一种银杏叶冻干粉针剂及其制备方法

摘要

本发明提供了一种银杏叶冻干粉针剂及其制备方法，其制备方法包括：采用醇提法得到银杏叶醇提物，采用絮凝沉淀法初步除杂，采用醇沉法进一步除杂，然后将药液上聚酰胺柱，用梯度乙醇进行洗脱，本发明采用3个浓度进行洗脱，并根据洗脱物中化合物极性逐渐减弱的特点，进行分段收集，极性稍强部分可用水饱和正丁醇萃取，极性稍弱部分用水饱和乙酸乙酯萃取，最后得到银杏叶提取物，其有效成分含量高，其中有效部位的总含量达到80％以上，总黄酮醇苷达到40％以上，萜类内酯达到10％以上。本发明进一步将银杏叶提取物制备成冻干粉针剂，其有效成分含量高，能够满足临床治疗的目的。

权利要求

1.一种银杏叶冻干粉针剂的制备方法，该方法包括步骤：

1)将银杏叶切碎，采用醇提法得醇提物；

2)加入絮凝剂，絮凝沉淀，过滤，上清液减压浓缩；

3)醇沉除杂，减压浓缩至无醇味；

4)加水适当稀释，上样至已处理的聚酰胺柱，用8-20％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用25-40％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用55-70％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；

5)药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得银杏叶提取物；

6)将步骤5)得到的银杏叶提取物制备成冻干粉针剂，

其中，步骤1)使用40-60％的乙醇提取；

其中，步骤2)所使用的絮凝剂为海藻酸、壳聚糖、明胶或聚乙烯吡咯烷酮，絮凝剂配制成0.5～2％的溶液，按照体积比1∶0.2～0.4加入到药液中，静置6-10小时，滤过，上清液减压浓缩；

其中，步骤3)添加乙醇使药液含醇量为70-85％进行醇沉除杂；

其中，步骤6)按重量比加入8-12倍量乙醇，适量注射用水，搅拌使溶解，补加注射用水至含生药0.5g/ml，调节pH5.0～6.5，加入适量支架剂，搅拌使充分溶解，药用炭吸附，除炭，加注射用水至含生药0.2-0.4g/ml，精滤，灌装，冷冻干燥，即得，其中所述支架剂选自甘露醇、右旋糖酐、乳糖、葡聚糖或聚山梨酯中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤4)用乙醇洗脱的浓度依次为

10％、30％、60％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中步骤5)对药液I、II、III萃取的次数均为3次。

4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)为：取银杏叶切碎，按重量比加入5-8倍量40-60％的乙醇，回流提取2-4次，每次1.0-1.5小时，合并，滤过，减压浓缩。

5.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的絮凝剂为壳聚糖。

6.如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)为：加入乙醇使药液含醇量为70-85％，静置12-24小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味。

说明书

一种银杏叶冻干粉针剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及医药领域，具体涉及一种银杏叶冻干粉针剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 银杏别名白果，又名公孙树，属于银杏科，拉丁学名Ginkgobiloba。其叶可入药，到目前为止已知其化学成分的银杏叶提取物多达160余种，主要有黄酮类、萜类、酚类、生物碱、聚异戊烯、奎宁酸、亚油酸、蟒草酸、抗坏血酸、a-已烯醛、白果醇、白果酮等。

[0003] 研究表明，银杏叶提取物对心脑血管和血液系统具有广泛的药理作用，主要表现在以下几方面：

[0004] 1、对动物实验性心肌缺血的影响 有明显对抗垂体后叶素引起的心肌缺血和改善动脉痉挛的作用，对动物实验性心肌缺血引起的心功能紊乱有明显的保护作用，对实验性动物具有对抗心肌缺血损伤，缩小心肌梗塞面积的作用。

[0005] 2、对实验性大鼠脑缺血有明显的保护作用。

[0006] 3、对实验性大鼠具有降低血栓程度、改善血液流变学特性的作用。

[0007] 4、能明显提高小鼠机体的耐缺氧能力。

[0008] 5、具有抗衰老作用 衰老的自由基学说已经被国内外学者所公认。自由基是代谢活动中不断产生的损害机体的毒性产物，它广泛地参与生理及病理过程。机体在自由基及其诱导的氧化反应下导致衰老。同时，自由基促成的脂质过氧化作用及生成的过氧化脂类随着年龄的增加而增加。动物实验表明，银杏叶提取物具有消除自由基、防护自由基损伤从而抑制衰老的作用。

[0009] 银杏叶提取物在临床上主要有如下几个方面的应用

[0010] 1、治疗冠心病心绞痛 银杏叶提取物对治疗冠心病心绞痛有明显的作用，可改善心脏血流、保护缺血心肌的功能，可降低胆固醇、甘油三酯、升高高密度脂蛋白，改善血液流变学的某些指标，对预防心脑血管疾病有重要意义，可明显改善冠心病患者的临床症状，如对头晕、胸闷、心悸、气短、乏力均有较好的改善作用。

