多谱系祖细胞

摘要

本发明描述了能够广谱转分化的胎儿血多谱系祖细胞。

权利要求

1.人胎儿血MLPC的纯化群，其特征在于，所述MLPC是CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性、CD10阴性、CD41阴性、CD45阴性、CD34阴性、以及Stro-1、SSEA-3和SSEA-4阴性的，其中所述胎儿血是脐带血或胎盘血。

2.如权利要求1所述的MLPC纯化群，其特征在于，所述MLPC展示成纤维细胞的形态。

3.如权利要求1所述的MLPC纯化群，其特征在于，所述MLPC获自脐带血。

4.如权利要求1所述的MLPC纯化群，其特征在于，所述MLPC还是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子、和HLA-DR阴性的。

5.如权利要求1所述的MLPC纯化群，其特征在于，所述MLPC在培养时粘附到塑料表面。

6.如权利要求1所述的MLPC纯化群，其特征在于，所述MLPC能够分化成所有三个胚层来源的细胞。

7.如权利要求1所述的MLPC纯化群，其特征在于，所述MLPC能够分化成具有骨细胞表型的细胞、具有脂肪细胞表型的细胞、具有神经干细胞表型的细胞、具有肌细胞表型的细胞、具有内皮细胞表型的细胞、具有肝细胞表型的细胞以及具有胰腺细胞表型的细胞。

8.如权利要求1所述的MLPC纯化群，其特征在于，所述MLPC包含外源核酸。

9.如权利要求8所述的MLPC纯化群，其特征在于，所述外源核酸编码多肽。

10.人胎儿血MLPC的克隆系，其特征在于，所述MLPC是CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性、CD10阴性、CD41阴性、CD45阴性、CD34阴性、以及Stro-1、SSEA-3和SSEA-4阴性的，其中所述胎儿血是脐带血或胎盘血。

11.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC展示成纤维细胞的形态。

12.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC获自脐带血。

13.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC还是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子和HLA-DR阴性的。

14.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培养时粘附到塑料表面。

15.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC能够分化成所有三个胚层来源的细胞。

16.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC能够分化成具有骨细胞表型的细胞、具有脂肪细胞表型的细胞、具有神经干细胞表型的细胞、具有肌细胞表型的细胞、具有内皮细胞表型的细胞、具有肝细胞表型的细胞以及具有胰腺细胞表型的细胞。

17.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC包含外源核酸。

18.如权利要求17所述的克隆系，其特征在于，所述外源核酸编码多肽。

19.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培养时至少经历了5次倍增。

20.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培养时经历了至少8次倍增。

21.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培养时经历了至少10次倍增。

22.如权利要求10所述的克隆系，其特征在于，所述MLPC在培养时经历了至少25次倍增。

23.包含权利要求1所述MLPC纯化群或权利要求10所述克隆系以及培养基的组合物。

24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含冷冻保存液。

25.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述冷冻保存液是二甲亚砜(DMSO)。

26.如权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述冷冻保存液是1到10％的DMSO。

27.如权利要求24所述的组合物，其特征在于，所述冷冻保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白和如下一种或多种物质的混合物：DMSO、海藻糖和葡聚糖。

28.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述冷冻保存液是人血清、DMSO和海藻糖。

29.如权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述冷冻保存液是胎牛血清和DMSO。

30.包含权利要求1所述MLPC纯化群或权利要求10所述克隆系的制品。

31.如权利要求30所述的制品，其特征在于，所述MLPC纯化群或所述克隆系被盛装在容器内。

32.如权利要求31所述的制品，其特征在于，所述容器是玻璃瓶。

33.如权利要求31所述的制品，其特征在于，所述容器是袋子。

34.如权利要求31所述的制品，其特征在于，所述容器还盛有冷冻保存液。

35.一种从人胎儿血中纯化MLPC群的方法，所述方法包括：a)使人胎儿血样本与组合物接触，其中所述胎儿血选自脐带血或胎盘血，所述组合物包含：葡聚糖；

抗血型糖蛋白-A抗体；

抗CD15抗体；以及

抗CD9抗体；

b)使所述样品分成凝集相和上清相；

c)从所述上清相中回收细胞；以及

d)通过使MLPC粘附到固体基质上从回收的细胞中纯化MLPC，其中所述MLPC是CD9和CD45阳性的e)还包括培养所述MLPC使其获得成纤维细胞表型，其中所述MLPC在获得所述成纤维细胞表型后是CD9、CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性、CD10阴性、CD41阴性、CD45阴性、CD34阴性、以及Stro-1、SSEA-3和SSEA-4阴性的。

36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述胎儿血样本是脐带血。

37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述固体基质是塑料基质。

38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述MLPC在获得所述成纤维细胞表型后还是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子、和HLA-DR阴性的。

39.如权利要求35所述的方法，还包括检测所述MLPC是否表达CD9。

40.如权利要求39所述的方法，还包括检测所述MLPC是否表达CD29、CD45、CD73和CD90。

41.一种冷冻保存MLPC的方法，所述方法包括：

f)使权利要求1所述的MLPC纯化群或权利要求10所述的克隆系与冷冻保存液接触；

以及

g)冷冻所述MLPC纯化群或所述克隆系。

42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述冷冻保存液是DMSO。

43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述冷冻保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白和如下一种或多种物质的混合物：DMSO、海藻糖和葡聚糖。

44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述冷冻保存液是人血清、DMSO和海藻糖。

45.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述冷冻保存液是胎牛血清和DMSO。

5

46.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述MLPC纯化群或所述克隆系以1×107

到5×10 细胞/毫升的浓度悬浮在所述冷冻保存液中。

47.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述MLPC纯化群或所述克隆系以可控速度冷冻。

48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述冷冻速度是电控制的。

49.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述MLPC纯化群或所述克隆系通过放置在液氮冷冻储藏罐的蒸汽相中进行乙醇浴而冷冻。

50.一种制备分化细胞群的方法，所述方法包括用有效诱导MLPC分化的试剂培养权利要求1所述的MLPC纯化群或权利要求10所述的克隆系。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述试剂包含胰岛素、谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤。

52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述试剂包含地塞米松、谷氨酰胺、抗坏血酸和β-磷酸甘油。

53.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述试剂包含上皮生长因子、胰岛素、胎球蛋白、地塞米松和碱性成纤维细胞生长因子。

54.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述试剂包含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、NSF-1和视黄酸。

55.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述试剂包含肝素、牛脑提取物、上皮生长因子和氢化可的松。

56.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述试剂包含抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4和干细胞生长因子。

说明书

多谱系祖细胞

[0001] 相关申请的交叉参考

[0002] 本申请要求2004年4月23日提交的美国临时专利申请序列号No.60/564,687的优先权。

技术领域

[0003] 本发明涉及来自于人血的多谱系祖细胞(MLPC)，更具体涉及具有分化成多种组织谱系潜能的MLPC及其在再生治疗中的应用。

[0004] 发明背景

[0005] 已在多种来源中鉴定出能在清髓治疗后进行造血重建的祖细胞，其中包括骨髓、脐带血和胎盘血、以及用干细胞动员剂量的粒细胞集落刺激因子处理的受试者的外周血。这些细胞通常被称为造血干细胞(HSC)，因其表面存在细胞表面糖蛋白如CD34和CD133而被鉴定。HSC作为“骨髓移植”的一部分只占总细胞群的很小比例，被认为是这种治疗的救命部分，负责恢复经清髓剂量的化疗或放疗患者的血液形成能力。通过骨髓移植进行干细胞治疗已经成为许多难治的白血病和遗传性血液疾病的标准治疗方法。

[0006] 最近的研究表明，在骨髓中存在一个较原始的细胞群，该群细胞能自我更新，并且能够分化成多种不同类型的组织，而不仅仅是血液细胞。这些多潜能细胞是在成人骨髓的CD34塑料粘附细胞群中作为次要成分而被发现的，曾被赋予各种名称，如间充质干细胞(MSC)(Pittenger等，Science 284：143-147(1999))或多潜能成年祖细胞(MAPC)(Furcht，L.T.等，美国专利公开20040107453 A1)。MSC细胞没有单一的特异性鉴别标记，但是研究发现有许多标记是阳性的，其中包括CD29、CD90、CD105和CD73，而另外一些标记是阴性的，其中包括CD14、CD3和CD4。不同的研究小组报道，MSC可分化成肌细胞、神经元、胰腺β细胞、肝细胞、骨细胞和结缔组织。另外一个研究小组(Wernet等，美国专利公开20020164794 A1)描述了一种具有多潜能的非限定性体细胞干细胞(USSC)，这种细胞来源于脐带血内的- -CD45/CD34 细胞 群。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明的基础在于从人胎儿血中鉴定稀有的未分化细胞群，该细胞群可自我更新，具有分化成分别代表三个胚层的细胞的潜能。这些胎儿血来源的细胞被称为多谱系祖细胞(MLPC)。如本文所描述，胎儿血MLPC与骨髓来源的MSC、HSC和USSC不同，其区别在于免疫表型特征、形态和不同的生长模式。本发明提供了从单个细胞培养单型克隆细胞系的方法。本发明还提供了深低温保存MLPC的方法(如，为了建立脐带血库)以及利用MLPC进行再生治疗的方法。

