包含多肽和糖的基于丙交酯/乙交酯共聚物的缓释微胶囊

摘要

本发明涉及生物活性多肽缓释用组合物，和形成及使用所述生物活性多肽缓释用组合物的方法。本发明缓释组合物包含其中分散有生物活性多肽和糖的生物相容性聚合物。

权利要求

1.用于在释放时间内释放生物活性多肽的缓释组合物，包括一种生物相容性聚合物、一种生物活性多肽、和一种糖，在所述组合物的制备过程中，向包括生物活性多肽、糖、聚合物的混合物中加入凝聚剂从而形成微粒，所述凝聚剂是硅油且硅油与聚合物溶剂的比率为

1.5∶1，其中，所述聚合物溶剂是二氯甲烷，通过汞压测定法确定所述组合物的总孔容积是0.1毫升/克或者更少，从而提供一种释放曲线，所述释放曲线在释放期间具有的生物活性多肽最大血清浓度Cmax与在释放期间具有的生物活性多肽平均血清浓度Cave之比是3或者更少，其中所述生物相容性聚合物是50∶50的DLPLG4A，

其中所述生物活性多肽是毒蜥外泌肽4并占所述缓释组合物的3％w/w到5％w/w，且其中所述糖是蔗糖，占所述缓释组合物的2％w/w。

2.根据权利要求1所述的缓释组合物，其中，所述毒蜥外泌肽4占所述缓释组合物的

5％w/w。

3.根据权利要求1所述的缓释组合物，其中所述生物相容性聚合物的粘度在0.3和

0.5dL/g。

4.在释放时间内持续释放毒蜥外泌肽4的组合物在制备用于治疗2型糖尿病的药物中的应用，所述组合物包括一种生物相容性聚合物、毒蜥外泌肽4和蔗糖，其中在所述组合物的制备过程中，向包括毒蜥外泌肽4、蔗糖和聚合物的混合物中加入凝聚剂从而形成微粒，所述凝聚剂是硅油且硅油与聚合物溶剂的比率为1.5∶1，其中，所述聚合物溶剂是二氯甲烷，通过汞压测定法确定所述组合物的总孔容积是0.1毫升/克或者更少，从而提供一种释放曲线，所述释放曲线在释放期间具有的毒蜥外泌肽4最大血清浓度Cmax与在释放期间具有的毒蜥外泌肽4平均血清浓度Cave之比是3或者更少，其中，所述缓释组合物的生物相容性聚合物是50∶50的DL PLG4A，其中所述毒蜥外泌肽4占所述缓释组合物的3％w/w到

5％w/w，其中所述蔗糖占所述缓释组合物的2％w/w。

5.制备持续释放多肽的组合物的方法，包括：(a)通过将包括水溶性多肽和糖的水相与包括生物相容性聚合物和该聚合物溶剂的油相相混合形成一种混合物；(b)将步骤(a)所得的混合物形成一种油包水乳剂，其中乳剂内部雾滴尺寸小于大约0.5微米；(c)将凝聚剂加入到该混合物中形成初期微粒，其中，所述凝聚剂为以足够量加入以达到硅油与聚合物溶剂比率为1.5∶1的硅油，其中，所述聚合物溶剂是二氯甲烷；(d)将初期微粒转移到淬灭溶剂中以使微粒硬化；(e)收集硬化的微粒；和(f)干燥硬化的微粒，其中，所述生物相容性聚合物是50∶50的DL PLG4A；多肽为毒蜥外泌肽4，占所述缓释组合物的3％w/w到

5％w/w；所述糖是蔗糖，占所述缓释组合物的2％w/w。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述聚合物以10％w/v以下存在于油相中。

7.权利要求1、2、3中任意一项所述的缓释组合物，其中所述组合物处于微粒形式。

8.适合于通过针头注射的可注射组合物，包括：(a)权利要求1、2、3中任意一项所述的缓释组合物；和(b)一种水相注射媒介物。

9.适合于通过针头注射的可注射组合物，包括：(a)权利要求7所述的缓释组合物；和(b)一种水相注射媒介物。

10.根据权利要求8或者9所述的可注射组合物，其中，水相注射媒介物的粘度在20℃下为20cp。

11.根据权利要求8或者9所述的可注射组合物，其中，水相注射媒介物的粘度在20℃下为高于50cp低于60cp。

12.根据权利要求9所述的可注射组合物，其中，所述微粒以大于30毫克/毫升的浓度悬浮在水相注射媒介物中，形成具有流动相的悬浮液，其中，所述悬浮液的流动相在20℃下的粘度为20cp。

13.根据权利要求8或者9所述的可注射组合物，进一步包括至少一个粘性增强剂、密度增强剂、张力增强剂和润湿剂。

14.根据权利要求8到12中任意一项所述的可注射组合物，通过直径为23到18号的针注射。

15.根据权利要求8到12中任意一项所述的可注射组合物，通过直径为25到18号的针注射。

16.根据权利要求8到12中任意一项所述的可注射组合物，通过直径为23号的针注射，其中所述水相注射媒介物包括3.0％w/v的羧甲基纤维素钠、0.9％w/v的氯化钠、0.1％v/v的聚山梨酸酯20和水。

17.根据权利要求16所述的可注射组合物，进一步包括一种缓冲剂。

18.根据权利要求9所述的可注射组合物，通过直径为23到18号的针注射，其中微粒的平均粒度是50微米到100微米。

19.根据权利要求9所述的可注射组合物，通过直径为25到18号的针注射，其中微粒的平均粒度是50微米到100微米。

20.通过25号的针注射的可注射组合物，包括：一种缓释组合物，该缓释组合物包括：

50∶50DL PLG 4A聚合物，3到5％w/w毒蜥外泌肽4、和2％w/w蔗糖，其中在释放期间具有的毒蜥外泌肽4的最大血清浓度Cmax与在释放期间具有的毒蜥外泌肽4平均血清浓度Cave之比是3或者更少，所述组合物的总孔容积是0.1毫升/克或者更少，在所述组合物的制备过程中，向包括生物活性多肽、糖、聚合物的混合物中加入凝聚剂从而形成微粒，所述凝聚剂是硅油且硅油与聚合物溶剂的比率为1.5∶1，其中，所述聚合物溶剂是二氯甲烷，该缓释组合物悬浮在一种注射媒介物中，所述注射媒介物包括在水中占3.0％w/v的羧甲基纤维素钠、0.9％w/v的氯化钠和0.1％v/v的聚山梨酸酯20。

21.根据权利要求20所述的可注射组合物，其中所述毒蜥外泌肽4在位置14的甲硫氨酸被亮氨酸取代。

22.制造可通过25号针注射的可注射组合物的试剂盒，包括：(a)小瓶，小瓶中含有治疗有效量的干燥的缓释组合物，所述组合物含有50∶50 DL PLG 4A聚合物，3到5％w/w毒蜥外泌肽4、和2％w/w蔗糖，其中在释放期间具有的毒蜥外泌肽4的最大血清浓度Cmax与在释放期间具有的毒蜥外泌肽4平均血清浓度Cave之比是3或者更少，所述组合物的总孔容积是0.1毫升/克或者更少，在所述组合物的制备过程中，向包括生物活性多肽、糖、聚合物的混合物中加入凝聚剂从而形成微粒，所述凝聚剂是硅油且硅油与聚合物溶剂的比率为

1.5∶1，其中，所述聚合物溶剂是二氯甲烷，和(b)小瓶，小瓶中包括在水中占3.0％w/v的羧甲基纤维素钠、0.9％w/v的氯化钠和0.1％v/v的聚山梨酸酯20，其中存在足够的注射媒介物将缓释组合物以至少30毫克/毫升的浓度悬浮。

23.制造持续释放毒蜥外泌肽4的药学可接受组合物的方法，包括：

(a)通过将包括水溶性毒蜥外泌肽4和蔗糖、不包括硫酸铵的水相与包括在氯仿中的纯化的50∶50 DL PLG 4A聚合物的油相相混合形成一种混合物；

(b)将步骤(a)所得的混合物形成一种油包水乳剂，其中乳剂内部雾滴尺寸小于大约

0.5微米；

(c)将凝聚剂加入到该混合物中形成初期微粒，其中，所述凝聚剂为以足够量加入以达到硅油与聚合物溶剂比率为1.5∶1的硅油，其中，所述聚合物溶剂是二氯甲烷，且其中硅油在三到五分钟之内加入到油包水乳剂中，将凝聚混合物维持一分钟以下或者一分钟；

(d)将初期微粒转移到淬灭溶剂中，按照氯仿与淬火溶剂之比为16∶1的比率以使微粒硬化，其中所述淬火溶剂是一种庚烷/乙醇混合物且所述转移时间是小于或者3分钟；

(e)收集硬化的微粒；和

(f)干燥硬化的微粒，

其中在释放期间具有的毒蜥外泌肽4的最大血清浓度Cmax与在释放期间具有的毒蜥外泌肽4平均血清浓度Cave之比是3或者更少，所述组合物的总孔容积是0.1毫升/克或者更少；

其中所述生物活性多肽是毒蜥外泌肽4并占所述缓释组合物的3％w/w到5％w/w，且其中所述糖是蔗糖，占所述缓释组合物的2％w/w。

说明书

包含多肽和糖的基于丙交酯/乙交酯共聚物的缓释微胶囊

[0001] 相关申请

[0002] 本申请要求于2004年4月15日提出申请的美国专利临时申请第60/563,245号和于2005年4月提出申请的USSN____(快件邮件编号EV 57190029US)的权益，后者题目为“基于聚合物的缓释装置”，指定律师代理申请案编号为1733.2056 US1，列出的发明人为Steven G.Wright、Troy Christensen、Thean Yeoh、Michael Rickey、Joyce Hotz、Rajesh Kumar和Henry R.Costantino。上述申请的整体教导在此引入作为参考。

[0003] 发明背景

[0004] 许多蛋白质和肽(本文中统称为多肽)在体内表现出生物学活性，可用作药物。很多疾病或病症需要给予持续水平的药物以提供最有效的预防和/或治疗作用。通常通过频繁皮下注射给予生物活性多肽可达到持续水平，而频繁皮下注射经常导致药物水平波动和患者依从性差。

