PMMoV抗性辣椒属植物的生产方法

摘要

本发明涉及一种辣椒属(Capsicum genus)植物，其中植物因为在所述植物的基因组中存在L4抗性等位基因而表现出对辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性，其中所述植物的基因组中的负责SNFD表型的遗传信息至少缺失到或被抑制到不表达SNFD表型的程度。本发明还涉及一种用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的方法，包括步骤a)提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒属受体植物或其部分；b)往所述受体植物或其部分或其子代植物的基因组中引入包括截短的L4抗性等位基因的基因组区，其中所述等位基因包括能够在所述植物或植物部分或子代植物中表达并据此赋予所述植物或植物部分或子代植物对PMMoV致病型1.2.3的抗性的遗传信息，以及其中所述等位基因中的赋予SNFD表型的遗传信息至少缺失到不表达SNFD表型的程度。

权利要求

1.一种用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的方法，包括步骤：a提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒属受体植物或其部分；

b提供辣椒属供体植物，所述供体植物由于其基因组中存在L4抗性等位基因而表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性；

其中所述L4抗性等位基因通过至少一个选自包括以下标记物的组的L4抗性等位基因标记物来指示：E39/M58-F-95，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCAGA和第二引物序列

5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACGT扩增，其中所述标记物的标记物长度为95bp；

E58/M60-F-255，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCCGT和第二引物序列

5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACTC扩增，其中所述标记物的标记物长度为255bp；

E58/M50-F-580，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCCGT和第二引物序列

5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACAT扩增，其中所述标记物的标记物长度为580bp，c将所述受体和供体植物杂交，产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的子代植物；

d筛选抗性子代植物的基因组中是否存在截短的L4抗性等位基因，其中所述截短的L4抗性等位基因包括至少一种L4抗性等位基因标记物，所述标记物选自包括以下标记物的组：E39/M58-F-95，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCAGA和第二引物序列

5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACGT扩增，其中所述标记物的标记物长度为95bp；

E58/M60-F-255，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCCGT和第二引物序列

5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACTC扩增，其中所述标记物的标记物长度为255bp；

E58/M50-F-580，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCCGT和第二引物序列

5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACAT扩增，其中所述标记物的标记物长度为580bp，且其中所述等位基因缺少选自包括以下标记物的组的至少一种L4抗性等位基因标记物：E39/M58-F-65，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCAGA和第二引物序列GATGAGTCCTGAGTAACGT扩增，其中所述标记物的标记物长度为65bp；E39/M51-F-380，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCAGA和第二引物序列

5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACCA扩增，其中所述标记物的标记物长度为380bp，所述标记物缺少的程度至少使得植物不显示可育性下降，不显示生长矮小，并且当所述等位基因是纯合的情况下产生对于PMMoV致病型1.2.3抗性而言是非分离的F1；并选出具有截短的L4抗性等位基因的子代植物。

2.权利要求1的方法，其中所述步骤c包括进行抗性生物检测。

3.权利要求1的方法，其中所述子代植物是通过在步骤c中杂交而得到的F1植物的自花传粉、或者通过将所述杂交而得到的F1植物与另一种辣椒植物进行杂交而产生的分离群的植物。

4.一种用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的方法，包括步骤：a提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒属受体植物或其部分；和

b往所述受体植物或其部分或其子代植物的基因组中引入包括截短的L4抗性等位基因的基因组区，其中所述等位基因包括选自包括以下标记物的组的能够在所述植物或植物部分或子代植物中表达并由此赋予所述植物或植物部分或子代植物对PMMoV致病型1.2.3的抗性的至少一种L4抗性等位基因标记物：E39/M58-F-95，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCAGA和第二引物序列5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACGT扩增，其中所述标记物的标记物长度为95bp；E58/M60-F-255，其可利用第一引物序列 5’-3’GACTGCGTACCAATTCCGT和 第 二 引 物 序 列5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACTC 扩增，其中所述标记物的标记物长度为255bp；E58/M50-F-580，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCCGT和第二引物序列5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACAT扩增，其中所述标记物的标记物长度为580bp，且其中所述等位基因缺少选自由以下标记物组成的组的至少一种L4抗性等位基因标记物：E39/M58-F-65，其可利用第一引物序列5’-3’GACTGCGTACCAATTCAGA和第二引物 序列5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACGT扩增，其中所述标记物的标记物长度为65bp；E39/M51-F-380，其可利用第一引物序列

5’-3’GACTGCGTACCAATTCAGA和第二引物序列5’-3’GATGAGTCCTGAGTAACCA扩增，其中所述标记物的标记物长度为380bp，所述标记物缺少的程度至少使得植物不显示可育性下降，不显示生长矮小，并且当所述等位基因是纯合的情况下产生对于PMMoV致病型1.2.3抗性而言是非分离的F1；且其中通过体外培养技术、原生质体融合、转化或双单倍体技术而进行所述基因组区的所述引入。

5.权利要求4的方法，还包括使得所述植物部分生长成辣椒植物的步骤。

6.权利要求4的方法，其中所述方法还包括步骤：

c选择PMMoV致病型1.2.3抗性植物或子代植物，和

d选择下述的抗性植物或子代植物：植物不显示可育性下降，不显示生长矮小，并且当所述等位基因是纯合的情况下产生对于PMMoV致病型1.2.3抗性而言是非分离的F1。

7.权利要求6的方法，其中所述步骤c包括进行抗性生物检测。

8.一种用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属的近交植物的方法，包括进行权利要求1的方法，并进一步包括步骤：e所选植物的自我传粉；

f播种通过所述自我传粉而得到的种子，并使所述种子生长成植物；

g鉴定来自步骤f的表现出PMMoV致病型1.2.3抗性并具有商业所需特性的植物，和h重复步骤e至g，直到产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性并具有商业所需特性的近交辣椒植物。

9.权利要求1的方法，其中所述供体植物是C.chacoense植物或其中所述截短的L4抗性等位基因源自C.chacoense的基因组。

10.权利要求1的方法，其中所述受体植物是辣椒植物。

11.权利要求4的方法，其中所述供体植物是C.chacoense植物或其中所述截短的L4抗性等位基因源自C.chacoense的基因组。

12.权利要求4的方法，其中所述受体植物是辣椒植物。

13.权利要求8的方法，其中所述供体植物是C.chacoense植物或其中所述截短的L4抗性等位基因源自C.chacoense的基因组。

14.权利要求8的方法，其中所述受体植物是辣椒植物。

说明书

PMMoV抗性辣椒属植物的生产方法　

技术领域

[0001] 本发明涉及抗病植物。更具体地，本发明涉及抗辣椒轻型斑驳病毒(Pepper mildmottle virus(PMMoV))的特殊致病型的辣椒植物以及生产这种植物的方法。

[0002] 背景技术

[0003] 辣椒属(Capsicum)(茄科或茄科植物)是一属植物，其甜的、芳香的果实被用作为香料、蔬菜和药物。该属包括约40个种。大多数品种都含有辣椒碱(甲基香草基壬酰胺)，
这是一种能在口腔内产生强烈烧灼感并且在医学上可用作循环刺激剂和疼痛缓解剂的刺
激性化学物。该属植物源自中南美洲，但是由于它们可以耐受几乎所有的气候条件，因此全
世界都盛产这种植物果实。商业上的辣椒主要是辣椒(Capsicum annuum)(铃状椒、牛角椒、
椒、Anaheim椒)、小米椒(Capsicum frutescens)(塔巴斯科椒)和黄灯笼辣椒
(Capsicum chinense)(哈瓦那椒(Habaneropepper))。

[0004] 辣椒(Capsicum annuum)也叫做红辣椒或众香(pimento)，是草本年生物种，其果实的长度、颜色和刺激性根据栽培品种的不同而有所不同。这个物种是全世界广泛栽培的，
例如在西欧和美国(USA)。小米椒和黄灯笼辣椒都有着极为刺激性的小果实，被用于辣椒油
和其他辣椒产品。因为强烈的香味必须要有相当温暖的气候，因此该物种主要栽培于热带
地区以及美国的亚热带地区。

[0005] 在栽培过程中，多种烟草花叶病毒都可以破坏辣椒属蔬菜。烟草花叶病毒属包括代表病毒种烟草花叶病毒(TMV)、和血清相关的番茄花叶病毒(ToMV)、辣椒轻型斑驳病毒
(PMMoV)和一些其他的植物病毒。病毒感染可以降低植物的活力，但通常不会杀死植物。例
如TMV可以影响多种植物包括辣椒、番茄和茄子，造成辣椒果实的严重坏死，使得大多数果
实都不可销售。TMV是一种非常顽固的疾病，因为它可以在土壤中存活数年。

[0006] PMMoV全面地感染所有的辣椒属物种，包括抗TMV和ToMV的栽培品种。铃状椒植物中的疾病症状包括幼苗植物的发育障碍、叶子皱曲和黄色色斑。果实是畸形的(多瘤的
和有斑驳的)并且大小上也有轻微的缩小。

[0007] 在1980年，分离出了TMV样病毒(tm-3)的病毒株，其可以感染当时已知的抗PMMoV辣椒品系(Boukema et al.，1980)。分离到的病毒株叫做TMV的P14株。在发现P14
株之后，1982年发现植物物种C.chacoense中的一个品系(PI260429系)表现出对该新病
毒的抗性(Boukema，1982)。之后发现植物的抗性是由L基因座上的L4等位基因赋予的
(Boukema，1984)，P14株能够克服L3等位基因所赋予的抗性，但它不能克服L4赋予的抗性。
能克服L3赋予的抗性的病毒株最初叫做TMV，之后被重新分类成特殊的PMMoV致病型，该致
病型被称为致病型1.2.3。

[0008] 育种者常常将表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的C.chacoense品系以及其衍生的商品化的辣椒品系称作Tm3抗性品系。许多育种公司已经将包括L4等位基因的该
C.chacoense品系的遗传物质基因渗入到它们的育种品系内，以便获得具有商业所需特性
的抗性辣椒植物。

[0009] 现在知道L4等位基因赋予了对多种病毒的抗性，所述病毒包括ToMV、TMV以及PMMoV致病型1、1.2、和1.2.3。L4等位基因所赋予的抗性在此后被称作“PMMoV抗性”，不
过更严格地说，其赋予了如上所述的更为广泛的抗性。

[0010] 在1980和2004年间，对烟草花叶病毒属的命名法已经进行了多次修改。在此所用的是保护植物新品种联合会(UPOV)在1994年11月4日提 出的辣椒(C.annuum L.)的
“实施特色、均一性和稳定性的测试指南”(TG/76/7)中的命名法。在这些指南中，对辣椒
- 1 2 3
烟草花叶病毒致病型的遗传抗性是受位于同一基因座上的5个等位基因(L，L，L，L，和
4
L)控制的。在此明确参照上面提及的UPOV指南TG/76/7第21到22页中的表格，其中显
示了抗各种病毒致病型的抗性和辣椒中的赋予抗性的等位基因组成之间的相关性。辣椒的
3 3
纯合子LL 基因型赋予了对烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)、铃状椒花叶病毒
(BePMV)、烟草轻型绿色花叶病毒(TMGMV)、Dulcamara黄色斑纹病毒(DYFV)、和辣椒轻型斑
4 4
驳病毒(PMMoV)致病型1.2的抗性，而纯合子LL 基因型提供了附加的对辣椒轻型斑驳病
毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性。

[0011] UPOV命名法与病毒学的科学文献中通常所采用的命名法多少有些不同。在科学文献中，命名法通常被限定于物种名称以及分离株的命名。仅仅描述了非常少数的致病型命
名。例如国际病毒分类委员会的通用病毒数据库中并不包括PMMoV的致病型1.2.3。还应
当注意到，命名法及进展随着时间有所变化，给定的烟草花叶病毒可能需要两个或多个通
用名，并且可能还要被如下详细解释的那样进行重新分类。要明白，无论病毒分离株有任何
新的命名，本发明涉及L4等位基因所赋予的植物对任何病毒株的抗性。

