一种重组抗OPN单克隆抗体及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种重组抗OPN单克隆抗体，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明还公开了编码该单克隆抗体的DNA分子，表达该单克隆抗体的载体以及被该表达载体转化的真核宿主细胞。本发明提供的抗OPN单克隆抗体能快速检测血清中OPN的浓度，灵敏度高，特异性强。

权利要求

1.一种重组抗OPN单克隆抗体，它包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

5.一种真核宿主细胞，其特征在于，它被权利要求4所述的表达载体转化。

6.根据权利要求5所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述的真核宿主细胞是CHO细胞。

7.如权利要求1所述的单克隆抗体用于检测OPN浓度的应用，其特征在于，所述检测采用ELISA法。

8.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：a)提供一表达载体，该表达载体含有权利要求3所述的DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

b)用步骤a)所述的表达载体转化真核宿主细胞；

c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的真核宿主细胞；和d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

说明书

一种重组抗OPN单克隆抗体及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及免疫学技术领域。具体地说，本发明涉及一种新的抗OPN单克隆抗体，及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] Osteopontin(OPN)为早期的T淋巴细胞活化分子1(Eta1)，是具有多种功能的分泌型糖蛋白。其可能的功能包括参与骨骼代谢，免疫调节，创伤愈合，细胞生存及肿瘤的进展。根据基因结构及染色体位置，OPN是整合素结合配体家族成员，为一小分子的N连接糖蛋白(SIBLING)，该家族还包括骨骼唾液酸蛋白(BSP)，牙基质蛋白1(DMP1)，牙齿唾液酸磷酸蛋白(DSPP)以及磷酸化糖蛋白细胞外基质(MEPE)。人OPN cDNA编码314个氨基酸残基的前体蛋白，其中包含16个氨基酸的信号肽，剪切后形成298个氨基酸的成熟蛋白。OPN为一高度酸化的多功能域的蛋白，理论分子量约33kDa，但由于高度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以达到75kDa。

[0003] OPN主要由骨骼、肾脏和上皮组织表达，但也可在子宫内膜组织、内皮细胞、T细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞及许多的肿瘤组织中检测到。在某些病理过程中组织中OPN的表达会上调，包括动脉硬化、瓣膜狭窄、心肌梗塞及类风湿性关节炎。OPN在数种生物体液中都可检测到，包括人血浆、血清、乳汁及尿液，在某些恶性肿瘤、爆发性肝炎、结核及自身免疫性疾病如多发性硬化和红斑狼疮中其表达上调。

[0004] OPN的活性可通过一系列受体介导，包括许多整合素和透明质酸受体CD44。OPN含有多个与整合素结合的功能域。其典型的Arg-Gly-Asp(RGD)位点可与数种αv类型的整合素(αvβ1，αvβ3，αvβ5)及α5β1，α8β1结合，含有lopinavir(LPV)的区域可以结合α4β1，SVVYGLR位点可以结合α4β1，α4β7和α9β1。OPN和可以结合CD44的变异体，可能通过与整合素的共同作用促进细胞迁移。 细胞内的OPN通过与CD44及ERM(ezrin/radixin/moesin)蛋白的相互作用或是通过调节细胞表面的CD44表达而促进细胞的迁移。 [0005] OPN及其蛋白酶解产物具有相互调节的作用。OPN被凝血酶、MMP-3、MMP-7或MMP-12酶解后产生OPN片段，与完整的OPN具有不同的生物学功能。例如，凝血酶、MMP-3、MMP-7酶切后可以增强整合素依赖的细胞粘附和迁移。反之，OPN通过包括转化/活化前体或是再活化TIMP抑制的酶的机制活化MMP-2和MMP-3。