[0009] 在一个方面，本发明的特征是人胎儿血(如脐带血)MLPC的纯化群，其中的MLPC是CD9和CD45阳性的。MLPC具有白细胞的形态。MLPC还可以是SSEA-4或CD34阳性的，以及CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干细胞因子、SSEA-3和CD13阳性的。MLPC可以是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61阴性的。MLPC在培养一段时间后可获得成纤维细胞样形态。MLPC在培养时还可以粘附到塑料表面。MLPC能够分化成所有三个胚层来源的细胞，其中包括，例如，具有骨细胞表型的细胞、具有脂肪细胞表型的细胞、具有神经干细胞表型的细胞、具有肌细胞表型的细胞、具有内皮细胞表型的细胞、具有肝细胞表型的细胞以及具有胰腺细胞表型的细胞。MLPC可包含外源核酸(如编码多肽的外源核酸)。

[0010] 在另一方面，本发明的特征是人胎儿血(如脐带血)MLPC的纯化群，其中的MLPC是CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性的。MLPC具有成纤维细胞的形态。MLPC还可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性的，还可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子、SSEA-3和HLA-DR阴性的。MLPC在培养时可以粘附到塑料表面。MLPC能够分化成所有三个胚层来源的细胞，其中包括，例如，具有骨细胞表型的细胞、具有脂肪细胞表型的细胞、具有神经干细胞表型的细胞、具有肌细胞表型的细胞、具有内皮细胞表型的细胞、具有肝细胞表型的细胞以及具有胰腺细胞表型的细胞。MLPC可包含外源核酸(如编码多肽的外源核酸)。

[0011] 本发明的另一个特征是人胎儿血(如脐带血)MLPC的克隆系，其中的MLPC是CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性的。MLPC具有成纤维细胞的形态。MLPC 还可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性的，还可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子、SSEA-3和HLA-DR阴性的。MLPC在培养时可以粘附到塑料表面。MLPC能够分化成所有三个胚层来源的细胞，其中包括，例如，具有骨细胞表型的细胞、具有脂肪细胞表型的细胞、具有神经干细胞表型的细胞、具有肌细胞表型的细胞、具有内皮细胞表型的细胞、具有肝细胞表型的细胞以及具有胰腺细胞表型的细胞。MLPC可包含外源核酸(如编码多肽的外源核酸)。在某些实施方式中，MLPC在培养时至少可以经历5次倍增(如至少8、10、15或25次倍增)。

[0012] 在另一方面，本发明的特征是包含MLPC纯化群或MLPC克隆系以及培养基的组合物。该组合物还可以包含冷冻保存液。在一个实施方式中，冷冻保存液是二甲亚砜(DMSO)(如1％到10％的DMSO)。在另一个实施方式中，冷冻保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上下列物质中的一种或几种：DMSO、海藻糖和葡聚糖。例如，冷冻保存液可以是DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMSO。

[0013] 在另一方面，本发明的特征是制品，其中包含MLPC纯化群或MLPC的克隆系。MLPC的纯化群或克隆系可储存在容器内(如玻璃瓶或袋子)。容器内还可以包含冷冻保存液。

[0014] 本发明的另一个特征是从人胎儿血内纯化MLPC细胞群的方法。该方法包括使人胎儿血样品(如脐带血)与含葡聚糖、抗血型糖蛋白-A抗体、抗CD15抗体和抗CD9抗体的组合物接触；使样品分成凝集物相和上清相；从上清相中收取细胞；以及通过粘附到固体基质(如塑料基质)上从收获的细胞中纯化MPLC，其中的MPLC是CD9和CD45阳性的。MLPC还可以是CD34、CD133、CD41、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90、干细胞因子、SSEA-3、SSEA-4和CD13阳性的。MLPC还可以是CD15、CD38、血型糖蛋白-A、CD2、CD3、CD8、CD19、CD20、CD22、CD5、CD7、CD10、CD14、CD4、HLA-DR、CD16、CD33和CD61阴性的。该方法还包括检测MLPC是否存在CD9或者是否存在CD9、CD29、CD45、CD73和CD90。

[0015] 该方法还包括培养MLPC使其获得成纤维细胞形态，其中的MLPC在获得成纤维细胞形态后是CD9阳性、CD45阴性、CD34阴性和SSEA-4阴性的。MLPC在获得成纤维细胞形态后还可以是CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105阳性的。MLPC在获得成纤维细胞形态后还可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD33、CD36、CD38、CD41、CD61、CD62E、 CD133、血型糖蛋白-A、干细胞因子、SSEA-3和HLA-DR阴性的。该方法还包括检测MLPC是否存在CD9或者是否存在CD9、CD29、CD45、CD73和CD90。

[0016] 在另一方面，本发明的特征是冷冻保存MLPC的方法。该方法包括使MLPC的纯化群或克隆系与冷冻保存液接触；以及冷冻MLPC的纯化群或克隆系。在一个实施方式中，冷冻保存液是DMSO(如1％到10％的DMSO)。在另一个实施方式中，冷冻保存液是胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上下列物质中的一种或几种：DMSO、海藻糖和葡聚糖。例如，冷冻5
保存液可以是DMSO和海藻糖，或者是胎牛血清和DMSO。MLPC的纯化群或克隆系以1×10
7
和5×10 细胞/毫升的浓度悬浮在冷冻保存液中。纯化群或克隆系可以可控速度冷冻(如冷冻速度是电控制的)，或者通过将细胞放置在液氮储存罐的蒸汽层进行乙醇浴来冷冻。

[0017] 在另一方面，本发明的特征是制备分化细胞群的方法。该方法包括用能够有效诱导MLPC分化的试剂培养MLPC的纯化群或克隆系。所述试剂包括胰岛素、谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤；地塞米松、谷氨酰胺、抗坏血酸和β-磷酸甘油；上皮生长因子、胰岛素、胎球蛋白、地塞米松和碱性成纤维细胞生长因子；碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、NSF-1和视黄酸；肝素、牛脑提取物、上皮生长因子和氢化可的松；或者抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子、肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4和干细胞因子。

[0018] 除非特别说明，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域的技术人员所常理解的意思相同。虽然与本文所描述的那些方法和材料相似或等价的方法和材料也可用于实现本发明，但是下面所描述的都是合适的方法和材料。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都已完整纳入本文作为参考。在发生矛盾时以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例只是为了说明，并不意味着限制。

[0019] 本发明的其他特征和优点通过阅读下面的详细描述和权利要求就会清楚。

附图说明

[0020] 图1是从胎儿血中纯化MLPC的细胞分离过程示意图。

[0021] 图2A-2D是描述正在发育的MLPC形态的显微照片。图2A显示的是从脐带血分离的MLPC的早期培养情况，说明细胞处于白细胞形态期。图2B显示的是MLPC培养物开始从白细胞形态向成纤维细胞形态转变。图2C显示的是处于对数生长期的 MLPC晚期培养物。图2D显示的是MLPC生长完全汇合的培养物。

[0022] 详细描述

[0023] 总的来说，本发明提供了人胎儿血(如脐带血(“脐血”)、胎盘血或胎儿血)来源的MLPC纯化群以及MLPC来源的MLPC克隆系。胎儿血提供了比成人骨髓更幼稚的细胞来源，所含有的携带不成熟细胞表面标记的细胞百分比更高。因此，胎儿血来源的祖细胞可能具有更高的扩增和分化能力。如本文所描述，MLPC具有与骨髓来源的MSC、骨髓来源的HSC以及脐带血来源的HSC和USSC不同的免疫表型特征。本文所描述的细胞具有自我更新的能力以及分化成不同类型组织的能力，这与骨髓来源的MSC和MAPC细胞相似。MLPC可用于开展细胞治疗和建立冷冻细胞库以便于以后进行再生治疗。MLPC还可以被改造使其能表达一种或多种我们感兴趣的多肽或其他治疗性化合物。