[0012] 如上所述，L基因的致病型特异性等位基因(L1、L2、L3、L4)赋予了辣椒属对烟草花叶病毒属的抗性，L4等位基因赋予了对PMMoV致病型1.2.3的抗性。L基因座所位于的
区域处于染色体11南侧的端粒上(Lefebvre et al，2002)。抗性基因通过触发过敏反应
(HR)发挥作用。

[0013] 当从C.chacoense基因渗入到其他辣椒属物种时，L4等位基因所赋予的抗性的显著的和不利的特性是新植物品系中的抗性是非孟德尔遗传的。孟德尔分离定律认为等位基
因对在配子形成过程中分离，在授粉时随机组合。对于每种特征，二倍体生物体都遗传了两
个等位基因，一个亲本一个。如果两个等位基因有所不同，那么一个显性等位基因完全表
达于生物体的表型上，而另一个隐性等位基因对表型没有显著的作用。根据常规的孟德尔
遗传学，纯合显性等位基因的植物与纯合隐性等位基因的植物的杂交将产生F1，或第一个
子代群，其在遗传学上(整个群都是杂合子)以及表型上(整个群都表达显性性状)都是
均一的。这种F1群被认为是显性性状是不分离的(当然F2群将出现性状分离)。因此，当
至少一个亲本是性状的纯合子时，F1群不会出现显性性状的分离。同样，无分离的F1的存
在也确认了其中一个亲本系为显性性状的纯合子。但是，在其中渗入L4等位基因的商品化
植物品系中并没有出现这种情况。

[0014] 对于植物育种者而言，重要的是育种品系为纯合子(纯种(truebreeding))，因为育种的结果优选地应当是可预知的。例如当从两种(纯合的)近交系中产生商品化杂种时，
所形成的杂合子的F1植物要优于它们的近交亲本，因为杂种优势或混种优势的原因。植物
育种者故意进行这种杂种杂交以便产生更为强壮的子代，纯合的近交系是具有高经济价值
的生产系(producer lines)。在育种实践中，习惯上通过植物品系的自体授粉以及筛选其
子代的非分离性来评价植物品系是否是单个基因所赋予的显性的抗性性状的纯合子(即
单基因显性性状)。或者，预计为纯合的显性植物品系可以与纯合的隐性品系杂交，据此分
离的F1说明所测试的“显性”亲本并非是纯合子。

[0015] 相信L4抗性等位基因是正常的单基因显性的抗性等位基因(Boukema，1983；VanDuin，1998)。但是对于L4抗性等位基因所赋予的PMMoV抗性而言，育种者经常观察到了关
于纯合品系杂交的可预测性以及这些品系的稳定性的问题。然而，预计为纯合的(L4L4)的
抗性植物的自我授粉一定会产生具有均一抗性表型的后代(据此确认了亲本植物的纯合
性)；另一方面，这种纯合的抗性亲本植物与易感亲本植物(即缺少L4等位基因的植物)
的杂交常常产生包括抗性和易感植物的F1，即分离的F1。在用PMMoV致病型1.2.3接种之
后，通过全身性花斑的存在可以检测出植物的易感性。因为上面所罗列的原因，这种其中一
部分F1子代 植物惊奇地丧失抗性的现象对于育种者是非常不便的。育种者常常把这些不
可预测的纯合的亲本植物称作“分离的”植物，不过严格地说应当是它们的F1子代是分离
的。

[0016] 在改良PMMoV抗性近交系的开发中，育种者最近利用传统的植物选择和试验杂交已经表明他们能够获得产生正常的非分离的F1的纯合植物(即遵循孟德尔法则)，据此
将L4等位基因赋予的抗性固定于这个植物品系中。现在还不清楚他们是怎样获得这种植
物品系的。但是，这些“非分离的”植物的主要问题是它们表现出可育性下降和生长矮小。
可育性下降的重要后果是这些植物只能产生有限量的种子和/或有限量的花粉。因此，尽
管这些植物是抗性的和“非分离的”，但是它们所表现出的以可育性下降和生长矮小为特征
的表型对于商品化种子生长是不利的。例如种子的延迟成熟(即生长缓慢)或植物发育
率的减少都可以提示生长矮小。在本申请中，这种分离的不育的矮小表型还被称作“SNFD
表型”。现在还不能解释这些负面性状包括生长、可育性和不育性的问题和L4等位基因从
C.chacoense到其他辣椒属物种的基因渗入之间的相关性。(参阅例如VanDuin，1998)。

[0017] 一直以来都发现往辣椒属物种中基因渗入L基因的任何一种L1、L2和L3等位基因都产生了孟德尔遗传群体，而没有在纯合子抗性植物中表现出SNFD表型。C.chacoense
的L4基因渗入现在首次提出了上述问题。

[0018] 目前需要具有L4等位基因赋予的对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒植物，它们是“非分离的”，并显示出正常的发育(率)以及产生合适量的种子。因此，本发明的一个目
的是提供辣椒属植物，其组合了L4等位基因赋予的对PMMoV致病型1.2.3的抗性以及商业
所需特性例如良好的生长和正常的种子产生，即没有不利的SNFD表型的特性。

发明内容

[0019] 通过本发明可以实现这个目的。本发明已经发现，通过减少包括L4等位基因的基因组基因渗入的规模而中断如在上面所述的纯合植物中观察到的对PMMoV致病型1.2.3的
抗性和SNFD表型之间的关联是有可能的。具体地，通过从L4抗性等位基因中去除位于L4
等位基因中的赋予PMMoV抗性部分的直接相邻部分的遗传信息可以实现这一点。结果是对
PMMoV致病型1.2.3的抗性可以从一个植物转移到另一个植物，而不转移赋予SNFD表型部
分，因此有可能产生具有PMMoV抗性且不表现出SNFD表型的农艺学有价值的植物。

[0020] 无意于受理论上的缚束，相信SNFD表型的负面的副作用特征是由L4等位基因所位于的C.chacoense染色体片段引起的，例如当C.chacoense染色体片段被插入到辣椒基
因组内时，邻近于L4等位基因中的赋予抗性部分的隐性基因引起了SNFD表型。所述基因本
身与L4等位基因遗传连锁，并破坏了受体植物基因组的染色体组织结构。因此，仅仅在被
作为完整L4等位基因的C.chacoense染色体基因渗入的纯合植物中才会表达SNFD表型。

[0021] 现在，既然已经获得了中断L4等位基因所赋予的需要的和不需要的表型之间的关联的可能性的重要发现，选出其中已经从L4等位基因中的赋予抗性部分的邻近部位去
除了SNFD表型的遗传信息或者所述遗传信息已经被变更到SNFD表型在纯合植物中不再被
组合表达的程度的植物已经成为可能。

[0022] 本发明的第一个部分现在提供了一种辣椒属植物，因为在所述植物的基因组中存在有L4抗性等位基因，使得植物表现出对辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗
性，其中所述L4等位基因是被截短的。截短提供了缩短长度的等位基因，并形成了有可育
性的以及表现出正常生长的非分离的植物，即缺少SNFD表型。

[0023] 通过去除或改变L4等位基因邻近部位的造成SNFD表型的遗传信息可以实现造成SNFD表型的遗传信息的缺失，优选地通过L4等位基因邻近 部位的重组事件可以实现所述
去除或改变。当SNFD信息只出现于等位基因的一侧时，单个重组事件就足以去除该信息。
当SNFD表型的遗传信息位于抗性等位基因的两侧时，优选地改变或去除该遗传信息的两
个部分。根据本发明的优选的实施方式，选出植物，其中已经发生了至少一次重组事件，优
选地发生了11号染色体南侧的L4等位基因的北侧(着丝粒侧)的重组事件，不过着丝粒
侧的截短也是可能的。对于二次重组而言，虽然重组事件并非一定都要发生于一个世代，但
是连续世代的重组事件可以一起造成抗性等位基因一侧或两侧的遗传信息的最终的去除
或改变。应当进行至少一个重组事件，使得能赋予抗性的遗传信息不会被去除，据此保持L4
抗性等位基因中的赋予抗性部分的存在。

[0024] 在本发明的植物的优选的实施方式中，所述L4抗性等位基因源自C.chacoense的基因组。

[0025] 为了评价是否去除或改变了适当的遗传信息，本领域技术人员可以适当地利用遗传标记物。本发明现在描述了一些可以用于标记物辅助选择重组植物的遗传标记物。所述
用途在本领域是公知的，并且在下面有着更为详细的描述。

[0026] 在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种其中缺少造成SNFD表型的遗传信息的植物，如缺少与L4抗性等位基因相连的至少一种标记物所提示的那样，其中所
述标记物选自由第2组标记物(E35/M49-F-90、E39/M58-F-65、E39/M51-F-380、E58/
M62-F-168、E66/M54-F-600和Tm3-DRS)、第3组标记物(E60/M54-F-447)、第1/3组标记
物(E63/M61-F-501、E66/M43-F-387、E66/M49-F-387、E66/M61-F-99、E67/M50-F-150、E67/
M62-F-214、E70/M54-F-133、E71/M47-F-550、E74/M61-F-385)组成的组，优选地是第3组和
2组标记物，更优选地是第2组标记物(E35/M49-F-90、E39/M58-F-65、E39/M51-F-380、E58/
M62-F-168、E66/M54-F-600和Tm3-DRS)。

[0027] 在另一个优选的实施方式中，本发明提供了一种其中缺少L4抗性等位基因的植物，如缺少与L4抗性等位基因相连的至少一种标记物所提示的那样，所述标记物选自第1
组标记物(E58/M50-F-580、E39/M58-F-95、E58/M60-F-255和E54/M55-F-101)、和第1/3组
标记物(E63/M61-F-501、E66/M43-F-387、E66/M49-F-387、E66/M61-F-99、E67/M50-F-150、
E67/M62-F-214、E70/M54-F-133、E71/M47-F-550、E74/M61-F-385)，优选地选自第1组标记
物，更优选地选自标记物E58/M50-F-580和E54/M55-F-101。

[0028] 上面所提及的标记物是以由“核心引物”(5′-GACTGCGTACCAATTC-3′和5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′)组成的AFLP引物为基础，加上如引物密码所示的三个附加的
选择性核苷酸，所述核心引物分别对应于限制性内切酶EcoRI(编码为E)和MseI(编码为
M)的限制性位点。在http://www.keygene.com/publications/index.htm以及具体地在其
中的题为“KF Nomenclature Primer Enzyme Combinations.pdf”的文档中可以找到引物
密码。在组合引物酶之后，记录下所扩增片段的大小(碱基对)。例如标记物E58/M60-255
说明在用引物酶组合(EcoRI+引物密码58/MseI+引物密码60)切割DNA后获得的255个
碱基对的扩增片段。

[0029] 引物密码如下：35：ACA；39：AGA；43：ATA；47：CAA；49：CAG；50：CAT；51：CCA；54：CCT；55：CGA；58：CGT；60：CTC；61：CTG；62：CTT；63：GAA；66：GAT；67：GCA；70：GCT；71：
GGA；74：GGT。引物酶组合密码的实例E63/M61-F-501为：EcoRI+GAA(＝E63)/MseI+CTG(＝
M61)。

[0030] 源 自 标 记 物TG036(Lefebvre et al.，2002) 的 标 记 物 Tm3-DRS是 通过PCR引 物 对P118(序 列5 ′-AATCCTTCAACTGCCATTTC-3 ′) 和引 物 P119(序 列
5′-ATTGGGACATGAGGTGTGTA-3′)所定义出的标记物，通过用引物P118和引物P119进行
PCR以及之后用TrulI(限制性位点TTAA)消化 PCR产物可以检测出该标记物。近350个
碱基对的扩增片段的存在说明存在L4等位基因。

[0031] 如下面更为详细描述的那样，也可以用提供具有截短的L4等位基因的说法来描述提供其中缺失或去除了造成SNFD表型的遗传信息的植物。与这种截短相关的部分可以
相似地应用于如上所述的遗传信息的去除或改变。

