神经束损伤是突触后的。

[0020] 在再一个实施方案中，BDNF包含与选自SEQ ID NO：2、4、6和其片段的序列实质同一的氨基酸序列。

[0021] 在再一个实施方案中，所述疼痛的信号在外周神经系统(PNS)细胞或者中枢神经系统(CNS)细胞中发生。在实施方案中，疼痛是神经性疼痛，在另一实施方案中，神经性疼痛与神经或者神经束损伤有关和/或选自躯体或内脏疼痛。在再一个实施方案中，神经性疼痛与化学损伤有关。在再一个实施方案中，疼痛选自慢性痛、慢性炎性痛、与关节炎相关的疼痛、纤维肌痛(fibromyalgia)、背痛、癌症相关的疼痛、消化性疾病相关的疼痛、克隆病相关的疼痛、自身免疫病相关的疼痛、内分泌疾病相关的疼痛、糖尿病性神经病相关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌痛、灼痛、疱疹后神经痛、艾滋病相关的疼痛、I和II型复合性区域疼痛综合征、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤相关的疼痛、与药物摄入相关的疼痛和再发的急性痛。

[0022] 在再一个实施方案中，方法包括对受试者施用能够减少所述受试者中神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂。在另一实施方案中，用途、组合物和包装包含此类活性剂。在一个实施方案中，该活性剂能够减少或者抑制神经胶质细胞的刺激，在再一个实施方案中，活性剂是ATP受体的抑制剂，在再一个实施方案中，ATP受体是P2X受体，在再一个实施方案中，该活性剂是TNP-ATP。在另一实施方案中，活性剂能够抑制BDNF表达，在再一个实施方案中，活性剂选自反义分子、核酶、siRNA和siRNA样分子。在再一个实施方案中，活性剂是反义分子，在再一个实施方案中，反义分子与编码BDNF的mRNA的部分实质互补，在再一个实施方案中，反义分子互补于与选自SEQ ID NO：1、3和5的序列实质同一的核酸序列的部分。在再一个实施方案中，活性剂是siRNA，在再一个实施方案中，siRNA的序列与选自SEQ ID NO：7、8、9、10和其片段的序列实质同一。在再一个实施方案中，活性剂向鞘内施用或者适于鞘内施用。

[0023] 在一个实施方案中，受试者是哺乳动物，在另一实施方案中，哺乳动物是人。

[0024] 附图简述

[0025] 图1.ATP刺激的小胶质细胞通过鞘内导管向大鼠的脊柱递送引起异常性疼痛和脊髓I板层神经元的跨膜阴离子梯度的去极化偏移。在幼稚大鼠中，ATP刺激的小胶质细胞(皮质或者脊髓来源)但不是静止小胶质细胞的局部脊髓递送导致平均缩足阈值(WD50)的显著降低。B，左，在来自静息小胶质细胞和ATP刺激的小胶质细胞注射的大鼠的LI神经元中记录的平均E阴离子的比较(注意到在细胞的静息膜电位中没有显著改变)。右，GABA引起的平均峰电流，其是来自用A中ATP刺激的或者静息小胶质细胞处理的大鼠的切片中不同Vm值下在LI神经元中测量的。水平标准误差线代表神经元间差异。Inset-代表原始迹线。C，电流钳记录模式下的代表性迹线，表明在静息膜电位下，在来自WD50＝3.4g的大鼠的LI神经元中对GABA的突触后应答，相比，在来自WD50＝12.6g的大鼠的LI神经元中的应答，GABA被超极化。

[0026] 图2.在背角中BDNF的增强的浓度引起感受伤害超敏感性和脊髓I板层神经元的跨膜阴离子梯度的去极化偏移。A，重组人BDNF(20μg)向完整大鼠的腰部背角的鞘内递送导致与盐水对照相比在1小时内WD50的显著和瞬时减少，盐水对照不引起显著减少。B，在用BDNF(50ng/ml；＞90分钟)处理的切片对比对照ACSF中的切片(幼稚)中LI神经元中的平均E阴离子的显著去极化。C，来自Fura-2-AM-装载的LI神经元的钙测量的代表性迹线表明在灌流(superfuse)BDNF的切片中快速应用GABA可以导致细胞内钙的荷包牡丹碱2+
敏感的增加([Ca ]i)。通过KCl介导的应答证实不应答GABA的细胞的生活力。右下插图，
2+
显示[Ca ]i的GABA介导的升高的LI神经元的比例不断增加，在连续BDNF灌注的80-120
2
分钟之间达到31％(x 校正的＝5.15)。相比，不存在BDNF时，在相似的时间期间内，仅2％的
2+ 2 11
细胞应答[Ca ]i的升高(C；x 校正的＝6.74)。D，鞘内施用BDNF转导腺病毒载体(adBDNF)引发WD50的延迟和进行性减少，其持续到注射后4天。相比，施用不编码BDNF的对照腺病毒(adGFP)不引起缩足阈值的减小。E，在来自D中adBDNF-vs.adGFP处理的大鼠的切片中LI神经元的平均E阴离子的显著去极化。F，来自D中adBDNF或adGFP处理的大鼠的切片中在不同Vm值下在LI神经元中测量的GABA引起的平均峰电流。水平标准误差线代表神经元间差异。G，电流钳记录方式的代表性迹线，其表明对来自adBDNF处理的大鼠的切片中LI神经元快速应用GABA可以引起动作电位。

[0027] 图3.具有外周神经损伤的大鼠中BDNF-TrkB信号传递逆转的异常性疼痛的功能性抑制和脊髓I板层神经元中E阴离子的去极化偏移。A，对显示出应答外周神经损伤(PNI)的强烈异常性疼痛的大鼠的腰部背角鞘内施用抗-TrkB或者TrkB-Fc导致WD50的显著增加。B，电流钳记录模式下代表性迹线，表明对GABA的突触后应答从来自PNI大鼠的LI神经元中静息去极化，而这些电位从用抗TrkB灌注的切片中静息去极化。C，电位钳记录方式下对来自PNI大鼠的切片中两个LI神经元中快速局部GABA应用(10ms)应答的代表性电流电压图，所述神经元一个来自用对照ACSF灌注的切片(对照)，另一个来自抗-TrkB灌注2小时后的切片(1μg/ml)。插图，合并的数据，表明来自已经接受PNI的大鼠的切片的抗TrkB灌注引起LI神经元中E阴离子的显著超极化。

[0028] 图4.小胶质细胞来源的BDNF引起脊髓I板层神经元的跨膜阴离子梯度的异常性疼痛和去极化偏移。A，局部脊髓递送用抗TrkB或者TrkB-Fc温育的或者用BDNF干扰RNA(siRNA)脂转染的ATP刺激的小胶质细胞都不导致缩足阈值的显著改变(WD50)。然而，用干扰RNA的乱序形式(Scr.siRNA)脂转染ATP刺激的小胶质细胞导致5小时后WD50显著下降。B，电流钳记录模式下代表性迹线，表明对GABA的突触后应答在来自用ATP刺激的小胶质细胞与抗-TrkB联合处理，或者用BDNFsiRNA脂转染的ATP刺激的小胶质细胞处理的大鼠的LI神经元中超极化。C，合并的数据，表明从来自已经接受局部脊髓递送与抗TrkB混合的ATP刺激的小胶质细胞或者用BDNF siRNA脂转染的ATP刺激的小胶质细胞的大鼠的LI神经元测量的平均E阴离子比从用ATP刺激的小胶质细胞注射的大鼠得到的LI神经元测量的更负。D，来自Fura-2-AM-装载的小胶质细胞的钙测量的代表性迹线，表明细胞对快速应用ATP的应答不受小胶质细胞暴露于抗TrkB或BDNF siRNA的影响。E，用磷酸缓冲盐水载体(PBS)、ATP、ATP+TNP-ATP(10μM)或者用BDNF siRNA预处理后再用ATP处理后5小时，培养的小胶质细胞的上清液中BDNF蛋白质的基于ELISA的测量。F.图解E阴离子和WD50之间关系的相关性图。该图中的数据包括在同一大鼠中记录了WD50和E阴离子的那些数据。