[0024] 细胞分离组合物

[0025] MLPC可利用美国专利公开No.2003-0027233-A1所描述的负筛选过程和细胞分离组合物从胎儿血(如脐带血)中分离。这种组合物包含葡聚糖和一种或多种抗细胞表面抗原的抗体(即与抗原具有结合亲和力的抗体)。

[0026] 葡聚糖是由葡萄糖单位组成的多糖，各单位之间主要以α(1到6)键相连。葡聚糖可导致红细胞堆积(即形成红细胞钱串)，因而便于从溶液中去除红细胞。抗细胞表面抗原的抗体有利于通过同型凝集(即相同类型的细胞凝集在一起)和/或异型凝集(即不同类型的细胞凝集在一起)从溶液中去除血细胞。

[0027] 例如，细胞分离组合物可包含葡聚糖和抗血型糖蛋白-A、CD15以及CD9的抗体。细胞分离组合物还可以包含抗其他血细胞表面抗原的抗体，其中包括CD2、CD3、CD4、CD8、CD72、CD16、CD41a、HLAI类分子、HLA-DR、CD29、CD11a、CD11b、CD11c、CD19、CD20、CD23、CD39、CD40、CD43、CD44、CDw49d、CD53、CD54、CD62L、CD63、CD66、CD67、CD81、CD82、CD99、CD100、Leu-13、TPA-1、表面Ig及其组合。因此，细胞分离组合物可制备成能选择性凝集特定类型血细胞的组合物。

[0028] 一般来说，细胞分离组合物中抗血型糖蛋白-A抗体的浓度为0.1到15mg/L(如0.1～10mg/L，1～5mg/L或1mg/L)。抗血型糖蛋白-A抗体至少可通过两种机制来促进从溶液中去除红细胞。第一，抗血型糖蛋白抗体可引起红细胞发生同型凝集，因为血型糖蛋白-A是红细胞的主要表面糖蛋白。另外，抗血型糖蛋白-A抗体可稳定葡 聚糖介导形成的红细胞钱串。典型的抗血型糖蛋白-A单克隆抗体包括而不限于：107FMN(鼠IgG1同种型)、YTH89.1(兔IgG2b同种型)、2.2.2.E7(鼠IgM同种型；BioE，St.Paul，MN)以及E4(鼠IgM同种型)。参见Vanderlaan等，Molecular Immunology20：1353(1983)；Telen M.J.和Bolk，T.A.，Transfusion 27：309(1987)；以及Outram S.等，Leukocyte Research.12：
651(1988)。

[0029] 细胞分离组合物中抗CD15抗体的浓度为0.1到15mg/L(如0.1～10mg/L，1～5mg/L或1mg/L)。抗CD15抗体可通过交联粒细胞表面存在的CD15分子而导致粒细胞发生同型凝集。抗CD1抗体还可以导致粒细胞与单核细胞、NK细胞和B细胞发生同型或异型凝集，其机制为刺激粒细胞表面表达能与单核细胞、NK细胞和B细胞的粘附分子发生相互作用的粘附分子(如L-选择素和β-2整合素)。这些细胞发生的异型凝集可促使这些细胞和红细胞组分一起从溶液中去除。典型的抗CD1单克隆抗体包括而不限于：AHN1.1(鼠IgM同种型)、FMC-10(鼠IgM同种型)、BU-28(鼠IgM同种型)、MEM-157(鼠IgM同种型)、MEM-158(鼠IgM同种型)、324.3.B9(鼠IgM同种型；BioE，St.Paul，MN)以及MEM-167(鼠IgM同种型)。参见Leukocyte typingIV(1989)；Leukocyte typing II(1984)；Leukocyte typing VI(1995)；Solter D. 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：5565(1978)；Kannagi R. 等，J.Biol.Chem.257：14865(1982)；Magnani，J.L. 等，Arch.Biochem.Biophys 233：
501(1984)；Eggens I.等，J.Biol.Chem.264：9476(1989)。

[0030] 细胞分离组合物中抗CD9抗体的浓度为0.1到15mg/L、0.1到10mg/L、1到5mg/L或1mg/L。抗CD9抗体可促使血小板发生同型凝集。抗CD9抗体还可以通过粘附到粒细胞和单核细胞表面的血小板引起粒细胞和单核细胞发生异型凝集。CD9抗体可加速血小板p-选择素(CD62P)、CD41/61、CD31和CD36的表达。这些分子可促使血小板结合到白细胞表面。因此，抗CD9抗体可加速多种细胞-细胞结合，从而有利于这些细胞的凝集并从溶液中去除。典型的抗CD9单克隆抗体包括而不限于：MEM-61(鼠IgG1同种型)、MEM-62(鼠IgG1同种型)、MEM-192(鼠IgM同种型)、FMC-8(鼠IgG2a同种型)、SN4(鼠IgG1同种型)、8.10.E7(鼠IgM同种型；BioE，St.Paul，MN)以及BU-16(鼠IgG2a同种型)。参见Leukocyte typing VI(1995)；Leukocytetyping II(1984)；Von dem Bourne A.E.G.Kr.和Moderman P.N.(1989)，引自Leukocytetyping IV(W.Knapp等编)，pp.989-92，Oxford University Press，Oxford；Jennings，L.K.等，引自Leukocyte typing V，S.F.Schlossmann等编，pp.1249-51，OxfordUniversity Press，Oxford(1995)；Lanza F. 等，J.Biol.Chem.266：
10638(1991)；Wright 等，Immunology Today 15：588(1994)；Rubinstein E.等，Seminars in Thrombosis andHemostasis 21：10(1995)。

[0031] 在某些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD41抗体，该抗体可选择性凝集血小板。在某些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD3抗体，该抗体可选择性凝集T细胞。在某些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD2抗体，该抗体可选择性凝集T细胞和NK细胞。在某些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD72抗体，该抗体可选择性凝集B细胞。在某些实施方式中，细胞分离组合物含有抗CD16抗体，该抗体可选择性凝集NK细胞和中性粒细胞。其中每种抗体的浓度为0.01到15mg/L。典型的抗CD41抗体包括而不限于PLT-1(鼠IgM同种型)、CN19(鼠IgG1同种型)和8.7.C3(鼠IgG1同种型)。抗CD3抗体的非限定性例子包括OKT3(鼠IgG1)、HIT3a(鼠IgG2a同种型)、SK7(鼠IgG1)和BC3(鼠IgG2a)。抗CD2抗体的非限定性例子包括7A9(鼠IgM同种型)、T11(鼠IgG1同种型)以及Leu5b(鼠IgG2a同种型)。抗CD72抗体的非限定性例子包括BU-40(鼠IgG1同种型)和BU-41(鼠IgG1同种型)。抗CD16抗体的非限定性例子包括3G8(鼠IgG)。

[0032] 如上所述，细胞分离组合物可被制备成能够选择性凝集特定血细胞的制剂。细胞分离组合物的一个例子包含抗血型糖蛋白-A、CD15和CD9抗体，该组合物可加速红细胞、粒细胞、NK细胞、B细胞和血小板的凝集。然后从溶液中回收T细胞、NK细胞和稀有的前体细胞如MPLC。如果制剂中还包含抗CD3的抗体，那么T细胞也可以被凝集，因而可以从溶液中回收NK细胞和稀有前体细胞如MLPC。

[0033] 细胞分离组合物可以包含抗其他类型细胞表面抗原的抗体(如肿瘤细胞的细胞表面蛋白)。本领域的技术人员可利用常规方法制备抗细胞表面抗原的抗体，这些抗原来源于人和其他哺乳动物如非人灵长类动物、啮齿动物(如小鼠、大鼠、仓鼠、兔和荷兰猪)、猪、牛和马的血细胞和其他细胞。

[0034] 一般来说，组合物中所用的抗体为单克隆抗体，单克隆抗体是针对抗原内特定表位的同源抗体群。适宜的单克隆抗体可从公司购买，或者利用标准的杂交瘤技术制备。更具体地说，单克隆抗体可利用通过培养传代细胞系制备抗体分子的技术制备，其中包括Kohler，G.等，Nature，1975，256：495所描述的技术，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：2026(1983))，以及EBV杂交瘤技术(Cole等，“Monoclonal Antibodies and CancerTherapy”(单克隆抗体和肿瘤治疗)，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1983))。

[0035] 抗体可以是任何类的免疫球蛋白，其中包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其亚 类。IgG和IgM的同种型抗体在本发明的细胞分离组合物中是特别有用的。五聚体IgM抗体比IgG抗体含有更多的抗原结合位点，在某些情况下(如抗血型糖蛋白-A和CD15抗体)特别适于作为细胞分离试剂。在另外一些情况下(如抗CD9抗体)，IgG同种型抗体特别适于刺激同型和/或异型凝集。