[0032] 在本发明的另一个优选的实施方式中，植物是辣椒种的植物。

[0033] 仍在本发明的植物的另一个优选的实施方式中，植物是L4抗性等位基因的纯合子，纯合植物优选地是近交植物。

[0034] 在另一个部分，本发明提供了因为在所述植物的基因组中存在L4抗性等位基因而表现出对辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物，其中所述L4等
位基因是截短的，以及其中所述截短包括去除距离端粒和/或着丝粒侧约为0.001到10cM
遗传距离的核苷酸序列，优选地去除距离等位基因的着丝粒侧约为0.001到10cM遗传距离
的核苷酸序列。如上所述的优选的实施方式也适用于本发明的这个部分的植物。

[0035] 所观察到的包括核心TM-3抗性基因的第1组标记物和第3组标记物之间的重组频率等价于约2cM距离。所观察到的第1组标记物和第2组标记物之间的重组频率也等价
于约2cM距离。因为缺少重组，不能测定出在此所给出的标记物组内的任一标记物之间的
距离。因此，在此所述的截短优选地代表距离位于任一第1组标记物的位置上的着丝粒侧
(第2组)或端粒侧(第3组)的任一标记物的不到2cM距离内的遗传缺失。

[0036] 在另一个部分，本发明提供了表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的杂种辣椒植物，其是通过杂交本发明的纯合的(优选地是近交的)植物和另一种表现出商业所需特性
的纯合的(优选地是近交的)辣椒植物获得的。

[0037] 仍在另一个部分，本发明提供了包括截短的L4抗性等位基因的分离的核酸序列，其中所述截短的L4抗性等位基因包括能够在辣椒属植物中 表达并据此赋予所述植物对
PMMoV致病型1.2.3的抗性的遗传信息，其中所述等位基因中不含赋予SNFD表型的遗传信
息。

[0038] 在这种分离的核酸序列的优选的实施方式中，赋予抗性的遗传信息包括至少一种选自包括标记物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/M60-F-255和E58/M50-F-580的组，
优选地选自由标记物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/M60-F-255和E58/M50-F-580组
成的组，更有优选地选自由标记物E54/M55-F-101和E58/M50-F-580组成的组中的标记物。
赋予抗性的遗传信息还包括赋予SNFD表型的遗传信息以及包括没有含有所述抗性等位基
因中的至少一种选自由第2组标记物和第3组标记物组成的组中的标记物，优选地是第2
组标记物。在最优选的实施方式中，本发明的分离的核酸序列中所包括的L4抗性等位基因
源自C.chacoense的基因组。

[0039] 在另一个部分，本发明提供了制备表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的方法，包括步骤a)提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒属受体植物或其部分，和
b)往所述受体植物或其部分或其子代植物中引入包括截短的L4抗性等位基因的基因组
区，其中所述等位基因包括能够在所述植物或植物部分或子代植物中表达并据此赋予所述
植物或植物部分或子代植物对PMMoV致病型1.2.3的抗性的遗传信息，其中所述等位基因
中的赋予SNFD表型的遗传信息至少缺失到不表达SNFD表型的程度。通过提供包括截短的
L4抗性等位基因的基因组区例如具有如在此所述的L4抗性等位基因的截短形式的重组供
体植物形式或者包括作为插入物的所述基因组区的载体形式都可以提前进行步骤b)。

[0040] 本发明的方法所用的包括截短的L4抗性等位基因的基因组区包括大小上比造成植物具有SNFD表型的L4等位基因更小的L4抗性等位基因。缩小L4抗性等位基因的大小，
但是该大小的缩小不会影响到赋予对PMMoV致病型1.2.3.的抗性的遗传信息。

[0041] 通过在源自受体植物和抗PMMoV致病型1.2.3的包括L4抗性等位基因的辣椒属供体植物的杂交的子代植物的基因组中的基因渗入可以实施用于实现非常合适的引入包
括截短的L4抗性等位基因的基因组区的方法。基因渗入的过程对于本领域技术人员是熟
知的，通常包括通过种间杂种与其一个亲本的重复回交将一个物种的一种或多种基因引入
到另一物种的基因池内。

[0042] 本领域技术人员容易明白，基因渗入并非是往植物的基因组种引入L4抗性等位基因或包括L4抗性等位基因的基因组区的唯一方式。其他方法可以包括例如应用转基因
技术例如单倍体细胞融合、植物转化等。因此通过体外培养技术、通过原生质体融合、通过
转化或通过双单倍体技术也可以实施所述基因组区的引入。这些技术常常并非都是实施于
完整植物，也可以实施于植物部分，通常是所述植物的繁殖物质例如单个细胞的组织培养
物或原生质体。因此，为了获得本发明的植物，这些方法可以任选地包括将所述植物部分产
生辣椒植物的附加步骤。通常这个步骤包括再生来自经异源DNA转化的植物部分或组织的
植物或所述植物的繁殖物质或两者，以及任选地包括生物学复制所述植物或繁殖物质或两
者。

[0043] 本发明的其中通过基因渗入方法将截短的L4抗性等位基因引入到辣椒植物的受体植物内的方法优选地产生了具有其基因组中被基因渗入包括截短的L4抗性等位基因的
基因组区的子代植物。因为获得具有截短的L4抗性等位基因的子代植物的方法包括重组，
优选地在实施任何基于子代植物的表型或基因型的选择之前产生了分离群。因此，所产生
的并在其基因组中具有截短的L4抗性基因的子代植物优选地是分离群的植物，例如通过
从上面所提及的杂交中获得的F1植物的自花传粉或者通过从所述杂交中获得的F1植物与
另一种辣椒植物的杂交所产生的分离群的植物。

[0044] 在本发明的方法中，优选地引入来自C.chacoense基因组的基因组区，以及在这种方法中所用的受体植物优选地是辣椒植物。

[0045] 尽管现在已经描述了产生本发明的植物的方法的基本元件，本发明的方法还可以包括附加的步骤。在优选的实施方式中，本发明的方法还包括步骤c)选择抗PMMoV致病型
1.2.3的植物或其抗PMMoV致病型1.2.3的子代植物；和d)选择没有表达SNFD表型的抗
性植物或抗性子代植物。

[0046] 用基于表型测定的方法可以实施选择抗PMMoV致病型1.2.3的植物或子代植物的步骤，例如通过施用抗性生物检测，例如通过给植物的叶子接种PMMoV致病型1.2.3的悬浮
液并评价感染的出现情况。但是，在优选的实施方式中，选择PMMoV致病型1.2.3抗性植
物的步骤包括筛选所述植物或子代植物的基因组中是否存在至少一种指示所述植物中存
在L4等位基因中的赋予抗性部分的选自包括1组或第1/3组标记物中的L4抗性等位基
因的标记物的过程。第1组的合适标记物包括标记物E39/M58-F-95、E54/M55-F-101、E58/
M60-F-255和E58/M50-F-580，优选地确定出存在至少一种选自由标记物E54/M55-F-101和
E58/M50-F-580组成的组中的标记物。适用于评价存在抗性性状的第1/3组的标记物包括
本领域人员已经确定出的抗性植物中所存在的那些标记物。1/3组的标记物包括指示L4抗
性等位基因的标记物以及指示等位基因中的赋予SNFD表型的标记物。因此，一些第1/3组
标记物指示去除了L4抗性等位基因中的赋予SNFD表型部分的合适的截短，其与第3组标
记物类似，而其他的第1/3组标记物指示存在核心的抗性基因或调节序列，因此其与第1组
标记物类似。

[0047] 从所述的抗PMMoV致病型1.2.3的植物中选择不表达SNFD表型的植物或子代植物的步骤(上述的步骤d)构成了本发明所述的标记物辅助性育种方法的核心。对不表达
SNFD表型的抗性植物或子代植物的选择优选地包括筛选抗性植物或子代植物的基因组中
的截短的L4抗性等位基因是否存在至少一种选自由第2组标记物和第3组标记物组成的
组中的L4抗性 等位基因的标记物(也任选地选自第1/3组标记物，优选地选自第2组标
记物)，以及选择其中作为截短指示的不存在至少一种所述标记物的植物或子代植物。

[0048] 在另一个部分，本发明提供了用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属近交植物的方法，包括实施如上所述的产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣
椒属植物的方法，以及还实施了步骤：e)所选植物的自花传粉；f)播种从所述自我传粉中
获得的种子，并由所述种子产生植物；g)从步骤f)的植物中鉴定出表现出对PMMoV致病型
1.2.3的抗性以及具有商业所需特性的植物；和h)重复e)至g)，直到产生了表现出PMMoV
致病型1.2.3抗性以及具有商业所需特性的近交辣椒植物。本发明上下文中的商业所需特
性可以涉及任一特性例如果实特性，如改善外观、更高的种子产率、提高可育性、更高的果
实产率、更大的或更小的果实、或改善果实颜色或味道；或者例如特性如改善茎强度、改善
茎系统、改善应激抗性、改善疾病抗性等。在实践中，商业所需特性可以是使得植物比野生
型植物具有更高商业价值的特性。

[0049] 在另一个部分，本发明提供了通过上述的本发明的任一方法获得的表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物或近交植物。

[0050] 在其他部分，本发明涉及本发明植物的子代、植物部分例如叶子、茎、根、根尖、根茎、秧、果实等或本发明的植物部分例如细胞、原生质体、愈合组织、细胞团、(体细胞)胚、
花药、叶柄、花粉、胚珠、花、培养细胞、种子等等。这些部分可以适用于繁殖，优选地通过
(器官)组织培养，或者这些部分可以适用于消费例如果实。

[0051] 在另一个部分，本发明提供了通过生长本发明的辣椒植物产生的辣椒种子。

[0052] 在另一个部分，本发明提供了通过杂交本发明的方法获得的本发明的近交辣椒植物和优选地表现出商业所需特性的近交辣椒植物获得的表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗
性的杂种辣椒植物或其部分。

附图说明

[0053] 图1显示了指示不同组(第1、2、3、1/3组)标记物的、与实施例1中所示的表1中罗列的每个组中所具有的与该基因座标记物相连的L4基因座的微图谱。

[0054] 图2显示了其中指示了单个标记物的相同的微图谱。

[0055] 图3提供了关于在此所用的标记物的详细信息，具体地是核苷酸序列信息和标记物长度。标记物长度是通过利用从编号PI260429的C.chacoense中分离到的基因组DNA
作为模板DNA以及所示的引物实施PCR反应扩增到的DNA片段的碱基对的近似长度。

具体实施方式

[0056] 定义

[0057] 在此提供的标题并不是对通过整体引用本说明书所能够得到的本发明的各个方面或实施方式加以限制。因此，通过整体地引用本说明书更充分地定义了在下面所定义的
术语。

[0058] 术语“L4抗性等位基因”或“L4等位基因”在此表示辣椒属物种的L4基因的致病型特异性抗性等位基因，它为这些植物提供了对番茄花叶病毒(ToMV)和辣椒轻型斑驳病
毒(PMMoV)致病型1、1.2和1.2.3的抗性，如Boukema(1984)首次所述的那样，所述基因
是L基因座的一部分。L基因座所位于的区域位于11号染色体南侧的端粒上。无截短形
式的L4等位基因与标记物Tm3-DRS相关。L4等位基因因此表示如下所述的核苷酸序列，
例如源自编号PI 260429的C.chacoense的核苷酸序列，所述核苷酸序列与在此所定义的
一种或多种第2组标记物(E35/M49-F-90、E39/M58-F-65、E39/M51-F-380、E58/M62-F-168、
E66/M54-F-600和Tm3-DRS)和一种或多种第3组或第1/3组标记物(E60-M54-F-447、
E63/M61-F-501、E66/M43-F-387、E66/M49-F-387、E66/M61-F-99、E67/M50-F-150、 E67/
M62-F-214、E70/M54-F-133、E71/M47-F-550、E74/M61-F-385)相毗邻，且所述核苷酸序列赋
予对PMMoV致病型1.2.3的抗性。