[0011] 2 治疗高脂血症 银杏叶提取物对高脂血症有治疗作用，可明显降低血脂水平，降低中老年人冠心病的发病率。

[0012] 3 治疗脑血管疾病 通过对银杏叶提取物制剂的临床应用，发现它能够改善细胞血液循环、活化细胞代谢，因而对老年痴呆症、脑损伤后遗症、脑血栓等疾病的疗效显著。

[0013] 4 抗癌作用 银杏叶提取物还能抑制亚硝胺等物质的致癌作用。

[0014] 但是由于目前银杏叶提取物的有效成分含量偏低，影响了疗效，不能满足临床治疗的要求。

发明内容

[0015] 本发明的目的在于针对上述不足提供一种银杏叶冻干粉针剂及其制备方法，本发明冻干粉针剂有效成分含量高，纯度高，安全稳定。

[0016] 本发明冻干粉针剂是通过下述方法制备获得的：

[0017] 1)将银杏叶切碎，采用醇提法得醇提物；

[0018] 2)加入絮凝剂，絮凝沉淀，过滤，上清液减压浓缩；

[0019] 3)醇沉除杂，减压浓缩至无醇味；

[0020] 4)加水适当稀释(可稀释至含生药4g/ml)，上样至已处理的聚酰胺柱，用8-20％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用25-40％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用55-70％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中，上样时可以按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时可以按照1.5柱体积/小时的流速进行；

[0021] 5)药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得银杏叶提取物；上述有机溶剂萃取以3次为宜；

[0022] 6)将步骤5)制备得到的银杏叶提取物制备成冻干粉针剂。

[0023] 上述步骤1)提取的方法具体可以为：取银杏叶切碎，按重量比加入5-8倍量40-60％的乙醇，回流提取2-4次，每次1.0-1.5小时，合并，滤过，减压浓缩。

[0024] 上述步骤2)中的絮凝剂可以为海藻酸、壳聚糖、明胶、聚乙烯吡咯烷酮等，优选为壳聚糖。絮凝沉淀的方法可以按照下述步骤进行：取絮凝剂配制成0.5～2％的溶液，按照体积比1∶0.2～0.4加入到药液中，静置6-10小时，滤过，上清液减压浓缩至相对密度约1.03-1.09(50℃时测)。

[0025] 上述步骤3)醇沉除杂的方法可以按照下述步骤进行：加入乙醇使药液含醇量为70-85％，静置12-24小时，倾出上清液，回收乙醇，然后减压浓缩至无醇味。

[0026] 上述步骤6)制备粉针剂的方法可以按照下述步骤进行：按重量比加入8-12倍量乙醇，适量注射用水，搅拌使溶解，补加注射用水至含生药0.5g/ml，调节pH5.0～6.5，加入适量支架剂，搅拌使充分溶解，药用炭吸附，除炭，加注射用水至含生药0.2-0.4g/ml，精滤，灌装，冷冻干燥，即得。

[0027] 其中的支架剂可为甘露醇、右旋糖酐、乳糖、葡聚糖或聚山梨酯中的一种或多种，加入支架剂使其含量为按重量体积比计为5-10％。

[0028] 上述药用炭吸附的方法可以按照下述步骤进行：按照每升溶液加入0.4-0.6g药用炭，75-85℃保温搅拌20-40min，然后过滤至澄清。

[0029] 有益效果：

[0030] 1)本发明采用乙醇浸提-树脂吸附法的生产得率更高。

[0031] 2)醇提之后采用常用的醇沉法和絮凝沉淀法进行除杂处理；利用聚酰胺对黄酮类的选择性吸附，对萜内酯类和黄酮类进行分离洗脱；利用各种有机溶剂的极性特点对萜内酯和极性不同的黄酮类进行选择性萃取，得到高纯度的产物。

[0032] 3)对不同浓度乙醇的洗脱物进行分段萃取，可提高有效部位总含量。

[0033] 通过对银杏叶提取物的成分分析，结果表明，通过本发明方法制备得到的银杏叶提取物，其有效部位的总含量可以达到80％以上，其中总黄酮醇苷达到40％以上，萜类内酯达到10％以上。

[0034] 通过本发明方法制备得到的粉针剂其有效成分含量高，能够满足临床治疗的目的。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

[0036] 实施例1 粉针剂的制备方法

[0037] 1)取银杏叶切碎，按重量比加入8倍量55％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，合并，滤过，减压浓缩；

[0038] 2)加入0.2倍量体积的1％的明胶溶液(即按照药液与絮凝剂溶液体积比1∶0.2加入1％(重量体积比)的明胶溶液)，静置8小时，滤过，上清液减压浓缩至相对密度约1.06(50℃时测)；