[0036] 抗细胞表面抗原的抗体可以存在于液相中(如可溶性的)。液相抗体在细胞分离组合物中存在的浓度一般在约0.1到约15mg/l之间(如，0.25-10、0.25-1、0.5-2、1-2、4-8、5-10mg/l之间)。

[0037] 抗细胞表面抗原的抗体还可以连接到固相(即底物结合)上。抗不同细胞表面抗原的抗体可以共价连接到固相支持物上以促进细胞表面分子的交联以及细胞表面粘附分子的活化。使用底物结合的抗体可加速细胞的分离(如，利用粒子有利于凝集细胞的特性，或者利用有益于纯化的特性)。

[0038] 在某些实施方式中，结合有底物结合抗体的固相支持物是粒子。在某些实施方式中，抗体被结合到乳胶微粒(如，通过生物素-亲和素连接子共价连接到聚苯乙烯小珠的COO基团上，或者共价连接到修饰小珠的NH2基团上)。在某些实施方式中，抗体被连接到酸腐蚀的玻璃粒子上(如，通过生物素-亲和素连接子)。在某些实施方式中，抗体被连接到凝集多肽如凝集的牛血清白蛋白上(如通过生物素-亲和素连接子，或者共价连接到多肽的COO基团或NH2基团上)。在某些实施方式中，抗体被共价连接到多糖如高分子量(如＞1,000,000Mr)的硫酸葡聚糖上。在某些实施方式中，生物素化的抗体被连接亲和素粒子上，形成四聚体复合物，每个亲和素分子结合四个抗体分子。在某些实施方式中，抗体通过生物素-亲和素-生物素化的抗体连接子被结合到生物素化的琼脂糖凝胶颗粒上(One Cell Systems(单细胞系统)，Cambridge，MA，U.S.A.)。这种粒子的直径一般约为300-500微米，可在超声水浴或快速混合水浴中制备。

[0039] 细胞-底物粒子(即，包含细胞和底物结合抗体的粒子)可作为凝集物从溶液中沉淀出来。当粒子是顺磁磁珠时，还可以通过应用磁场从溶液中去除细胞-底物粒子。底物9
结合抗体在细胞分离组合物中的浓度通常为约0.1到约50.0×10 个粒子/升(如，0.25～
9 9 9 9 9 9
10.0×10、1～20.0×10、2～10.0×10、0.5～2×10、2～5×10、5～10×10 以及10～
9
30×10 个粒子/升)，其中的粒子是指结合有抗体的固相粒子。

[0040] 细胞分离组合物还可以含有二价阳离子(如Ca+2和Mg+2)。二价阳离子可通过平+2衡盐溶液(如Hank’s平衡盐溶液)的方式提供。据报道，Ca 离子对于选择素介导的和整合素介导的细胞-细胞粘附来说是重要的。

[0041] 细胞分离组合物还可以包含抗凝血剂如肝素。肝素可防止凝固以及在高钙环境下由凝固导致的非特异性细胞丢失。肝素还可以促使血小板凝集。凝集的血小板可粘附到粒细胞和单核细胞上，因而比单个的血小板更容易促使异型凝集。肝素可以肝素盐(如肝素钠、肝素锂或肝素钾)的形式提供。

[0042] MLPC群和克隆系

[0043] MLPC可用上述细胞分离组合物从人胎儿血中纯化。本文所使用的术语“纯化的”是指细胞群内至少有90％(如91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的细胞是MLPC。本文所用的术语“MLPC”是指CD9阳性的、以及常常显示其他标记如CD13、CD73和CD105群体(constellation)的胎儿血细胞。“MLPC群”是指从人胎儿血中获得的原始培养物及其未克隆的后代。“克隆系”是指单个细胞来源的细胞系。本文所用的术语“细胞系”是指在适当的培养条件下、在适当的一段时间内能自我更新的一群细胞。但是，术语“系”并不代表那些进行不确定繁殖的细胞。本文所描述的克隆系在衰老前一般都能经历75到100次倍增。

[0044] 一般来说，MLPC群可通过使胎儿血样本与上述细胞分离组合物接触并使样本分成凝集相和上清相来获得。例如，通过重力作用或通过离心使样本沉降。优选的MLPC纯化自小于48小时的脐带血样本(如，产后24、12、8或4小时之内)凝集以后，从上清相中回收未凝集的细胞。例如，通过如下过程回收上清相中的细胞：离心，用盐溶液洗涤并接种到固相底物上(如，塑料培养装置如带槽的玻片或培养板)，使用含10％血清的标准培养基(如含10％血清的DMEM；含10％血清的RPMI-1640；或者含10％血清的间充质干细胞培养基(产品编号为#PT-3001，Cambrex，Walkersville，MD))培养。MLPC可粘附到固相底物表面，而+
其他细胞如T细胞、NK细胞和CD34HSC却不能粘附，因而通过洗涤可以去除。在开始培养后3天到2周内MLPC从白细胞形态转变为成纤维细胞形态，然后细胞进入对数生长期，只
5 2
要培养物内的细胞浓度维持在约1.5×10 细胞/cm 以下，细胞就可以继续维持对数生长。

[0045] 克隆系的建立可通过如下过程完成：收获MLPC，然后稀释并重新接种到多孔培养5 2
板上，这样就可以在孔内找到单个细胞。当细胞浓度达到1到5×10 细胞/75cm 时将细胞
5 5 2
转移到较大的培养瓶内。细胞浓度维持在1×10 到5×10 细胞/75cm 之间以使其维持对数生长。

[0046] 可利用本领域熟知的技术来分析MLPC的存活力、增殖能力和寿命。例如，存活力可通过台盼蓝排出试验、醋酸荧光素摄取试验或碘化丙啶摄取试验来测定。增殖能力可通过胸苷摄取试验或MTT细胞增殖试验来测定。寿命可通过确定培养物细胞 群倍增的最大数目来分析。

[0047] 利用已知的技术可确定MLPC的免疫表型。例如，从组织培养装置中去掉细胞培养基，然后用平衡盐溶液(如Hank’s平衡盐溶液)和牛血清白蛋白(如2％BSA)洗涤粘附的细胞。细胞与抗体共孵育，这些抗体与细胞表面抗原如CD9、CD45、CD13、CD73、CD105或其他任何细胞表面抗原有结合亲和力。抗体可连接上可检测标记(如荧光标记或酶催化标记)或者利用带有可检测标记的二抗来检测。另外，MLPC上的细胞表面抗原可利用流式细胞仪和荧光标记抗体来检测。

[0048] 如本文所描述，MLPC上存在的细胞表面抗原是可以改变的，这些抗原因培养阶段的不同而不同。在培养早期MLPC展示白细胞样形态时，MLPC是CD9和CD45、SSEA-4(阶段特异性胚胎抗原-4)、CD34以及CD13、CD29、CD41、CD44、CD73、CD90、CD105、干细胞因子、STRO-1(骨髓体细胞表达的细胞表面抗原)、SSEA-3(半乳糖苷葡糖)和CD133阳性的，并且是CD15、CD38、血型糖蛋白-A(CD235a)和系标记CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、HLA-DR以及CD102阴性的。当转变成成纤维细胞形态后，MLPC依然是CD9、CD13、CD29、CD73、CD90和CD105阳性的，但是却变成CD34、CD41、CD45、干细胞因子、STRO-1、SSEA-3、SSEA-4和CD133阴性的。在体外培养的整个过程中，未分化的MLPC是CD15、CD38、血型糖蛋白-A(CD235a)、系标记CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD11b、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD33、CD36、CD41、CD61、CD62E、CD72、HLA-DR和CD102阴性的。

[0049] 骨髓来源的MSC和MAPC以及脐带血来源的USSC被认为是来源于CD45-/CD34-细+ +胞群。MLPC与这些类型的细胞的区别在于MLPC是CD45/CD34 来源的细胞。另外，在整个成熟过程中胎儿血来源的MLPC是否存在CD9以及存在的持续时间也可以将MLPC与MSC和MAPC区分开，后者没有CD9标记。MLPC在其白细胞形态相中拥有造血标记CD45、CD133、CD90和CD34，与HSC的区别在于HSC具有强制性的塑料粘附特性以及存在间充质细胞相关的标记CD105、CD29、CD73、CD13和胚胎相关标记SSEA-3和SSEA-4。另外，利用现有的技术无法在体外培养HSC而不使其进一步分化，而MLPC保持不分化状态可扩增许多代。MLPC与MSC和USSC的区别还在于MSC和USSC在体外培养时生长状态较差，具有丝状胞浆突起以及达到最佳生长偏爱低密度培养条件。