[0029] 图5A.A，PNI后但不是假手术后，对成年大鼠的机械刺激的感受伤害缩足阈值(WD50)在2-3周中显著下降。B和C，显微照片，表明OX-42染色(指出活化的小胶质细胞)在PNI大鼠(右)的同侧背角比假手术的大鼠(左)中更浓烈。C中的比例尺为0.2mm；SDH ipsi.＝与PNI同侧的表面背角。D，合并的数据，表明对从已经接受PNI的大鼠得到的切片灌注TNP-ATP(1μM)引起LI神经元中E阴离子的显著超极化。

[0030] 图6.人BDNF的编码(SEQ ID NO：1，检索号M37762)和多肽(SEQ IDNO：2，检索号AAA51820)序列。

[0031] 图7.小鼠BDNF的编码(SEQ ID NO：3，检索号BC034862)和多肽(SEQ ID NO：4，检索号AAH34862)序列。

[0032] 图8.大鼠BDNF的编码(SEQ ID NO：5，检索号AY176065)和多肽(SEQ ID NO：6，检索号AAO17828)序列。

[0033] 发明详述

[0034] 在第一方面，本发明涉及基于神经胶质细胞来源的BDNF的调节(例如，减少)，治疗和预防疼痛的方法和化合物。本文使用的“BDNF”或者“脑源性神经营养因子”在本文中可互换使用并且涉及参与多种神经元过程的神经营养因子，所述神经元过程为诸如神经发14 15
生、突触发生、受损网络的修复、发育神经元的存活和分化、脑 和脊髓 中成熟神经元、正常突触(例如，抑制性和/或兴奋性)的维持、树突和轴突生长的调节和行为过程(例如，抗抑郁、情绪稳定、记忆)。BDNF多肽在中枢神经系统中是普遍存在的并且由多种细胞来源产生，所述细胞来源为诸如神经元(例如，初级感觉神经元和突触后神经元)、神经胶质细胞(例如，小胶质细胞、星形胶质细胞或者少突胶质细胞)、非神经免疫细胞(例如，淋巴细胞(例如，T和B淋巴细胞)、白细胞、巨噬细胞和内皮细胞。在实施方案中，BDNF多肽由神经胶质细胞(例如，受刺激的神经胶质细胞)产生和分泌。在实施方案中，BDNF包含SEQ ID NO：2(人BDNF；也见图6)、4(小鼠BDNF，也见图7)或6(大鼠BDNF，也见图8)的多肽序列，其片段或者其实质上同一的序列。在其他实施方案中，BDNF由能够编码SEQ ID NO：2、4或
6的多肽的核酸序列或其片段或者其实质上同一或通过杂交标准(见下文)相关的序列编码。在进一步的实施方案中，此类核酸序列可以包含SEQ ID NOs：1(人BDNF DNA，也见图
6)、3(小鼠BDNF DNA，也见图7)或5(大鼠BDNFDNA，也见图8)的序列，其片段或者其实质上同一或通过杂交标准(见下文)相关的序列。

[0035] 本发明还提供了通过减小(1)神经胶质细胞中的BDNF表达；(2)BDNF从神经胶质细胞的释放或分泌；(3)神经胶质细胞的刺激和/或(4)神经胶质细胞来源的BDNF活性的方法。

[0036] 因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过减少神经胶质细胞来源的BDNF治疗疼痛的方法。本文使用的“神经胶质细胞”定义为神经系统的非神经元细胞。在一个实施方案中，神经胶质细胞位于神经系统中，在进一步的实施方案中，位于中枢神经系统中(例如，脊髓中)。在一个实施方案中，神经胶质细胞选自小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在一个实施方案中，神经胶质细胞是少突胶质细胞。少突胶质细胞通常形成白质的髓鞘形成和灰质中的周围细胞体。它们很大，围绕的神经元具有很少的分枝包裹。在另一实施方案中，神经胶质细胞是星形胶质细胞。星形胶质细胞通常在血管和神经元之间形成连接。它们比少突胶质细胞小并且具有广泛的分枝。在另一实施方案中，神经胶质细胞是小胶质细胞。小胶质细胞在神经系统中起免疫功能。一旦被活化或刺激，小胶质细胞可以吞噬碎屑。它们是非常小的细胞但是一旦被活化或刺激就变大。在实施方案中，神经胶质细胞通常表达OX-42(CR3/CD11b)、神经胶质fribrillary酸性蛋白和/或RIP。本文使用的术语“神经胶质细胞来源的BDNF”定义为神经胶质细胞产生、释放或者分泌的BDNF，在实施方案中，包括小胶质细胞、星形胶质细胞和/或少突胶质细胞产生或分泌的BDNF。

[0037] 在另一实施方案中，BDNF活性或表达的调节剂(例如，抑制剂)可以用于治疗或预防受试者中的疼痛或者减小伤害感受。在一个实施方案中，抑制剂(例如，活性剂或化合物)可以鞘内施用。在一个实施方案中，这些调节剂是能够减小BDNF下游信号传递的NTR活性剂，如BDNF受体的抑制剂(例如，TrkB或者p75 )，例如，K-252a或者抗-TrkB抗体；
MAPK(ras促分裂原活化蛋白激酶)途径的抑制剂；PI3K-Akt(磷脂酰肌醇-3激酶-Akt)途径抑制剂；PLCγ(磷脂酶Cγ途径)的抑制剂。在另一实施方案中，这些调节剂是能够抑制神经胶质细胞的刺激(例如，ATP刺激)的化合物(如P2X（如P2X4和P2X7)受体的抑制剂，例如，TNP-ATP、米诺环素和丙戊茶碱(propentophylline))。在再一个实施方案中，这些调节剂是能够减小BDNF表达的化合物或者活性剂(如dsRNA BDNF、siRNA分子、siRNA样分子、反义寡核苷酸、核酶，等等)。在一个实施方案中，当活性剂或者化合物是反义寡核苷酸时，它与编码BDNF的mRNA的部分实质互补，在另一实施方案中，它与核酸序列的部分互补，所述核酸序列与选自SEQID NO：1、3和5的序列实质同一。在再一个实施方案中，当活性剂或者化合物是siRNA时，该siRNA的序列与选自SEQ ID NO：7、8、9、10的序列和其片段实质同一。