[0006] 如其命名，OPN在骨骼的代谢中发挥一定的作用。在体外，OPN可刺激破骨细胞向骨骼粘附，如果抑制这种相互作用，则可以阻断骨骼的再吸收。OPN基因敲除的小鼠骨骼的发育表观上是正常的，但表现出出生后某些部位骨骼再吸收的缺陷，因此也支持OPN对破骨细胞的作用。OPN还直接参与调节矿物晶体的形成及生长。在体内和体外，OPN与羟基磷灰石结合可抑制晶体的形成。炎症反应的介导因子包括LPS，NO，IL-1β，和TNFα均可刺激OPN的表达。OPN调节巨噬细胞的分化和聚集。OPN还具有趋化因子及T细胞共刺激分子的功能，其可促进Th1细胞因子IL-12的产生。OPN基因敲除的小鼠表现为Th1反应的缺陷以及易于发生细菌和病毒的感染。但OPN在某些条件下也可抑制炎症反应。如在体外，OPN可抑制骨关节炎软骨细胞数种炎性介质的释放。

[0007] 由于OPN具有重要的生理及病理学意义，因此，检测OPN的血清浓度具有潜在的生理及病理学意义，所以迫切需要一种能有效、快速检测OPN在血清中浓度的产品。

发明内容

[0008] 本发明的需要解决的技术问题之一是提供一种重组的抗OPN单克隆抗体，以克服现有技术的不足。

[0009] 本发明需要解决的第二个技术问题是提供一种编码上述抗OPN单克隆抗体的DNA分子。

[0010] 本发明需要解决的第三个技术问题是提供一种上述单克隆抗体的用途。

[0011] 本发明需要解决的第四个技术问题是提供一种该单克隆抗体的制备方法。

[0012] 为达到上述发明目的，本发明一方面提供了一种重组的抗OPN抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

[0013] 本发明另一方面提供了编码上述单克隆抗体的DNA分子。

[0014] 在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

[0015] 本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。

[0016] 本发明第四方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被上述表达载体转化。在一个较佳的实例中，该宿主细胞是CHO细胞。

[0017] 本发明第五方而提供了一种抗OPN单克隆抗体检测OPN浓度的的方法，其特征在于，所述的方法为常规的ELISA法。

[0018] 本发明第六方面提供了一种制备上述单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括：

[0019] a)提供一表达载体，该表达载体含有上述DNA序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列；

[0020] b)用步骤a)所述的表达载体转化宿主细胞：

[0021] c)在适合所述单克隆抗体表达的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和

[0022] d)分离纯化获得所述单克隆抗体。

[0023] 本发明的优点在于本发明的单克隆抗体能快速、灵敏的检测患者血清中OPN的浓度。

附图说明

[0024] 图1：载体pMG18，并且标明了其中的元件及酶切位点。

[0025] 图2：本发明所构建的pM载体。其中，hCMV pro为人巨细胞病毒早期启动子；Ck为小鼠κ轻链恒定区基因；IgG1constant为小鼠γ1重链恒定区基因；pA为多聚腺苷化信号；DHFR为二氢叶酸还原酶基因；AmpR为氨苄青霉素抗 性基因。

[0026] 图3：本发明所构建的pM(H+L)载体，含有重组抗OPN抗体重链全长和轻链全长基因。

[0027] 图4：抗OPN单克隆抗体与市售OPN单克隆抗体检测OPN灵敏度的比较实验结果。 具体实施方式

[0028] 本发明涉及一种重组的抗OPN单克隆抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其特征在于，轻链可变区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

[0029] 本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

[0030] 本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(V L)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

[0031] 本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈p一折叠构型，由形成连接环 的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分p折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体
的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

[0032] 单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或用重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。

[0033] 本发明还提供了编码本发明重组抗OPN单克隆抗体的DNA分子。在一个较佳的实例中，该DNA分子含有SEQ ID NO：3所示的编码所述单抗轻链可变区的核苷酸序列，以及SEQ ID NO：4所示的编码所述单抗重链可变区的核苷酸序列。

[0034] 在获得编码本发明重组抗OPN单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列后，通常可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。

[0035] 首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。

[0036] 本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。

[0037] 编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一读框内。

[0038] 本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体，以及可购得的表达载体pMG 18(《根据
INCP-9质粒序列进行环境监测的工具的开发》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B152TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScoring Av.4，Minsk 220080 Belarus)。

[0039] 随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是CHO细胞。用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5一二甲基一1，5一二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染CHO细胞。