[0050] 可通过将细胞(5×106到2×107细胞/毫升)悬浮于冷冻保存液中冷冻保存MLPC，所 述冷冻保存液如二甲亚砜(DMSO，一般为1-10％)，或者胎牛血清、人血清或人血清白蛋白加上DMSO、海藻糖和葡聚糖中的一种或几种。例如，(1)含10％DMSO的胎牛血清；(2)含10％DMSO和1％葡聚糖的人血清；(3)含1％DMSO和5％海藻糖的人血清；或者(4)20％人血清白蛋白、1％DMSO和5％海藻糖，这些都可用于冷冻保存MLPC。加入冷冻保存液后将细胞冷冻起来(如到-90℃)。在某些实施方式中，细胞以可控速度冷冻(如冷冻速度是电控制的)，或者通过将细胞放置在70％乙醇浴和液氮储存罐的蒸汽层进行冷冻。当细胞冷冻到-90℃时放置到液氮储存罐的液体相中以便于长期储存。冷冻保存液可用于长期储存这些细胞作为治疗的应用。

[0051] MLPC的分化

[0052] MLPC能够分化成各种细胞，包括三个胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞。本文所用的术语“能够分化成”是指一个给定的细胞或其后代能够在适当的培养条件下呈现分化表型。例如，MLPC可分化成具有骨细胞表型的细胞、脂肪细胞表型的细胞、神经细胞表型的细胞、肌细胞表型的细胞、内皮细胞表型的细胞、肝细胞/胰腺细胞前体细胞表型的细胞(也被称为椭圆形细胞)以及其他类型的细胞。利用一种或几种分化试剂可诱导分
2+
化，其中包括而不限于Ca 、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、角质化细胞生长因子(KGF)、转化生长因子(TGF)、细胞因子如白细胞介素、干扰素或肿瘤坏死因子、视黄酸、转铁蛋白、激素(如雄激素、雌激素、胰岛素、催乳素、三碘甲状腺氨酸、氢化可的松或地塞米松)、丁酸钠、TPA、DMSO、NMF(N-甲基甲酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)或基质如胶原、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素。

[0053] 确定MLPC是否已经分化成特定类型的细胞可以利用已知的方法来分析，其中包括检测形态学和细胞表面标记的改变(如，通过流式细胞术或免疫组化方法)、通过光学显微镜或共聚焦显微镜观察细胞的形态、或者利用一些方法如聚合酶链式反应(PCR)或基因表达谱分析来检测基因表达的变化。

[0054] 例如，利用含地塞米松、L-谷氨酰胺、抗坏血酸和β-磷酸甘油的诱导培养基(如成骨细胞分化培养基，产品编号为#PT-3002，Cambrex)诱导MLPC使其分化成具有骨细胞表型的细胞(Jaiswal等，J.Biol.Chem.64(2)：295-312(1997))。具有骨细胞表型的细胞含有钙结晶沉淀，通过茜素红染色可以看到。

[0055] 利用含胰岛素、L-谷氨酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤的诱导培养基(如脂肪细胞分化培养基，产品编号为#PT-3004，Cambrex)诱导MLPC使其分化成具有脂肪细胞表型的细胞。具有脂肪细胞表型的细胞包含充满脂质的脂质 体，通过油红染色可以看到。这种细胞还含有甘油三酯(trigyceride)，用尼罗红染色后可发绿色荧光(Fowler和Greenspan，Histochem.Cytochem.33：833-836(1985))。

[0056] 利用含EGF、胰岛素、胎球蛋白、地塞米松和碱性成纤维细胞生长因子的诱导培TM养基诱导MLPC可使其分化成具有肌细胞表型的细胞(如SkGM ，产品编号为CC-3160，Cambrex)。具有肌细胞表型的细胞表达快肌肌球蛋白和α肌动蛋白。

[0057] 利用含人碱性成纤维细胞生长因子、NSF-1和FGF-4的培养基(如，NPMMTM-神经祖细胞维持培养基，产品编号为#CC-3209，Cambrex)在预先涂布多聚D赖氨酸和层粘连蛋白(BD Biosciences Discovery Labware，产品编号为#354688)培养装置内诱导MLPC可使其分化成具有神经干细胞表型的细胞(神经球)。细胞一旦分化成神经球，通过加入脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-3(NT-3)它们还可以进一步分化成运动神经元，通过加入白血病抑制因子(LIF)、视黄酸和睫状神经营养因子可以进一步分化成星形胶质细胞，通过加入3，3’，5-三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)可以进一步分化成少突胶质细胞。通过检测是否表达干蛋白、III类β微管蛋白(微管蛋白β-4)、神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)和半乳糖脑苷脂(GalC)可以确定细胞是否已经向神经细胞分化。对于神经球来说，所有这些标记都是阳性的，而某些类型的分化细胞不表达这些标记。髓磷脂碱蛋白(MBP)染色阳性说明已分化成少突胶质细胞。

[0058] 利用含肝素、牛脑提取物、上皮生长因子(如人重组上皮生长因子)和氢化可的松的内皮细胞生长培养基(如EGM3-MV，产品编号为#CC-3125，Cambrex)诱导MLPC可使其分化成具有内皮细胞表型的细胞。内皮细胞的分化可通过E-选择素(CD62E)和ICAM-2(CD102)的表达来确定。

[0059] 利用含抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、EGF、肝细胞生长因子、碱性成纤TM维细胞生长因子、FGF-4和干细胞因子的诱导培养基(如HCM -肝细胞培养基，产品编号为#CC-3198，Cambrex)诱导MLPC可使其分化成具有肝细胞/胰腺细胞前体细胞表型的细胞。
肝细胞和胰腺细胞具有共同的祖细胞。肝细胞的分化可通过肝细胞生长因子和人血清白蛋白的表达来确定。胰腺细胞的分化可通过胰岛素和胰岛素原的表达来确定。

[0060] MLPC的修饰群

[0061] MLPC可以被修饰以使其产生一种或多种目的多肽或其他治疗性化合物。为了修饰分离的细胞以使其产生目的多肽或其他治疗性化合物，必须向细胞内导入合适的外源核酸。在某些实施方式中，细胞被瞬时转染，这说明外源核酸是游离的(即，不整合到染色体DNA上)。在另外一些实施方式中，细胞被稳定转染，即，外源核酸 被整合到宿主细胞的染色体DNA上。本文所用的术语“外源的”指核酸和特定细胞时是指非来源于其天然宿主细胞的任何核酸。另外，术语“核酸”也包括天然核酸。例如，编码分离自人细胞的多肽的核酸一旦被导入到第二种人源细胞中，钙核酸对于第二种人源细胞来说就是外源的。外源核酸一般作为载体的一部分被转移，载体内的调节元件如启动子可操控地连接到目的核酸上。

[0062] 利用病毒载体如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒载体可改造细胞。参见Kay等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12744-12746中有关病毒载体和非病毒载体的综述。载体可以通过机械方式导入，如脂质体或化学介导的DNA摄取。例如，通过本领域熟知的方法将载体导入到MLPC内，其中包括转染、转化、转导、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、钙磷酸盐沉淀、脂TM质体、LIPOFECTIN 、溶酶体融合、合成的阳离子脂质、利用基因枪或DNA载体转运子。

[0063] 载体包含编码筛选标记的核酸。筛选标记的非限定性例子包括嘌罗霉素、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基葡萄糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。这些标记可用于筛选培养物中稳定的转化子。

[0064] MLPC还可以进行靶向基因修饰。导入靶向基因修饰的同源重组方法是本领域熟知的。为了获得同源重组MLPC，需要构建同源重组载体，其中目的基因的5’和3’端侧翼序列分别为靶向细胞基因组内源性的基因序列，这样载体携带的目的基因就可以和靶细胞基因组的内源性基因发生同源重组。两侧所加的核酸序列要足够长，以便于目的基因与靶细胞基因组的内源性基因发生同源重组。一般来说，载体内所包含的侧翼序列有几个kb(5’端和3’端)。构建同源重组载体的方法以及制备同源重组动物的方法是本领域熟知的(参见 Thomas 和 Capecchi，1987，Cell 51：503；Bradley，1991，Curr.Opin.Bio/Technol.2：823-29；以及PCT公开Nos.WO 90/11354、WO91/01140和WO 93/04169)。