[0038] 在一个实施方案中，本发明还涉及急性或者慢性痛的治疗，更具体地，涉及神经性疼痛的治疗。本文使用的“神经性疼痛”指与中枢神经系统中神经损伤(化学损伤后、压伤或者横切后、神经压迫后、疾病导致的神经退化后、化学损伤后)有关的慢性痛。在一个实施方案中，化学损伤可以来自化学治疗。在一个实施方案中，神经性疼痛与神经或者神经束损伤有关。在进一步的实施方案中，神经性疼痛与内脏和/或躯体疼痛有关。在实施方案中，疼痛的信号可以来自外周神经系统细胞或者神经胶质细胞的跨突触感觉纤维。在实施方案中，疼痛可以与许多状况有关，如慢性炎性痛、与关节炎相关的疼痛、纤维肌痛、背痛、癌症相关的疼痛、消化性疾病相关的疼痛、克隆病相关的疼痛、自身免疫病相关的疼痛、内分泌疾病相关的疼痛、糖尿病性神经病相关的疼痛、幻肢痛、自发性疼痛、慢性术后疼痛、慢性颞下颌痛、灼痛、疱疹后神经痛、艾滋病相关的疼痛、I和II型复合性区域疼痛综合征、三叉神经痛、慢性背痛、与脊髓损伤相关的疼痛、与药物摄入相关的疼痛和/或再发的急性痛。在一个实施方案中，与药物摄入相关的疼痛是与化学疗法治疗有关的疼痛。

[0039] 本文描述的方法还涉及降低神经胶质细胞来源的BDNF以减小伤害感受。本文使用的“伤害感受”指疼痛的感觉组分。疼痛可以是多种刺激的结果，包括但不限于压力、损伤、热刺激或者化学(例如，离子)刺激。

[0040] 本文使用的“BDNF”指与BDNF有关的任何可检测的表型。例如，可以通过测量TrkB酪氨酸磷酸化水平(例如，使用蛋白质印迹)、MAPK(ERK)途径激活水平(例如，使用蛋白质印迹)、Akt磷酸化水平(例如，使用蛋白质印迹)、PLCγ途径激活水平、神经递质释放报告水平、NMDA受体磷酸化水平、细胞存活、细胞分化和细胞死亡(例如，凋亡)来评估BDNF活性。可以使用许多凋亡测定法，如TUNEL染色、膜联蛋白V染色、FACS分析、琼脂糖电泳、蛋白质印迹、组织学、电子显微术、胱天蛋白酶测定、ELISA、线粒体测定法(例如，细胞色素C释放测定)、组织蛋白酶和钙蛋白酶测定，等等。在实施方案中，BDNF活性也可以影响神经细胞(例如，LI神经元)的阴离子逆转电位(E阴离子)。例如，通过使用短杆菌肽穿孔膜片钳记录(见下文实施例部分)可以测定阴离子逆转电位。

[0041] “BDNF表达”涉及BDNF转录物的产生和/或BDNF多肽或者蛋白质的分泌。因此，在实施方案中，BDNF表达可以通过直接估计蛋白质水平(例如，通过免疫细胞化学、ELISA和/或蛋白质印迹分析)或者编码BDNF的核酸的水平(例如，BDNF mRNA水平或者转录物)来确定。通过使用例如，诸如逆转录酶聚合酶链式反应[RT-PCR]方法、基于微阵列的方法或者通过RNA印迹分析测定这些水平。

[0042] 能够降低神经胶质细胞中BDNF活性或者表达的化合物可以例如，以使得它们接触CNS组织或者CNS细胞的方式施用。可以使用的化合物包括，但不限于，直接或间接修饰蛋白质的活性的化合物和调节(例如，在转录、翻译、成熟、翻译后修饰、磷酸化、分泌和降解水平上)该蛋白质的产生和/或稳定性的那些化合物。

[0043] 一类这些化合物是通过抑制神经胶质细胞的刺激起作用的化合物。实际上，应答神经胶质细胞的刺激(例如，ATP刺激)而分泌BDNF。本领域中已知许多化合物抑制神经胶质细胞的活化。通过抑制神经胶质细胞的活化，这些化合物抑制BDNF的分泌并因此可以用于预防或者治疗疼痛。这些化合物包括，但不限于P2X受体(例如，P2X4和P2X7)抑制剂，如TNP-ATP。

[0044] 可以用于抑制BDNF表达的另一类化合物是降低BDNF转录物水平的化合物。通过这样做，这些化合物抑制可以产生的BDNF多肽的数目，并且因此可以用于治疗或预防疼痛。这些化合物包括但不限于，dsRNA(例如，SEQ ID NO：7、8、9或者10)、siRNA、siRNA样分子、反义寡核苷酸或者核酶。

[0045] 另一类可以用于治疗或预防疼痛的化合物或者活性剂是能够抑制BDNF信号的介NTR导的化合物。这些化合物可以例如，作用于BDNF受体，如TrkB或者p75 。在一个实施方案中，BDNF受体是TrkB受体。可以抑制TrkB信号传递的化合物包括，但不限于，K-252a(可以从Calbiochem购买)或者针对TrkB的中和抗体(抗TrkB抗体[例如，IgG])(可以从BD Transduction Laboratories购买)。备选地，这些化合物可以作用于多种信号传递途径，该途径在BDNF与其受体连接时被激活。

[0046] 此外，BDNF表达的调节还可以从调节BDNF表达的转录因子的调节(例如，通过磷酸化介导)产生。此类转录因子包括，但不限于NFκB和Brn-3c。

[0047] 此外，BDNF活性的调节可以通过调节(例如，减少)BDNF从神经胶质细胞的分泌实现。

[0048] 本文描述的方法还预期调节(例如增强)BDNF降解。此类增强的降解可以在产生BDNF的细胞(例如神经胶质细胞)中或者在含有BDNF受体的细胞中(例如，具有BDNF受NTR体如TrkB或者p75 的神经元细胞)细胞内地产生。对于后一种情况，在它的降解之前，BDNF在接触BDNF受体后已经被细胞内转移。在另一实施方案中，一旦已经分泌BDNF，还可以在细胞外观察到增强的降解速率。

[0049] 在一个实施方案中，本文描述的方法和用途应用于脊椎动物受试者。在另一实施方案中，受试者是哺乳动物，在再一个实施方案中，是人。

[0050] 如上面提到的，BDNF的保留活性的同源物、变体和/或片段也可以用所描述的方法抑制。同源物包括与BDNF的氨基酸序列实质上同一、与BDNF共有结构和功能同源性的蛋白质序列。变体包括但不限于，通过任一修饰、和/或氨基酸替代、缺失或添加而与BDNF不同的蛋白质或肽。修饰可以发生在任何地方，包括多肽主链(即，氨基酸序列)、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。此类替代、缺失或添加可以包括一个或多个氨基酸。片段包括BDNF的片段或者部分或者BDNF的同源物或变体的片段或部分。

[0051] “同源物”和“同源的”指两个肽或者两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较比对的序列中每个位置确定同源性。核酸之间或者氨基酸序列之间同源性程度是序列共有的位置上相同或者匹配核苷酸或者氨基酸的数目的函数。如该术语在本文使用的，给定序列(核酸或者氨基酸)与另一序列是“同源的”，条件是这两个序列实质同一并且保留该序列的功能活性(如本文使用的，术语“同源的”不推论出进化相关性)。两个核酸序列或者两个氨基酸序列被认为是“实质同一的”，条件是当最佳比对(允许缺口)时，它们具有至少约50％序列相似性或者同一性，或者这两个序列共有确定的功能基序。在备选实施方案中，最佳比对的实质同一的序列的序列相似性可以为至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。如本文使用的，序列之间同源性的给定百分数表示最佳比对的序列中序列同一性程度。“不相关的”或者“非同源的”序列与SEQ ID NO：1到10具有小于40％同一性，尽管优选小于约25％同一性。