[0039] 3)加入乙醇使药液含醇量为80％，静置24小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味；

[0040] 4)加水适当稀释，上样至已处理的聚酰胺柱，用8％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用25％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用55％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中，上样时按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时按照1.5柱体积/小时的流速进行；

[0041] 5)药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，60℃真空干燥，得银杏叶提取物；

[0042] 6)按重量比加入10倍量无水乙醇，适量注射用水，搅拌使溶解，补加注射用水至含生药0.5g/ml，用氢氧化钠调节pH6.0，按照重量体积比加入5％甘露醇，搅拌使之充分溶解，按照重量体积比加入0.04％药用炭，80℃保温搅拌30min，过滤除炭，加注射用水至含生药0.3g/ml，依次用0.45μm、0.22μm滤膜过滤，无菌灌装，冷冻干燥，密封，压盖，即得。

[0043] 对银杏叶提取物的成分进行分析，结果表明：其有效部位的总含量可以达到80.0％，其中总黄酮醇苷达到43.6％，萜类内酯达到11.4％。

[0044] 实施例2 粉针剂的制备方法

[0045] 1)取银杏叶切碎，按重量比加入8倍量60％的乙醇，回流提取3次，每次1小时，合并，滤过，减压浓缩；

[0046] 2)加入0.4倍量体积的0.5％海藻酸溶液，静置10小时，滤过，上清液减压浓缩至相对密度约1.09(50℃时测)；

[0047] 3)加入乙醇使药液含醇量为70％，静置12小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味；

[0048] 4)加水稀释至含生药4g/ml，上样至已处理的聚酰胺柱，用20％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用40％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用70％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中，上样时按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时按照1.5柱体积/小时的流速进行；

[0049] 5)药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，真空干燥，得银杏叶提取物；

[0050] 6)按重量比加入10倍量无水乙醇，适量注射用水，搅拌使溶解，补加注射用水至含生药0.5g/ml，用氢氧化钠调节pH6.5，按照重量体积比加入8％右旋糖酐，搅拌使之充分溶解，药用炭吸附，除炭，加注射用水至含生药0.4g/ml，精滤，灌装，冷冻干燥，密封，压盖。

[0051] 对银杏叶提取物的成分进行分析，结果表明：其有效部位的总含量可以达到87.5％，其中总黄酮醇苷达到47.2％，萜类内酯达到14.1％。

[0052] 实施例3 粉针剂的制备方法

[0053] 1)取银杏叶切碎，按重量比加入6倍量40％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，合并，滤过，减压浓缩；

[0054] 2)加入0.3倍量的1.5％聚乙烯吡咯烷酮溶液，静置8小时，滤过，上清液减压浓缩至相对密度约1.03(50℃时测)；

[0055] 3)加入乙醇使药液含醇量为70％，静置24小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味；

[0056] 4)加水稀释至含生药4g/ml，上样至已处理的聚酰胺柱，用10％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用30％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用60％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中，上样时按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时按照1.5柱体积/小时的流速进行；

[0057] 5)药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，60℃真空干燥，得银杏叶提取物；

[0058] 6)按重量比加入10倍量无水乙醇，适量注射用水，搅拌使溶解，补加80℃注射用水至含生药0.5g/ml，用氢氧化钠调节pH5.0，按照重量体积比加入10％乳糖，搅拌使之充分溶解，按照重量体积比加入0.06％药用炭，85℃保温搅拌40min，过滤除炭，加注射用水至含生药0.2g/ml，依次用0.45μm、0.22μm滤膜过滤，无菌灌装，冷冻干燥，密封，压盖，即得。

[0059] 对银杏叶提取物的成分进行分析，结果表明：其有效部位的总含量可以达到95.4％，其中总黄酮醇苷达到56.2％，萜类内酯达到12.4％。

[0060] 实施例4 粉针剂的制备方法

[0061] 1)取银杏叶100g，粉碎至10目以下，加入1000mL 40％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小时，合并，滤过，减压浓缩至300ml；

[0062] 2)加入60ml 1％的壳聚糖溶液，静置8小时，滤过，上清液减压浓缩至相对密度约1.06(50℃时测)；

[0063] 3)加入乙醇使药液含醇量为80％，静置24小时，倾出上清液，回收乙醇，减压浓缩至无醇味；

[0064] 4)加水稀释至含生药4g/ml，上样至已处理的聚酰胺柱，用10％乙醇洗脱，收集上样流出液及洗脱液，减压浓缩得药液I；用30％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液II；继续用60％乙醇洗脱聚酰胺柱，收集洗脱液，回收乙醇，减压浓缩得药液III；其中，上样时按照0.5柱体积/小时的流速进行，洗脱时按照1.5柱体积/小时的流速进行；