[0065] 使用MLPC的方法

[0066] MLPC可用于酶替代疗法以治疗特殊的疾病，其中包括而不限于溶酶体贮积病，如Tay-Sachs综合征、Niemann-Pick综合征、Fabry综合征、Gaucher综合征、Hunter综合征和Hurler综合征，以及其他神经节苷脂贮积病、粘多糖增多症和糖原贮积病。

[0067] 在其他实施方式中，细胞可作为基因治疗的载体来矫正遗传性代谢缺陷、脑白质肾上腺萎缩症、囊性纤维化、糖原贮积病、甲状腺功能低下、镰状细胞性贫血、Pearson 综合征、Pompe病、苯酮尿症(PKIJ)、卟啉病、枫糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖贮积症(mucoplysaccharide nosis)、慢性肉芽肿性疾病和酪氨酸血症以及Tay-Sachs病，或者治疗癌症、肿瘤或其他病理状态。

[0068] MLPC可用于修复因疾病而导致的组织和器官损伤。在这种实施方式中，给予患者MLPC群使因疾病受损的组织或器官再生或修复。例如，给予患者MLPC群以增强患者化疗或放疗后的免疫系统功能，或者修复心肌梗死后的心脏组织。

[0069] 细胞还可用于组织再生治疗或替代治疗，其中包括而不限于角膜上皮缺损的治疗、软骨修复、面部斑痕修复、粘膜膜、肠垫片、神经结构(如视网膜、基底膜上的听觉神经元、嗅上皮上的嗅觉神经元)、皮肤烧伤创伤修复、或者重建其他损伤或患病的器官或组织。

[0070] MLPC还可用于治疗性移植手术中以增加或替换肝、胰腺、肾、肺、神经系统、肌肉、骨、骨髓、胸腺、脾、粘膜组织或头发的干细胞或祖细胞。

[0071] 组合物和制品

[0072] 本发明的特征还有含MLPC纯化群或MLPC克隆系的组合物和制品。在某些实施方式中，MLPC的纯化群或克隆系被置于容器内(如玻璃瓶或袋子)。在某些实施方式中，克隆系至少在培养物中经历了3次倍增(如，至少4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或TM50次倍增)。在其他实施方式中，组合物或制品中也包含培养基(如，MSCGM 培养基)。在其他实施方式中，组合物或制品还包含一种或多种冷冻保存液或药用载体。例如，组合物可包含血清和DMSO，血清、DMSO和海藻糖的混合物，或者人血清、DMSO和海藻糖的混合物。

[0073] MLPC的纯化群或克隆系可用包装材料包装，以试剂盒的形式出售。试剂盒的包装材料通常包含描述MLPC纯化群或克隆系如何培养、分化或使用的说明书或标记。生产这种试剂盒的组分和方法也是大家所熟知的。

[0074] 本发明还在下列实施例中做了进一步的描述，这些实施例并不是要限定权利要求所描述的本发明的范围。

[0075] 实施例

[0076] 实施例1：分离血细胞

[0077] 本实施例描述了利用下文所述的细胞分离试剂分离细胞的通用方法。等体积的细胞分离试剂(见表1)和枸橼酸葡萄糖(ACD)、CPDA(枸橼酸盐、磷酸盐、葡萄糖、腺嘌呤)或肝素化的脐带血样品在封闭的无菌容器(如，50ml圆锥形试管)内混合(每种 25ml)。含6
20×10 细胞/毫升以上白细胞的一份血液样品与两份细胞分离试剂混合。在室温下，试管在振荡平台上温和振荡混合20到45分钟，然后将试管正放在试管架上静置30到50分钟，使凝集细胞与未凝集细胞分开，未凝集细胞依然留在溶液中。用移液管从上清中回收未凝集细胞，不要搅动凝集物。回收的细胞用25ml PBS洗涤，500×g离心7分钟。然后将细胞团重新悬浮于4ml含2％人血清白蛋白的PBS中。

[0078] 表1

[0079] 细胞分离试剂

[0080]葡聚糖(平均分子量为413,000) 20g/l
Dulbecco磷酸缓冲盐水(10×) 100ml/l
肝素钠(10,000units/ml) 1ml/l
Hank’s平衡盐溶液(pH 7.2-7.4) 50ml/l
抗人血型糖蛋白-A抗体(鼠IgM单克隆抗体，克隆 2.2.2.E7) 0.1-15mg/L(优选约0.25mg/L)
抗CD15抗体(鼠IgM单克隆抗体，克隆324.3.B9) 0.1-15mg/L(优选约2.0mg/L)
抗CD9抗体(鼠IgM单克隆抗体，克隆8.10.E7) 0.1-15mg/L(优选约2.0mg/L)

[0081] 还可以利用含EDTA和乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)的低渗溶解液从凝集物中回收细胞。凝集的细胞用25ml VitaLyse (BioE，St.Paul，MN)处理，并振荡。10分钟后细胞在500×g离心7分钟，去掉上清，然后将细胞重悬于4ml PBS中。

[0082] 利用标准的流式细胞术和免疫表型分析法鉴定回收的红细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、造血干细胞和非造血干细胞。在进行流式细胞术前，利用Coulter Onyx Hematology Analyzer鉴定回收的白细胞(即，白细胞计数)。通过血液学分析和流式细胞术分析、根据光学发散特性鉴定细胞及标记抗体染色来确定细胞的类型并进行细胞计数。

[0083] 如表2所示，99.9％的红细胞被去除，99.8％的单核细胞和粒细胞、74％的B细胞、64.9％的B细胞和99.4％的血小板被从脐带血中去除。

[0084] 表2

[0085] 细胞回收

[0086]分离前 分离后
红细胞/毫升 4.41×109 0.006×109
白细胞/毫升 5.9×106 1.53×106
淋巴细胞(％) 28.7 99.0
单核细胞(％) 8.69 0.12
粒细胞(％) 62.5 .083
T细胞(CD3+) 19.7 83.2
B细胞(CD19+) 4.46 8.10
NK细胞(CD16+) 3.15 8.43
血小板/毫升 226×106 1.4×106

[0087] 实施例2：MLPC的纯化

[0088] 表3所示的细胞分离试剂用于从非凝集的上清相中分离MLPC。参见图1所示的纯化示意图。

[0089] 表3

[0090] 细胞分离试剂

[0091]葡聚糖(平均分子量为413,000) 20g/l
Dulbecco磷酸缓冲盐水(10×) 100ml/l
肝素钠(10,000units/ml) 1ml/l
Hank’s平衡盐溶液(pH 7.2-7.4) 50ml/l
抗人血型糖蛋白-A抗体(鼠IgM单克隆抗体，克隆 2.2.2.E7) 0.1-15mg/L(优选约0.25mg/L)
抗CD15抗体(鼠IgM单克隆抗体，克隆324.3.B9) 0.1-15mg/L(优选约2.0mg/L)
抗CD9抗体(鼠IgM单克隆抗体，克隆8.10.E7) 0.1-15mg/L(优选约2.0mg/L)

[0092] 简言之，50-150ml CPDA抗凝的脐带血(48小时以内的脐带血)与表3所示的等体积细胞分离组合物温和混合30分钟。混合完以后，将盛有血液/细胞分离组合物混合物的容器向上放置，在正常的1×g重力下使内容物沉降30分钟。沉降完成后从上清中收集非凝集的细胞。通过离心然后用PBS洗涤的方法从上清中回收细胞。细胞重悬到完全MSCGMTM(间充质干细胞生长培养基，产品编号为#PT-3001，Cambrex，Walkersville，MD)中，用完全MSCGMTM将细胞浓度调整到2-9×106/ml。将细胞接种到标准塑料组织培养瓶(如，Corning)、带槽的玻片或其他培养装置中，在37℃、含5％CO2的湿润环境中培养过夜。除非特别说明，以后的孵育都是在37℃、5％CO2的湿润环境中进行。在这个初始孵育过程中，MLPC粘附到塑料上。未粘附的细胞(如T细胞、NK细胞和CD34+造血干细胞)通过用完全MSCGMTM强力洗涤培养瓶或孔而去除。

[0093] 通过定期去掉完全MSCGMTM并加入新鲜的完全MSCGMTM来饲养MLPC培养物。通过这种方法，细胞浓度可维持在1×105-1×106细胞/75cm2之间。当细胞浓度达到
8×105-1×106细胞/75cm2时，用10％DMSO和90％血清冷冻保存细胞，或者扩增到新的培养瓶内。通过去掉完全MSCGMTM并加入PBS+0.1％EGTA从粘附培养物上回收细胞。细胞在
37℃孵育15到60分钟，然后从培养瓶中收集，并用完全MSCGMTM洗涤。然后以1×105细胞/mL的浓度重新接种细胞。培养物生长到汇合时就会发现细胞已失去增殖和分化能力。如果出现这种情况，培养物的密度就不要超过1×106细胞/75cm2。