[0040] 然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的重组抗OPN单克隆抗体。

[0041] 所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

[0042] 下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。

[0043] 实施例1 从抗体库中筛选OPN的抗体基因可变区

[0044] 1)鼠源抗体库的构建

[0045] Osteopontin(购自R&D System)与弗氏佐剂免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清1∶500稀释后与OPN显强阳性反应，取免疫后小鼠脾脏，按照Marks等人J.Mol.
Biol.，222，581-597.Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227，381-388.Haidaris CG等人J Immunol Methods.2001Nov 1；257(1-2)：185-202，Griffiths，A.D.等人EMBO J.，13，
3245-3260(1994).Nissim，A.等人EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法，构建鼠源抗体库。

[0046] 2)筛选

[0047] 将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。

[0048] 12000rpm高速离心10分钟，将上清液转移至无菌的50毫升离心管中，保存备用。11
确保其滴度应在2×10 以上。用纯化的OPN作为抗原，用常规方法包被25毫升细胞培养
10
瓶。包被后的细胞瓶中加入不少于3×10 噬菌体，37℃温育1小时。倒掉瓶中的液体，用
10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的
TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。

[0049] 重复上段所述步骤4次。

[0050] 将上述获得的细胞稀释至105细胞/毫升后在加有0.1氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上培养，获得单克隆。

[0051] 取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。

[0052] 将上述深孔板在96孔板离心机上5000RPM离心20分钟后，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4℃备用。

[0053] 取96孔板10块，每孔中加入OPN(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗(购自Pharmacia公司)，37℃温育30分钟后用1％Tween-20
的PBS洗涤10次。

[0054] 加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。

[0055] 根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。本试验结果共筛选出316个阳性克隆，根据其读数确定其中5个亲和力最强的克隆，用于下一步的研究。

[0056] 3)抗体可变区编码序列向表达载体的克隆

[0057] 使上述5个克隆的菌株在100毫升LB培养基中扩增，然后按照生产商说明书用Promega公司的pMG18质粒DNA抽提纯化试剂盒纯化质粒DNA。

[0058] 用XbaI和NheI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取357bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取339bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区。PCR扩增后，进行序列测定。
确定正确序列后，化学合成法合成轻链全长序列，5’端设计HindIII酶切位点，恒定区为小鼠κ轻链恒定区序列，3’端设计EcoRI酶切位点。

[0059] PCR法自小鼠脾细胞扩增IgG1重链恒定区序列，并将CH1起始氨基酸突变为Ala-Ser，同时含有了NheI酶切位点，3’端设计BamHI酶切位点，扩增后测序验证无误后，NheI和BamHI双酶切小鼠IgG1恒定区片段和pMG18，将小鼠IgG1恒定区连入pMG18，构建的新载体命名为pM，见图2。

[0060] 用XbaI和NheI限制性酶酶切表达载体pM。该表达载体的酶切图谱如图2所示。然后将上述重链可变区插入该表达载体的XbaI/NheI位点中。同样，利用HindIII和EcoRI限制性酶将抗体轻链全长cDNA插入到pM载体的HindIII/EcoRI位点中，从而构建得到含有重组抗OPN抗体重链全长和轻链全长基因的表达载体pM(H+L)，见图3。

[0061] 4)CHO细胞的转染与重组克隆的筛选

[0062] 上述构建的带有抗体基因的表达载体分别转化大肠杆菌DH5α菌株中接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒，将上述纯化的质粒DNA转染CHO细胞，操作参照厂家的 说明书进行。

[0063] 转化的CHO细胞在HAT选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极限稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。

[0064] 挑出的单克隆细胞系在RPMI 1640培养基上进行培养，对上清进行Western印迹试验，根据染色反应判断表达强度，挑选出12个表达强的克隆作为候选细胞株。

[0065] 5)单克隆抗体的纯化

[0066] 用ProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化出上述单克隆抗体，经SDA-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。将这些样品用于以下的进一步分析与研究中。