[0065] 5)药液I用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，得药液IV；药液II用水饱和的正丁醇萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，备用；药液III用水饱和的乙酸乙酯萃取3次，水层弃去，有机层回收溶剂，与药液II萃取的有机层浓缩物、药液IV合并，减压浓缩至稠膏，60℃真空干燥，得银杏叶提取物；

[0066] 6)加入10ml无水乙醇，搅拌使之溶解，补加注射用水至含生药0.5g/ml，用氢氧化钠调节pH6.0，加入甘露醇21g，搅拌使之充分溶解，加入药用炭0.08g，80℃保温搅拌30min，过滤除炭，加注射用水至含生药0.3g/ml，依次用0.45μm、0.22μm滤膜过滤，无菌灌装，冷冻干燥，密封，压盖，即得。

[0067] 对银杏叶提取物的成分进行分析，结果表明：其有效部位的总含量可以达到85.7％，其中总黄酮醇苷达到44.6％，萜类内酯达到11.3％。

[0068] 实验例1 不同乙醇浓度的洗脱物萃取试验

[0069] 试验方法：取银杏叶2000g，醇提、壳聚糖絮凝以及醇沉的方法分别参照实施例4的步骤1、2和3，将药液稀释至500ml，平均分成两份，一份上样至已处理的800ml聚酰胺柱，依次用10％、30％、60％乙醇洗脱，均洗脱2400ml，分别收集洗脱液，均减压浓缩至
100ml，10％乙醇洗脱浓缩物用水饱和乙酸乙酯萃取3次，每次30ml，合并有机层，回收溶剂；30％乙醇洗脱浓缩物用水饱和正丁醇萃取3次，每次30ml，合并有机层，回收溶剂；60％乙醇洗脱浓缩物用水饱和乙酸乙酯萃取3次，每次30ml，合并有机层，回收溶剂；合并后真空干燥，得银杏叶提取物1。另一份上样至已处理的800ml聚酰胺柱，依次用10％和60％乙醇洗脱，均洗脱2400ml，合并洗脱液，减压浓缩至200ml，用水饱和乙酸乙酯萃取3次，每次
60ml，合并有机层，回收溶剂，真空干燥，得银杏叶提取物2。分别检测其含量，结果见表1。

[0070] 表1 不同乙醇浓度的洗脱物萃取试验

[0071]总黄酮(％) 总萜内酯(％)有效部位总含量(％)
银杏叶提取物1 74.4 11.3 85.7
银杏叶提取物2 65.6 10.0 75.6

[0072] 由上表可见采用本发明的方法可以有效提高药效成分的含量。

[0073] 实验例2 药效学研究(无新疗效，如无必要，可以将其删去)

[0074] 药效学试验结果表明：1、本发明能改善犬的心肌缺血改变，具有减少犬心肌缺血范围、减轻缺血程度的作用。2、具有增加心输出量及降低犬左室内压峰值，减少血管总外周阻力，提高心脏指数，减少血管总外周阻力之趋势。3、具有显著降低冠脉阻力、增加冠脉流量的作用。5、能对抗垂体后叶素致大鼠心肌缺血导致的ST段的改变，均具有较好抗急性心肌缺血的作用。6、能降低血瘀证大鼠血液粘度及血浆粘度；降低家兔血小板聚集率；具有活血化瘀的作用。

[0075] 药物：1)银杏叶粉针剂，规格：10mg/支，试验时用0.9％氯化钠注射液配成所需浓度。

[0076] 2)金纳多注射液，德国威玛舒培大药厂生产，进口药品注册证号：X97038，批号：7170450，规格：17.5mg银杏叶提取物/5ml/瓶，试验时用0.9％氯化钠注射液稀释至需浓度。

[0077] 动物：1)健康杂种犬，雌雄不限，购自湖南省卫生防疫站实验动物养殖场。

[0078] 2)SD大鼠，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。许可证号：SCXK(沪)2003-0002。

[0079] 3)日本大耳白家兔，2.0-2.5kg，雄性，湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供。合格证号：SCXK(湘)2003-0003。

[0080] 一、对犬急性心肌缺血改善作用实验。

[0081] 试验方法 取健康杂种犬30条，雌雄兼用，体重9.5±1.1kg，随机分为5组，即生理盐水对照组；高、中、低三个给药剂量组和金纳多注射液阳性对照组。各组动物分别用戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉注射麻醉，气管插管进行人工呼吸，左侧开胸，缝制心包摇篮，用绵线电极记录16点心外膜电图，冠状窦插管，血液回流至右颈外静脉。右颈总动脉插管，分别取血测冠状窦血乳酸、游离脂肪酸和过氧化脂质含量。动脉取血测血磷酸肌酸激酶、乳酸脱氢酶含量。于冠脉前降支主干末端和主干远端1/3处用丝线结扎。结扎冠脉15min后，记录及测定各项指标.然后经股静脉给药，5min内注完，给药体积为2ml/kg，记录给药后5min、15min、30min、60min的心外膜电图，计算心肌缺血范围(N-ST)及心肌缺血程度(∑-ST)。给药前及给药后15min、30min、60min时取血测生化指标。药后3小时，取心称重，置-10℃冰箱中冰冻60分钟后取出，于心脏冠脉前降支主干1/3结扎点下方，平行于冠状沟，用单面刀片将左心室横切成5片，用硝基四氮唑蓝(N-BT)于37℃染色15分钟，用重量法测心肌梗塞范围。