[0094] 实施例3：MLPC的形态学及向成纤维细胞的发育

[0095] 按照实施例1和2描述的方法分离和培养的脐带血来源的MLPC用标准的MSCGMTM培养直到汇合为止。根据供体的不同，MLPC培养物生长到汇合所需的时间为2到8周不等。这些细胞在生长和培养成熟期间的形态学见图2A-2D。

[0096] 在图2A所示的早期阶段，细胞分裂比较缓慢，与循环中的白细胞形态相似，但是有树突状的胞浆突起。许多细胞还呈现小的圆形细胞形态，与这些细胞在循环中的形态相似。随着培养的继续，白细胞样细胞的形态开始从白细胞样变成更扁平更暗的成纤维细胞样(见图2B)。当细胞分裂时，它们开始聚集、分裂并重新粘附到培养瓶的表面，然后再次扩展开来。这个过程缓慢地持续进行，直到细胞长满可用的表面。图2C显示了处于对数生长期的细胞的形态。图2D显示了MLPC完全汇合后的形态。除了在画面的左下角发现有两个处于活跃分裂期的细胞以外，其他所有细胞都呈成纤维细胞样形态。

[0097] 总之，在培养的早期，细胞小而圆，但是具有胞浆突起，既有手指样突起又有高度延伸的突起，这是它们与其他血细胞的区别。开始培养后不久，细胞开始扩展，变得扁平，呈现与成纤维细胞一致的形态。最后，细胞一旦生长到汇合在一起，细胞开始大量地在平行方向上生长。培养物多次生长到汇合会导致其失去增殖和分化能力。

[0098] 实施例4：利用免疫荧光显微镜确定细胞的免疫表型

[0099] 为了确定MLPC的表面标记，将新鲜分离的细胞接种到16孔带槽玻片上并使其生长到汇合。在培养的不同时间点(从接种后3天到汇合后)收获细胞并用下
列 标 记 染 色：CD45-FITC(BD/Pharmingen)、CD34-PE(BD/Pharmingen)、CD4-PE(BioE)、CD8-PE(BioE)、抗HLA-DR-PE(BioE)、CD41-PE(BioE)、CD9-PE(Ancell)、CD105-PE(Ancell)、CD29-PE(Coulter)、CD73-PE(BD/Pharmingen)、CD90-PE(BD/Pharmingen)、 抗 人 干细 胞 因 子 -FITC(R&D Systems)、CD14-PE(BD/Pharmingen)、CD15-FITC(Ancell)、CD38-PE(BD/Pharmingen)、CD2-PE(BD/Pharmingen)、CD3-FITC(BD/Pharmingen)、CD5-PE(BD/Pharmingen)、CD7-PE(BD/Pharmingen)、CD16-PE(BD/Pharmingen)、
CD20-FITC(BD/Pharmingen)、CD22-FITC(BD/Pharmingen)、CD19-PE(BD/Pharmingen)、CD33-PE(BD/Pharmingen)、CD10-FITC(BD/Pharmingen)、CD61-FITC(BD/Pharmingen)、CD133-PE(R&DSystems)、抗 STRO-1(R&D Systems) 和 羊 抗 鼠 IgG(H+L)-PE(BioE)、SSEA-3(R&DSystems)和羊抗大鼠IgG(H+L)-PE(BioE)、SSEA-4(R&D Systems)和羊抗鼠IgG(H+L)-PE(BioE)。还要分析骨髓MSC(Cambrex，Walkersville，MD)和脐带血HSC(来自上述非粘附细胞)的细胞表面标记。

[0100] 简言之，从玻片的孔中去掉细胞培养基，用Hank’s平衡盐溶液+2％BSA洗涤细胞3次，然后在暗处室温下用抗体染色细胞20分钟。孵育以后用Hank’s平衡盐溶液+2％BSA洗涤细胞3次，，然后用荧光显微镜直接观察细胞是否有荧光。脐带血来源的MLPC与骨髓来源的MSC及脐带血来源的造血干细胞(HSC)进行比较所得到的结果列于表4中。

[0101] 表4

[0102]细胞标记 早期MLPC (白细胞形态) 成熟MLPC (成 脐带血HSC 骨髓MSC
纤维细胞形态)
CD2 阴性 阴性 阴性 阴性
CD3 阴性 阴性 阴性 阴性
CD4 阴性 阴性 阴性 阴性
CD5 阴性 阴性 阴性 阴性
CD7 阴性 阴性 阴性 阴性
CD8 阴性 阴性 阴性 阴性
CD9 阳性 阳性 阴性 阴性
CD10 阴性 阴性 阴性 阴性
CD13 阳性 阳性 阴性 阳性
CD14 阴性 阴性 阴性 阴性
CD15 阴性 阴性 阴性 阴性

[0103]细胞标记 早期MLPC (白细胞形态) 成熟MLPC (成纤维 脐带血HSC 骨髓MSC细胞形态)
CD16 阴性 阴性 阴性 阴性
CD19 阴性 阴性 阴性 阴性
CD20 阴性 阴性 阴性 阴性
CD22 阴性 阴性 阴性 阴性
CD29 阳性 阳性 阳性 阳性
CD33 阴性 阴性 不确定 阴性
CD34 阳性 阴性 阳性 阴性
CD36 阴性 阴性 阴性 阴性
CD38 阴性 阴性 不确定 阴性
CD41 阴性 阴性 阴性 阴性
CD45 阳性 阴性 阳性 阴性
CD61 阴性 阴性 不确定 阴性
CD73 阳性 阳性 阴性 阳性
抗HLA-DR 阴性 阴性 不确定 阴性
CD90 阳性 阳性 阳性 阳性
CD105 阳性 阳性 阴性 阳性
STRO-1 阳性 阴性 阴性 阴性
SSEA-3 阳性 阴性 阴性 阴性
SSEA-4 阳性 阴性 阴性 阴性
SCF 阳性 阴性 阴性 阴性
血型糖蛋白A 阴性 阴性 阴性 阴性
CD133 阳性 阴性 阳性 阴性

[0104] 实施例5：克隆的MLPC细胞系

[0105] 实施例2的MLPC传2代以后，通过用含0.1％EGTA(pH 7.3)的PBS替换细胞培养基将细胞从培养瓶的塑料表面分离下来。用完全MSCGMTM将细胞稀释到1.3个细胞/毫升，然后加入到96孔培养板内，每孔0.2ml，这样平均3个孔约有一个细胞。在37℃过夜孵育使细胞粘附到培养板上以后，观察培养板内细胞的实际分布情况。只有每孔一个细胞的孔继续培养。当细胞繁殖到浓度为1-5×105细胞/75cm2时将其转移到更大的培养瓶中以使细胞浓度维持在1×105到5×105细胞/75cm2之间，使其保持对数生长状态。细胞在37℃、5％CO2的环境中培养。

[0106] 利用这种方法至少建立了52个克隆细胞系，分别命名如下：UM081704-1-E2、UM081704-1-B6、UM081704-1-G11、UM081704-1-G9、UM081704-1-E9、UM081704-1-E11、UM081704-1-G8、UM081704-1-H3、UM081704-1-D6、UM081704-1-H11、UM081704-1-B4、UM081704-1-H4、UM081704-1-C2、UM081704-1-G1、UM081704-1-E10、UM081704-1-B7、UM081704-1-G4、 UM081704-1-F12、UM081704-1-H1、UM081704-1-D3、UM081704-1-A2、UM081704-1-B11、UM081704-1-D5、UM081704-1-E4、UM081704-1-C10、UM081704-1-A5、UM081704-1-E8、UM081704-1-C12、UM081704-1-E5、UM081704-1-A12、UM081704-1-C5、UM081704-1-A4、UM081704-1-A3、MH091404-2#1-1.G10、UM093004-1-A3、UM093004-1-B7、UM093004-1-F2、UM093004-1-A12、UM093004-1-G11、UM093004-1-G4、UM093004-1-B12、UM093004-2-A6、UM093004-2-A9、UM093004-2-B9、UM093004-2-C5、UM093004-2-D12、UM093004-2-H3、UM093004-2-H11、UM093004-2-H4、UM093004-2-A5、UM093004-2-C3 和UM093004-2-C10。按照实施例所述的方法分析克隆细胞系UM081704-1-E8的细胞表面标记，结果发现与具有成纤维细胞形态的“成熟MLPC”一样，如表4所示。