[0067] 实施例2 抗体基因在CHO细胞中的表达强度

[0068] 将上述筛选得到的12个高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿中，如下所述用ELISA法测定抗体的表达量。将羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(鼠IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP一羊抗鼠IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用10分钟，最后用H2SO4终止反应，测A450值。下表1中显示了上述筛选获得的12个候选克隆的表达量。

[0069] 表1 候选克隆在CHO细胞中的表达量

[0070]细胞株编号 2A3 2B3 3C5 4D9 5E6 6F2 7G2 8H5 9B2 8E3 9H4 6D2 5F2
表达量(微克/毫升)165.4 152.6 142.9 256.4 168.9 153.8 301.5 251.4283.1 152.9 273.2 146.8 139.3[0071] 从上表1可以看出，7G2，9B2和9H4具有很高的表达水平。

[0072] 实施例3 抗OPN单克隆抗体基因的DNA测序

[0073] 根据系谱，对上述获得的7G2细胞株的抗OPN抗体基因进行DNA测序。结果如下：SEQ ID NO：3显示了其轻链可变区基因序列(5’到3′，339bp)其推测的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1中；SEQ ID NO：3显示了其重链可变区基因序列(5′到3′，357bp)，其推测的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：2中。

[0074] 实施例4 单克隆抗体亲和力研究

[0075] 按以下方法对各克隆的细胞培养液进行纯化。10000rpm离心除去细胞和细胞碎片，100Kd截留分子量的滤膜超滤浓缩至1/10体积，超滤缓冲液是100mMTris-HCl，pH7.5。过SPA-sepharose亲和层析柱，上样液为100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脱液为20mM柠檬酸，pH3.0，100mM NaCl。分子筛(Sephadex G200)层析。洗脱液为100mM Tris-HCl，pH7.5，得纯品。

[0076] 亲和力测定采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107：220)-10 -10进行。结果表明，7G2，9B2和9H4三种单抗的亲和力分别达到5.6×10 ，1.78×10 和
-7
8×10 。

[0077] 实施例5 抗OPN单克隆抗体的对OPN的检测试验

[0078] 1.试剂和材料

[0079] 1.1待检测样品和标准品。

[0080] 1.2抗OPN单抗：构建的工程细胞经无血清发酵，proteinA亲和层析纯化获得。 [0081] 1.3兔抗人OPN多克隆血清(Osteopontin与弗氏佐剂免疫新西兰大白兔，取血清检测，1∶2000稀释后，与OPN呈强阳性反应，取血清备用。

[0082] 1.4羊抗兔IgG(H+L)多抗，HRP标记，稀释度1∶1000-4000，Southern Biotech。 [0083] 1.5HRP显色底物：TMB，上海科华公司，分A液及B液，临用前，两者等体积混合。 [0084] 1.6终止液：0.5mol/L硫酸。

[0085] 1.7pH＝7.2的PBS：称取KH2PO4 0.21g，NaCl 9.0g，Na2HPO4.12H2O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。

[0086] 1.8包被缓冲液：20mmol/l pH＝9.6的碳酸钠缓冲液。

[0087] 1.9封闭缓冲液：称取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。

[0088] 1.10洗涤缓冲液：取1ml Tween20，加入PBS至1升。

[0089] 1.11酶标仪。

[0090] 1.12低吸附96孔酶标板：Nunc。

[0091] 1.13其它：多道加样器、吸嘴等

[0092] 2.方法：夹心ELISA法

[0093] 2.1抗OPN单抗稀释于包被缓冲液中，浓度1.0μg/ml，包被96孔酶标板，0.1ml/well，37℃2h。

[0094] 2.2洗涤：洗涤缓冲液洗涤2遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0095] 2.3封闭：封闭缓冲液加满孔后37℃2h。

[0096] 2.4洗涤：洗涤缓冲液洗涤3遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0097] 2.5加抗原：加入用封闭缓冲液稀释至100，50，25，12.5，6.25(pg/mL)的OPN标准品，0.1ml/well，设2复孔，同一板内加入适当稀释的待检测样品，0.1ml/well，设2复孔。 [0098] 2.6 37℃2h。