[0059] 术语“辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)致病型1.2.3”在此表示能克服L3等位基因所赋予的抗性的感染辣椒的轻型斑驳病毒的病毒株。在文献中，常常用术语PMMoV抗性株表
示这些病毒株。要明白ICTV所认证的缩写词PMMoV和PMMV都可以用于表示辣椒轻型斑驳
病毒。在文献中可以遇到的PMMoV的同义词是：烟草花叶病毒的Samsun潜伏株(SL-TMV)、
辣椒花叶病毒和辣椒属花叶病毒。因为病毒分类的快速发展，一些最初被分类为辣椒轻型
斑驳病毒(PMMoV，ICTV十进制编码71.0.1.0.007)的病毒株(主要是最初的Dutch病毒株
(Tobias et al.，1982))现在被重新分类成红辣椒轻型斑驳病毒(PaMMV，ICTV十进制编码
71.0.1.0.006)。术语“辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)致病型1.2.3”在此因此也包括能克服辣
椒植物中L3等位基因所赋予的抗性的PaMMV株。术语“辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)致病型
1.2.3”所示的病毒的实例在此包括，但不限于下面的病毒株：TMV的分离株P14(Boukema，
1982；Tobias et al.，1982；Rast，1988)、PMMoV-1所示的意大利株(Wetter et al.，1984；
Rodriguez-Cerezo et al.，1989；Velasco et al.，2002；Berzal-Herranz et al.，1995；
Garcia-Luque et al.，1993)、PMMoV-S所示的西班牙株(Tenllado et al.，1997；Velasco
et al.，2002；Tenllado et al.，1996；Berzal-Herranz et al.，1995；Garcia-Luque et
al.，1993；Alonso et al.，1991；Avila-Rincon et al.，1989；Rodriguez-Cerezo et al.，
1989.)、PMMoV-J和PMMoV-Ij所示的日本株(Tsuda et al.，1998；Hagiwaraet al.，2002；
Kirita et al.，1997)、PMMV-k所示的韩国株(Lim et al.，1997)、和PaMMV(Garcia-Luque
et al.，1993；Ruiz del Pino et al.，2003；Gilardi etal.，2004)。描述辣椒轻型斑驳病
毒和红辣椒轻型斑驳病毒的权威参考文献是i.a.Brunt，A.A.，Crabtree，K.，Dallwitz，
M.J.，Gibbs，A.J.，Watson，L.andZurcher，E.J.(eds.)(1996 onwards).″Plant Viruses
Online：Descriptions andLists from the VIDE Database.Version：16th January
1997.″和国际病毒分 类学委员会的通用病毒数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
ICTVdb/index.htm)。

[0060] “截短的等位基因”在此被定义为遗传距离的大小比完整等位基因更小的等位基因。例如通过缺少至少一种相连的标记物和/或缺少可识别的表型(在本申请中为SNFD
表型)可以显示出大小的缩小。

[0061] 术语“等位基因”在此表示基因的任何一种或多种可选择的形式，所有等位基因都与至少一种性状或特性相关。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占据了一对同源
染色体上的相应基因座。因为本发明涉及QTL，即可以包括一种或多种基因或调节序列的基
因组区，因此在某些时候用“单倍型”而不是“等位基因”是更为准确的，但是，在那些时候，
术语“等位基因”应当被理解成包含术语“单倍型”。当等位基因表达相似的表型时，它们被
认为是相同的等位基因。序列差异是有可能的，但并不是重要的，只要它们不影响表型。

[0062] “基因组区”在此被定义为核苷酸序列，优选地是DNA序列，其可以包括具有不同的基因组功能的序列例如基因和调节元件区。基因组区可以是核苷酸构建体，也可以包含于
载体内。同样地，在杂交所述植物之后，通过染色体重组可以将基因组区从一种植物转移到
另一种植物。基因组区理论上可以包括源自一种或多种物种的遗传物质。

[0063] “基因”在此被定义为由DNA序列构成的遗传单位，所述DNA序列占据了染色体上的特异位置并且含有生物体的特殊特性或性状的遗传指令。

[0064] “基因座”在此被定义为遗传图谱上的位置，其是给定物种的染色体上的给定的基因位置。

[0065] 术语“杂合子的”在此表示当不同的等位基因位于同源染色体上的相应位置时所存在的遗传状态。

[0066] 术语“纯合的”在此表示当相同的等位基因位于同源染色体上的相应位置时所存在的遗传状态。纯合性在此被定义为在单个植物的自我传粉之后没有分离，或者在与易感
株杂交之后，F1没有出现分离现象。

[0067] 术语“杂种”在此表示两种遗传学上不像的个体之间杂交的任何子代(Rieger etal.，1968)。

[0068] 术语“近交”在此表示基本上纯合的单体或品系。

[0069] 在本申请中，“重组事件”被理解为(减数分裂)交换。

[0070] 术语“基因渗入”、“被基因渗入的”和“基因渗入的”在此表示通过杂交这些物种将一个物种、品种或栽培品种的基因移动到另一个物种、品种或栽培品种的基因组内的方法。
该杂交可以是天然的或人为的。任选地通过与轮回亲本的回交可以实现该方法，在这种情
况中，基因渗入表示通过种间杂种与其中一个亲本的重复回交将一个物种的基因渗入到另
一物种的基因库内。基因渗入也可以被描述为被稳定地整合到受体植物的基因组中的异源
的遗传物质。

[0071] “遗传加工”、“转化”和“遗传修饰”在此都是将任何种类的遗传信息转移到靶植物的DNA(通常但不一定是另一种生物体的染色体DNA或基因组)内的同义词。遗传加工是
将异源遗传物质稳定地整合到受体植物的基因组内的方法，其可以包括用包括异源DNA的
DNA重组体转化植物的细胞或组织的方法，异源DNA包括编码基因或其等位基因变体的外
来核苷酸序列以及选自能够使得异源DNA稳定整合到植物细胞或组织内并且能够使得在
植物细胞或植物组织中表达外来核苷酸序列的调节元件中的调节元件。

[0072] 术语“分离的标记物”在此表示利用任一技术获得的标记物，例如限制性内切酶多态性(RFLP)标记物、扩增片段长度多态性(AFLP)标记物、单核苷酸多态性(SNP)标记物、
微卫星标记物、序列特征性扩增重复(SCAR)标记物或同工酶标记物或在此所述的标记物
的组合，所述标记物定义出了特异的遗传学的染色体位置，并且检测出了两个等位基因 之
间的多态性。在此所提供的作为代表性标记物的第1、2、3组和第1/3组标记物(具体地是
AFLP标记物)是由双链或单链核苷酸序列组成的，所述双链或单链核苷酸序列是通过用辣
椒属基因组DNA作为模板，用图3所示的第一和第二引物的引物序列作为一对扩增引物，实
施核酸扩增反应而获得的，以便使得由辣椒特异性核苷酸序列或其互补序列组成的双链或
单链核苷酸序列的每一侧为所述引物序列或其互补序列。术语“辣椒特异性核苷酸序列”
在此表示当利用编号PI 260429的C.chacoense的基因组DNA作为模板DNA时所获得的序
列，并表示与所述序列的相似性至少为90％、优选为95％、更优选为97％、甚至更优选为超
过98％的序列。

[0073] 术语“限制性内切酶片段长度多态性”或“RFLP”在此表示经特异的限制性内切酶切割的单个片段在DNA片段大小方面的变异。造成RFLP的多态性片段用作为遗传连锁图
谱上的标记物。

[0074] 术语“群”在此表示共享有共同遗传学来源的、遗传学上同源的或异源的植物的集合。

[0075] 术语“品种”或“栽培品种”在此表示一组可以从相同物种的其他品种中鉴定出的结构特征和性能方面相似的植物。术语“品种”在此与1972年11月10日、1978年10月
23日、以及1991年3月19日在日内瓦修改过的1961年12月2日的保护植物新品种的国
际公约(UPOV协定)中的相应定义具有相同的含义。因此，“品种”表示最低已知级别的单
个植物类别内的植物分组，不论是否完全满足给育种者授权的条件，i)通过表达给定基因
型或基因型的组合所形成的特性可以定义出分组；ii)通过表达至少一种所述特性可以从
任一其他的植物分组中区分出该分组；以及iii)所述分组在其可被不变更地繁殖的适用
性方面可以被认为是一个单元。

[0076] 术语“辣椒”或“辣椒属”在此表示辣椒属的任何种、品种、栽培品种或群。

[0077] 在一个方面，本发明提供了表现出对辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物。本发明的辣椒属植物可以是辣椒属的 任一物种，其包括但不限
于辣椒、C.baccatum、C.cardenasei、C.chacoense、黄灯笼辣椒、C.eximium、小米椒、
C.microcarpum、小 辣 椒(C.minimum)、C.pendulum、C.praetermissum和C.pubescens。
本发明的植物优选地是开白花的辣椒属物种，优选地是辣椒、小米椒、黄灯笼辣椒、或
C.chacoense植物，更优选地是辣椒、小米椒或黄灯笼辣椒植物，仍更优选地是辣椒或小米
椒植物，最优选地是辣椒。在一个甚至更为优选的实施方式中，本发明提供了具有农艺学上
或商业所需特性的辣椒植物。

[0078] 术语“辣椒(C.annuum)”在此表示辣椒属的辣椒植物，其中植物的基因组包括作为遗传背景的辣椒基因组。这种植物基本上都具有辣椒基因组，其中作为重组、转化或任何其
他方法的结果，其已经整合了其他物种的DNA。本领域技术人员要明白，两种植物物种之间
的育种将形成具有两个亲本的特性和遗传物质的植物，因此使得物种之间的分界线变得模
糊。这些植物在此都被称作辣椒植物。

[0079] 1952年美国南加州首次在辣椒中报道了烟草花叶病毒属的辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)(McKinney，1952)。症状包括轻微的萎黄和发育障碍，特别是如果植物是在幼苗时
被感染的。果实可以是小的、变形的、斑驳的以及可以具有坏死性凹窝，因此使得它们无法
销售。PMMoV是通过植物之间的紧密接触、通过种子表面上的病毒体、以及通过嫁接传播
的。在多个国家都报道了该病毒(阿根廷、澳大利亚、加拿大、丹麦、法国、匈牙利、冰岛、意
大利、日本、韩国、荷兰、西班牙、英国和美国)。通过使用抗性栽培品种极好地实现了疾病控
制。已经报道了能够克服L4等位基因所赋予的抗性的新病毒株(Antignus et al.，2000)。

[0080] 本发明的植物中的对辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)致病型1.2.3的抗性是因为植物基因组中存在L4抗性等位基因。本发明的植物基因组中的赋予对PMMoV致病型1.2.3的
抗性的L4抗性等位基因可以源自任何来源。 根据本发明的优选的实施方式，L4抗性等位
基因源自C.chacoense，更优选地源自编号PI 260429和SA 185的C.chacoense(Boukema，
1983)。

[0081] 本发明的植物能够将PMMoV抗性转移给子代，并且可以是L4抗性等位基因的杂合子，但是优选地是L4抗性基因的纯合子。作为L4抗性等位基因纯合的本发明的植物没有
表现出可育性下降和/或生长矮小。

[0082] 当植物没有表现出可育性下降和/或生长矮小时，推断植物缺少足够多的引起SNFD表型的遗传信息，或者该遗传信息已经被充分地灭活。造成SNFD表型的遗传信息的缺
少至少到不表达SNFD表型的程度。

[0083] 本发明人通过AFLP已经确定出在L4等位基因的邻近部位存在着不同的遗传标记物，并且已经发现根据标记物之间或标记物和L4等位基因之间的重组，这些标记物可以被
分成不同的组(见实施例中的表1)。图1显示与L4基因座相连的不同组标记物的位置。
第1组标记物被认为处于与L4等位基因本身最为接近的位置，使得在PMMoV致病型1.2.3
的生物检测中没有观察到指示存在L4等位基因的标记物和抗性标记之间的重组。第2组
和第3组标记物分别位于第1组标记物的每一侧。第4个组是由位于横跨第1组和第3组
的区域内的标记物组成的，该组标记物在此被叫做第1/3组标记物。