[0082] 试验结果

[0083] 1、对犬急性心肌缺血时缺血范围(N-ST)的影响：见表2，本发明各剂量组均能显著减少缺血范围，5min即起作用，30min时作用最强，60min时作用有所减弱。

[0084] 表2 对犬急性心肌缺血时缺血范围(N-ST)的影响(x±SD n＝6)

[0085]

[0086]

[0087] 与生理盐水组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与给药前比较：△P＜0.05；△△P＜0.01。

[0088] 2、对犬急性心肌缺血时缺血程度(∑-ST)的影响：

[0089] 表3 对犬急性心肌缺血时缺血程度(∑-ST)的影响(x±SD MV n＝6)

[0090]

[0091] 与生理盐水组比较：*P＜0.05，**P＜0.01；与给药前比较：△P＜0.05，△△P＜0.01。

[0092] 由表3可见，本发明各剂量组均能显著减轻心肌缺血程度(∑-ST)。

[0093] 3、对犬急性心肌缺血时梗塞组织学染色范围的影响：见表4，本发明各剂量组均能显著减少组织学染色梗塞范围。

[0094] 表4 对犬急性心肌缺血时心肌梗塞组织学范围的影响(x±SD n＝6)

[0095]* **

[0096] 与生理盐水组比较：P＜0.05，P＜0.01。

[0097] 4、对犬急性心肌缺血时血清肌酸激酶(CPK)及乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响：见表5，本发明各剂量组均能显著降低血清CPK和LDH活性。

[0098] 表5 对犬急性心肌缺血时CPK及LDH活性的影响(x±SD n＝6)

[0099]

[0100] 与生理盐水组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

[0101] 5、对犬急性心肌缺血时冠状窦血乳酸、游离脂肪酸和过氧化脂质含量的影响：见表6，中、高两个剂量组能显著减少冠状窦血中乳酸含量，3个剂量组均能显著减少窦血中游离脂肪酸和过氧化脂质含量。

[0102] 表6 对犬急性心肌缺血时冠状窦血乳酸、游离脂肪酸和过氧化脂质含量的影响(x±SD n＝6)

[0103]

[0104]

[0105] 与生理盐水组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

[0106] 二、对犬心脏功能及血流动力学影响实验

[0107] 试验方法

[0108] 取健康杂种犬30条，雌雄兼用，体重9.7±1.3kg，随机分为五组，动物组别同前。用戊巴比妥钠(30mg/kg)静注麻醉，气管插管作人工呼吸，正中开胸，缝制心包摇篮，剥离主动脉根部脂肪组织，放置直径10mm的FR型探头，用电磁血流量计测主动脉流量代表心输出量，左心室尖部插管测左室内压，分离股动脉插管测动脉血压。四肢皮下刺入针型电极测II导联心电图。信号用RM-86型多导生理记录仪输入动物心功能自动分析系统。待各项指标稳定后开始采样，记录给药前各项指标值。然后各组动物股静脉给予相应药物，给药方法及剂量同前，记录给药后15min，30min，60min各项指标值。

[0109] 试验结果

[0110] 1、对犬心率、血压的影响：见表7，三个剂量组对犬心率及收缩压(SAP)、舒张压(DAP)、平均动脉压(MAP)影响不大，与生理盐水组比较P＞0.05。

[0111] 表7 对犬心率、血压的影响(x±SD n＝6)

[0112]

[0113]

[0114] 2、对犬左室内压峰值、左室内压最大上升速率及左室做功指数的影响：见表8，三个剂量组具有降低犬左室内压峰值，左室内压最大上升速率之趋势。

[0115] 表8 对犬左室内压峰值、左室内压最大上升速率及左室作功指数的影响(x±SD n＝6)

[0116]

[0117]

[0118] 3、对犬心输出量，心脏指数，血管总外周阻力的影响：见表9，中、高剂量组于30min均可增加心输出量。各组有提高心脏指数，减少血管总外周阻力之趋势。

[0119] 表9 对犬心输出量、心脏指数、血管总外周阻力的影响(x±SD n＝6)[0120]

[0121] 血管总外周阻力(dyn.s.cm-5)

[0122]