[0099] 2.7洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0100] 2.8加入兔抗人OPN多克隆抗血清，37℃2h。

[0101] 2.9洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0102] 2.10加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗：加入用PBS 1∶2000稀释的二抗，37℃1h。 [0103] 2.11洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0104] 2.12显色：加显色底物100μL/孔，避光显色5～20min(显色时间视显色情况而定)，加终止液50μL/孔。

[0105] 2.13酶标仪读数：测量450nm光吸收，以630nm为参考波长。

[0106] 2.14用标准品浓度(对数)与A450/630nm值做直线回归方程。

[0107] 该方法检测OPN灵敏度高(6.52pg/mL)，特异性强(与小鼠血清、食蟹猴血清等均无交叉反应)，准确性与精密度均可达到药物代谢动力学的要求。

[0108] 实施例6 抗OPN单克隆抗体与市售OPN单克隆抗体检测OPN灵敏度的比较试验 [0109] 1.试剂和材料

[0110] 1.1人OPN(R&D Systems)。

[0111] 1.2市售mouse anti human OPN mAb(R&D Systems，MAB14331)。

[0112] 1.3本专利公开的抗OPN单抗：构建的工程细胞经无血清发酵，proteinA亲和层析纯化获得。

[0113] 1.4兔抗人OPN多克隆血清(Osteopontin与弗氏佐剂免疫新西兰大白兔，取血清检测，1∶2000稀释后，与OPN呈强阳性反应，取血清备用。

[0114] 1.5羊抗兔IgG(H+L)多抗，HRP标记，稀释度1∶1000-4000，Southern Biotech。 [0115] 1.6HRP显色底物：TMB，上海科华公司，分A液及B液，临用前，两者等体积混合。 [0116] 1.7终止液：0.5mol/L硫酸。

[0117] 1.8pH＝7.2的PBS：称取KH2PO4 0.21g，NaCl 9.0g，Na2HPO4.12H2O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。

[0118] 1.9包被缓冲液：20mmol/l pH＝9.6的碳酸钠缓冲液。

[0119] 1.10封闭缓冲液：称取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。

[0120] 1.11洗涤缓冲液：取1ml Tween20，加入PBS至1升。

[0121] 1.12酶标仪。

[0122] 1.13低吸附96孔酶标板：Nunc。

[0123] 1.14其它：多道加样器、吸嘴等

[0124] 2.方法：夹心ELISA法

[0125] 2.1本专利公开的抗OPN单抗及市售mouse anti human OPN mAb稀释于包被缓冲液中，浓度1.0μg/ml，包被96孔酶标板，0.1ml/well，37℃2h。

[0126] 2.2洗涤：洗涤缓冲液洗涤2遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0127] 2.3封闭：封闭缓冲液加满孔后37℃2h。

[0128] 2.4洗涤：洗涤缓冲液洗涤3遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0129] 2.5加抗原：本专利公开的抗OPN单抗包被孔中加入用封闭缓冲液稀释至100，50，25，12.5，6.25(pg/mL)的OPN标准品，0.1ml/well，设2复孔，市售mouseanti human OPN mAb包被孔中加入用封闭缓冲液稀释至100，50，25，12.5，6.25(ng/mL)的OPN标准品，
0.1ml/well，设2复孔。

[0130] 2.6 37℃2h。

[0131] 2.7洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0132] 2.8加入兔抗人OPN多克隆抗血清，37℃2h。

[0133] 2.9洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0134] 2.10加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗：加入用PBS 1∶2000稀释的二抗，37℃1h。 [0135] 2.11洗涤：洗涤缓冲液洗涤5遍，每次均在吸水纸上拍干。

[0136] 2.12显色：加显色底物100μL/孔，避光显色5～20min(显色时间视显色情况而定)，加终止液50μL/孔。

[0137] 2.13酶标仪读数：测量450nm光吸收，以630nm为参考波长。

[0138] 2.14用标准品浓度(对数)与A450/630nm值做直线回归方程。

[0139] 实验结果表明，本专利公开的抗OPN单抗包被孔与市售mouse anti human OPNmAb包被孔显色程度基本一致，而OPN浓度相差3个数量级，即本专利公开的单抗检测人OPN的灵敏度比市售单抗高1000倍。见图4