[0005] 作为选择，可采用使用生物降解性材料(例如聚合物)封装所述药物来作为持续递药系统。例如，呈微粒或微载体形式的生物降解性聚合物的使用，可通过利用聚合物固有的生物降解性控制药物释放，提供缓释药物，藉此提供更为一致、持续的药物水平，并改进患者的依从性。

[0006] 然而，这些缓释装置通常可表现出很高的药物初始爆发释放，此后释放极微，导致血药水平处于治疗窗口之外和/或药物生物利用度差。另外，聚合物的存在、生理温度和机体对缓释组合物的反应可使药物发生改变(例如降解、聚合)，由此干扰所期需的药物释放曲线。

[0007] 此外，由于药物的不稳定性和处理步骤的降解作用，形成缓释组合物所用的方法可引起药物活性损失。当药物为多肽时降解作用尤其是个问题。

[0008] 因此，需要有一种以持续方式给予生物活性多肽的手段，其中递送的多肽的量处于治疗水平，且在所期需的释放时间内保持活性和效力。尽管为致力于解决这些问题一直在进行大量的研发工作，但仍需要新的解决方案。

[0009] 发明概述

[0010] 本发明涉及如下发现：通过在制作过程中控制凝聚剂与聚合物溶剂的比率(例如硅油与聚合物溶剂的比率)由此达到低孔容积，用含有少量组分的制剂可得到优异的释放曲线(例如特征为Cmax与Cave比率为约3以下的曲线)。此外，已发现这种所期需的优异释放曲线可通过控制凝聚过程来得到，例如控制加入凝聚剂(例如硅油)的时间长度、加入后保持时间长度和转移到猝灭剂的时间长度。也已发现通过控制内部乳滴粒径可得到优异的低孔容积缓释组合物(例如微粒)。此外，业已发现控制粒径和粒径分布可进一步提供和有助于优异的期需释放曲线(例如特征为Cmax与Cave比率为约3以下)和批与批之间更一致的曲线。本发明涉及用于药剂(例如生物活性多肽)缓释的组合物和形成与使用此等生物活性多肽缓释用组合物的方法。本发明缓释组合物包含生物相容性聚合物、药剂(例如生物活性多肽)和糖。优选多肽和糖分散于聚合物中。多肽和糖可分别分散或优选共同分散。缓释组合物提供期需的一致性释放曲线。在一具体实施方案中，该曲线特征为Cmax与Cave的比率为约3以下。在一优选实施方案中，该生物活性多肽为抗糖尿病多肽或葡糖调节性(glucorgulatory)多肽，例如GLP-1、GLP-2、毒蜥外泌肽-3、毒蜥外泌肽-4或其类似物、衍生物或激动剂，优选毒蜥外泌肽-4。糖类优选蔗糖、甘露醇或其组合。优选的组合包括毒蜥外泌肽-4和蔗糖和/或甘露醇。

[0011] 另外或作为选择，缓释组合物包含生物相容性聚合物、药剂(例如生物活性多肽)和糖，其中该组合物的总孔容积为约0.1ml/g以下。在具体实施方案中，总孔容积用压汞孔隙率测定法来测定。

[0012] 另外或作为选择，缓释组合物基本上由或作为选择由生物相容性聚合物、浓度约3％w/w的毒蜥外泌肽-4和浓度约2％w/w的蔗糖组成。生物相容性聚合物优选聚丙交酯乙交酯共聚物。

[0013] 本发明也包括形成生物活性药剂(例如多肽)缓释用组合物的方法，其包括通过将包含水、药剂(例如水溶性多肽)和糖的水相与包含生物相容性聚合物和该聚合物的溶剂的油相混合来形成混合物；通过例如超声处理或均化该混合物形成油包水乳剂；将硅油加入到该混合物形成初期微粒(embryonic microparticle)；将该初期微粒转移到淬灭溶剂中使该微粒硬化；收集硬化的微粒；干燥硬化微粒。在一具体实施方案中，硅油以足够量加入以达到硅油与聚合物溶剂比率约1.5∶1。另外或作为选择，聚合物以约10％w/v以下存在于油相中。

[0014] 药剂或多肽(例如毒蜥外泌肽毒蜥外泌肽4)可以最终组合物总重量的约0.01％到约10％w/w的浓度存在于本文所述组合物中。另外，糖(例如蔗糖)可以组合物最终重量的约0.01％到约5％w/w的浓度存在。

[0015] 本发明组合物可通过注射、植入(例如皮下、肌肉内、腹膜内、颅内和皮内)、粘膜给药(例如鼻内、阴道内、肺内或借助于栓剂)或原位递送(例如通过灌肠剂或气雾剂)来给予人类或其它动物。

[0016] 当缓释组合物中掺入激素(特别是抗糖尿病肽或葡糖调节性肽，例如GLP-1、GLP-2、毒蜥外泌肽3、毒蜥外泌肽4或其激动剂、类似物或衍生物)时，以有效治疗量来给予该组合物以治疗患有糖尿病、糖耐量受损(IGT)、肥胖、心血管(CV)疾病或其它可由上述多肽或其衍生物、类似物或激动剂中一种治疗的任何疾病的患者。

[0017] 在本发明缓释组合物中应用糖，可改善所掺入的生物活性多肽(例如抗糖尿病肽或葡糖调节性肽)的生物利用度，并将由于不稳定性和/或多肽与配制该缓释组合物中所含或所用的其它组分之间的化学相互作用而引起的活性损失减到最少，同时还保持优异的释放曲线。

[0018] 在一实施方案中，该组合物含有约5％的活性药剂毒蜥外泌肽4、约2％的糖和生物聚合物。在另一实施方案中，该组合物含有约3％的活性药剂毒蜥外泌肽4、约2％的糖和生物聚合物。在另一此类实施方案中，该组合物含有PLGA聚合物。在又一实施方案中，该组合物含有PLG 4A聚合物，其包含约50摩尔％DL丙交酯对50摩尔％乙交酯比率，具有未封端的游离羧酸端基(命名为“4A”)。在又一实施方案中，该组合物形成具有如本文所述粒径、粒径分布和总孔容积的微粒。在更进一步的实施方案中，该总孔容积小于约0.1ml/g，中值粒径DV50可为约50微米，其分布下限DV10为约30微米，分布上限DV90为约90微米。在又一实施方案中，该微粒通过本文所述方法形成、获得，或通过本文所述过程可获得。在一种此类实施方案中，该方法为水/油/油(“W/O/O”)法，其中内部乳滴粒径如本文所述。
另外，该方法可包括硅油凝聚物，其与聚合物溶剂之比可为约1.5比1。此外，该方法可包括如本文所述控制凝聚步骤，甚至进一步包括将凝聚物转移到内部乳剂发生在约3分钟以下、保留约1分钟以下的步骤和在不足约3分钟的时间内快速转移到淬灭/硬化溶剂中的步骤。在另一实施方案中，该溶剂为双溶剂，优选庚烷/乙醇混合物。

[0019] 在另一实施方案中，本发明组合物可进一步调配为适于通过针注射入宿主内的形式。注射用组合物包含可如本文所述存于合适粘度水性注射载体中的微粒组合物。该水性注射用载体在20℃时粘度可至少为20cp，而进一步在20℃时粘度可大于50cp和小于60cp。微粒可以大于约30mg/ml的浓度悬浮于注射用载体中形成混悬剂，混悬剂的流动相在20℃时的粘度至少为20cp。该组合物也可包含粘度增强剂、密度增强剂、张力增强剂(tonicity enhancing agent)和/或湿润剂。注射用载体粘度提供组合物通过直径约18-23号针之间的注射针的注射能力，更优选约18-25号针，甚至更优选约25号针。

[0020] 在一适于通过23号针通道的实施方案中，该注射用载体包含存于水中的3.0％(w/v)的羧甲基纤维素钠、0.9％(w/v)的氯化钠和0.1％(v/v)或任选0.5％的聚山梨醇酯20，NF(Tween 20)。该溶液任选地经过缓冲。在另一实施方案中，如上所述含依森泰德(exenatide)的微粒悬浮于注射用载体中，该载体为存于水中的3.0％(w/v)羧甲基纤维素钠、0.9％(w/v)氯化钠和0.1％(v/v)或任选0.5％聚山梨醇酯20，NF(Tween 20)。在另一实施方案中，悬浮的依森泰德-微粒浓度高于约30mg/ml。通常每毫升载体中悬浮约100-200mg干微粒。如本文所述的缓释制剂的优点包括：通过减少重复给药的需求增加患者依从性和可接受性，通过提供期需的释放曲线减少活性药剂于血液中的浓度波动来增加治疗效益，通过减少这些波动来潜在降低提供治疗效益所必需的生物活性多肽的总量。在其它实施方案、包括本文所述的组合物和方法中，该药剂为具有氨基酸取代的毒蜥外泌肽
4，其中14位的甲硫氨酸被亮氨酸取代毒蜥外泌肽。举例而言，一个实施方案为适于通过
18-23号针(更优选25号针)的、包含缓释组合物的注射用组合物，其中缓释组合物包含
50∶50 DL PLG 4A聚合物、约3-5％(w/w)具有氨基酸取代的毒蜥外泌肽4(其中14位的甲硫氨酸被亮氨酸取代)毒蜥外泌肽和约2％(w/w)蔗糖，其中Cmax与Cave的比率为约3以下，该组合物的总孔容积为约0.1ml/g以下，所述缓释组合物悬浮于包含存于水中的3.0％(w/v)羧甲基纤维素钠、0.9％(w/v)氯化钠和0.1％(v/v)聚山梨醇酯20，NF(Tween 20)的注射用载体中。

[0021] 附图简述

[0022] 图1为显示平均孔径与本文所述缓释组合物体外释放之间相互关系的图(A.S.＝硫酸铵)。

[0023] 图2为显示孔隙率对体外从微粒释放毒蜥外泌肽4的影响和处理条件也即硅油与亚甲基氯比率对所形成的微粒的孔隙率影响的图。

[0024] 图3A-3B为所选择的本文所述微粒制剂的低温SEM扫描。

[0025] 图4A-4D为所选择的本文所述微粒制剂的低温SEM扫描。

[0026] 图5为残留乙醇和二氯甲烷百分率对本文所述微粒制剂Tg所作的图。

[0027] 图6为制剂2-1(3％毒蜥外泌肽4和2％蔗糖)、制剂1(单用3％毒蜥外泌肽4)和制剂4(3％毒蜥外泌肽4和0.5％硫酸铵)的代表性药代动力学曲线(浓度(pg/ml)对时间(天数)，插图显示第一天的浓度)。