[0107] 实施例16：MLPC向骨细胞的分化

[0108] MLPC细胞群和克隆细胞系UM081704-1-E8都用完全MSCGMTM培养，并在上述对数生长条件下扩增。用PBS+0.1％EGTA处理后收获细胞，再以5×103到2×104/ml的浓度接种用完全MSCGMTM。细胞孵育过夜使其粘附，然后培养基替换成成骨细胞分化培养基(产品编号为#PT-3002，Cambrex)，该培养基由添加地塞米松、L-谷氨酰胺、抗坏血酸和β-磷酸TM甘油的完全MSCGM 组成。细胞在37℃、5％CO2的环境中培养，每3-4天换一次培养基，共培养2-3周。利用修改的茜素红染色方法证明是否存在钙结晶，在相差显微镜和荧光显微镜下观察钙矿化的茜素红染色情况。

[0109] 实施例7：MLPC向脂肪细胞的分化

[0110] MLPC细胞群和克隆细胞系UM081704-1-E8都接种到完全MSCGMTM，浓度为1×104到5
2×10 细胞/毫升培养基，在37℃、5％CO2的环境中培养。使细胞重新粘附到培养板上，每
3-4天换一次培养基，直到培养物生长到汇合为止。当细胞100％汇合时，用脂肪细胞形成分化培养基(产品编号为#PT-3004，Cambrex)培养，这种培养基由添加人胰岛素、L-谷氨TM
酰胺、地塞米松、吲哚美辛和3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤的完全MSCGM 组成，至少培养14天。

[0111] 为了分析分化情况，细胞用可对脂质特异性染色的油红染色。MLPC汇合培养物呈成纤维细胞样形态，油红染色结果发现，没有任何迹象表明出现了脂质体。但是用脂肪细胞形成培养基诱导分化3周后MLPC出现了脂肪细胞特有的脂质体(即，胞浆 中亮白色的管状物)，并且油红染色后产生红色。用脂肪细胞形成培养基诱导分化的MLPC在用特异于甘油三酯的尼罗红染色后还呈现绿色荧光。未分化的细胞维持其成纤维细胞样形态，不被染色。

[0112] 实施例8：MLPC向肌细胞的分化

[0113] MLPC(细胞群和克隆细胞系UM081704-1-E8)以1.9×104细胞/孔的浓度接种到TM带四个槽的用纤连蛋白预涂布的玻片内的完全MSCGM 中，并在37℃、5％CO2的环境中培养24-48小时使细胞粘附到板上。去掉培养基，换成10μM的5-氮杂胞苷(产品编号为#A1287，Sigma Chemical Co.)，继续孵育24小时。细胞用PBS洗涤2次，然后用含重组人表皮生长因子(huEGF)、人胰岛素、胎球蛋白、地塞米松和重组人碱性成纤维细胞生长因子(100ng/mL)(huFGF-basic，产品编号为#F0291，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的TM
SkGM 骨骼肌细胞培养基(产品编号为#CC-3160，Cambrex)培养。每2-3天换一次培养基，TM TM
培养约21天。对照孔用MSCGM 培养，而试验孔用SkGM (如上所述)培养。

[0114] 在开始肌细胞培养后7天收获细胞。去掉培养上清，细胞用2％缓冲甲醛溶液固定TM2小时。细胞用PermaCyte (BioE，St.Paul，MN)进行透化处理，然后用人快骨骼肌肌球蛋白特异性的鼠单克隆抗体(MY-32，产品编号为#ab7784，Abcam，Cambridge，MA)或α肌动蛋白特异性的鼠单克隆抗体(BM 75.2，产品编号为#ab11008，Abcam)染色。细胞与一抗孵育20分钟，用PBS洗涤，再用羊抗鼠IgG(H+L)-PE(BioE，St.Paul，MN)复染。肌细胞培养物含有快骨骼肌肌球蛋白和α肌动蛋白，这说明MLPC已转分化成骨骼肌细胞。

[0115] 实施例9：MLPC向神经细胞的分化

[0116] 骨髓来源的hMSC(Cambrex)、脐带血MLPC和MLPC克隆细胞系在上述对数生长条4
件下培养。按照上述方法收获细胞，再以每孔0.8×10 个细胞的浓度接种到四槽玻片上，该玻片已预先涂布了多聚D赖氨酸和层粘连蛋白(BD Biosciences DiscoveryLabware，产品编号为#354688)，每孔加入0.5mL含huFGF-basic、huEGF、脑源性神经营养因子、神经存活因子-1、成纤维细胞生长因子-4(20ng/mL)和200mM GlutaMaxI Supplement(产品编号TM
为#35050-061，Invitrogen，Carlsbad，CA)的NPMM (产品编号为#CC-3209，Cambrex)。每
2-3天换一次培养基，共培养21天。4到20天后出现神经球。MLPC转化成神经细胞系可通过干蛋白(抗人干蛋白单克隆抗体，MAB1259， 克隆196908，R&D Systems)、III类β微管蛋白(微管蛋白b-4)(抗神经元特异性的III类β微管蛋白单克隆抗体，MAB1195，克隆TuJ-1，R&D Systems)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)(抗人GFAP单克隆抗体，HG2b-GF5，克隆GF5，AdvancedImmunochemical，Inc.)以及半乳糖脑苷脂(GalC)(鼠抗人GalC单克隆抗体MAB342，mGalC克隆，Chemicon)的阳性染色来确定。

[0117] 在神经祖细胞维持培养基中加入10ng/mL BDNF(产品编号为#B3795，SigmaChemical Co.)和10ng/mL NT3(产品编号为#N1905，Sigma Chemical Co.)继续培养-6
10-14天，细胞可进一步分化成神经元。在神经祖细胞维持培养基中加入10 M视黄酸(产品编号为#R2625，Sigma Chemical Co.)、10ng/mL LIF(产品编号为#L5158，SigmaChemical Co.)和10ng/mL CNTF(产品编号为#C3710，Sigma Chemical Co.)继续培养10-14天，神经-6
球可进一步分化成星形胶质细胞。在神经祖细胞维持培养基中加入10 M T3(产品编号为#T5516，Sigma Chemical Co.)继续培养10-14天，神经球可进一步分化成少突胶质细胞。
分化成少突胶质细胞可由髓磷脂碱性蛋白(MBP)(抗MBP单克隆抗体，产品编号为#ab8764，克隆B505，Abcam)的阳性染色来确定。

[0118] 实施例10：MLPC向内皮细胞的分化

[0119] MLPC以每孔1.9×104个细胞的浓度接种到四槽玻片上(2cm2)。细胞用1ml含肝素、牛脑提取物、人重组上皮生长因子和氢化可的松的内皮细胞培养基-微脉管系统(EGM3-MV，产品编号为#CC-3125，Cambrex)培养。每2-3更换一次培养基，共培养约21天。在7到10天内发生形态学的改变。MLPC分化成内皮细胞系可通过CD62E[E-选择素，鼠抗人CD62E单克隆抗体，产品编号为#551145，克隆68-5H11，BDPharmingen]和CD102[ICAM-2，抗人ICAM-2单克隆抗体，MAB244，克隆86911，R&D Systems]染色来分析。在MSCGM中生长14天的对照MLPC是CD62E和CD102染色阴性的，而分化的培养物是CD62E和CD102双阳性的。

[0120] 实施例11：MLPC向肝细胞/胰腺细胞前体细胞的分化

[0121] MLPC以1×105细胞/cm2的浓度体外接种到HCMTM培养基(产品编号为#CC-3198，Cambrex)内，该培养基含有抗坏血酸、氢化可的松、转铁蛋白、胰岛素、huEGF、重组人肝细胞生长因子(40ng/mL)、huFGF-basic(20ng/mL)、重组人成纤维细胞生长因子-4(20ng/mL)和干细胞生长因子(40ng/mL)。细胞培养29天或更长时间以使其分化成肝细胞系和胰腺细胞系的前体细胞。MLPC从成纤维细胞形态转变成肝细胞形态， 表达肝细胞生长因子的细胞表面受体，产生肝细胞的细胞产物人血清白蛋白和胰岛细胞的细胞产物胰岛素，二者都可以通过在30天时进行细胞内抗体染色来确定。

[0122] 其他实施方式

[0123] 虽然结合上面的详细说明和实施例已对本发明作了描述，但是上述的说明和实施例是为了说明的目的，并不意味着对附属权利要求所定义的本发明范围的限制。其他方面、优点及修饰都在权利要求的范围之内。