[0084] 第1/3组内的标记物是不同的，其中到目前为止每种这些标记物都不能被放置于第1组或第3组内，因此在给定标记物和第1组标记物之间、给定标记物和第3组标记物之
间都没有观察到重组。因为在第1/3组和第2组标记物之间观察到了重组，因此这两组中
的标记物的遗传位置是明显不同的，这些标记物的确切位置是第1组或第3组。

[0085] 迄今为止，在每一组内部都没有观察到重组。

[0086] 图1的图谱朝向染色体剩余部分的定位是使得第2组标记物位于11号染色体南侧的着丝粒侧以及第3组标记物位于端粒侧(朝向末端)。即分离群PY的等位基因的主要
部分位于11号染色体的标记物TG036的下方，如 Lefebvre et al.，2002中的图1所示的
辣椒的种间共同连锁图谱所展示的那样，本申请在此引用了该图。

[0087] 发现在具有抗性的和L4等位基因纯合的以及缺少第2组、第3组或第1/3组中的任一标记物(特别是第2组中的标记物)的植物没有表现出SNFD表型。因此，可以用其他
基因型的同源NDA取代与L4等位基因正常连接的特定的基因组区，且不影响抗性，还会强
烈地影响到生长和可育性，以及将抗性性状遗传给子代植物的行为。

[0088] 例如通过传统杂交(植物杂交)技术的方式可以获得没有SNFD表型的植物。但是，条件是施用正确的选择标准。根据本发明，现在已经定义出了合适的选择标准，即L4抗
性等位基因邻近部位的遗传信息的完全或部分缺失或失活。根据本发明，在重组中缺失或
抑制了多少抗性等位基因周围的遗传信息或者赋予SNFD表型的基因被何种方式灭活都是
无关紧要的，只要植物和其子代没有SNFD表型。

[0089] 为了发现其中已经在L4等位基因和引起SNFD表型的基因之间发生了重组的植物、分离群或这些群的子代，在实践中是通过筛选具有重组表型即PMMoV致病型1.2.3抗性
的纯合子以及联合非SNFD表型的植物。

[0090] 尽管以这种方式发现合适的重组体是有可能的，但是有很多原因导致发现农艺学上有价值的重组体是复杂的。如前所述，纯合子可表现出SNFD表型。但是，发现如果这些
纯合子与易感植物(即不含有L4等位基因)杂交，F1可表现出抗性以及没有SNFD。这是
因为L4抗性等位基因是显性的，而造成SNFD表型的基因是隐性的。

[0091] 具有单拷贝的C.chacoense染色体片段的植物的子代因此将组合有抗性和正常(无SNFD)的表型。但是，它们的F1子代将出现抗性表型的分离，因此这些植物不能在商业
上应用，因为商业的辣椒属品种必须满足对遗传均一性的严格要求，以便能进行循环。

[0092] 尽管可以出现上述的困难，但是以传统的方式选择其中缺少SNFD表型的遗传信息的所需植物显然是非常有可能的。但是，这种方式的选择的确需要相当大量的分离群或
大量用于鉴定的杂交。

[0093] 因此，利用分离生物学工具选择合适的植物将是更为有效的。一种有效的技术是如Vos et al.，1995所述的AFLP技术。

[0094] 当应用于本发明时，本技术是基于对DNA标记物的基因定位，所述DNA标记物在遗传学上与L4等位基因相连接，之后可以用相当简单的方式确定出在杂交试验的子代的L4
等位基因的邻近位置上是否发生了重组事件。通过使用分子标记物可以显著地增加选择具
有L4等位基因以及无SNFD表型的组合的纯合性的植物的效率。当缺少L4相连的标记物
时，(因此)已经发生了L4等位基因和标记物之间的交换。通过选择与等位基因有着不同
的遗传距离的标记物，可以确定出重组的位置，因此使得可以确定出等位基因的邻近位置
是否或多或少都有所消失。因此，其中没有一种或多种相连的标记物的子代至少缺少一段
不利的等位基因的邻近部分，并因此具有比平均机会更多的存在其中没有造成SNFD表型
的遗传信息的具有L4等位基因的染色体的机会。

[0095] 对等位基因的邻近部位的遗传标记物的基因定位是一种分子生物学技术领域的技术人员非常容易实施的方法，例如在Lefebvre和Chevre，1995；Michelmore，1995；
Winter和Kahl，1995中描述了相关的技术。在Voset al.(见上)中可以找到关于AFLP技
术的综合信息。

[0096] 在本发明的实施方式中，本发明的其中存在纯合子状态的抗性等位基因以及不表达SNFD表型的植物可以适用于将PMMoV P1.2.3抗性转移到其他的农艺学上有价值的辣椒
属类型内。因此，通过杂交纯合植物(优选地是近交系)和另一种辣椒植物可以产生杂种
辣椒植物。抗或不抗PMMoV P1.2.3的其他辣椒植物优选地是纯合植物，甚至更优选地是近
交系。

[0097] 在本发明的实施方式中，本发明的其中存在纯合子状态的抗性等位基因以及不表达SNFD表型的植物也可以用于将PMMoV P1.2.3抗性固定到其他的农艺学上有价值的辣椒
属类型内。例如利用通过标准的回交方法(见例如Briggs and Knowles，1967)、随后通过
植物自花授粉至少两代以及选择具有抗性等位基因的纯合子且不表达SNFD表型的植物的
方式可以实现所述固定。

[0098] 在选择方法的特殊步骤中，使用异花授粉。但是，在被用作雌性亲本的植物中，要预防需要自体授粉的自花授粉植物的异花授粉。通过人为地去除繁殖器官的雄性部分可以
实现这一点。这可以通过物理去除或通过化学试剂和/或对花施用水的方式可以来实现。
所有这些去除了或使得繁殖器官的雄性部分无功能的方法在本领域是公知的。通过引起杂
交的雌性亲本产生种子，收集F1或回交种子以及播种种子获得新的植物可以获得杂交的
子代。F1植物可以被自花授粉产生F2代或者与回交方案中的轮回亲本进行回交。回交植
物还可以与(轮回)亲本杂交，以便提高后代植物的农艺学价值，或者回交植物可以自花授
粉产生L4等位基因纯合的且不表达SNFD表型的植物。

[0099] 在本申请中，结合辣椒阐述了本发明。对于本领域技术人员显而易见的是本发明的原理同样适用于辣椒属的其他物种，以及更常见地适用于其中可以引入L4等位基因而
被赋予PMMoV抗性的茄科植物。理论上，本发明的各个部分都可以涉及受PMMoV感染的所
有植物，本发明的理论同样适用于PMMoV宿主范围内的任何植物物种。在此上下文中，对
PMMoV宿主范围进行了特定的引用，如官方引述为“Brunt，A.A.，Crabtree，K.，Dallwitz，
M.J.，Gibbs，A.J.，Watson，L.and Zurcher，E.J.(eds.)(1996 onwards).′Plant Viruses
Online：Descriptions and Lists from the VIDEDatabase.Version：20th August
1996.′URL：http://biology.anu.edu.au/Groups/MES/vide/”的网络文献中所述的那
样，但是在http://image.fs.uidaho.edu/vide/refs.htm中也可以找到PMMoV的宿主 范
围。在此上下文中，也应当引用Dallwitz，1980 and Dallwitz et al.，1993。对辣椒的参
照不应当被视为对本发明的限制。

[0100] 除了辣椒属植物本身以及其适用于消费的部分例如果实外，本发明还包括适用于繁殖的植物部分。如上所述，本发明并不限于辣椒植物的植物部分，而是涉及PMMoV的宿主
范围内的任何植物的部分。适用于繁殖的部分实例是器官组织例如种子、叶子、茎、根、秧
等、原生质体、体细胞胚、花药、叶柄、培养细胞等。不仅可以以传统方式还可以通过植物部
分的组织培养技术方式培育或繁殖本发明的植物。

[0101] 用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的本发明的方法包括提供易感于PMMoV致病型1.2.3的辣椒属的合适受体植物的步骤。

[0102] 用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的本发明的方法还包括将例如供体植物中的L4抗性等位基因引入到所述受体植物中的步骤，其中L4抗性等位
基因赋予所述受体植物对PMMoV致病型1.2.3的抗性。

[0103] 用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的本发明的方法还包括从所述抗性植物中产生分离群的步骤。

[0104] 用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的本发明的方法还包括产生所述分离群的基本上每种植物的子代的步骤。通过容许所述植物产生种子、例如通
过杂交或自交所述植物以及所述种子产生新植物可以产生子代或后代。同样地，用其他合
适的技术可以获得子代。这些可选择方案在植物育种领域是相当常见的。

[0105] 用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的本发明的方法包括从至少一种所述子代中选出其基因组内存在L4抗性等位基因以及其基因组内的造成SNFD
表型的遗传信息至少缺失到不表达SNFD表型的程度的植物。

[0106] 本发明的植物基因组中的L4抗性等位基因的存在可以是任何原因(天然或人为原因)的结果，以及可以例如是基因渗入、遗传加工(转化)或原生质体融合的结果。

[0107] 利用本领域已知的技术可以完成往无抗性的或具有低水平的PMMoV抗性的受体植物中基因渗入供体植物的一种或多种编码L4抗性的基因。例如，任选地联合分子筛选方
法例如利用标记物，用传统育种技术可以将一种或多种编码PMMoV抗性的基因即L4等位基
因基因渗入到无抗性的受体辣椒植物或具有低水平的PMMoV抗性的植物内。

[0108] 传统育种技术可以适用于将供体植物的一种或多种编码PMMoV抗性的基因基因渗入到无抗性的或具有低水平PMMoV抗性的受体植物内。这些方法包括物种、品种或栽培
品种的传统杂交，只要这些物种、品种或栽培品种可以相互杂交。当计划的供体和受体只能
有限程度地相互杂交时，可以使用桥接物种。

[0109] 在一种传统育种方法(称作谱系育种)中，表现出对PMMoV的抗性以及含有编码PMMoV抗性的L4等位基因的第一种辣椒植物与无PMMoV抗性或具有低水平的PMMoV抗性以
及表现出农艺学上或商业所需特性例如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、有价值的果实特性
等的第二种辣椒植物杂交。然后所形成植物群(即F1)被容许自花授粉并收获种子(F2种
子)。

[0110] 筛选由F2种子产生的F2植物的PMMoV抗性。可以用多种不同的方法筛选群。首先，用在此也称作抗性生物检测的传统的病理疾病筛选法筛选群。PMMoV的这种生物检测
在本领域是已知的。具体地，可以在孵育箱或温室中用PMMoV攻击单个植物或其部分，并对
所形成的每种植物的抗性或易感表型进行计分(score)。作为示例但不作为限制，可以如
下在温室中筛选植物：在通常适用于辣椒植物培育的以及本领域技术人员已知的生长条件
下，例如白天为22℃以及夜间为20℃的温度以及在正常的夏季日照条件下，在温室中由F2
种子产生辣椒植物。F2植物例如也可以 生长于还含有对照植物例如一种或多种抗性植物
以及一种或多种易感植物的花盆(tray)内。受感染的叶子可以作为接种物，其可以是冷冻
储存的。通过用水碾磨受感染的叶子(例如用100ml水碾磨1g冷冻叶)以及添加碳化硅
(碳化硅)可以制备出包括测试病毒的接种物。通过用海绵往植物的第一真叶的表面(例
如最小3.5×2cm)上涂擦接种物可以实现对测试植物的接种。在第一次观察之后，可以去
除肉眼可判断为易感的植物(看得见的症状是全身花斑)。在1周后的第二次观察期间，可
以计算出易感的抗性植物的数目。对于叶子测试，可以将叶子(距离植物顶部4-5cm)放置
于含有湿滤纸的花盆内，并将叶子放置于滤纸的顶部。往花盆(Tray)中加入易感的和抗性
的对照植物，用塑料包裹花盆，并将花盆置于16小时/天光照方案中、20℃下。如上所述，
可以用海绵进行接种，在6-8天后进行评价。