[0028] 图7为三种微粒制剂2、2-1和2-2的体内释放曲线图。

[0029] 图8为微粒制剂5-1、5-2和5-3的药代动力学数据图。

[0030] 图9图解工艺参数与用该工艺得到的内部乳滴粒径之间相互关系。

[0031] 发明详述

[0032] 本发明涉及生物活性多肽缓释用的组合物和形成及使用所述生物活性多肽缓释用的组合物的方法。本发明缓释组合物包含生物相容性聚合物、药剂(例如生物活性多肽)和糖。药剂和糖分别分散或优选共同分散于生物相容性聚合物中。在一具体实施方案中，该缓释组合物的特征为最大血清浓度(Cmax)与平均血清浓度(Cave)比率为约3以下的释放曲线。本文所用术语“a”或“an”指一个(种)或多个(种)。

[0033] 药剂

[0034] 在优选实施方案中，药剂为生物活性多肽，例如抗糖尿病多肽或葡糖调节性多肽，包括GLP-1、GLP-2、毒蜥外泌肽3、毒蜥外泌肽4或其类似物、衍生物或激动剂。最具体地说，该多肽为毒蜥外泌肽4。然而，其它药剂可利用此中所作出的发现。

[0035] 本文所用术语生物活性多肽统一指代生物活性蛋白质和肽及其药物上可接受盐，它们在体内释放时为其分子生物活性形式，由此在体内具有所需治疗、预防和/或诊断特性。通常该多肽分子量介于500与200,000道尔顿之间。

[0036] 适合的生物活性多肽包括但不限于胰高血糖素、胰高血糖素样肽(例如GLP-1、GLP-2或其它GLP类似物)、胰高血糖素样肽的衍生物或激动剂、毒蜥外泌肽(例如毒蜥外泌肽3和毒蜥外泌肽4)和其衍生物、激动剂和类似物、血管活性肠肽(VIP)、免疫球蛋白、抗体、细胞因子(例如淋巴因子、单核因子、趋化因子)、白细胞介素、巨噬细胞激活因子、干扰素、促红细胞生成素、核酸酶、肿瘤坏死因子、集落刺激因子(例如G-CSF)、胰岛素、酶(例如过氧化物歧化酶、纤溶酶原激活物等等)、肿瘤抑制剂、血液蛋白、激素和激素类似物和激动剂(例如促卵泡激素、生长激素、促肾上腺皮质激素和促黄体激素释放激素(LHRH))、疫苗(例如肿瘤抗原、细菌抗原和病毒抗原)、抗原、血凝因子、生长因子(NGF和EGF)、胃泌素、GRH、抗细菌肽例如防御素、脑啡肽、缓激肽、降钙素和所有前述物质的突变蛋白、类似物、截短、缺失和取代变体及药物上可接受盐。

[0037] 毒蜥外泌肽4为39个氨基酸的多肽。于1995年6月13日授予Eng的美国专利第5,424,286号(其整体内容在此引入作为参考)中可发现毒蜥外泌肽4的氨基酸序列。AC2993和依森泰德与术语毒蜥外泌肽4同义。业已表明毒蜥外泌肽4在人类和动物中存在浓度升高的高血糖时刺激胰岛素分泌，但在低血糖浓度(低血糖症)期间不刺激分泌。也已证明其抑制胰高血糖素分泌，减慢胃排空，影响食物摄入和体重以及其它作用。如此，毒蜥外泌肽4及其类似物和激动剂可用于治疗糖尿病、IGT、肥胖等等。

[0038] 含于缓释组合物聚合物基质中的生物活性多肽的量为有效治疗、诊断或预防的量，其可由本领域普通技术人员考虑到诸如体重、待治疗的病症、所用聚合物类型和自聚合物释放速率等因素来确定。

[0039] 缓释组合物通常含有约0.01％(w/w)-约50％(w/w)的药剂，例如生物活性多肽(例如毒蜥外泌肽4)(占组合物总重量)。举例而言，生物活性多肽(例如毒蜥外泌肽4)的量可为组合物总重量的约0.1％(w/w)-约30％(w/w)。多肽的量将视所期需效果、该药剂的效力、计划释放的水平和该多肽释放的时间间隔而定。优选负荷范围介于约0.1％(w/w)到约10％(w/w)之间，例如0.5％(w/w)到约5％(w/w)之间。当药剂(例如毒蜥外泌肽4)以约3％w/w装载时和进一步当以约4％或约5％装载时可得到优异的释放曲线。

[0040] 糖

[0041] 如本文所定义，糖为单糖、二糖或寡糖(约3到约10个单糖)或其衍生物。举例而言，单糖的糖醇为包括于本发明糖定义中的适合的衍生物。如此，举例而言，由单糖甘露糖衍生的糖醇甘露醇包括于本文所用糖定义中。

[0042] 适合的单糖包括但不限于葡萄糖、果糖和甘露糖。如本文进一步定义，二糖为通过水解产生两个单糖分子的化合物。适合的二糖包括但不限于蔗糖、乳糖和海藻糖。适合的寡糖包括但不限于棉子糖和阿卡波糖。

[0043] 缓释组合物中的糖含量可介于缓释组合物总重量的约0.01％(w/w)到约50％(w/w)范围内，例如约0.01％(w/w)到约10％(w/w)，例如约0.1％(w/w)到约5％(w/w)。掺入约2％(w/w)蔗糖可得到优异的释放曲线。

[0044] 或者，缓释组合物中的糖含量可用与药剂或生物活性多肽的重量比来表示。举例而言，多肽和糖可以约10∶1到约1∶10的重量∶重量比率存在。在尤其优选的实施方案中，多肽(例如毒蜥外泌肽4)与糖(例如蔗糖)的比率为约3∶2(w/w)、4∶2(w/w)和5∶2(w/w)。

[0045] 也可用两种或多种糖的组合。当采用组合时，糖量与上面所述范围相同。

[0046] 当多肽为毒蜥外泌肽4时，糖优选蔗糖、甘露醇或其组合。

[0047] 聚合物

[0048] 适合形成本发明缓释组合物的聚合物为生物相容性聚合物，其可为生物降解性聚合物或非生物降解性聚合物或其掺合物或共聚物。若聚合物和该聚合物的任何降解产物对接受者无毒性，且对接受者机体无明显有害或不利的作用(例如注射位点有显著免疫反应)，则该聚合物为生物相容性的。

[0049] 如本文所定义，生物降解性意指组合物将在体内降解或逐渐销蚀形成较小单位或化学物质。例如，降解可通过酶促法、化学法和物理法产生。适合的生物相容的生物降解性聚合物包括例如聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯/乙交酯共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、聚碳酸酯、聚酰胺酯、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二酸烷二酯、共聚物或聚乙二醇和聚原酸酯、生物降解性聚氨酯、其掺合物和其共聚物。

[0050] 适合的生物相容的非生物降解性聚合物包括选自以下的非生物降解聚合物：聚丙烯酸酯、乙烯/醋酸乙烯共聚物和其它酰基取代的醋酸纤维素、非降解性聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚乙烯基咪唑、聚烯烃氯磺酸酯、聚环氧乙烷、其掺合物和其共聚物。

[0051] 本发明所用聚合物的可接受的分子量可由本领域普通技术人员考虑到诸如所需聚合物的降解率、物理特性(例如机械强度)、端基化学和聚合物于溶剂中溶出率等因素来确定。通常可接受分子量范围为约2,000道尔顿到约2,000,000道尔顿。在优选实施方案中，该聚合物为生物降解性聚合物或共聚物。在更优选实施方案中，该聚合物为(丙交酯-乙交酯)共聚物(在下文中为“PLG”)，丙交酯∶乙交酯比率为约1∶1，而分子量为约10,000道尔顿到约90,000道尔顿。在甚至更优选的实施方案中，本发明所用PLG分子量为约30,000道尔顿到约70,000道尔顿的分子量，例如约50,000到约60,000道尔顿。

[0052] PLG可具酸性端基或封闭端基，例如可通过酯化该酸来得到封闭端基。用具酸性端基的PLG可得到优异的结果。

[0053] 也可根据聚合物的比浓对数粘度来选择聚合物。适合的比浓对数粘度包括约0.06-1.0dL/g，例如约0.2-0.6dL/g，更优选介于约0.3到0.5dL/g之间。选择将在3到4周内降解的优选聚合物。适合的聚合物可购自Alkermes，Inc.，商标名为 ，例如以5050 DL3A或5050 DL 4A出售的聚合物。也可用Boehringer Ingelheim
PLG，例如 RG503和503H。

[0054] 本发明的缓释组合物可形成很多形状，例如薄膜、丸状、圆柱状、盘状或微粒。如本文所定义，微粒包含直径小于约一毫米且生物活性多肽分散或溶于其间的聚合物组分。微粒可为球形、非球形或不规则形状。通常微粒大小适于注射。典型的微粒大小范围为1000微米以下。在一具体实施方案中，微粒直径介于约1到约180微米范围内。在更进一步的实施方案中，当微粒介于约1-100微米、从约30到90微米、从约50到70微米范围内时，甚至进一步中值粒径可从约50到60微米时，可获得优异的释放曲线。在一实施方案中，中值粒径不小于或等于约50、60或70微米，优选小于约80、90或100微米。在粒径较大时，优选颗粒基本上不聚集以便可通过23号针，甚至更优选25号针。在又一实施方案中，通过控制粒径分布得到一致的优异释放曲线。在一实施方案中，中值粒径为约50微米，粒径的下限和上限分别为约30和90微米。可用中值粒径(meandiameter of the volume)来描述微粒分布。中值粒径分布(mean diameterof the volume distribution)代表分布重心，是一种类型的“平均粒径”。在一实施方案中，组合物的中值粒径分布为约50-70微米，约50-60微米或约50、60或70微米，在30微米时容积分布(DV)小于或约5％、10％或15％，而在90微米时DV大于或约80％、85％、90％或95％。在一实施方案中，组合物的中值粒径分布为约60微米，在30微米时体积分布(DV)小于或约10％，而在90微米时DV大于或约
90％。