[0052] 实质互补的核酸是其中一种分子的“互补序列”与另一分子实质同一的核酸。

[0053] 用于同一性比较的序列的最佳比对可以使用多种算法进行，如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math 2：482的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法，和这些算法的计算机化实现(如Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A中 的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)。还可以使用Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-10(使用公开的默认设置)中描述的BLAST算法确定序列同一性。用于进行BLAST分析的软件可以从National Center forBiotechnology Information(通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的因特网)得到。BLAST算法包括首先鉴定高得分序列对(HSP)，其通过鉴定查询序列中长为W的短字来进行，所述短字当与数据库序列中相同长度的字比度时匹配或者满足某个正值阈值得分T。T称作邻近字得分阈值。最初的邻近字命中作为起始搜索的种子以发现更长的HSP。字命中在两个方向上沿着序列延伸，只要累积比对得分可以增加。当满足下面的参数时停止每个方向的字命中延伸：累积比对得分从其实现的最大得分下降量X；由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积得分达到0或者以下；或者达到了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏性和速度。BLAST算法可以以字长(W)11、BLOSUM62得分矩阵(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)比对(B)50、期望值(E)10(或1或0.1或者0.01或者0.001或者0.0001)，M＝5，N＝4，和两条链的比较作为默认值。使用BLAST算法对两条序列之间统计学相似性的一种测量是最小总概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或者氨基酸序列之间的匹配将由于机会发生的概率的指示。在本发明的备选实施方案中，如果测试序列的比较中最小总概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，那么认为核苷酸或氨基酸序列是实质同一的。

[0054] 两个核酸序列实质互补的备选表示是在中等严格，或者优选地严格条件下两条序列相互杂交。在中等严格条件下与滤器结合的序列杂交可以例如，在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA 65℃下进行，并在0.2x SSC/0.1％SDS 42℃下洗涤(见Ausubel，等人(编著)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，Green PublishingAssociates，Inc.，和John WileySons，Inc.，New York，at p.2.10.3)。备选地，在严格条件下与滤器结合的序列杂交可以例如在0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中65℃下进行并在0.1x SSC/0.1％SDS中68℃下洗涤(见Ausubel，等人(编著)，1989，上文)。杂交条件可以根据已知的方法修改，取决于目的序列(见Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2″Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays″，Elsevier，New York)。通常，选择严格条件比在确定的离子强度和pH下对特定序列的解链温度低约5℃。

[0055] 本发明还提供了用于预防和/或治疗疼痛的组合物，其包含能够降低神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂与可药用载体的混合物。在实施方案中，该活性剂能够减小(1)神经胶质细胞中的BDNF表达，(2)BDNF从神经胶质细胞的释放或分泌，(3)神经胶质细胞的刺激，和/或(4)神经胶质细胞来源的BDNF活性。在一个实施方案中，这种组合物适于施用于CNS神经细胞或者组织，如脊髓组织或者细胞。在再一个实施方案中，这种组合物可以是BDNF表达或者活性的抑制剂。本文使用的“抑制剂”是直接或者间接下调或者减小BDNF基因的表达、BDNF mRNA或转录物的稳定性、BDNFmRNA或转录物的翻译、BDNF多肽的成熟、转运和/或BDNF多肽的分泌的化合物。在一个实施方案中，“抑制剂”还可以下调或者抑制BNDF激活剂(如增强BDNF基因表达的转录因子(如NFκB和Brn-3c))。在实施方案中，BDNF可以来自小胶质细胞、星形胶质细胞和/或少突胶质细胞。在再一个实施方案中，组合物可以适于鞘内施用。

[0056] 本发明还提供了能够减少神经胶质细胞来源的BDNF的上述组合物或者上述活性剂或者化合物用于治疗或预防疼痛的用途。本发明还提供了能够降低BDNF活性或者表达的上述组合物或者上述活性剂或者上述化合物用于制备治疗或预防疼痛的药物的用途。在另一实施方案中，可以配制活性剂用于施用于受试者的CNS组织，例如，CNS细胞。在再一个实施方案中，活性剂可以适于鞘内施用。在另一实施方案中，所述化合物可以例如是BDNF表达或者活性的抑制剂。

[0057] 本发明还提供了包含上述组合物或者活性剂以及它们用于治疗或预防疼痛的使用说明书的药盒或包装(例如，商业包装)。

[0058] 在多种实施方案中，能够调节(例如减少)神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂可以治疗性用于治疗疼痛的制剂或者药物中。本发明还提供了对应的医学治疗方法，其中将能够调节(在一个实施方案中，减少)神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂的治疗剂量以药理学上可接受的制剂施用。因此，本发明提供了治疗组合物，其包含能够调节(在一个实施方案中，减小)BDNF活性或表达的化合物，和可药用的赋形剂或者载体。治疗组合物在生理上可接受的pH下可溶于水溶液中。

[0059] 在一个实施方案中，可以施用本文描述的活性剂使得它与CNS组织或者CNS神经元接触。本文使用的“中枢神经系统”或者CNS是神经系统的部分，包含脑和脊髓(例如，腰区中)。相比，“外周神经系统”或者PNS是神经系统的除了脑和脊髓之外的部分。在一个实施方案中，CNS组织是表面背角，在进一步的实施方案中，是I板层(lamina I)神经元。同样，在一个实施方案中，可以施用本发明的活性剂以通过直接颅内或者鞘内注射或者注射到脑脊液施用以治疗CNS细胞。备选地，可以以能够穿过血脑屏障并进入CNS的形式全身(例如，静脉内或者口服)施用活性剂。本文使用的“神经的”和“神经元的”可以互换使用并且都涉及神经元。“非神经元的”在本文中用于涉及不同于神经元的细胞，在神经系统的细胞的上下文中，涉及神经系统的不同于神经元(例如，神经胶质细胞)的细胞。

[0060] 本发明还提供了药物组合物(药物)，其包含能够调节，例如减少CNS细胞中的神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂。在一个实施方案中，此类组合物包括足以治疗或减轻疼痛的治疗或预防有效量的活性剂和可药用载体。“治疗有效量”指在必要的剂量和时间期限内，有效实现所希望的治疗结果，如疼痛的减轻的量。能够调节，在一个实施方案中减少神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂的治疗有效量可以根据如下因素而变：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，和化合物在个体中引起所希望的应答的能力。可以调节剂量方案以提供最佳治疗应答。治疗有效量还是治疗有益效果超过化合物的毒性或者有害效果的量。“预防有效量”指在在必要的剂量和时间期限内，有效实现所希望的预防结果，如预防或抑制疼痛的发作或者增加疼痛的严重性的量。可以如上面对治疗有效量描述的确定预防有效量。对于任何具体受试者，可以根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的职业判断随时间调节特定剂量方案。

[0061] 本文使用的“可药用载体”或者“赋形剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂，等等。在一个实施方案中，载体适于肠胃外施用。备选地，载体可以适于静脉内、腹膜内、肌内、颅内、鞘内、舌下或者口服施用。可药用载体包括无菌水溶液或者分散体和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉剂。
此类介质和活性剂用于药学活性物质的用途是本领域公知的。除了与活性化合物不相容的常规介质或者活性剂外，预期其用于本发明的药物组合物。还可以将补充的活性化合物掺入组合物中。

[0062] 治疗组合物通常必须在生产和保存条件下是无菌和稳定的。可以将组合物配制为溶液、微乳剂、脂质体或者其他适于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或者分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物。例如，通过使用包衣，如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂可以保持合适的流动性。在许多情况中，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇或者氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的物质，如单硬脂酸盐和明胶可以引起可注射组合物的延长吸收。此外，能够调节，(在一个实施方案中，减少或下调)神经胶质细胞来源的BDNF的化合物可以以定时释放制剂，例如以包括缓释聚合物的组合物施用。活性化合物可以用将保护该化合物免于快速释放的载体配制，如控释制剂，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。许多用于制备此类制剂的方法已经申请专利并且是本领域技术人员公知的。