[0123] 与生理盐水组比较：*P＜0.05。

[0124] 三、对犬心肌耗氧量影响试验

[0125] 试验方法

[0126] 取健康杂种犬30条，雌雄兼用，体重9.5±1.8kg，随机分为五组，动物组别同前。戊巴比妥钠(30mg/kg)静注麻醉后，气管插管行人工呼吸，右侧开胸，缝制心包摇篮，于右心耳插导管至冠状窦，血液回流至右颈外静脉，于回流管上放置3mm直径的FF型流量计探头，用MFV-1200型电磁血流量计测冠状窦血流，计算冠脉阻力。右颈总动脉插管分别取冠状窦血和动脉血用CY-2型血氧仪测血氧分压，计算每分钟每100g心肌组织耗氧量，记录给药前各项指标值，然后经股静脉给药，5min内注完，给药体积为2ml/kg，记录给药后15min，
30min，60min各项指标值。

[0127] 试验结果

[0128] 1、对犬冠脉流量、冠脉阻力及心肌耗氧量的影响：见表10，三个给药剂量组均能显著增加冠脉流量，减少冠脉阻力，有减少心肌耗氧量的趋势。

[0129] 表10 对犬冠脉流量、冠脉阻力及心肌耗氧量的影响(x±SD n＝6)

[0130]

[0131]

[0132] 与生理盐水比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

[0133] 四、对垂体后叶素致大鼠急性心肌缺血的影响

[0134] 试验方法

[0135] 60只大鼠，随机分为6组，每组10只。即生理盐水组、金钠多组、本发明高、中、低三个静脉注射组和一口服给药组。在静脉注射垂体后叶素前10分钟从舌下静脉分别注射生理盐水或受试药物，另一口服给药组灌胃给予本发明，连续7天，于末次给药1小时后静脉注射垂体后叶素0.5U/kg，注射体积为1ml/kg。于注射后5、10、15、30、60、120、300秒记录心电图，测量心电图ST段，求出注射垂体后叶素后ST段改变的总毫伏数绝对值。表示心肌损伤程度。

[0136] 试验结果

[0137] 注射垂体后叶素可使心电图ST段显著升高。与生理盐水比较，预先10分钟从舌下静脉给予本发明，在5分钟(300s)内可显著抑制心电图ST段升高，阳性对照药金钠多亦可显著抑制心电图ST段升高，预先1小时口服本发明也可显著抑制心电图ST段升高，但作用效果比静脉注射相同剂量的作用效果差。(表11)

[0138] 表11 对PP致大鼠心肌缺血心电图ST段(mV)改变的影响(x±SD，n＝10)[0139]

[0140]

[0141] 与生理盐水组比较：*p＜0.05；**p＜0.01。

[0142] 五、活血化瘀作用试验研究

[0143] 试验方法

[0144] 1、对血瘀证大鼠血液流变学的影响：大鼠，200-250g，60只，雌雄各半，随机分为6组，即生理盐水对照组、血瘀证模型组、金纳多阳性对照组和本发明低、中、高剂量组。分别静脉注射相应药液，体积为4ml/kg，连续给药3天，每天一次，第3天给药后，除生理盐水对照组外，其余各组动物皮下注射0.1％肾上腺素0.8ml/kg，共2次，两次间隔4小时，在两次注射肾上腺素之间(前后各间隔2小时)，将大鼠浸入冰水中5分钟，处置后禁食不禁水，于次晨颈动脉取血，肝素抗凝，用LBY-N7型血液流变仪测定全血粘度高切、中切、低切及血浆粘度。

[0145] 2、对家兔血小板聚集的影响：家兔，2.0-2.5kg，50只，雄性，随机分为5组，即生理盐水对照组、金纳多阳性对照组和本发明低、中、高剂量组。静脉给予相应药液，给药体积为4ml/kg，连续给药3天，每天一次，末次给药后60min，颈动脉取血，以3.8％枸橼酸钠抗凝，
1000rpm，离心5min，取上层血浆0.2ml作为富含血小板血浆(PRP)，剩余血浆以4000rpm，离心15min，制备贫血小板血浆(PPP)。由PPP调PRP，使血小板数为2×108/L，将PRP加入测定管内，置于LBY-NJ2型血小板聚集仪中，37℃保温1min，经PPP标定后，以ADP作为诱导剂测定1min、3min、5min血小板聚集率及最大聚集率(MPAR)。

[0146] 试验结果

[0147] 1、对血瘀证大鼠血液流变学的影响：见表12，3个剂量组可不同程度地降低全血比粘度及血浆比粘度，改善血液流变性的作用。

[0148] 表12 对血瘀证大鼠血液流变性的影响(n＝10，x±SD)