[0055] 额外的赋形剂

[0056] 尽管很可能如本领域所熟知的，可将额外赋形剂加入到本发明制剂中，但本发明令人惊奇的发现为，用本文所述的简单制剂可得到优异的释放曲线。此种额外的赋形剂可提高或降低药剂的释放速率，和/或促进药剂稳定性或药剂另外的所需特性。可显著提高释放速率的成分包括成孔剂和促进聚合物降解的赋形剂。举例而言，在非中性pH下聚合物水解速率提高。因此，可将酸性或碱性赋形剂例如无机酸或无机碱加入到用于形成微粒的聚合物溶液中，以改变聚合物的销蚀速率。可显著降低释放速率的成分包括降低药剂水溶性的赋形剂。

[0057] 所述缓释制剂的优选实施方案基本上由生物相容性聚合物、药剂和糖组成。“基本上由...组成”意即不存在显著提高从制剂释放活性药剂速率的成分。预计不显著提高或降低药剂释放速率的额外赋形剂实例包括额外的活性药剂和惰性成分。

[0058] 在又一实施方案中，制剂由生物相容性聚合物、药剂和糖组成。“由...组成”意即不存在除已列出的组分或成分和来自所述工艺的残留水平的原料、溶剂等等之外的组分或成分。

[0059] 为得到具良好以致优异生物利用度的含药剂(例如毒蜥外泌肽4)的缓释制剂，在水相中不需要诸如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或其它生物相容性缓冲剂等的缓冲剂，这一直是个令人惊异的发现。无需析出盐来控制药剂(例如毒蜥外泌肽4)的爆发释放也是个出乎意料的发现。如此，如本文所述，本发明组合物也包括基本上(或完全)不存在缓冲剂和/或析出盐的组合物。

[0060] 作为选择或另外地，本发明缓释组合物具低孔隙率。在此等实施方案中，缓释组合物包含生物相容性聚合物、生物活性多肽和糖，其中该组合物总孔容积为约0.1ml/g以下。另外，总孔容积可从0.0到0.1ml/g和从0.01到小于0.1ml/g。已发现这种极小的总孔容积引起药剂的小量初始爆发释出(释放)，且进一步促进比常规制剂更慢和/或更长的缓释曲线，使得可以在曲线中将Cmax时间后移。在特定实施方案中，总孔容积用例如下文所详述的压汞孔隙率测定法来测定。

[0061] 在另一实施方案中，当缓释组合物具如本文所述的低孔隙率时(其既起降低初始释放的作用，又起提供具有所希望的Cmax与Cave比率的较长时间缓释的作用)，可存在额外赋形剂。此等赋形剂优选对释放速率具很小影响或基本上无影响。此等赋形剂可包括在制备、贮存或释放期间提供或增强药剂稳定性的赋形剂。适合的稳定剂包括例如碳水化合物、氨基酸、脂肪酸和表面活性剂，这些是本领域技术人员所知晓的。此外，稳定剂包括“抗氧化剂”，例如甲硫氨酸、维生素C、维生素E和马来酸。抗氧化剂可作为稳定水性制剂的部分存在或加入到聚合物相中。此外，可加入pH缓冲液。缓冲液为含有弱酸和该酸有关盐或者弱碱和该碱有关盐的溶液。在制备、贮存或释放的任一阶段，缓冲液可维持所需pH以稳定制剂。举例而言，缓冲液可为一碱价磷酸盐或二碱价磷酸盐或其组合或者挥发性缓冲液例如碳酸氢铵。其它缓冲液包括但不限于乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐和氨基酸，例如甘氨酸、精氨酸和组氨酸。缓冲液可以总重量的约0％到约10％存在于制剂中，优选低于约10、15、20、25或30mM。鉴于本文所述的本发明微粒的令人惊奇的新物理方面和新制备方法，相信即使在存在影响释放速率的赋形剂时，本发明也可提供新的微粒和方法。微粒的新特性可抵消或降低必需赋形剂(例如稳定盐)的不想要的释放作用。在另一实施方案中，赋形剂以显著影响释放速率的水平存在，以进一步增强所需释放曲线。

[0062] 给药

[0063] 本发明组合物通常可按照本领域通常所知方法给药。可通过注射、植入(例如皮下、肌内、腹膜内、颅内和皮内)、粘膜给药(例如鼻内、阴道内、肺内或借助栓剂)、口服、通过无针注射(例如参见美国专利第5312335号和第5630796号，其在此引入作为参考)或原位递送(例如通过灌肠剂或气雾剂)将本发明组合物给予患者(例如需要该药剂的人类)或其它动物。

[0064] 可用在所需时间内达到所需治疗水平的任何给药时间表给予该缓释组合物。举例而言，可给予缓释组合物，监测患者直到所递送的药物水平回到基线。回到基线后，可再次给予缓释组合物。或者，可在患者体内达到基线水平前序惯给予缓释组合物。

[0065] 举例而言，当缓释组合物其中掺入激素、特别是抗糖尿病肽或葡糖调节性肽，例如GLP-1、GLP-2、毒蜥外泌肽3、毒蜥外泌肽4或其激动剂、类似物或衍生物时，以有效治疗量来给予该组合物以治疗患有糖尿病、IGT、肥胖、心血管(CV)疾病或可由上述多肽或其衍生物、类似物或激动剂之一治疗的其它任何疾病的患者。

[0066] 可通过给予本发明缓释组合物治疗的其它病症包括I型和II型糖尿病，其可用其中掺入胰岛素的缓释组合物治疗。另外，当掺入的多肽为FSH或其类似物时，该缓释组合物可用于治疗不育症。在其它实例中，当所掺入多肽为β干扰素或其突变蛋白时，缓释组合物可用于治疗多发性硬化症。正如可认识到的，缓释组合物可用于治疗对给予特定多肽有反应的疾病。

[0067] 在另一实施方案中，本发明缓释组合物可与皮质类固醇一起给予。本发明缓释组合物与皮质类固醇一起给予可进一步提高缓释组合物中生物活性多肽的生物利用度。皮质类固醇与缓释组合物的联合给药详述于Dasch等的美国专利申请第60/419,430号中，其题目为“Method of Modifying the Release Profile of Sustained ReleaseCompositions”，其整体内容在此引入作为参考。

[0068] 本文所定义的皮质类固醇指类固醇类抗炎性剂，也称为糖皮质激素。

[0069] 适合的皮质类固醇包括但不限于21-乙酰氧孕烯诺龙、阿氯米松(Alclometasone)、阿 尔 孕 酮(Algestone)、安 西 奈 德(Amcinonide)、倍 氯 米 松(Beclomethasone)、倍 他米松(Betamethasone)、布地 奈德(Budesonide)、氯泼 尼松(Chloroprednisone)、氯 倍他 索(Clobetasol)、氯 倍他 松(Clobetasone)、氯 可托龙(Clocortolone)、氯泼尼醇(Cloprednol)、皮质酮(Corticosterone)、可的松(Cortisone)、可的伐唑(Cortivazol)、地夫可特(Deflazacort)、地奈德(Desonide)、去羟米松(Desoximetasone)、地塞米松(Dexamethasone)、二氟拉松(Disflorasone)、二氟可龙(Diflucortolone)、二氟泼尼酯(Difluprednate)、甘草次酸(Enoxolone)、氟扎可特(Fluazacort)、氟氯奈德(Flucloronide)、氟米松(Flumethasone)、氟尼缩松(Flunisolide)、氟轻松(FlucinoloneAcetonide)、醋酸氟轻松(Fluocinonide)、氟可丁丁酯(Fluocortin Butyl)、氟可龙(Flucortolone)、氟米龙(Fluorometholone)、醋酸氟培龙(Fluperolone Acetate)、醋酸氟泼尼定(Fluprednidene Acetate)、氟泼尼龙(Fluprednisolone)、氟氢缩松(Flurandrenolide)、丙酸氟替卡松(Fluticasone Propionate)、福莫可他(Formocortal)、哈西奈德(Halcinonide)、丙酯卤倍他素(Halobetasol Propionate)、卤米松(Halometasone)、醋酸卤泼尼松(Halopredone Acetate)、氢可他酯(Hydrocortamate)、氢化可的松(Hydrocortisone)、氯替泼诺碳酸乙酯(Loteprednol Etabonate)、马泼尼酮(Mazipredone)、甲羟松(Medrysone)、甲泼尼松(Meprednisone)、甲泼尼龙(Methylprednisolone)、糠酸莫米松(Mometasone Furoate)、帕拉米松(Paramethasone)、泼尼卡酯(Prednicarbate)、泼尼松龙(Prednisolone)、泼尼松龙25-二乙氨基-醋酸酯(Prednisolone 25-Diethylamino-acetate)、泼尼松龙磷酸钠(Prednisolone Sodium Phosphate)、泼尼松(Prednisone)、强的松龙戊酸酯(Prednival)、泼尼立定(Prednylidene)、利美索龙(Rimexolone)、替可的松(Tixocortol)、曲安西龙(Triamcinolone)(所有形式)，举例而言，曲安奈德(Triamcinolone Acetonide)、曲安奈德21-oic acid甲酯(Triamcinolone Acetonide 21-oic acid methyl ester)、苯曲安奈德(Triamcinolone Benetonide)、己曲安奈德(TriamcinoloneHexacetonide)、双醋曲安西龙(Triamcinolone Diacetate)、其药学上可接受混合物和其盐及其任何其它衍生物和类似物。

[0070] 在一实施方案中，皮质类固醇可共同掺入到包含生物相容性聚合物和掺入其中的生物活性多肽药剂的缓释组合物中。

[0071] 在另一实施方案中，皮质类固醇可单独掺入到第二生物相容性聚合物中。该第二生物相容性聚合物可与其中已掺入生物活性多肽药剂的第一生物相容性聚合物相同或不同。