[0063] 通过将活性化合物(例如，能够减少神经胶质细胞来源的BDNF的化合物)与上述列举的一种或几种成分的组合(如果需要)一起以所需的量掺入合适的溶剂中，然后过滤除菌，可以制备无菌注射液。通常，将活性化合物掺入含有基本分散介质和来自上述的那些所需的其他成分的无菌载体中来制备分散体。对于用于制备无菌注射液的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上来自其以前的无菌过滤的溶液的额外目的成分的粉末。根据本发明的备选方面，能够调节，(在一个实施方案中，减少或下调)神经胶质细胞来源的BDNF的化合物可以用增强其溶解度的一种或多种额外化合物配制。

[0064] 根据本发明的另一方面，包含能够减少神经胶质细胞来源的BDNF的活性剂的本发明的治疗组合物可以在容器或者包装(例如，商业包装)中提供，该容器或者包装还包含它们用于实现疼痛的治疗或预防的使用说明书。

[0065] 考虑到神经胶质细胞来源的BDNF的减少与如本文描述的痛觉的减轻相关，本发明的另一方面是通过对受试者施用编码BDNF抑制剂的核酸分子，如dsRNA、siRNA、反义寡核苷酸或者核酶来治疗疼痛。合适的施用方法包括基因治疗方法(见下文)。

[0066] 使用诸如DNA的直接注射、受体介导的DNA摄入、病毒介导的转染或非病毒转染和基于脂类的转染，可以将本发明的核酸递送到体内细胞，所有这些方法可以包括使用基因治疗载体。直接注射已经用于向细胞体内导入裸DNA(见例如，Acsadi等人(1991)Nature332：815-818；Wolff等人(1990)Science 247：1465-1468)。可以使用用于将DNA注射到体内细胞的递送装置(例如，“基因枪”)。此类装置可以通过商业途径获得(例如，从BioRad)。
还可以通过将DNA与阳离子如聚赖氨酸络合(该阳离子偶联到细胞表面受体的配体)向细胞导入裸DNA(见例如，Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.263：14621；Wilson等人(1992)J.Biol.Chem.267：963-967；和美国专利号5,166,320)。DNA配体络合物与受体的结合可以促进通过受体介导的内吞对DNA的摄入。可以用连接到腺病毒壳体的DNA-配体复合体避免细胞内溶酶体对复合体的降解，所述腺病毒壳体破坏内体，从而向细胞质释放物质(见例如Curiel等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8850；Cristiano等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2122-2126)。

[0067] 缺陷逆转录病毒被良好表征用作基因治疗载体(综述见Miller，A.D.(1990)Blood 76：271)。用于产生重组逆转录病毒和用这种病毒在体外或者体内感染细胞的方案可以见Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等人(eds.)Greene Publishing Associates，(1989)，Sections9.10-9.14和其他标准实验室手册。合适的逆转录病毒的实例包括本领域技术人员公知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适的包装病毒株的实例包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am.。逆转录病毒已经用于向许多不同的细胞类型体外和/或体内导入多种基因，所述细胞类型包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(见例如，Eglitis，等人(1985)Science 230：1395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464；Wilson等 人 (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：3014-3018；Armentano 等 人 (1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6141-6145；Huber等 人 (1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：8039-8043；Ferry 等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8377-8381；Chowdhury等人(1991)Science 254：
1802-1805；vanBeusechem等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7640-7644；Kay等人(1992)Human Gene Therapy 3：641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
10892-10895；Hwu等人(1993)J.Immunol.150：4104-4115；美国专利号4,868,116；美国专利号4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；和PCT申请WO 92/07573)。

[0068] 对于用作基因治疗载体，可以操作腺病毒的基因组使得它编码和表达本发明的核酸，但是它在正常溶解病毒生命周期中复制的能力方面是失活的。见例如Berkner等 人(1988)BioTechniques 6：616；Rosenfeld 等 人(1991)Science 252：431-434；和Rosenfeld等人(1992)Cell 68：143-155。来自腺病毒株Ad型5dl324或者腺病毒的其他毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等等)的合适的腺病毒载体是本领域技术人员公知的。重组腺病毒是有利的，因为它们不需要分裂细胞以成为有效的基因递送载体并且可以用于感染多种细胞类型，包括气管上皮(Rosenfeld等人(1992)上文引用)、内皮细胞(Lemarchand等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6482-6486)、肝细胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2812-2816)和肌细胞(Quantin等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2581-2584)。

[0069] 腺伴随病毒(AAV)可以用作基因治疗载体以为了基因治疗目的递送DNA。AAV是天然发生的缺陷病毒，其需要另一种病毒，如腺病毒或者疱疹病毒作为辅助病毒以有效复制和产生生命周期(Muzyczka等人Curr.Topics in Micro，and Immunol.(1992)158：97-129)。AAV可以用于将DNA整合到非分裂细胞(见例如，Flotte等人(1992)
Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-356；Samulski等人(1989)J.Virol.63：3822-3828；
和McLaughlin等人(1989)J.Virol.62：1963-1973)中。如在Tratschin等人(1985)Mol.Cell.Biol.5：3251-3260中描述的AAV载体可以用于向细胞引入DNA(见例如，Hermonat等 人 (1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6466-6470；Tratschin等 人 (1985)Mol.Cell.Biol.4：2072-2081；Wondisford等人(1988)Mol.Endocrinol.2：32-39；Tratschin等 人(1984)J.Virol.51：611-619；和Flotte等人(1993)J.Biol.Chem.268：3781-3790)。慢病毒基因治疗载体也可以适用于本发明。

[0070] 用于基因治疗的一般是本领域已知的。见例如，Anderson等人的美国专利号5,399,346，Baetge等人的PCT公开WO 95/05452中描述了用于递送遗传物质的生物相容的胶囊，以前已经报导了基因向造血细胞转移的方法(见Clapp，D.W.，等人，Blood 78：
1132-1139(1991)；Anderson，Science 288：627-9(2000)；和 Cavazzana-Calvo 等 人，Science 288：669-72(2000))。

[0071] 考虑到神经胶质细胞来源的BDNF和疼痛的相关性，能够减少如神经胶质细胞来源的BDNF的化合物可以用于预防和治疗疼痛。因此，本发明涉及鉴定和表征能够减少神经胶质细胞来源的BDNF的化合物的筛选方法。

[0072] 因此，本发明还提供了确定候选或者受试化合物是否能够减小神经胶质细胞来源的BDNF活性或表达并且又可用于预防和治疗疼痛的方法。这种方法可以包括在候选化合物存在与不存在下测定合适的系统中BDNF活性和/或表达。在一个实施方案中，该方法包括将具有BDNF活性或者表达BDNF的神经胶质细胞与所述候选化合物接触并测定在受试化合物存在下，BDNF活性或者表达是否降低。BDNF活性或者表达的降低表明受试化合物可以用于治疗或预防疼痛。在一个实施方案中，神经胶质细胞是受刺激的神经胶质细胞(例如，ATP刺激的神经胶质细胞或者外周神经或者神经束损伤的突触后的神经胶质细胞)。在另一实施方案中，神经胶质细胞选自小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在再一个实施方案中，神经胶质细胞内源地表达BDNF。在另一实施方案中，上述神经胶质细胞已经基因工程化以表达BDNF基因。本文描述的方法可以用于筛选受试化合物，如dsRNA、siRNA分子、siRNA样分子、核酶和/或反义寡核苷酸。