[0111] 或者，可以联合分子筛选方法实施传统育种方法。这些方法一般被称作标记物辅助性选择或标记物辅助性育种，并包括利用一种或多种分子标记物鉴定出那些含有一种或
多种编码所需性状的基因(即L4等位基因或其截短形式)的子代植物。基因组的遗传组成
可以预测出植物的表型，以及长度的生物检测不再是必需的。也可以用标记物辅助性选择
验证从生物检测筛选中获得的结果。然后可以选出表现出PMMoV抗性表型的F2杂种植物，
所述植物含有编码PMMoV抗性所需的基因以及那些附加的商业所需特性所需的基因，并且
所述植物可以被自体授粉数代，以便容许辣椒植物成为逐渐近交的。这种育种和选择的结
果是产生了具有遗传上同品系的与PMMoV抗性相关的基因以及与商业相关性状有关的其
他基因的植物品系。

[0112] 本发明现在提供了产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的方法，包括步骤：

[0113] a)提供第一种对PMMoV致病型1.2.3或其部分易感的辣椒属植物；

[0114] b)提供第二种因为在所述植物的基因组中存在L4抗性等位基因而表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物；

[0115] c)杂交第一种和第二种植物，产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的子代植物；和

[0116] d)进一步筛选所述抗性子代植物的基因组中是否存在截短的L4抗性等位基因，其中所述等位基因包括赋予所述子代植物对PMMoV致病型1.2.3的抗性的遗传信息，以及
其中所述等位基因中的赋予SNFD表型的遗传信息至少缺少到不表达SNFD表型的程度。

[0117] 在本发明的优选实施方式中，通过评价是否缺失至少一种L4抗性等位基因的标记物进行步骤d)中的筛选，所述标记物选自由如图3所示的第2组标记物、第1/3组标记
物和第3组标记物组成的组，优选地是如图3所示的第2组标记物。

[0118] 根据本发明的方法，所选的商业所需特性包括缺少SNFD表型，说明与无PMMoV致病型1.2.3抗性的商业辣椒属品种相比较，所述植物是非分离的、可育的并表现出正常的
生长。用任一合适的方法可以鉴定出植物中的这些特性。例如，通过肉眼观察生长性状可
以鉴定出正常的生长特性，其中没有矮小生长表示正常生长。通过肉眼观察种子和/或花
粉的数量可以评价可育性。通过评价对如上所述的杂交(抗性对易感株)的F1种子的抗
性筛选的测试结果可以评价非分离的表型。

[0119] 或者，通过筛选植物是否缺少特异标记物可以评价是否缺少SNFD表型。在本发明的植物和方法的特别优选的实施方式中，缺少一种或多种第2组标记物。因此，在一个优选
的实施方式中，用于产生表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性的辣椒属植物的本发明的方
法包括从至少一种抗性植物的分离群的子代中选择出其基因组中存在在此所述的一种或
多种(优选的全部的)第1组标记物以及其基因组中没有在此所述的一种或多种第2组标
记物的植物的步骤。

[0120] 在本发明的植物的另一个实施方式中，缺少一种或多种如在此所述的第3组标记物。仍在本发明的植物的另一个实施方式中，缺少一种或多种如在此所述的第1/3组标记
物。在此上下文中，一种或多种第1/3组标记物的缺失应当被理解为仅仅没有那些位于造
成对PMMoV致病型1.2.3的抗性的基因组区内的标记物，因为这些遗传信息的缺失就不会
形成因为在植物的基因组内存在L4抗性等位基因而表现出对PMMoV致病型1.2.3的抗性
的植物。因此，一种或多种第1/3组标记物的缺失优选地只涉及那些位于对应于第3组标
记物的区域的标记物，优选地不涉及第1组标记物的区域。在最优选的实施方式中，L4等
位基因是被截短的，使得一种或多种第2组标记物是缺失的。在这种情况中，截短是着丝粒
侧的，而在第3组标记物截短的情况中，截短是端粒侧的。在另一个最优选的实施方式中，
所述截短使得TG036(Lefebvre et al.，2002；Ben-Chaim et al，2001)标记物(第2组标
记物的一种成分)是缺失的。

[0121] 通过往植物内引入包括L4等位基因的截短形式的C.chacoense基因渗入(在此称作截短的L4等位基因)因此可以实现具有L4等位基因的植物中的SNFD表型的缺失。本
领域技术人员可以容易地确定出截短的程度。例如，通过或者经转基因方法或经重组和选
择的方法部分或完全去除其中任一包括2组、3组和第1/3组标记物的基因渗入区域可以实
现合适水平的截短，只要当去除包括第1/3组标记物的区域时，只去除那些不具有造成对
PMMoV致病型1.2.3的抗性的信息的区域部分。优选地，所述截短涉及包括第2组标记物
的包括L4等位基因的C.chacoense基因渗入区域的部分或完全去除。因此，或者通过转基
因方法或者通过重组和选择的方法去除包括一种或多种第2组标记物的区域将形成不再
表达SNFD表型的植物。最优选地，该截短将造成TG036标记物的去除(Lefebvre et al.，
2002；Ben-Chaim et al，2001)。

[0122] 截短水平也可以被定义为遗传距离。通过相同染色体上的基因座之间的交换频率可以测定出遗传距离。两个基因座离得越远，它们之间发 生交换的可能性就越大。相
反地，如果两个基因座彼此非常接近，它们之间就不太可能发生交换。用在此所定义的各
种标记物组中的标记物可以指示出基因座。通常1厘摩(cM)等于基因座(标记物)之间
的1％重组。造成一种或多种2组、3组和/或1/3组的标记物缺失的截短水平优选地可
以是0.001-10cM，更优选地是0.01-10cM。或者，指示存在基因渗入(例如一种或多种第
1组标记物)以及被截短的标记物之间的遗传距离可以优选地是0.001-10cM，更优选地是
0.01-10cM。

[0123] 利用重复选择和回交技术也可以开发出新的优秀的PMMoV抗性的近交辣椒植物品系。在这个方法中，通过杂交轮回亲本和第一个供体植物(其不同于轮回亲本，在此称作
“非轮回亲本”)可以将L4抗性基因渗入到靶受体植物(叫做轮回亲本)内。轮回亲本是无
抗性的或具有低水平的PMMoV抗性以及具有商业所需特性例如但不限于疾病抗性、昆虫抗
性、有价值的果实特性等、以及其中没有SNFD表型的植物。回交方法被广泛地应用于将“供
体亲本”的基因杂交到具有高农艺学价值的遗传背景内。通常通过3到5次回交以及随后
的例如2到3次自花授粉可以实现显性基因往农艺学可接受的表型内的基因渗入，其中在
所有步骤中都执行了对农艺学价值的选择。非轮回亲本表现出PMMoV抗性并含有L4抗性
等位基因。非轮回亲本或供体亲本可以是任一植物品种或近交系，其可以与轮回亲本或靶
向受体植物杂交可孕的。将轮回亲本和非轮回亲本之间杂交产生的子代与轮回亲本回交。
然后筛选所形成的植物群。可以用多种不同的方式筛选群。首先，用如在此先前所述的传
统病理筛选法筛选群。

[0124] 其次，利用一种或多种在此前所述的分子标记物进行标记物辅助性选择，以便鉴定出含有L4抗性等位基因以及其中缺少一种或多种与SNFD表型相关的标记物的那些子
代。或者，可以用标记物辅助性选择验证从抗性生物检测筛选中获得的结果。

[0125] 一旦进行了适当的选择，就重复所述过程。与轮回亲本回交以及选择PMMoV抗性及缺少SNFD表型(或者与之相关的标记物)的过程被重 复了近5代或更多代。该过程所
形成的子代是L4等位基因的杂合子。然后末次回交的子代被自花授粉，以便提供包括赋予
PMMoV抗性的L4等位基因以及缺少SNFD表型的纯合的纯种的育种子代。

[0126] 在附加的杂交中，可以用在此所述的L4等位基因纯合的以及不表达SNFD表型的PMMoV抗性近交辣椒品系产生PMMoV抗性的杂种植物。例如，第一种PMMoV抗性近交辣椒植
物可以与具有商业所需性状例如但不限于疾病抗性、昆虫抗性、所需的果实特性等的第二
种近交辣椒植物杂交。第二种近交辣椒品系可以抗或者不抗PMMoV。

[0127] 在本发明中所用的选择方法可以包括提供植物的核酸样品，优选地是DNA，例如可以利用本领域熟知的核酸分离方法可以获得所述核酸样品，并测试所述核酸序列中是否含
有标记物。在此所定义的标记物是AFLP标记物，通过实施依据其命名的AFLP反应或者同样
地通过实施扩增反应例如PCR可以检测出所述AFLP标记物，所述PCR是利用一组或多组标
记物特异性引物，其反应条件是其中所述引物可以与它们的特异模板退火，所述引物能够
产生特异的扩增产物。然后，特异的扩增产物的存在指示在模板序列中存在着标记物，而缺
少扩增产物指示缺少标记物。为了验证L4基因渗入(L4等位基因)的存在，检测核酸样品
中的一种或多种(优选地是所有的)第1组标记物，更优选地是在此所述的E58/M50-F-580
标记物和/或E54/M55-F-101标记物。为了验证被适当截短的等位基因的存在，在此所述
的一种或多种第2组标记物优选地是缺失的。一些AFLP标记物也可以被转化成标记序列
的位点标记物，其容许快速并便利地筛选杂交子代(Werner et al.，2001)。

[0128] 或者，一种筛选植物基因组中是否存在L4标记物的方法可以包括将植物的核酸样品与探针接触，所述探针可以与染色体区上的包括一种或多种标记物序列的靶向多核苷
酸序列选择性地结合，其中探针在其中探针与靶向多核苷酸序列选择性结合形成稳定的杂
交复合物的条件下与样 品接触；以及包括检测是否存在杂交复合物，据此筛选出植物中是
否存在所述标记物。

[0129] 在此前所述的方法中所用的标记物辅助性选择例如可以是逐步进行的，其中在超过一个世代中选择L4等位基因的存在以及SNFD表型的缺失。可以在测试并选择其他的商
业所需性状例如疾病抗性、昆虫抗性、所需果实特性等之前、同时或之后进行对L4等位基
因赋予的抗性的标记物辅助性选择。同样，对PMMoV抗性或SNFD表型缺失的评价次序并不
是特别受限的。应当了解可以在选择PMMoV抗性植物之前或者甚至同时进行对包括赋予
SNFD表型的遗传信息的植物的排除(优选地是标记物辅助性排除)。

[0130] 从其自然的周围环境中分离出L4等位基因的物质来源是例如来自C.chacoense编号PI 260429或SA185(Boukema，1983)的植物，所述L4等位基因因此只含有赋予L4抗
性的遗传信息以及不含赋予SNFD表型的遗传信息。从Plant Genetic Resources(PGR)
cluster of the Centre for GeneticResources，the Netherlands(CGN)，Wageningen，The
Netherlands中可以得到这些编号。

[0131] 通过从抗PMMoV致病型1.2.3的植物中分离出DNA以及从所述DNA中分离出L4抗性等位基因例如可以产生包括本发明的截短的L4抗性等位基因的分离的核酸序列。通
过例如用合适的正向和反向引物扩增包括所述L4等位基因的赋予PMMoV抗性部分的遗传
区域例如可以实现这种分离。合适的引物例如是那些用于第2组标记物的定义的引物以及
用于第3组标记物的定义的标记物。通过利用或开发出退火于C.chacoense基因组上的距
离第1组标记物的位置不那么远例如更近的位置上的其他引物可以缩小扩增片段的大小。
通过这种方法，可以使得L4等位基因不含有赋予SNFD表型的遗传信息。本领域技术人员
注意到所述核酸中必须存在各种调节元件，因为所述核酸需要在辣椒属植物中进行表达，
据此赋予所述植物对PMMoV致病型1.2.3的抗性。