[0072] 在又一实施方案中，皮质类固醇可以非封装状态而是与缓释组合物混合存在。举例而言，皮质类固醇可溶于用于递送缓释组合物的载体中。或者，皮质类固醇可以悬浮于合适载体中的固态存在。此外，皮质类固醇可以与缓释组合物混合的粉末存在。

[0073] 应该理解，皮质类固醇以足够提高来自缓释组合物的生物活性多肽的生物利用度的量存在。生物利用度提高是指，与给药时不存在皮质类固醇的情况相比，当与皮质类固醇共同给药时，在从给药后2天开始和并于所述具体制剂释放周期结束时结束的期间，来自缓释组合物的生物活性多肽的生物利用度的提高。

[0074] 本文所用术语患者是指人类，例如需要该药剂或治疗方法、预防方法或诊断方法的人类。

[0075] 如本文所定义，生物活性多肽的缓释是从本发明缓释组合物释放该多肽，释放发生的时间比直接给予该多肽溶液后存在可利用的生物学显著量的时间长。优选缓释为释放发生时间至少约1周，例如至少约2周，至少约3周或至少约4周。缓释可为连续释放或不连续释放，释放速率相对恒定或有变化。所用聚合物组成的类型(例如单体比率、分子量、嵌段组合物和聚合物的不同组合)、多肽负荷和/或为产生所需效果的赋形剂选择可影响释放的连续性和释放水平。

[0076] 本文所用术语治疗量有效、预防有效量或诊断有效量为给药后引起所需生物学反应所需要的缓释组合物的量。

[0077] 本文所用术语Cmax为在所监测的释放期间所出现的最大血清药物浓度。

[0078] 本文所用术语Cave为通过释放曲线的曲线下面积(AUC)除以释放时间得到的平均血清药物浓度。

[0079] 优选Cmax与Cave的比率为约3以下。例如，这种曲线对于诸如上述的抗糖尿病多肽或葡糖调节性多肽尤其需要。约3以下比率可在治疗窗内提供Cave，同时避免由较高比率可能产生的不利药物副作用。此外，如本文所述，业已发现通过控制缓释组合物的物理外观，可得到和控制所需的优异释放曲线的其它所需特性。该方法可提供并且本发明组合物可具有优异的降低的爆发释放(即初始释放；例如0-1天时的Cmax)。在一实施方案中，初始爆发释放小于总药剂的约1％。在另一实施方案中，初始释放小于约0.75％，进一步小于约0.5％。在这方面Cmax与Cave比率小于约3，另外可为约1到3，进一步可为约2到3。此外，若存在Cmax，则Cmax可移到在爆发释放或初始释放期外的缓释期的某个时间，移到释放“缓释期(sustained phase)”。在一实施方案中，Cmax可在给药后至少7、14、21、28、35或42天出现，且可出现在其间的任何整数天。在进一步的实施方案中，Cmax为给药后约21-35天，在另一进一步实施方案中为给药后约28到31天，进一步为约28天。在另一实施方案中，最大药物浓度(例如血浆浓度)出现在给药后至少7、14、21、28、35或42天，且可出现在其间的任何整数天。在又一实施方案中，最大药物浓度出现在给药后约21到35天，尤其是在葡糖调节性药剂例如毒蜥外泌肽4、GLP-1、GIP或其类似物情况下。

[0080] 本发明组合物的优异缓释曲线使得可用这样一种方法给药：通过降低不想要的高初始爆发释放，以避免不想要的(副)作用(例如恶心)的剂量给予一种或多种活性药剂。此外，该优异的缓释曲线使得可用以一定剂量给予一种或多种活性药剂的方法，其中所述剂量低于有效治疗量，但在多次缓释给药后，可达到患者中的有效治疗浓度。然后通过进一步持续给药可容易地保持该浓度。由本发明实现的这种治疗方法的一个优点是，通过降低不想要的药物高爆发释放，进一步通过让患者适应浓度逐渐增加的所述药剂，可降低或消除不想要的(副)作用，例如恶心。因此，在一实施方案中，提供多次缓释给药以使每一次连续给药增加患者中所述药剂的浓度，其中该患者体内可得到有效治疗浓度的所述药剂。在另一实施方案中，施行各剂量连续缓释给药，以便该剂量的缓释期与前一剂量的缓释期重叠。此外，某一剂量的Cmax或其最大药剂浓度可与前一剂量的药剂Cmax或最大浓度重叠。

[0081] 本文所用术语生物利用度是指到达循环系统的治疗药的量。生物利用度可定义为计算出的特定多肽在给药后开始和于预定时间点结束期间释放曲线的曲线下面积(AUC)。如本领域所理解，通过用预定时间点(X-轴)时受试者生物活性药剂的血清水平(Y轴)作图可产生释放曲线。通常生物利用度以％生物利用度来表示，其为给予缓释组合物后得到的特定多肽的生物利用度，除以静脉给予同样剂量药物后得到的特定多肽的生物利用度，再乘以100。

[0082] 通过适当药代动力学监测患者血清中生物活性多肽药剂的存在情况，可确证对该释放曲线的修正。举例而言，如本领域所熟知的基于特异性抗体的测定(例如，ELISA和IRMA)，可用于测定患者血清中某些生物活性多肽的浓度。此测试的实例如本文所述为毒蜥外泌肽4。

[0083] 为监测药剂对患者的治疗作用对患者进行药效学监测可用于确证所释放药剂生物活性的保留。可根据待给予的生物活性多肽药剂，使用广泛可用的技术，来选择监测药效学效果的方法。

[0084] 制备

[0085] 已知有大量方法可形成本发明缓释组合物(聚合物/生物活性多肽基质)，尤其是本文所述具低孔隙率的组合物。工作实施例中阐明了形成微粒的某些方法的详细步骤。在优选实施方案中，形成生物活性多肽缓释用组合物的本发明方法包括：通过将包含水、药剂(例如水溶性多肽)和糖的水相与包含生物相容性聚合物和该聚合物的溶剂的油相混合来形成混合物；形成油包水乳剂；将凝聚剂(如硅油、植物油或矿物油)加入到该混合物形成初期微粒；将该初期微粒转移到淬灭溶剂中以使该微粒硬化；收集硬化的微粒；干燥硬化的微粒。该方法在本文中通常称为油包油包水法(W/O/O)。

[0086] 优选聚合物可以约3％w/w到约25％w/w的浓度范围存在于油相中，优选该范围为约4％w/w到约15％w/w，例如约5％w/w到约10％w/w。本文用油相中6％w/w浓度的PLG得到优异的结果。

[0087] 聚合物通常与聚合物溶剂混合。若聚合物为PLG(例如本文优选的那些实例)，则将该聚合物加入到PLG溶剂中。此等溶剂在本领域中众所周知。优选溶剂为二氯甲烷。

[0088] 将药剂和糖加入到水相中，优选加入到同一水相。优选药剂浓度为10-100mg/g，优选介于50到100mg/g之间。优选糖浓度为10-50mg/g和30-50mg/g。

[0089] 然后将这两相混合形成乳剂。优选该乳剂的形成使内部乳滴粒径小于约1微米，优选小于约0.7微米，更优选小于约0.5微米，例如约0.4微米。此外，内部乳滴粒径可为约0.1到1.2微米，甚至进一步可为约0.1-1.0微米，再进一步可为约0.2-0.4微米。下限很大部分是根据将聚合物降解(例如由于剪切)或药剂降解(例如由于乳剂形成期间产生的热)减少到最小的需要来决定。因此，在一实施方案中，间歇和/或相对短时间内施用形成乳剂的方法(例如通过均化、通过高剪切或通过超声处理)，以便例如使乳剂中形成的热最少和/或让其消散。举例而言，通过使整体乳剂多次不连续通过(discrete passes)可实施均化。可用超声波破碎仪和均化器形成这种乳剂。

[0090] 本文所用术语凝聚剂是指聚合物溶液(聚合物和溶剂)不易溶解于其中因此与聚合物溶液形成不同相的任何油。用于本发明的适合的凝聚剂包括但不限于硅油、植物油和矿物油。在具体实施方案中，凝聚剂为硅油，将其以足够达到硅油与聚合物溶剂比率为约0.75∶1到约2∶1的量加入。在具体实施方案中，硅油与聚合物比率为约1∶1到约1.5∶1。在优选实施方案中，硅油与聚合物比率为约1.5∶1。其它凝聚剂比率预期相似，或可用上述比率作为起始点进一步详细地确定。

[0091] 在一实施方案中，凝聚步骤包括将凝聚剂加入(或转移)到乳剂约1-5分钟时间，或相反，将乳剂加入(或转移)到凝聚剂中，进一步加入或转移步骤可为约2-4分钟，甚至进一步可为约3分钟。在又一实施方案中，加入或转移步骤为不足或等于约1、约2、约3或约3.5分钟。在另一实施方案中，当加入或转移步骤如本文所述控制时，凝聚剂如本文所述为硅油。在又一实施方案中，凝聚剂体积与聚合物溶剂体积比如本文所述，例如约1.5比1(例如硅油比二氯甲烷)。在更进一步的实施方案中，内部乳剂可的滴径小于约1微米，又可进一步为如本文所述的滴径。在一实施方案中，药剂为葡糖调节性肽，例如毒蜥外泌肽4、GLP1、GIP或其类似物，甚至进一步可以本文所述浓度装量。在又一实施方案中，聚合物为本文所述的PLGA，优选约50∶50丙交酯比乙交酯形式。在一实施方案中，聚合物溶液或在凝聚前包含乳剂的水溶液中的任一种或两者都可含有所需的赋形剂。

[0092] 凝聚步骤可进一步包括保持期，其中在进行硬化步骤之前，将凝聚剂和乳剂的混合物保持较短时间，如约1分钟到约5分钟。另外，保持期可为约30-90秒，甚至进一步可为约1分钟。此外在其它实施方案中，保持期可以是任选的，可以小于1分钟，进一步可为小于30秒。在另一实施方案中，处理凝聚混合物以预防水/油/油组分分离或将水/油/油组分分离减少到最小。此处理可借助任何手段，包括例如搅拌、均化、搅动、超声处理、混合、振摇和加压。无论其为微粒还是其它形状，选择条件以便将组合物组分的降解(包括初期聚合物/药剂组合物的破坏)减少到最小。