[0073] 本发明还提供了鉴定或表征可以用于治疗或预防疼痛的化合物的另一种筛选方法。在一个实施方案中，该方法包括将神经胶质细胞与候选化合物接触并确定在受试化合物存在下，神经胶质细胞刺激是否降低。神经胶质细胞活化的降低表明该受试/候选化合物可以用于治疗或预防疼痛。在一个实施方案中，神经胶质细胞是受刺激的神经胶质细胞(例如，ATP刺激的神经胶质细胞或者外周神经或者神经束损伤的突触后的神经胶质细胞)。在另一实施方案中，神经胶质细胞选自小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

[0074] 如上面提到的，本发明还涉及鉴定和表征能够减少BDNF基因表达的化合物的方法。这种方法可以包括测定在受试化合物存在和不存在下BDNF基因的表达。通过检测对应的RNA或者蛋白质，或者通过使用合适的报导构建体可以测量这种基因表达，所述构建体包含通常与有效连接报导基因的BDNF基因结合的转录调节元件。当第一种核酸序列与第二种核酸序列置于功能关系中时，第一种核酸序列可以“有效连接”第二种核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么启动子有效连接编码序列。通常，有效连接的DNA序列是连续的，并且必要时连接可读框中的两个蛋白质编码区。然而，因为例如，增强子当与启动子相隔几千碱基时通常是有功能的，并且内含子序列可以是不同的长度，一些多核苷酸元件可以是有效连接的但不是连续的。“转录调节元件”是通用术语，其指DNA序列，如起始和结束信号、增强子和启动子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号，其诱导或者控制它们有效连接的蛋白质编码序列的转录。可以在转录或者翻译水平上，例如，通过产生的RNA或者蛋白质的量测量这种报导基因的表达。例如，通过RNA印迹分析或者通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方法可以检测RNA(见例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA)。可以使用亲和试剂(例如，抗体或其片段[方法见例如，Harlow，E.和Lane，D(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY]；结合蛋白质的配体)或者通过其他性质(例如，对于绿色荧光蛋白，通过荧光)或者通过测量蛋白质的活性(其可以使得酶促活性产生可检测的产物(例如，具有改变的分光性质)或者可检测的表型(例如，细胞生长中的改变)来检测。合适的报导基因包括但不限于氯霉素乙酰转移酶、β-D半乳糖苷酶、萤光素酶，和/或绿色荧光蛋白。

[0075] 在一个实施方案中，可以进一步分析候选化合物以测定它是否能够调节BDNF介导的过程或者BDNF活性。

[0076] 本发明还提供了化合物的另一筛选方法，所述化合物可以基于它们减小神经胶质细胞分泌BDNF的能力治疗或预防疼痛。在一个实施方案中，该方法包括在能够分泌BDNF的细胞(如神经胶质细胞)存在下接触受试化合物并确定在受试化合物存在下，BDNF的分泌是否减少。BDNF从神经胶质细胞的分泌减少表明该受试化合物可以用于治疗或预防疼痛。在一个实施方案中，神经胶质细胞是受刺激的神经胶质细胞(例如，ATP刺激的神经胶质细胞或者外周神经或者神经束损伤的突触后的神经胶质细胞)。在一个实施方案中，神经胶质细胞选自小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

[0077] 本文提到的筛选方法可以使用单种受试化合物或者多种受试化合物或者受试化合物文库(例如，组合文库)。对于后一种情况，还可以鉴定和表征通过化合物组合提供的协同作用。上面提到的化合物可以用于预防和/或治疗疼痛，或者可以用作前导化合物用以开发和测试具有提高的特异性、功效和/或药理学(例如，药物代谢动力学)性质的额外化合物。在一个实施方案中，化合物可以是前体药物，其在合适的作用部位，例如，在CNS组织(例如，脊髓中)改变成它的活性形式。在一些实施方案中，可以自动化本发明的筛选/测试方法的一个或多个步骤。

[0078] 尽管本文公开了本发明的多种实施方案，但是可以根据本领域技术人员的一般常识在本发明范围内进行许多改编和修改。此类修改包括本发明的任一方面的已知等同物的替代，以便以基本上相同的方式实现相同的结果。数字范围包括定义该范围的数字。在权利要求中，单词“包含”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括，但不限于”。下面的实施例阐明本发明的不同方面，并且不限定如权利要求书中公开的本发明的宽泛方面。

[0079] 实施例

[0080] 实施例1-材料和方法

[0081] 外周神经损伤模型和行为研究

[0082] 通过在成年雄性Sprague-Dawley大鼠的坐骨神经周围手术植入聚乙烯套囊(长3，17
2mm，内径0.7mm)诱导外周神经损伤 。对于用作对照的假手术，动物将进行所有手术步
3，18
骤，只是不植入套囊。评估对机械刺激的50％缩足阈值，或者50％缩足阈值 。神经手术后，仅机械阈值(14-17天内)逐渐下降到2g或者以下的动物用于进一步实验。在用该模型诱导外周神经损伤的动物中，在神经套囊同侧的脊髓中有小胶质细胞激活，如通过小胶质细胞活化标记OX-42的增加的标记所示(图5B和5C)。

[0083] 切片制备.如以前描述的从成年(＞50日龄)雄性大鼠制备脊髓的旁矢状面切片31
(300-350μm) 。将切片用含有(mM)126NaCl、26NaHCO3、10葡萄糖、2.5KCl、2CaCl2、2MgCl2、
1.25NaH2PO4的人工脑脊液(ACSF)(用95％O2/5％CO2冒泡，pH～7.4)连续灌流(2-3ml -1
min )。

[0084] 记录.对于穿孔膜片钳记录，将吸管吸头装入含有(mM)：130甲基硫酸钾((KMeSO4)、5CsCl、2MgCl2、11BAPTA、1CaCl2、4ATP、0.4GTP、10HEPES(～pH 7.4)的溶液。将-1 -1吸管回装补充25μg ml 短杆菌肽D(短杆菌肽贮存液为二甲亚砜(DMSO)中10mg ml )的该相同溶液。当接入电阻稳定在25-45MΩ时，选择以该模式记录。对于全细胞电位钳记录，将吸管装入缺少短杆菌肽D的上述溶液。通过经由微量吸管通过压力注射局部应用
19
GABA10-50ms。如以前描述的进行PSC的数据获取和分析 ；如以前描述的校正膜电位测量
20
。输入电阻和LI神经元的静息膜电位都没有受到用于该研究的任何药物或者方案的显著影响。除了指出时，所有测量都以平均值±SEM给出。对于平均值的比较，使用斯氏t检验测试统计学显著性，卡方检验用于列联表，方差的混合设计分析(因此Tukey′s HSD检验)用于重复测量。

[0085] 小胶质细胞培养物.在如所述的标准条件下制备大鼠原代培养的小胶质细胞2，21
。简言之，从新生Wistar大鼠制备混合的神经胶质细胞培养物并在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中保持10-16天。通过轻微摇动培养瓶将小胶质细胞与原代培养物分离并在塑料皿上再次平板接种。使用细胞刮棒从皿表面除去细胞并用100μl PBS收集；随后，使用细胞计数器测量小胶质细胞的细胞密度并调节PBS的体积以得到1000个细胞/10μl的最终密度。该方法产生＞95％纯度的小胶质细胞培养物。对于ATP刺激，将纯化的小胶质细胞与ATP(50μM)温育1小时。