[0132] 通过利用本领域公知的标准DNA分离方法提供辣椒植物的基因组DNA样品也可以分离出例如L4等位基因或L4基因。为了回收大的DNA片段，对分离物质量的要求是相当
高的，即基本上避免了基因组DNA的严重降解。如果采用了用于获得大分子量(HMW)DNA制
剂的分离技术，通常可以获得足够长的DNA。HMW DNA是在制备期间避免物理剪切力的情况
下所获得的DNA。从辣椒属植物组织中制备出HMW DNA例如可以包括利用细胞壁水解分离
出原生质体，并将原生质体包埋于琼脂糖内。另一种可选用的方法是从植物的细胞核中制
备出HMW DNA。对多种植物物种都已经成功地进行了巨碱基DNA的分离，并且这些方法现在
都常常被应用于提供适用于构建细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)克隆载体
中的大的插入DNA文库的巨碱基DNA。一旦分离到基因组DNA，例如通过利用PCR扩增反应
所用的限制性内切酶就可以处理所述DNA，或者可以用在此所提供的任何标记物序列克隆
或探针化所述DNA。

[0133] 本发明还预期利用本领域已知的技术将这些分离的和纯化的基因(或等位基因)插入到辣椒或其他植物内，以便提供表现出抗PMMoV感染的转基因植物。植物转化包括构
建能在植物细胞内发挥作用的表达载体。在本发明中，这种载体包括包括基因的DNA，所述
基因是在调节元件例如启动子的控制之下或与之可操纵地连接的编码PMMoV抗性的基因。
表达载体可以含有一种或多种这样可操纵地连接的基因/调节元件组合，只要组合物中所
含的至少一种基因能编码PMMoV抗性。载体可以是质粒形式，利用本领域已知的转化方法
(例如土壤杆菌转化系统)可以单独使用或与其他质粒联合使用所述质粒，以提供抗PMMoV
的转基因植物。

[0134] 表达载体可以包括至少一种与调节元件(例如启动子)可操纵地连接的遗传标记物，以便容许通过阴性选择(通过抑制不含选择标记物基因的细胞的产生)或者通过阳性
选择(通过筛选遗传标记物所编码的产物)回收含有标记物的转化细胞。许多常用的植物
转化的选择标记物基因是 本领域已知的，包括例如编码代谢性地解毒选择性的化学试剂
(可以是抗生素或除草剂)的酶的基因，或者编码对抑制剂不敏感的变更了的靶点的基因。
一些阳性选择方法在本领域是已知的，例如甘露糖选择。或者，可以用无标记物转化获得没
有所提及的标记物基因的植物，所述技术在本领域是已知的。

[0135] 一种用于将表达载体引入到植物内的方法是基于土壤杆菌的天然转化系统(见例如Horsch et al.，1985)。根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌
(A.Rhizogenes)都是遗传转化植物细胞的植物致病性的土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根
土壤杆菌的Ti和Ri质粒分别携带有造成植物的遗传转化的基因(见例如Kado，1991)。
往植物组织中引入表达载体的方法包括用根癌土壤杆菌直接感染植物细胞或与植物细胞
共同培养(Horsch et al.，1985)。Gruber and Crosby，1993和Moloney et al.，1989提
供了对土壤杆菌载体系统以及用于土壤杆菌介导的基因转移的方法的描述，也见于美国专
利5,591,616。在Gruber和Crosby，1993中可以找到对植物表达载体和报告子基因以及
转化方案的综合描述以及对土壤杆菌载体系统以及用于土壤杆菌介导的基因转移的方法
的描述。例如Miki et al.，1993和Phillips et al.，1988提供了培养植物组织的常用
方法。分子克隆技术以及合适表达载体的专业参考手册是Sambrook，J.，E.F.Fritsch，
and T.Maniatis.Molecular Cloning：a Laboratory Manual(3rd.edition).ColdSpring
Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.，2000。

[0136] 另一种用于将表达载体引入到植物内的方法是基于微粒介导的转化，其中微粒表面上携带有DNA。用biolistic装置将表达载体引入到植物组织内，所述装置可以将微粒加
速到300到600m/s的速度，这足以穿透植物细胞壁和细胞膜(见，Sanford et al.，1987，
1993；Sanford，1988，1990；Klein et al.，1988，1992)。另一种用于将DNA引入到植物内的
方法是通过对靶细胞的超声处理(见，Zhang et al.，1991)。或者，脂质体或质体融合也已
经被用于往植物内引入表达载体(见，例如Deshayes et al.，1985和 Christou et al.，
1987)。也已经报道了利用氯化钙沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接摄入到原生质
体内的方法(见，例如Hain et al.，1985和Draper et al.，1982)。也已经描述了对原生
质体和整个细胞和组织的电穿孔(D′Halluin et al.，1992和Laursen et al.，1994)。

[0137] 在转化辣椒靶组织之后，利用本领域目前公知的再生和选择方法，上面所述的选择标记物基因的表达容许对转化细胞、组织和/或植物的优先选择。

[0138] 可以用上述的转化方法产生转基因辣椒植物或其他植物物种例如但不限于茄科物种。如前面所定义的那样，本发明的各个部分理论上可以涉及受PMMoV感染的所有植物，
因此可以产生在PMMoV宿主范围内的任何植物物种的本发明的转基因植物。

[0139] 然后这种转基因植物可以与另一种(未转化的或转化的)植物杂交，以便提供抗PMMoV感染的辣椒或其他植物物种的转基因杂种。或者，已经被在此所述的转化技术遗传
加工成含有编码PMMoV抗性的外来的(异源的或纯合的)基因的转基因辣椒或其他植物物
种中的外来的(外源的)PMMoV抗性基因可以被本领域公知的传统育种技术(例如回交技
术)转移到另一种植物内。例如，如前面所讨论的，可以用回交将含有编码PMMoV抗性的外
来的(异源的)基因以及不含有造成SNFD表型的遗传信息的转基因的PMMoV抗性近交辣
椒或其他植物品系中的PMMoV抗性基因基因渗入到无抗性的辣椒植物或不含有该基因的
其他农作物内，或者可以用回交将含有编码PMMoV抗性的外来基因的转基因的杂种PMMoV
抗性辣椒植物或其他植物中的PMMoV抗性基因基因渗入到不含该基因的植物品系内。

[0140] 在另一个实施方式中，可以用原生质体融合产生优秀的新的PMMoV抗性植物。更具体地，可以从表现出抗PMMoV感染以及不含造成SNFD表型的遗传信息的辣椒植物或其他
植物品系中获得第一个原生质体。可以从含有商业所需特性例如但不限于疾病抗性、昆虫
抗性、有价值的果 实特性等的第二种辣椒或其他植物品种中获得第二个原生质体。然后用
本领域已知的传统原生质体融合方法融合原生质体。例如，通过采用聚乙二醇(PEG)溶液
促进膜的融合可以完成原生质体融合。在Sundberg etal.，1986所述的用于产生种间杂种
或其修饰物的条件下可以实现这种体细胞杂交。但是，本领域技术人员要知道可以用不同
于利用聚乙二醇(PEG)的其他方法完成原生质体融合。例如，利用Koop and Spangenberg，
1989所述的电场诱导融合技术可以融合原生质体。另外，用葡聚糖和聚乙烯醇可以完成原
生质体融合。在Gleba et al.，1984和Dodds and Roberts，1995中可以找到用于原生质
体融合的其他方法。

[0141] 现在将以举例说明的方式给出本发明的实施例，这并非是对本发明的限制。

[0142] 实施例

[0143] 产生两种近交亲本系，称作Sylvia雄性亲本(S&G品种“Cuby”的近交系)和Manito雌性亲本(S&G品种“Tasty”的近交系)。品种Sylvia和Manito的PMMoV抗性最
初都是分离的。通过植物选择以及测试杂交，有可能将抗性固定于两种变体内。但是，注
意到，两种品种的雄性亲本都具有例如不稳定的雄性可育性/差的可育性和矮小生长的性
状。

[0144] 这些实施例中所用的PMMoV致病型1.2.3都是具有与Boukema，1982所提及的分离株P14相似的特性的病毒分离株。在下面的实施例中，各种试验中所用的病毒分离
株都来自PTG(Proefstation voor Tuinbouw onderGlas)，now PPO，in Naaldwijk，The
Netherlands，并被机械化地传代繁殖。实施例1：相同品种内的抗性和易感辣椒植物中的
L4抗性标记物

[0145] 通过Keygene(Wageningen，The Netherlands)产生L4基因座的连锁图谱。L基因座所被基因定位的区域位于11号染色体南侧的端粒上(Lefebvre et al.，2002)。

[0146] 该基因座周围的标记物可以分成4组。图1显示出了与L4基因座相连的不同的组的位置。每组都含有多个标记物，每组内都没有发现重组。连锁图谱朝向染色体的剩余
部分的定位还不清楚。表1显示了每组内的标记物。

[0147] 表1：相应各组内的标记物的概述

[0148]第1组 (L4等位基因特异) 第1/3组 第3组 第2组
E39/M58-F-95 E63/M61-F-501 E60/M54-F-447 E35/M49-F-90
E54/M55-F-101 E66/M43-F-387 E39/M58-F-65
E58/M60-F-255 E66/M49-F-387 E39/M51-F-380
E58/M50-F-580 E66/M61-F-99 E58/M62-F-168
E67/M50-F 150 E66/M54-F-600
E67/M62-F-214 TG036
E70/M54-F-133
E71/M47-F-550
E74/M61-F-385

[0149] 在与上面所述的相当相似的生物检测中测试分离品种Manito和Sylcia的F1植物以及抗性亲本系。花盆(tray)包括35株测试植物，包括一个易感对照和一个抗性对照。
基本上如上所述的进行茎和叶测试生物检测。表2显示了生物检测的结果。

[0150] 表2：对品种Sylvia和Manito以及它们的抗性亲本系的生物检测的结果

[0151]名称 抗性植物数目 易感植物数目 标记物测试中的测试编号
Manito 14 11 23-28
Manito的父本 20 0 29-33
Sylvia 19 11 34-39
Sylvia的父本 20 0 40-44

[0152] 从表2所述的生物检测中，随机选出分离品种Manito和Sylvia的F1植物中的3株抗性和3株易感植物，以及随机地选出它们的相应的抗性雄性亲本的5株植物。用表1所
示的与L4基因座相连的4种标记物进一步分析所选的植物。在进行测试的同时，并没有鉴
定表1中所列的所有标记物。通 过测试各种标记物的存在分析每种品种中的3株抗性和
3株易感植物。分析了5株来自相应的抗性亲本的植物。表3列出了标记物分析的结果。

[0153] 表3：所选植物的生物检测中的标记物计分(显性，见正文)

[0154]

[0155] 编号对应于标记物测试中的测试编号；R：抗性；S：易感；+：存在；-：缺乏。

[0156] 如表3中所见的那样，与L4等位基因相关的所有标记物都存在于在生物检测(R)中表现出抗性表型的F1植物内。但是，在易感植物内，不存在L4标记物。在生物检测中，
Manito的抗性父本(第29-33)和Sylvia的抗性亲本(第40-44)都没有表现出分离性，
所有与L4等位基因相连的标记物都存在于这些植物内。因为标记物只被计分为存在或缺
失(显性)，因此还不能推断出基因渗入片段的存在是否是纯合的或杂合的。推断出L4基
因渗入的缺失引起了F1中的易感性。附加的测试还发现不存在对L4抗性遗传性的母系效
应。

[0157] 实施例2：开发非分离的Sylvia品种

[0158] 为了开发出非分离的Sylvia品种，抗性亲本系(4578品系)的单个植物与易感亲本的植物杂交。在所形成的单个F1群中评价L4抗性分离的发生情况。结果列于表4内。

[0159] 通过4578-8号植物的自花传粉获得了6636品系。6636品系的单个植物被列出多次，因为这些植物作为雄性品系被用于不同的(但相关的)易感的雌性品系。