[0093] 凝聚步骤进一步包括将凝聚混合物转移到淬灭或硬化溶液中。淬灭可包含聚合物非溶剂。聚合物非溶剂一般为本领域所熟知。特别优选的淬灭包含硬化溶剂和洗涤溶剂的溶剂混合物，例如庚烷/乙醇溶剂系统，举例而言如美国专利第6,824,822号所述，其在此引入作为参考。该转移步骤可尽可能快地立即发生，在进一步的实施方案中可短于约0.5、1、2、3或4分钟。

[0094] 使用上述方法的改良形式也可将固态药物包胶。该改良形式可称为固体/油/油(S/O/O)。

[0095] 举例而言，将固态毒蜥外泌肽4悬浮于含有6％PLG的二氯甲烷中，在冰上超声约4分钟。随后以类似于W/O/O方法的方式来进行处理。

[0096] 在一实施方案中，组合物含有约5％活性药剂毒蜥外泌肽4、约2％糖和生物聚合物。在另一实施方案中，组合物含有约3％活性药剂毒蜥外泌肽4、约2％糖和生物聚合物。在另一此类实施方案中，组合物含有PLGA聚合物。在又一实施方案中，组合物含有PLG 4A聚合物，其包含约50摩尔百分比DL丙交酯与50摩尔百分比乙交酯比率，且具有未封端的游离羧酸端基(用“4A”表示)。在又一实施方案中，组合物形成具如本文所述粒径、粒径分布和总孔容积的微粒。在更进一步的实施方案中，总孔容积小于约0.1ml/g，中值粒径可为约50微米，分布下限为约为30微米，而上限为约为90微米。在又一实施方案中，可通过本文所述方法形成、得到微粒，或通过本文所述方法可得到所述微粒。在一此类实施方案中，该方法为水/油/油(“W/O/O”)方法，其中内部乳滴粒径如本文所述。另外，该方法可包括硅油凝聚层，其与聚合物溶剂比率可为约1.5比1。此外，该方法可包括如本文所述控制凝聚步骤，再进一步，其中凝聚层转移到内部乳剂发生在约3分钟以下，保留步骤为约1分钟以下，经不足约3分钟的快速转移步骤转移到淬灭/硬化溶剂中。在另一实施方案中，溶剂为双溶剂，优选庚烷/乙醇混合物。

[0097] 在另一实施方案中，本发明组合物可进一步调配为适于通过针注射入宿主内的形式。注射用组合物可包含存于粘性水性注射用载体中的本文所述的微粒组合物，举例而言，如美国专利第6,495,164号所述，该文献在此引入作为参考。该水性注射用载体在20℃时粘度可至少为20cp，进一步在20℃时粘度可大于50cp和小于60cp。微粒可以大于约30mg/ml的浓度悬浮于注射用载体中形成混悬剂，混悬剂的流动相在20℃时的粘度至少为20cp。在其它实施方案中，混悬剂的流动相在20℃时粘度至少为约30cp、40cp、50cp和60cp。该组合物也可包含粘度增强剂、密度增强剂、张力增强剂和/或湿润剂。注射用载体的粘度提供组合物通过直径介于18-23号针范围内的注射针的注射能力，更优选通过25号针。如本领域技术人员所知，18号常规壁(RW)针的额定内径(ID)为0.033英寸，而22号正规壁针的额定内径为0.016英寸。注射用载体可含有粘度增强剂。在一实施方案中，粘度增强剂为羧甲基纤维素钠，尽管也可使用其它适合的粘度增强剂。注射用载体也可包含增加注射用载体密度的密度增强剂。在另一实施方案中，密度增强剂为山梨醇，尽管也可使用其它适合的密度增强剂。注射用载体也可含有调整张力以排除毒性问题和改善生物相容性的张力调节剂。尽管也可使用其它适合的张力调节剂，但优选的张力调节剂为氯化钠。注射用载体也可包含确保注射用载体完全湿润微粒的湿润剂。湿润剂包括聚山梨醇酯20(Tween20)、聚山梨醇酯40(Tween 40)和聚山梨醇酯80(Tween 80)。

[0098] 微粒可以大于约30mg/ml的浓度悬浮于注射用载体中。在一实施方案中，微粒以约150mg/ml-约300mg/ml的浓度悬浮。在另一实施方案中，微粒以约100mg/ml-约400mg/ml的浓度悬浮。然而，应该理解本发明并不限于具体浓度。

[0099] 在一适于通过23号针的实施方案中，注射用载体包含存于水中的3.0％(w/v)的羧甲基纤维素钠、0.9％(w/v)的氯化钠和0.1％(v/v)或任选0.5％的聚山梨醇酯20，NF(Tween 20)。该溶液任选地可经过缓冲。在另一实施方案中，如上所述含依森泰德的微粒悬浮于注射用载体中，该载体为存于水中的3.0％(w/v)的羧甲基纤维素钠、0.9％(w/v)的氯化钠和0.1％(v/v)或任选0.5％的聚山梨醇酯20，NF(Tween 20)。在另一实施方案中，悬浮的依森泰德-微粒浓度大于约30mg/ml。通常每毫升载体中悬浮约100-200mg干微粒。

[0100] 在本发明的其它实施方案中，将发现于公开说明书WO2004036186(2004年4月29日公开)中的特定微粒排除在外。更具体地说，排除那些不含显著影响释放的量的硫酸铵的微粒。此等特定微粒包括那些称为IF-1、IF-2、IF-3、IF-4、M1到M4、M7-M14、M18、M19的微粒。

[0101] 本发明现在将通过下列实施例进一步具体阐述。

[0102] 实施例

[0103] 微粒制剂I

[0104] 通过相分离法来制备本文所述缓释组合物。以下描述制备1公斤批次规模的含有毒蜥外泌肽4和蔗糖的微粒的通用方法。

[0105] A.内部油包水乳剂的形成

[0106] 借助于均化器制造油包水乳剂。适合的均化器包括在线(in-line)Megaton均化器MT-V 3-65F/FF/FF，Kinematica AG，Switzerland。通过将毒蜥外泌肽4和赋形剂例如蔗糖溶于水来制备乳剂水相。所得溶液中的药物浓度可为约50mg/g-约100mg/g。举例而言，当药物为毒蜥外泌肽4时，溶液中的药物浓度可为每600g水约30g-约60g。在一具体实施方案中，50g毒蜥外泌肽4和20g蔗糖溶于600g冲洗用水(WFI)中。上列指定量表示额定负荷，不进行为针对所用毒蜥外泌肽4批次补充肽含量浓度的调整。通过将PLGA聚合物(例如930g纯化50∶50 DL4A PLGA(Alkermes，Inc.)溶于二氯甲烷(14.6kg或6％w/w)来制备乳剂油相。

[0107] 然后将该水相加入到该油相中，用悬挂式混合器(overhead mixer)处理约3分钟形成粗制乳剂。然后在环境温度下以大约21300rpm将粗制乳剂均化3个不连续的时期。这导致内部乳滴粒径小于1微米。不言而喻，可用任何适合的手段完成内部乳剂的形成。乳剂形成的适合手段包括但不限于上述均化和超声处理。

[0108] B.凝聚层形成

[0109] 然后通过在约5分钟时间内将硅油(21.8kg二甲硅油，NF，350cs)加入到内部乳剂中来实施凝聚步骤。这相当于1.5∶1的硅油与二氯甲烷比率。来自聚合物溶液的二氯甲烷分配到硅油中，开始在含毒蜥外泌肽4的水相周围沉淀该聚合物，引起微囊化。如此形成的初期微球体是软的，需要硬化。通常让初期微球体在进行微球体硬化步骤之前静置一段短时间，例如从约1分钟到约5分钟。

[0110] C.微球体硬化和漂洗

[0111] 然后将初期微球体立即转移到庚烷/乙醇溶剂混合物中。所需的庚烷/乙醇混合物体积可基于微球体批料规模来确定，通常以16∶1的二氯甲烷与庚烷/乙醇溶剂比率。在本实施例中，在3℃的冷却搅拌槽中使用约210kg庚烷和23kg乙醇。该溶剂混合物通过从微球体萃取额外的二氯甲烷来硬化微球体。此硬化步骤也可称为淬灭。在3℃淬灭1小时后，在3℃轻轻倒出该溶剂混合物，并加入新鲜庚烷(13kg)，且保持1小时以冲洗掉微球体表面的残留硅油、乙醇和二氯甲烷，或直接跳到收集步骤。

[0112] D.微球体干燥和收集

[0113] 在淬灭或倾倒/洗涤步骤结束时，转移微球体，在12”SwecoPharmasep过滤器/干燥器PH12Y6型上收集。该过滤器/干燥器使用20微米的多层收集筛，并连接到在收集和干燥期间振荡该筛的电动机上。用庚烷(3℃6公斤)实施最后漂洗，以确保最大限度的在线转移并除去任何多余的硅油。然后其按下列方案在真空下受控速率用恒定氮气吹扫干燥微球体：3℃6小时；6小时慢慢上升到41℃；41℃84小时。

[0114] 在完成干燥后，将微球体排放到收集容器中，通过150微米筛来筛分，贮存于约-20℃直至填充使用。

[0115] 对于此中所制备的所有微粒制剂而言，所制备的制剂中多肽(例如毒蜥外泌肽4)和赋形剂的含量以占该缓释组合物最终重量的％(w/w)来表示。除非指出，否则％(w/w)为额定百分数。

[0116] 微粒制剂II

[0117] A.内部油包水乳剂形成

[0118] 借助于超声破碎仪制造油包水乳剂。适合的超声破碎仪包括Vibracell VCX 750，带CV33型探头，Sonics and Materials Inc.，Newtown，CT。通过将毒蜥外泌肽4和赋形剂例如蔗糖溶于水来制备乳剂水相。所得溶液中的药物浓度可为约50mg/ml-约100mg/ml。举例而言，当药物为毒蜥外泌肽4时，溶液中的药物浓度可为每65.5g水约3.28g-约6.55g。在一具体实施方案中，5.46g毒蜥外泌肽4和2.18g蔗糖溶于65.5g冲洗用水或WFI中。为了补偿组分通过过滤除菌时的损失，上列指定量表示超过目标负荷的4％。通过将PLGA聚合物(例如97.7g纯化50∶50 DL4A PLGA(Alkermes，Inc.)溶于二氯甲烷(1539g或6％w/w)来制备乳剂油相。