[0086] 鞘内注射和ELISA.在药物施用前至少3天，将大鼠用戊巴比妥钠(65mg kg-1)麻醉22
并将腰部脊椎导管(PE-10聚乙烯管)插入到鞘内空间 。在从手术回收时，通过鞘内利多卡因注射(2％，30μl)诱导下部身体麻醉以证实正确的导管定位。仅将显示出对利多卡因的适当的暂时麻醉，以及缺少运动缺陷的动物用于行为测试。药物/载体施用后，处死动物并解剖它们的脊柱以在视觉上证实导管的正确放置。药物包括BDNF(10μg/天或者10μg/注射)和抗-TrkB抗体(12μg每2小时或者30μg/注射)、TrkB-Fc(5μg/注射)，它们都
28
用盐水+10％(v/v)DMSO制备。对于病毒介导的转导，施用编码BDNF和EGFP 的腺病毒载
10
体一次(20μl；2.0×10 PFU/ml)。在使用的剂量下，没有化合物产生运动障碍或者镇静，
23
如通过抓握、翻正和放置反射和行为观察评估 。对于其中用小干扰RNA(siRNA)脂转染小胶质细胞的实验，从Dharmacon Inc得到抗-BDNF和乱序siRNA。BDNF siRNA由四种合并
6
的21-核苷酸双链体组成。四种双链体的序列如下 ：

[0087] 1)TCGAAGAGCTGCTGGATGA(SEQID NO：7)

[0088] 2)TATGTACACTGACCATTAA(SEQID NO：8)

[0089] 3)GAGCGTGTGTGACAGTATT(SEQID NO：9)

[0090] 4)GAACTACCCAATCGTATGT(SEQID NO：10)

[0091] 按照生产商的使用说明，用BDNF或者乱序siRNA与Lipofectamine2000TM转染小胶质细胞培养物。简言之，将siRNA和lipofectamine用无血清的培养基稀释，混合并加入到小胶质细胞培养物中。允许转染进行5小时并如上所述收集小胶质细胞用于随后的鞘内注射。在所有情况中，将30μl小胶质细胞+上清液鞘内注射到正常大鼠中。

[0092] 免疫组织化学.在灌流的自由漂浮的切片上进行免疫组织化学。标记CD3/CD11b的OX-42(Cedarlane，1∶1000)用作小胶质细胞的特异标记物。在4℃与一级抗体过夜温育后，冲洗切片并用生物素化的抗-小鼠IgG(1∶1000)在室温下温育1小时。然后将切片再次冲洗并浸入抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合体(Vector Laboratories)1小时。最后，用含有0.003％过氧化氢的0.05％3，3’-二氨基联苯胺(DAB)显色阳性标记。

[0093] 为了测量BDNF分泌，在如上述的多种实验条件下制备小胶质细胞并在37℃温育6小时以对上面的体内实验建模。

[0094] 钙成像.制备脊髓切片用于钙成像和如以前描述的测试对GABA的应答5。如上制备小胶质细胞的原代培养物，转移到标准盖玻片中并与HEPES缓冲盐水(+0.01％DMSO)中的2.5μM Fura-2-AM温育45分钟。荧光团负荷后，使用从微量移液器快速(～5s)2+
应用ATP(10μM)引起各小胶质细胞中[Ca ]i的改变。使用在装备表面荧光光学仪器的
2+
Zeiss Axioscope上的40倍水浸物镜通过荧光分析测量[Ca ]i。用连接CCD照像机的TILLPhotonics单色器获得图像，并在明显不同的神经元细胞体上画上目的区域(用于计算比例)。

[0095] 实施例2结果

[0096] 为了研究小胶质细胞是否可以影响I板层(LI)神经元中的E阴离子，申请人通过鞘2
内导管对幼稚大鼠的腰部脊柱水平体内施用小胶质细胞，如以前描述 ，随后在从这些动物制备的急性脊髓切片中LI神经元在体外进行穿孔膜片钳和全细胞记录。在处死每只动物
2，3
前，申请人测定感受伤害缩足阈值以证实存在或不存在响应该处理的触觉异常性疼痛 。
在申请人施用了用ATP(50μM)刺激的小胶质细胞的动物中，感受伤害缩足阈值不断下降，约5小时后达到最小值(图1A)。相比，在用对照——未受刺激的小胶质细胞处理的动物中，缩足阈值没有改变(图1A)。申请人发现皮质和脊柱来源的小胶质细胞导致缩足阈值的相当水平的降低。因为皮质的较大尺寸，它产生更多小胶质细胞并且因此用于随后的研究中。

[0097] 在鞘内小胶质细胞施用后5小时从切片进行电生理记录。使用来自LI神经元的电位钳记录，申请人发现在来自用对照小胶质细胞注射的大鼠的脊髓切片中，E阴离子为-68.3±1.8mV(n＝6；图1B)。另一方面，在来自施用ATP刺激的小胶质细胞后大鼠的LI神经元中，E阴离子为-61.6±1.1mV(n＝16，p＜0.0001)。使用电流钳记录，申请人发现GABA导致来自对照动物的LI神经元中的超极化(图1C，上图)，而在来自已经施用ATP刺激的小胶质细胞的大鼠的神经元中，GABA引起去极化(图1C，下图)。从而，鞘内施用ATP刺激的小胶质细胞导致LI神经元中E阴离子的去极化偏移并将GABA引起的应答从超极化转变成去极化。这些抑制性应答的改变与ATP刺激的小胶质细胞产生的感受伤害缩足阈值的减小相吻合。

[0098] 为了实现E阴离子的偏移，ATP刺激的小胶质细胞可以对LI背角神经元发信号。已知活化的小胶质细胞分泌多种生物学活性信号传递分子，其中之一是BDNF，其已经涉及致25，26 27
敏和炎症后背角神经元的超敏 和海马中阴离子梯度偏移 。申请人对幼稚大鼠鞘内施用BDNF并且发现它产生缩足阈值的减小，该减小与ATP刺激的小胶质细胞产生的缩足阈值的减小相当(图2A)。

[0099] 为了确定BDNF是否可以导致E阴离子的偏移，申请人将其bath-applied到得自幼稚大鼠的脊髓切片。申请人发现用BDNF处理(＞90分钟)的切片中LI神经元(n＝9)中E阴离子比来自对照、未处理的切片的LI神经元的E阴离子显著较不负(n＝9；p＜0.005；图2B)。从而，在BDNF施用期间，对GABA的应答是刺激性的，而不是抑制性的。申请人利用钙成像，
2+
通过在LI神经元(n＝96)中快速GABA应用后监视细胞内钙([Ca ]i)的水平研究了该问
2+
题。在用BDNF灌注期间，并且在谷氨酸受体阻断剂存在下，随着[Ca ]i的升高，应答GABA的神经元的比例随时间增加，在80到120分钟之间记录为达到31％的神经元(p＜0.05；
2+
图2C)。通过bath applying GABAA受体阻断剂荷包牡丹碱阻止了[Ca ]i的升高(n＝18；
p＜0.05)，证实该效应由GABAA受体介导。从而，申请人推断在切片中急性施用BDNF导致E阴离子的去极化偏移，并且在约30％的细胞中导致GABA产生净兴奋。