[0149]# ## * **

[0150] 与对照组比较 P＜0.05，P＜0.01；与模型组比较 P＜0.05，P＜0.01。

[0151] 2、对家兔血小板聚集的影响：见表13，3个剂量组可不同程度地降低血小板聚集率。

[0152] 表13 对家兔血小板聚集率(％)的影响(n＝10，x±SD)

[0153]

[0154] 与生理盐水比较*P＜0.05，**P＜0.01。

[0155] 急毒试验：

[0156] 选用KM种小鼠静脉注射或腹腔注射银杏叶粉针剂后，观察动物的急性毒性反应和死亡情况，连续观察7天。并对死亡动物进行尸检，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等脏器有无异常，统计死亡结果，用Bliss方法计算LD50及95％的可信限。结果可见动物与给药剂量呈相关性的活动减少，高剂量组动物俯卧不动。于给药后1-3分钟高剂量组即有动物死亡，死亡动物大多数发生在24小时内，24小时后较少死亡。死亡动物经解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等脏器，未见明显病理改变。对照组无动物死亡，也未显示异常反应。本粉针剂静脉注射LD50为979.5mg/kg，95％的可信限为810.4-1183.9mg/kg；腹腔注射LD50为2279.7mg/kg，95％的可信限为1869.1-2780.5mg/kg。

[0157] 长毒试验：

[0158] Beagle犬静脉注射银杏叶粉针剂，连续给药6周，安全剂量为27mg/kg。

[0159] 大鼠腹腔注射银杏叶粉针剂，连续给药6周，其安全剂量为75mg/kg。

[0160] 安全性试验

[0161] 试验一、局部(血管、肌肉)刺激性试验

[0162] 一、试验材料

[0163] 药物：银杏叶粉针剂，试验时用生理盐水配制成浓度为2mg/ml。

[0164] 动物：日本大耳白兔，体重2.0-3.0kg，雌、雄各半，由湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供。合格证号：SCXK(湘)2003-0003。

[0165] 二、试验方法

[0166] 1、血管刺激性试验：选择健康家兔12只，体重2.0-3.0kg，雌、雄各半，随机分为2组，每组6只，一组耳缘静脉注射生理盐水，另一组耳缘静脉注射受试药。给药体积均按
4ml/kg，连续给药3天，每天一次，末次注射24小时后，先肉眼观察注射部位的血管及周围组织有无充血、水肿、变性、硬结及坏死等的变化，然后每组取3只家兔，以注射部位靠近心端，剪下兔耳(含血管)1.5-3cm，用10％甲醛溶液固定，常规组织切片，进行病理组织学检查。另3只家兔于末次静脉注射给药后7天，同法肉眼观察注射部位的血管及周围组织的变化，并进行病理组织学检查。

[0167] 2、肌肉刺激性试验：取健康家兔4只，体重2.0-3.0kg，雌、雄各半，随机分为2组，每组2只，一组在其左右两腿股四头肌内以无菌操作法注入生理盐水1ml，另一组在其左右两腿股四头肌内以无菌操作法注入银杏叶粉针剂1ml。注射后48小时处死动物，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射局部刺激反应并按表14换算相应的反应级数。

[0168] 表14 注射剂对家兔肌肉注射刺激反应评分表

[0169]

[0170] 三、试验结果

[0171] 1、血管刺激性试验：肉眼观察显示兔耳静脉注射后，24小时及7天后均未见明显的静脉充血，水肿，亦未见明显的变性，硬结和坏死等现象。病理组织学检验显示给药后24小时和7天，各组均未发现静脉组织充血，血栓形成，管壁炎症坏死，内皮细胞松散脱落，炎症细胞浸润等现象。

[0172] 2、肌肉刺激性试验：股四头肌纵向切开，肉眼观察及病理组织学检验均未见明显的红肿、充血、组织变性和坏死等现象。

[0173] 四、结论

[0174] 在本实验设计剂量条件下，本银杏叶粉针剂对血管及肌肉无刺激作用。

[0175] 试验二、银杏叶粉针剂溶血性试验

[0176] 一、试验材料

[0177] 药物：银杏叶粉针剂，临用时用生理盐水配制成浓度为2mg/ml。

[0178] 动物：日本大耳白家兔，2.0-3.0kg，由湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供。合格证号：SCXK(湘)2003-0003。

[0179] 二、试验方法

[0180] 2％红细胞悬液：选择健康家兔，取新鲜血液10ml，加入干燥洁净放有玻璃珠的三角瓶中，并不停摇动以除去纤维蛋白原，然后转入刻度离心管内，再加倍量生理盐水离心，除去上清液，反复数次，直到上清液为无色澄明为止。按所得红细胞的容积，用生理盐水配制成2％的混悬液，供试验用。