[0119] 然后经约3分钟将水相加入到油相中，同时在环境温度下以100％振幅超声处理。以5psig下通过具有1”HPLC管端(ID＝20/1000”)的1/4”不锈钢管泵入水相，将其加入到超声探头下的超声区内。然后以1400-1600rpm搅拌反应器，另外以100％振幅超声超声处理2分钟，接着停30秒，然后再超声处理1分钟。此导致内部乳滴粒径小于0.5微米。不言而喻，可用任何适合的手段完成内部乳剂的形成。乳剂形成的适合手段包括但不限于上述超声处理和均化。

[0120] B.凝聚层形成

[0121] 然后通过经约3-5分钟时间将硅油(2294g二甲硅油，NF，350cs)加入到内部乳剂中来实施凝聚步骤。这相当于1.5∶1的硅油与二氯甲烷比率。来自聚合物溶液的二氯甲烷分配到硅油中，开始在含毒蜥外泌肽4的水相周围沉淀该聚合物，引起微囊化。如此形成的初期微球体是软的，需要硬化。通常让初期微球体在进行微球体硬化步骤之前静置一段短时间，例如从约1分钟到约5分钟。

[0122] C.微球体硬化和漂洗

[0123] 然后将初期微球体立即转移到庚烷/乙醇溶剂混合物中。所需的庚烷/乙醇混合物体积可基于微球体批料规模来确定。在本实施例中，在3℃的冷却搅拌槽(350-450rpm)中使用约22kg庚烷和2448g乙醇。该溶剂混合物通过从微球体萃取额外的二氯甲烷来硬化微球体。此硬化步骤也可称为淬灭。在3℃淬灭1小时后，在3℃轻轻倒出该溶剂混合物，并加入新鲜庚烷(13kg)，且保持1小时以冲洗掉微球体表面的残留硅油、乙醇和二氯甲烷。

[0124] D.微球体干燥和收集

[0125] 在漂洗步骤结束时，转移微球体，在锥形干燥室内的6”直径的20微米多层筛(用作死端式过滤器)上收集。用庚烷(4℃6公斤)实施最后漂洗，以确保最大限度的在线转移。然后按下列方案在受控速率下用恒定氮气吹扫干燥微球体：3℃18小时；25℃24小时；35℃6小时；38℃42小时。

[0126] 在完成干燥后，将微球体排放到连接至干燥锥室的特氟隆/不锈钢灭菌收集容器中。密封该收集容器，移出干燥锥室，贮存于约-20±5℃直至填充使用。取拆卸清洁时残留在锥室的物质进行药物含量分析。产量为大约100g微球体。

[0127] 对于此中所制备的所有微粒制剂而言，所制备的制剂中多肽(例如毒蜥外泌肽4)和赋形剂的含量以占该缓释组合物最终重量的％(w/w)来表示。除非指出，否则％(w/w)为额定百分数。

[0128] 聚合物：

[0129] 适于使用的具体PLG聚合物实例如下所列。下列实施例所用的所有聚合物示于此清单中，所有列出的聚合物都来自Cincinnati，OH的Alkermes，Inc.，可如下所述：

[0130] 聚合物2A：(丙交酯-乙交酯)共聚物；50∶50的丙交酯∶乙交酯比率；12.3kD分子量；IV＝0.15(dL/g)。

[0131] 聚合物4A：(丙交酯-乙交酯)共聚物；50∶50的丙交酯∶乙交酯比率；分子量为45-64kD；IV＝0.45-0.47(dL/g)。

[0132] PLG的纯化：本领域中已知(例如参见，Lucke等的PeptideAcylation by Poly(α-Hydroxy Esters)，Pharmaceutical Research，Vol.19，No.2，p.175-181，February 2002)，由于与PLG的降解产物或聚合物制备后残留的杂质相互作用，掺入PLG基质中的蛋白质和肽可被不想要地改变(例如，降解或化学修饰)。如此，在制备缓释组合物之前，用本领域公认的纯化方法纯化制备本文所述的大部分微粒制剂所用的PLG聚合物。

[0133] 表征方法：

[0134] 已确定下列表征方法适于鉴别将提供所需活性药剂的释放曲线的微粒。

[0135] SEM

[0136] 用SEM评估微粒的粒径、形态和表面特性。在 系统(ASPEXTM，LLC)上实施SEM成像。所有样品都通过抹刀沉积到覆有碳素双面磁带的标准SEM棒上。用Model SC 7620“微型”喷镀仪(Sputter Coater，Energy Beam Sciences)在18mA发射电流下将样品用Au喷镀约90秒。用20KeV电子束在放大倍数为大约250-2500X范围内实施所有SEM成像。

[0137] 低温SEM

[0138] 用低温SEM研究微粒横截面。将微粒样品与 溶液(Fischer)混合，于-20℃过夜保存于低温恒温器中。将硬化微粒固定于玻璃盖玻片上，然后用金属刀切片。将切片的粒子固定于用铂和钯喷镀的铝棒上，在扫描电镜(Phillips 525M)下观察。切片的目测观察提供了测定微粒孔隙率程度的方法。

[0139] 孔隙率测量-压汞法

[0140] 用SutoPor IV 9500Moden型压汞孔率计(Micromeritics，Norcross，GA)测定微粒的孔容积分布。简言之，通过逐步加压的方式施加高至最大压力为60,000Psia，将汞强压入透度计内已知量的微粒中。测量各种压力下压入到孔中的汞体积。该方法定量测定微粒的孔分布。也就是说，被压入孔的孔径与所施压力负相关。可用Washburn方程来阐述液-固-汽体系上内力和外力的平衡。所施压力与压汞孔径之间的关系由下式阐述：

[0141]

[0142] 其中：D＝孔径

[0143] γ＝表面张力(常数)

[0144] θ＝接触角(常数)

[0145] P＝压力

[0146] 因此，汞压入孔径与所施压力成反比。假定所有孔为密封的圆柱体，可通过孔容积(V＝πD2h/4)除以孔面积(A＝πDh)来计算平均孔径(D＝4V/A)。

[0147] 残留溶剂

[0148] 用一种方法定量庚烷、乙醇和二氯甲烷。设备由带有Rtx 1301，30cm×0.53mm柱的HP 5890 Series 2气相色谱仪组成。将约130mg微粒溶于10ml N，N-二甲基酰胺中。乙酸丙酯用作内标。调节样品制剂以便可定量低至0.03％浓度的二氯甲烷。

[0149] 微粒制剂

[0150] 表1中列出的微粒批料以100g规模如上所述制备，其使用4A聚合物和比率为1.5∶1或1∶1的硅油与二氯甲烷，硅油粘度为350cs。制剂中毒蜥外泌肽4和赋形剂的用量也在表1中列出。

[0151] 表1

[0152]批号# 制剂 体外爆发 备注
释放(％)
02-019-147(#1) 0％蔗糖，0％AS 0.40 1.5∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-167(#2) 2％蔗糖(F16) 0.40 1.5∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-160(#2-1) 2％蔗糖(F16) 0.44 1.5∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-164(#2-2) 2％蔗糖(F16) 0.45 1.5∶1 Si Oil∶MeCl2
02-030-08(#2-3) 2％蔗糖(F16) 0.80 1∶1 Si Oil∶MeCl2
02-030-01(#2-4) 2％蔗糖(F16) 1.0 1∶1 Si Oil∶MeCl2
02-030-04(#2-5) 2％蔗糖(F16) 1.1 1∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-136(#3-1) 2％蔗糖，0.5％AS(F14) 1.3 50∶50淬灭
02-019-115(#3-2) 2％蔗糖，0.5％AS(F14) 2.2 1.5∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-170(#4) 0％蔗糖，0.5％AS 3.8 1.5∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-133A(#3-3) 2％蔗糖，0.5％AS(F14) 12.7 100％庚烷淬灭
02-019-185(#5) 2％蔗糖(F17) 0.5 5％药物负荷，
(5％药物负荷) 1.5∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-64(#-4) 2％蔗糖，0.5％AS(F14) 0.5 1.5∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-10(#3-5) 2％蔗糖，0.5％AS(F14) 1.30 1∶1 Si Oil∶MeCl2
02-001-196(#3-6) 2％蔗糖，0.5％AS(F14) 2.70 1∶1 Si Oil∶MeCl2
02-019-24(#3-7) 2％蔗糖，0.5％AS(F14) 6.70 1∶1 Si Oil∶MeCl2[0153] *除了#5外所有制剂药物的负荷为3％

[0154] 孔隙率

[0155] 获自压汞孔隙率测定法的总压入体积和所计算的平均孔径示于表2中。平均孔径与体外释放之间的关系示于图1中。

[0156] 表2

[0157]批号# 总孔容积(mL/g) 体外爆发释放(％) 平均孔径(μm)
02-019-147(#1) 0.033 0.40 0.0068
02-019-167(#2) 0.035 0.40 0.0069
02-019-160(#2-1) 0.037 0.44 0.0070
02-019-164(#2-2) 0.035 0.45 0.0070
02-030-08(#2-3) 0.036 0.80 0.0070
02-030-01(#2-4) 0.038 1.0 0.0073
02-030-04(#2-5) 0.039 1.1 0.0074
02-019-136(#3-1) 0.041 1.3 0.0073
02-019-115(#3-2) 0.039 2.2 0.0078
02-019-170(#4) 0.067 3.8 0.0125
02-019-133A(#3-3) 0.513 12.7 0.0277
02-019-64(#3-4) 0.030 0.5 0.0060
02-019-10(#3-5) 0.060 1.30 0.0090
02-001-196(#3-6) 0.060 2.70 0.0100
02-019-24(#3-7) 0.180 6.70 0.0170