[0160] 4578品系的植物都没有形成完全抗性的F1。但是通过4578品系的自花传粉(参见6636品系)，有可能发现100％被转移了抗性基因的植物品系。在10个实例中有4例形
成了完全抗性的F1。源自6636-4的F1的分离显示出了不同于其他植物品系的分离模式。
如图4所示，分离的F1群(2R/3S-3R/2S)中的抗性植物的数目有所不同。当结合分离的F1
群中的抗性和易感植物的数目时，预计分离将是更为可靠的。因为所有F1群都使用了相同
的抗性来源，因此不稳定的(分离的)抗性的原因是相同的。表8显示了在表4中所提及
的三种杂交(4578、6636杂交1和6636杂交2)的汇总(compiled)结果；两种6636杂交是
两种不同的易感亲本与相同的抗性植物杂交的结果。

[0161] 表4：源自单个植物的Sylvia的F1分离。

[0162]

[0163] 也测试了用于产生表1中的F1群的6636品系的单个植物的自花传粉的PMMoV抗性。所有自花传粉的植物品系都显示出完全的抗性。结果列于表5中。

[0164] 表5：亲本系的自花传粉的结果

[0165]抗性亲本的植物编号 抗性植物的数目 易感植物的数目
6636-1 50 0
6636-2 50 0
6636-3 50 0
6636-4 50 0
6636-5 50 0
6636-6 50 0
6636-7 50 0
6636-8 50 0
6636-9 50 0
6636-10 50 0

[0166] 从该试验中，L4等位基因的不需要的特性变成清楚的，可以推断出造成非分离的后代的单个植物的自花传粉验证了纯合性，而单个抗性植物与易感植物的杂交造成了分离
的F1后代并验证了杂合性。

[0167] 实施例3：非分离的Manito品种的开发

[0168] 用如实施例2所述的相似方法开发非分离的Manito品系。抗性亲本系的植物与易感亲本的植物单个地杂交，并评价单个F1群的分离性。结果列于表6。

[0169] 在杂交之前去除了所有表现出低可育性(SNFD表型)的植物，这些植物作为“未测试的”列于表6内。最初在0025-5植物中没有观察到低可育性，但是之后其表现出存在低
可育性。

[0170] 表6：源自各植物(首先筛选的)的Manito的F1分离。

[0171]抗性亲本的植物 编号 抗性F1植 物的数目 易感F1植 物的数目 抗性亲本的植物 编号 抗性F1植 物的数目 易感F1植 物的数目
0021-1 39 11 0023-11 35 15
0021-2 34 16 0023-12 未测试 未测试
0021-3 34 16 0024-1 37 13
0021-4 39 11 0024-2 42 8
0021-5 未测试 未测试 0024-3 38 12
0021-6 38 12 0024-4 41 9
0021-7 22 28 0024-5 39 11
0021-8 未测试 未测试 0024-6 38 12
0021-9 30 20 0024-7 未测试 未测试
0021-10 34 16 0024-8 44 6
0022-1 未测试 未测试 0024-9 38 12
0022-2 40 10 0024-10 40 10
0022-3 42 8 0024-11 27 13
0022-4 39 11 0025-1 30 20
0022-5 40 10 0025-2 35 15
0022-6 31 19 0025-3 34 16
0022-7 39 11 0025-4 32 18
0022-8 40 10 0025-5 50 0
0022-9 35 15 0025-6 34 16
0022-10 35 15 0025-7 37 13
0023-1 41 9 0025-8 未测试 未测试
0023-2 未测试 未测试 0025-9 36 14
0023-3 未测试 未测试 0025-10 未测试 未测试
0023-4 38 12 0025-11 未测试 未测试
0023-5 36 14 0026-1 30 20
0023-6 40 10 0026-2 31 19
0023-7 未测试 未测试 0026-3 36 14
0023-8 未测试 未测试 0026-4 34 16
0023-9 39 11 0026-5 未测试 未测试
0023-10 39 11 0026-6 未测试 未测试

[0172] 仅仅0025-5植物形成了非分离的杂种。在60个品系中总共有14个品系都表现出了低可育性(SNFD表型)。该表中的F1群的分离性也被汇总于表8。

[0173] 为了增加造成非分离的F1的抗性植物的数目，进行了第二个测试。在杂交之前没有去除表现出低可育性的植物。结果列于表7内，分离性也被汇总于表8。50个品系中总
共有12个品系(25％)形成了完全抗性的F1群。

[0174] 表7：源自单个植物(第二次筛选)的Manito的F1分离

[0175]

[0176] 表8：实施例2和3中的分离的F1的汇总结果

[0177]目
数
的
物
植
感 19 31 30 80 23
易 1 1 1 6 8
目
数
的
物
植
性抗 412 721 741 2061 9601

a
ivly
本亲 本亲 S fo 本亲 本亲
性雄 性雄 tne 性雄 性雄
的ai 的ai rap 的ot 的ot
称名 vlyS vlyS elam inaM inaM

号

编
物植 1 s 2 s
的本亲性 87 sorc，63 sorc，63 6200-12 4382-52
抗 54 66 66 00 82
例
施
实 2 2 2 3 3

[0178] 在所有情况中都相似的一点是抗性植物要比易感植物更多。4578和6636-杂交1代的分离率接近于1∶1，符合抗性亲本为杂合子的单基因模型。在6636-杂交2和
2825-2834中，分离接近于9∶7。9∶7分离源自F2群。通过杂交两种纯合系(抗性不分
离的品系)，不可能得到F1中的9∶7分离。更可能 的是，也存在1∶1分离。0021-0026
的分离不同于其他情况，其最符合3∶1分离。根据可育性选择植物以及杂交之前去除了
低可育性植物的事实可能造成了这种差异。

[0179] 实施例4：对所观察到的L4等位基因非孟德尔遗传的连锁累赘(linkagedrag)解释

[0180] 引言

[0181] 对于用于表8中的杂交的植物，对其可育性和矮小生长(SNFD表型)进行记分(score)。所有造成非分离的F1的植物都表现出低可育性。这说明低可育性和非分离相关
联。表7中所示的结果显示，约25％的植物形成了非分离的杂种。在表6中，25％植物表现
出低可育性并且在评价F1之前被去除。当低可育性植物被认为是好的赋予抗性的亲本时，
那么表6和表7之间的结果是相当的。在此提到的源自这些非分离的植物的近交系的确都
表现出矮小生长。从中可以推断出，负面性状(不稳定的抗性、低可育性、矮小生长)与L4
等位基因紧密连锁或具有多效性。

[0182] 归纳并测试了在实施例1到3中观察到的F1分离的性质的可能解释。测试了致死性基因与易感等位基因连锁或者致死性基因与抗性等位基因连锁的可能性，但是否定了
这种可能性。也否定了基因沉默、需要第二种用于表达L4等位基因或者需要第二种用于转
移L4等位基因的可能性。另外，没有找到存在转座子或印记(imprinting)(种子发育期间
的特殊条件所造成的基因沉默)的证据。此外，在详细地推敲测试方案之后，除外了抗性性
状为非单基因的可能性。随后测试了C.chacoense基因渗入片段是否造成了辣椒染色体的
染色体折叠的问题。不规则的折叠将形成不平衡的染色体，造成纯合子(L4L4)植物的减数
分裂方面的问题。在染色体配对过程中，其中一条染色体可以被损坏，造成等位基因的缺
失，称作“-”等位基因。这反过来会造成抗性的丢失。结合在分离F1的易感植物中没有发
现标记物，染色体的破坏是最有可能的。如果存在纯合的缺失 等位基因是致死性的，那么
L4-基因型的自花传粉的确将在生物检测中形成完全抗性系。按此方式也能衍生出非分离
的F1，当L4-基因型与易感系杂交时，F1将按1∶1比例分离。在L4-基因型的自花传粉
之后，能发现具有纯合的L4基因型(L4L4)的植物，但是预计这些植物将会遇到减数分裂方
面的问题。然后，这就可以解释当在生物检测中进行测试时，该品系为完全抗性的(即所有
测试植物都是抗性的植物)，但是仍发现当与易感亲本杂交时形成了分离的F1群的原因。
这也可以解释为什么在易感的F1群植物中没有找到标记物的原因。

[0183] 这个解释预测形成非分离的F1的L4L4基因型是染色体折叠的重排结果。在该重排的折叠情况中，染色体配对不会造成染色体臂的断裂。但是，造成低可育性和减慢生长
(矮小植物)的植物内的其他过程是最可能被破坏的。已知只有少数花粉源自这些植物。
也只有少数种子被报道源自这些植物品系。

[0184] 从上面的试验中，因此可以推断出包括L4等位基因的C.chacoense的基因组片段太大并造成了分离的F1群。因此，缩小该片段的大小可以解决整个问题。

[0185] 试验方案

[0186] 在多个辣椒品系中都评价了L4基因座的各种标记物的存在。首先，评价两种抗性辣椒品系M-873和M-3751的基因渗入片段的大小。已知这些品系都形成了非分离的F1
以及正常的可育性。通过筛选位于L4等位基因侧面的标记物可以比较片段和S&G近交系
(Manito的父本)中所存在的基因渗入的大小。标记物的位置见表2。结果列于表9。

[0187] 测试植物品系中的与L4基因座相连的4种标记物，朝向L4等位基因的标记物的位置显示于表1。表9中所列的标记物被标记为纯合存在、杂合存在或缺失。也罗列了抗性
亲本系的可育性以及F1的抗性。通过将花粉的量标记为“有限量花粉”(-，差的可育性)、
“中等量花粉”(+/-，中等 可育性)、和“与非抗性的、可育对照植物相似的花粉量”(+，好的
可育性)可以肉眼评价可育性。

[0188] M-873 和 M-3751 品 系 的 抗 性 来 自 De Ruiter Seeds，Bergschenhoek，TheNetherlands的辣椒培育品系。筛选具有好的和中等的可育性的M-873和M-3751品系
植物是否存在或不存在标记物。所有实例中的平均可育性比Manito品系父本的可育性更
好。其他品系都是培育品系，对其的选择是根据可育性或者是因为它们形成了非分离的杂
种。

[0189] 表9：对一些辣椒品系中的C.chacoense基因渗入的评价。

[0190]

[0191] ++：标记物纯合存在，有抗性；-：标记物纯合缺失，易感的；+/-：标记物杂合存在，

[0192] 有抗性；+：标记物存在，未测试等位基因差异；？：未测试。

[0193] 结果说明在M-873和M-3751品系中存在着更小的基因渗入片段。不含第2组标记物(E39/M58-F-65)。通过评价这些品系的谱系，发现两品系共享有共同的vp-nr
91Pa0424，F3T137310。

[0194] 8972，8609和8613品系的植物都给出了杂合子的记分(score)，尽管在生物检测中其都被计为完全抗性。进行了与8972品系的杂交，结果列于表10。

[0195] 表10：源自标记为表9的杂合的8972品系的F1群的结果。

[0196]

[0197] 从8972品系中获得的F1群的结果是在预期之内的。为了进一步地鉴定出重组，分析分离品系是否存在L4基因座标记物。根据F3分离(其最接近于3∶1)选择品系。收
集每个F3群的植物，因为在从F1到F2的自花传粉期间应当可以发生重组。在已经发生重
组的情况中，F3群应当是重组的纯合子。所选定的品系列于表11。

[0198] 表11：重组鉴定所选定的品系

[0199]

[0200] 对这些植物的标记物分析的结果列于表12。如表1所示的指出了L4基因座的标记物。标记物标记“+”表示存在标记物，标记物标记“-”表示不存在。

[0201] 表12：所选定的L4抗性和非SNFD表型品系的标记物标记

[0202]

[0203] 可以推论出，在所选定的含有L4抗性等位基因的标记物(第1组标记物)且不含有包括第2组标记物的位置的遗传物质的品系中没有发现新的 重组。发现这些品系是有
抗性的，而且没有观察到SNFD表型。因此，推论出导致包括第2组、或第2组和第3组的标
记物位置的遗传物质丢失的重组造成了SNFD表型的丧失。

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