[0100] 为了确定在体内持续长期暴露于BDNF的效果，申请人通过鞘内导管施用BDNF转28
导重组腺病毒(adBDNF) (n＝16)。该adBDNF导致注射后测试的4天内缩足阈值的不断减小。相比，注射不编码BDNF的对照腺病毒在相同的时间内对缩足阈值没有影响(n＝6；
p＜0.005；图2D)。因为adBDNF处理的长期效果，申请人能够测试来自被处理的动物的切片中E阴离子的改变。申请人发现来自adBDNF注射的大鼠(n＝7)的LI神经元中E阴离子比来自用对照腺病毒处理的大鼠(n＝4；p＜0.01；图2E，F)测量的E阴离子明显较不负。此外，GABA应用导致来自adBDNF注射的大鼠的一些LI神经元引起动作电位(测试的7种细胞的两种)，而这在对照条件下从没有观察到。从而，像急性施用BDNF一样，持续局部释放导致缩足阈值的减小、E阴离子的去极化偏移，并且可以将GABA的作用从抑制性转向兴奋性。

[0101] 这些结果表明外源BDNF足够导致触觉异常性疼痛和E阴离子的偏移。为了研究BDNF是否可能是外周神经损伤后遗症的内源介体，申请人使用针对TrkB受体的功能阻断性抗体(抗-TrkB)以及BDNF螯合性融合蛋白(TrkB-Fc)，已经表明它们都阻断BDNF的作5，25，29
用 。申请人通过鞘内导管对在外周神经损伤后两周已经产生异常性疼痛的大鼠施用抗-TrkB或者TrkB-Fc。施用这些试剂之前和之后测量缩足阈值。申请人发现这些试剂的每一种都急性逆转缩足阈值的减小(n分别＝7和4，p＜0.05；图3A)。相比，对具有外周神经损伤的大鼠进行载体施用不产生缩足阈值的改变(图3A)。为了确定BDNF-TrkB信号传递对于LI神经元中E阴离子的神经损伤诱导的偏移是否是必需的，申请人检查了对从外周神经损伤后两周具有异常性疼痛大鼠得到的脊髓切片急性应用抗-TrkB的效果。申请人发现用抗-TrkB处理的切片(n＝7)中LI神经元的E阴离子比载体处理的切片中E阴离子更负(n＝6；p＜0.05；图3B，C)。总之，这些发现表明内源BDNF对于维持触觉异常性疼痛和外周神经损伤导致的LI神经元中E阴离子的去极化偏移是必要的。

[0102] 为了测试用BDNF-TrkB信号传递干扰是否将防止通过施用ATP刺激的小胶质细胞产生的异常性疼痛和LI神经元E阴离子的偏移，申请人施用ATP刺激的小胶质细胞以及抗-TrkB或者TrkB-Fc。施用ATP刺激的小胶质细胞以及这些阻断剂的任一种在鞘内注射后5小时内不导致缩足阈值的改变(n分别＝8和7；图4A)。相比，不用这些试剂，施用ATP刺激的小胶质细胞后进行性产生异常性疼痛(n＝8)。用ATP刺激的小胶质细胞可以引起从脊髓内的细胞释放BDNF。阻断剂可以干扰来自该来源而不是来自施用的小胶质细胞本身6
的BDNF的作用。为了区分这两种可能性，申请人用针对BDNF的双链RNA(BDNF siRNA)预处理培养的小胶质细胞。该预处理后，将小胶质细胞用ATP刺激，然后当鞘内注射到幼稚大鼠时，不能导致缩足阈值的改变(n＝7；图4A)。为了控制siRNA的可能的非特异作用，申请人在ATP刺激前用BDNF siRNA的乱序形式处理小胶质细胞；这些小胶质细胞引起强烈的异常性疼痛(n＝4；图4A)。而且，用抗TrkB或用BDNF siRNA处理的小胶质细胞中ATP引起的钙应答与载体处理的对照小胶质细胞没有不同，表明抗TrkB或用BDNF siRNA处理不影响小胶质细胞对ATP的应答(图4D)。然而，用BDNF-TrkB信号传递干扰阻止了小胶质细胞诱导的触觉异常性疼痛。

[0103] ATP刺激的小胶质细胞产生的E阴离子中的去极化偏移可以通过用BDNF-TrkB信号传递干扰来阻止。申请人发现来自接受ATP刺激的小胶质细胞以及抗-TrkB或者BDNF siRNA预处理后动物的LI神经元中E阴离子与来自接受未受刺激的小胶质细胞的动物的LI神经元中的无显著差异。然而，来自这些组大鼠的LI神经元中E阴离子与接受了ATP刺激的小胶质细胞与载体的动物的LI神经元中的相比明显更负(图4C)。从而，抗-TrkB和BDNF siRNA阻止了ATP刺激的小胶质细胞诱导的E阴离子中的偏移。

[0104] 此外，ATP刺激(n＝3)但不是载体对照(n＝4)导致从培养的小胶质细胞释放BDNF(p＜0.001；图4E)。该ATP的作用通过用P2X受体阻断剂TNP-ATP处理阻断(n＝3；p＜0.05)。此外，用BDNF siRNA预处理小胶质细胞阻止通过ATP刺激导致的BDNF释放(n＝3；p＜0.001)。将这些发现与上面的行为和电生理学结果一起考虑，申请人推断ATP刺激的小胶质细胞引起的缩足阈值的减小和LI神经元中E阴离子的偏移需要BDNF-TrkB信号传递并且BDNF的来源是小胶质细胞它们自身。

[0105] 为了测试抑制小胶质细胞ATP信号传递是否可以抑制外周神经损伤导致的E阴离子的偏移，申请人使用了TNP-ATP，已经表明它通过作用于小胶质细胞中P2X而逆转神经2
损伤诱导的触觉异常性疼痛 。申请人将TNP-ATP急性地bath-applied于来自外周神经损伤后2周从异常性疼痛大鼠得到的脊髓切片。在TNP-ATP存在下，LI神经元的E阴离子为-59.3±1.8mV(n＝6)，其与来自神经损伤的动物的未处理切片的LI神经元中的E阴离子(-49.3±4.5mV，n＝6，p＜0.05)相比明显更负。从而，申请人断定必需P2X受体激活来维持具有外周神经损伤的E阴离子动物中去极化偏移。此外，申请人发现所有实验条件下缩足阈值和LI神经元中E阴离子之间的负相关(图4F)，提示E阴离子作为小胶质细胞和异常性疼痛之间关键的机械联系。

[0106] 显然在脑14和脊髓15中抑制性突触的正常调谐需要神经元来源的BDNF；实际上，11
已知引发长期突触后塑性的刺激模式已经被证明引起从表面背角中初级传入释放BDNF 。
然而，似乎正常塑性仅仅必需TrkB受体的快速激活，因为已经记载BDNF螯合抗体的应用仅
16
仅减弱长期塑性的诱导，对于维持没有作用 。相比，抑制的病理生理阻遏可能需要重复活化TrkB受体：在本文中表明，通过应用中和抗体(抗-TrkB)抑制TrkB快速减弱疼痛超敏反应，以及减小来自神经损伤的LI神经元阴离子梯度。从而，本文中描述的研究表明靶定小胶质细胞来源的BDNF对于神经性疼痛的治疗干预而不是操作所有BDNF作用的益处，因为它代表消除催化该疾病的过程，而使对于正常神经元功能关键的过程(例如，BDNF的神经元库)保持完整。因此，在一个实施方案中，本文描述的方法对正常神经元过程没有影响或者基本没有影响。

[0107] 在本申请全文中，引用多种参考文献来更完整地描述本发明所述领域状态。将这些参考文献的公开引入本公开作为参考。

[0108] 参考文献

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