[0140] 尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

[0141] 序列表

[0142] <110>上海中信国健药业有限公司

[0143] <120>一种重组抗OPN单克隆抗体及其制备方法和用途

[0144] <160>4

[0145] <170>PatentIn version3.1

[0146] <210>1

[0147] <211>103

[0148] <212>PRT

[0149] <213>人工序列

[0150] <220>

[0151] <221>misc_feature

[0152] <222>(1)...(103)

[0153] <223>轻链可变区

[0154] <400>1

[0155] Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

[0156] 5 10 15

[0157] Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

[0158] 20 25 30

[0159] Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

[0160] 35 40 45

[0161] Pro Lys Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

[0162] 50 55 60

[0163] Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

[0164] 65 70 75 80

[0165] Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

[0166] Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser

[0167] 85 90 95

[0168] Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

[0169] 100 105 110

[0170] Arg

[0171] <210>2

[0172] <211>119

[0173] <212>PRT

[0174] <213>人工序列

[0175] <220>

[0176] <221>misc_feature

[0177] <222>(1)...(119)

[0178] <223>重链可变区

[0179] <400>2

[0180] Met Ala Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

[0181] 5 10 15

[0182] Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

[0183] 20 25 30

[0184] Thr Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu

[0185] 35 40 45

[0186] Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Asn Glu

[0187] 50 55 60

[0188] Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Asn Thr

[0189] 65 70 75 80

[0190] Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

[0191] 85 90 95

[0192] Tyr Ser Asp Ser His Tyr Gly Gly Ser Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

[0193] 100 105 110

[0194] Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

[0195] 115

[0196] <210>3

[0197] <211>339

[0198] <212>DNA

[0199] <213>人工序列

[0200] <220>

[0201] <221>misc_feature

[0202] <222>(1)...(339)

[0203] <223>轻链可变区

[0204] <400>3

[0205] GATAT TTTGA TGACC CAGAC TCCAC TCTCC CTGCC TGTCA GTCTT GGAGA TCAAG CCTCC 60 [0206] ATCTC TTGCA GATCT AGTCA GAGCC TTGTA CACAG TAATG GAAAC ACCTA TTTAC ATTGG 120 [0207] TACCT GCAGA AGCCA GGCCA GTCTC CAAAG CTCCT GATCT ACAAA GTTTC CAACC GATTT 180 [0208] TCTGG GGTCC CAGAC AGGTT CAGTG GCAGT GGATC AGGGA CAGAT TTCAC ACTCA AGATC 240 [0209] AGCAG AGTGG AGGCT GAGGA TCTGG GAGTT TATTT CTGCT CTCAA AGTAC ACATG TTCCG 300 [0210] TGGAC GTTCG GTGGA GGCAC CAAGC TGGAA ATAAA ACGT 339 [0211] <210>4

[0212] <211>357

[0213] <212>DNA

[0214] <213>人工序列

[0215] <220>

[0216] <221>misc_feature

[0217] <222>(1)...(357)

[0218] <223>重链可变区

[0219] <400>4

[0220] ATGGC CCAGG TTCAG CTGGA GCAGT CTGGA CCTGA GCTGG TAAAG CCTGG GGCTT CAGTG 60 [0221] AAGAT GTCCT GCAAG TCTTC TGGAT ACACA TTCAC TACCT ATGTT ATGCA CTGGG TGAAG 120 [0222] CAGAA GCCTG GGCAG GGCCT TGAGT GGATT GGATA TATTA ATCCT TACAA TGATG GTAGT 180 [0223] AAGTA CAATG AGAAG TTCAA AGGCA AGGCC ACACT GACTT CAGAC AAATC CTCCA ACACA 240 [0224] GCCTA CATGG AGCTC AGCAG CCTGA CCTCT GAGGA CTCTG CGGTC TATTA CTGTG CAAGC 300 [0225] CACTA CGGTG GTAGC CCTGC TTACT GGGGC CAAGG GACTC TGGTC ACTGT CTCTG CG 357