[0158] 图1显示了硫酸铵对体外初始释放的影响。数据表明体外初始释放与微粒孔径相关。用硫酸铵制备的制剂显示了不同的体外释放水平和可变的孔隙率，不象无硫酸铵的制剂表现出一致的孔隙率和释放。在制备微粒期间水相中存在硫酸铵可在制备内部乳剂期间可使药物物质盐析。沉淀物微环境的差异可导致孔隙率的不同，因此改变初始释放。在不用硫酸铵制备的制剂中未观察到这种影响。与含毒蜥外泌肽4、蔗糖和硫酸铵的制剂比较，含蔗糖和毒蜥外泌肽4的制剂显示出更加合意和一致的初始释放水平。

[0159] 图2进一步证明孔隙率对体外释放的影响以及加工条件即硅油与二氯甲烷比率对所形成微粒孔隙率的影响。简言之，用硅油与二氯甲烷比率为1∶1(表1中制剂2-4和2-5)制备的微粒制剂，比用硅油与二氯甲烷比率为1.5∶1(表1中制剂2、2-1和2-2)制备的相同制剂具有更高的初始释放。图2提示：更高的硅油与二氯甲烷比率导致造成较低初始释放的较低孔隙率。

[0160] 低温SEM

[0161] 如上所述对表1中的2、3和5型制剂进行低温SEM分析。图3A-3B为所选择的2型(制剂2-2，图3A)和5型(5％毒蜥外泌肽4，2％蔗糖，图3B)制剂的扫描显微图。图
4A-D分别为表1中制剂3-4、3-5、3-6和3-7的扫描显微图。再次在图4A-D的低温SEM横截面中可观察到使用可造成初始释放变异性的硫酸铵所展示的孔隙率的变化。

[0162] 残留溶剂水平

[0163] 所给制剂中残留溶剂的水平可影响制剂的Tg。测定了表1中2型和5型微粒制剂的残留溶剂水平。用一种方法定量庚烷、乙醇和二氯甲烷。设备由带有Rtx 1301，30m×0.53mm柱的HP 5890 Series 2气相色谱仪组成。将约130mg微粒溶于10毫升N，N-二甲基甲酰胺中。乙酸丙酯用作内标。调节样品制备以便可定量低至0.03％浓度的二氯甲烷。

[0164] 图5为对表1中2型和5型微粒制剂(3或5％毒蜥外泌肽4，2％蔗糖)所作的残留乙醇和二氯甲烷百分率的图。图5显示当残留溶剂量增加时Tg降低。

[0165] 制备具有3％毒蜥外泌肽4和2％蔗糖的微粒

[0166] 鉴于微粒制剂中存在硫酸铵所引入的孔隙率变化以及孔隙率被鉴定为显著影响初始释放的特性，在进一步发现中不继续用硫酸铵。

[0167] 内部乳滴粒径的影响

[0168] 进行下列研究以确定方法参数对形成内部乳剂以及所得乳剂的稳定性的影响，和对得到的用不同方法参数所产生的微球体24小时体外释放的影响。如上所述，通过对100g规模对进行超声处理，或用带36/4发生器的MT5000均化器(Kinematica AG，Switzerland)以低速(10,800rpm)或高速(21,300rpm)均化，形成水相和溶剂相内部乳剂。通过不同技术形成内部乳剂后，在取出等份试样之前，将乳剂保留于反应器中用悬挂式搅拌器温和搅动5、15或60分钟。在指定保留时间后，如上所述将内部乳剂进一步加工成微粒，然后如下所述测定每批的24小时体外释放。

[0169] 可用Horiba粒径分析仪测定内部乳滴粒径特性

[0170] 用玻璃移液管从反应器中取出内部乳剂的等份试样。用移液管将约30滴内部乳剂加入到20毫升螺帽闪烁管制瓶内约10毫升6％ 50∶504A PLG聚合物溶液中，然后混合。也用6％ 50∶504A PLG聚合物溶液作为参考空白溶液。然后将约9毫升这种稀释乳剂样品转移到干净的10毫升Horiba样品贮罐(holder)中。将该样品贮罐盖上盖子以防聚合物溶剂快速蒸发。制备的样品在每个蓝棒(灯)0.65％-0.90％透射率读数的可接受百分率范围内。在程序准备中选择相对折射率设置在0.94-0.00i。然后用Horiba粒径分析仪例如LA 910型来测量样品滴径。与该方法参数有关的数据和经5、
15和60分钟保留时间得到的内部乳滴粒径以及得到的24小时体外释放结果(在括号内)示于图9中。

[0171] 微球体表征

[0172] 就毒蜥外泌肽4微球体的药物含量、粒径、残留溶剂、体外初始释放和在大鼠中的PK特性等有关方面进行常规表征。提取药物，以获得对包胶后所选批料中毒蜥外泌肽4纯度的初步评价。

[0173] 体外初始释放

[0174] 通过测量在释放缓冲液(10mM HEPES，100mM NaCl，pH 7.4)中1小时后毒蜥外泌肽4的浓度，可测定毒蜥外泌肽4的初始释放。室温下将150±5mg微球体置于5.0毫升10mM HEPES，100mM NaCl，pH7.4缓冲液中，涡流振荡约30秒以悬浮该溶液，然后置于37℃气室中1小时。1小时后，从气室取出样品，上下颠倒数次进行混合，接着以3500rpm离心
10分钟。除去上清液，立即用下列条件通过HPLC进行分析柱： ，7.8mm×30cm，
5m(TSOH BIOSEP PART#08540)；柱炉温度：环境温度；自动加样器温度：6℃；流速：0.8毫升/分钟；检测：280纳米；进样体积：10升；流动相：35％乙腈/65％水，含0.1％TFA/升(v/v)；运行时间：大约20分钟。将于30mM乙酸盐缓冲液，pH 4.5中制备的0.2mg/ml毒蜥外泌肽4本体药物物质用作标准品。

[0175] 动物研究

[0176] 本文所述所有药代动力学(PK)研究皆在重约500±50g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠中进行。

[0177] 对于微粒制剂的PK表征，每只动物在肩胛间区接受悬浮于稀释剂(3％羧甲基纤维素、0.9％NaCl、0.1％Tween 20)中的微粒的皮下注射。通常剂量大约为每只大鼠1.0mg毒蜥外泌肽4，注射体积为0.75毫升。在给药后0.5、2、4、6、10、24小时和2、4、7、
10、14、17、21、24和28天通过侧部尾静脉采集血液样品。立即将血液样品置于含有EDTA的 管中，以约14,000Xg离心约2分钟。然后将血浆转移到无添加剂的
管中，贮存于-70℃直至分析时。用IRMA测定血浆毒蜥外泌肽浓度。

[0178] 体内释放-IRMA

[0179] 定量血浆中毒蜥外泌肽4的方法为夹层免疫测定，用固相单克隆抗体EXE4:2-8.4来捕获分析物，通过放射性碘标记单克隆抗体GLP-1:3-3来检测。从标准校准曲线来定量计数界限。该测定对全长或完整毒蜥外泌肽4为特异性的，不能检测毒蜥外泌肽4(3-39)。典型标准曲线范围为30pg/ml到2000pg/ml，其视示踪抗体的使用年限而定。

[0180] 体外和体内释放

[0181] 如上所述来测试制剂2、2-1和2-2(3％毒蜥外泌肽4和2％蔗糖)的体外初始释放。体外释放分别为0.4％、0.4％和0.5％。所有3批也具有相对低的体内初始释放，0-1天Cmax范围为1154-1555pg/ml。图6是具有3％毒蜥外泌肽4和2％蔗糖(2-1)的制剂和仅具有3％毒蜥外泌肽4的制剂(1)及具有3％毒蜥外泌肽4和0.5％硫酸铵的制剂(4)的代表性药代动力学曲线。使用1.5∶1的硅油与二氯甲烷比率，硅油粘度为350cs。

[0182] 从图6可看出，不含硫酸铵的制剂表现出较低的初始释放。尽管仅含毒蜥外泌肽4的制剂显示了适合的初始释放，但与含毒蜥外泌肽4和蔗糖组合的制剂比较，该药物包胶后的纯度降低了。在制剂中加入糖降低了药剂的降解。

[0183] 上面比较的3种制剂2、2-1和2-2的体内释放曲线示于图7中。所有3批表现出相对低的初始释放，接着是“沟”(约第4天到第7天之间血清水平低)，接着在约第21天到第28天内缓释。这3种制剂的低初始释放和释放曲线形状一致。

[0184] 使用1∶1的硅油与二氯甲烷比率的制剂

[0185] 用1∶1的硅油与二氯甲烷比率制备表1中的制剂2-3、2-4和2-5(3％毒蜥外泌肽4，2％蔗糖)。这些制剂的初始释放高于表1中的制剂2、2-1和2-2(3％毒蜥外泌肽4，2％蔗糖，硅油与二氯甲烷比率为1.5∶1)。具体而言，1.5∶1比率的制剂提供约0.4％的平均初始释放，而1∶1比率的制剂提供约1.0％的平均初始释放。在体内观察到相同的趋势，1∶1比率时大鼠中0-1天的Cmax为2288±520pg/ml，而1.5∶1比率时大鼠中0-1天Cmax为1300±221pg/ml。

[0186] 增加药物负荷

[0187] 增加毒蜥外泌肽4负荷到4％，同时保持蔗糖为2％，会导致与3％负荷同样范围的体外和体内初始释放。

[0188] 制备表1中的3种5型制剂(5％药物负荷，2％蔗糖，1.5∶1的硅油与二氯甲烷比率)。5-1、5-2和5-3三批都表现出介于0.2-0.5％范围内的体外低初始释放。相似地，制剂的体内Cmax一致地为介于467pg/ml到1267pg/ml范围内的低值。图8展示了所测试的这3批的药代动力学数据图。与具有2％蔗糖的3％毒蜥外泌肽4制剂的行为相比，5％的制剂在约第1天和第2天表现出更高的血清药物水平。5％制剂曲线的其余部分与具沟接着主要在初始第21天到第28天释放药物的3％制剂相似。

[0189] 尽管已通过其优选实施方案对本发明进行了具体展示和阐述，但本领域技术人员会理解，在不偏离所附权利要求书所包括的本发明范围的情况下，可对形式和细节作出各种改变。