[0181] 取试管7支，按表2配比量依次加入2％红细胞悬液和生理盐水，混匀后，于37℃恒温箱放置30分钟，然后分别加入不同量的药液。摇匀后，置37℃恒温箱中观察4小时，1小时内每隔15分钟观察一次。2-4小时，每隔1小时观察一次反应结果，按如下标准判断是否溶血，溶血(+)溶液澄明红色，管底无红细胞残留。不溶血(-)红细胞全部下沉，上清液无色澄明。凝血：虽不溶血，但出现红细胞凝聚，经振摇后不能分散。

[0182] 表15 银杏叶粉针剂溶血性试验结果

[0183]

[0184] 三、试验结果

[0185] 1小时内，第1-6号管红细胞逐渐下沉，第7号管溶液澄明、红色。

[0186] 2-4小时，第1-6号试管红细胞全部下沉、上层液体无色澄明，振摇后迅速分散，经镜检细胞未发生凝集或变形。第7号管溶液澄明、红色。

[0187] 四、结论

[0188] 本银杏叶粉针剂对家兔红细胞不产生溶血反应，故可以供静脉注射用。

[0189] 试验三、银杏叶粉针剂过敏性试验

[0190] 一、试验材料

[0191] 药物：银杏叶粉针剂，试验时用生理盐水配制成浓度为2mg/ml。

[0192] 阳性对照物：10％鸡蛋清，临用时新鲜配制。

[0193] 动物：白色豚鼠，体重250-350g，18只，雄性；SD大鼠，体重150-200g，雄性，由湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供。合格证号：SCXK(湘)2003-0003。

[0194] 二、试验方法

[0195] 1、全身主动性过敏试验：选择体重250-350g的豚鼠，18只，雄性，随机分为3组，每组6只。即空白对照组、阳性对照组和受试药物组。隔日腹腔注射，每次0.5ml/只，共三次，然后将每组6只动物随机均分为A、B二组，A组于首次注射后14天静脉注射受试药物1.0ml/只，观察注射药物后15分钟内有无搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难，大小便失禁，休克和死亡等反应。B组于首次注射后21天同样静脉注射受试药物，同法观察。

[0196] 2、大鼠被动皮肤过敏试验

[0197] 抗血清制备：大鼠，随机分为4组，A组用天花粉-4％氢氧化铝凝胶的混悬液(10mg/ml)，对每个大鼠足跖注射，每个足跖注射0.1ml，4个足跖共注射0.4ml。B、C组用银杏叶粉针剂(2，10mg/ml)，对每个大鼠腹腔注射，每只腹腔注射0.4ml。D组用生理盐水，对每个大鼠腹腔注射，每只腹腔注射0.4ml。隔日致敏一次，共三次，于末次致敏10天后，从股动脉插管、负压管取血，离心(3000rpm/15min，4℃)，制得抗血清，置-20℃保存备用。

[0198] 被动皮肤致敏：取大鼠体重150-200g，40只，随机分为A、B、C、D四组，用乙醚麻醉后，在大鼠背中两侧，距脊柱1.5cm处把毛剪光，每侧剪2个点，每点间隔1.5-2.0cm，A组用A抗血清皮内注射(1∶10、1∶50稀释的抗血清)，B组用B抗血清皮内注射(1∶10、1∶50稀释的抗血清)，C组用C抗血清皮内注射(1∶10、1∶50稀释的抗血清)，D组用D抗血清皮内注射(1∶10、1∶50稀释的抗血清)，每一稀释度注射0.1ml。

[0199] 抗原攻击：注射后48h后进行抗原攻击，A组静脉注射天花粉10mg/kg，天用1％伊文斯蓝溶液配成1mg/ml。B组静脉注射银杏叶粉针剂2mg/kg，用1％伊文斯蓝溶液配成0.2mg/ml。C组静脉注射银杏叶粉针剂10mg/kg，用1％伊文斯蓝溶液配成1mg/ml。D组静脉注射1％伊文斯蓝溶液，每100g体重注射伊文斯蓝溶液1ml。20min后断头处死动物，翻转背部皮肤，分别剪下1∶10、1∶50的蓝斑皮肤，剪碎，加入丙酮生理盐水(7∶3)混合液5ml，浸泡，次日离心(3000rpm，15min)，分别取上清液，590nm处测定光密度(OD)值，用X±SD表示，用t检验进行统计学处理。

[0200] 三、试验结果

[0201] 1、全身主动性过敏试验：豚鼠于首次注射供试品后第14天及第21天，再次静脉注射受试品。空白对照组及银杏叶粉针剂组均未出现搔鼻、喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难，大小便失禁，休克和死亡等的反应，过敏试验为阴性。而阳性对照组于首次注射后第14天、第21天再次静脉注射，均可出现动物抽搐、呼吸困难、休克直至死亡，过敏反性为阳性。结果见表16。

[0202] 表16 银杏叶粉针剂过敏性试验结果

[0203]

[0204]