本发明涉及一种简便快速制备含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的方法，包括菌株选择、培养及产酶，收集乳酸菌细胞，应用溶菌酶破壁菌细胞制备转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液，应用粗酶液处理乳清粉等步骤。本发明方法大大降低乳清粉中的乳糖含量的同时，生成高含量低聚半乳糖，工艺简单合理，避免了繁杂的酶蛋白纯化过程，省时省力，降低了生产成本，具有广阔的工业化应用前景。
1.一种含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的制备方法，步骤如下：
(1)将产转糖基β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株之一接种于MRS培养基进行活化，将活化菌以1～10％(v/v)的接种量接种于产酶发酵培养基中，30～45℃静止培养16～24小时；
上述MRS培养基，其组分为：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物
5g/L，柠檬酸二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·H2O0.25g/L，吐温
上述产酶发酵培养基，依据选择乳酸菌菌株而定，其组分至少含有：5～20％体积比的
10波美度麦芽汁作基础培养基，1～10g/L蛋白胨，1～10g/L牛肉膏和1～10g/L酵母粉；
(2)将步骤(1)获得的培养液以8000～10000转/分离心5～10分钟，收集乳酸菌细胞；
(3)将上述离心收集的乳酸菌细胞，以w/v＝g/mL计，按乳酸菌细胞∶缓冲液＝1∶3的比例，将乳酸菌细胞重悬于缓冲液中，制成乳酸菌细胞悬液，将10000U/mg的溶菌酶按溶菌酶∶乳酸菌细胞悬液＝0.1～10mg/mL的比例加入乳酸菌细胞悬液中，30～40℃破壁处理1～5小时，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；
(4)将步骤(3)制得的β-半乳糖苷酶粗酶液与5～40％重量体积百分比的乳清粉水溶液按照1∶10体积比混合，于30～50℃反应1～5小时，即获得含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉溶液。
2.如权利要求1所述的含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的制备方法，其特征是，步骤(1)所述的产转糖基β-半乳糖苷酶乳酸菌菌株为下列之一：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC 11842，罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillusreuteri)ATCC 55148，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC
10797，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ATCC 19987。
3.如权利要求1所述的含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的制备方法，其特征是，步骤(1)所述的产转糖基β-半乳糖苷酶乳酸菌菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC 11842。
4.如权利要求1所述的含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的制备方法，其特征是，步骤(1)所述的产酶发酵培养基组分为10％体积比的10波美度麦芽汁作基础培养基，5g/L蛋白胨，
5.如权利要求1所述的含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的制备方法，其特征是，步骤(3)所述的缓冲液是pH 6.5～7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液。
一种含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种低乳糖乳清粉的制备方法，尤其涉及一种含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的制备方法。技术背景
[0002] 乳清粉中60～80％成分为乳糖，食品行业中主要用于乳制品生产。临床耐受检测结果表明，摄取50克乳糖，有50～100％的人出现乳糖消化不良症状，即乳糖不耐症。乳糖不耐症是指由于体内缺乏乳糖酶(又称β-半乳糖苷酶)，导致乳糖不能在小肠中消化和吸收而直接被转运到大肠，在细菌的作用下引起发酵和水解，造成肠道内水和二氧化碳等气体的大量积累，并刺激肠粘膜从而导致腹涨、肠鸣、肠痉挛以及腹泻等一系列的症状。据统计，全世界大约有2/3的成年人是乳糖酶缺乏者；我国有88.9％的成年人存在不同程度的乳糖酶缺乏，55.1％的成年人有乳糖不耐受症状。
[0003] 近年来，为了降低乳清粉中乳糖含量、减少由此产生的乳糖不耐症，用微生物产生的具转糖基活性的β-半乳糖苷酶来处理乳清粉，既水解乳糖为易吸收和甜味品质好的葡萄糖和半乳糖，同时又通过转糖基作用合成低聚半乳糖(galactooligosaccharides，GOS)，获得了含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉。该方法不仅降低了乳清粉中的乳糖含量，有效解决乳糖不耐症；同时含有的低聚半乳糖增强了乳清粉的益生功能和营养价值。GOS作为双歧杆菌增殖因子，是众多功能性低聚糖中令人瞩目的一种，具有许多有益的功能，在降低梭菌数量、产生较多短链脂肪酸、产生较少气体等方面都具有突出的优点。
[0004] 目前微生物酶法生产含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的方法可以分为两类，一是采用部分纯化或纯化乳糖酶制剂添加到乳清粉溶液中进行反应，得到含GOS的混合物；二是采用固定化酶方法固定化部分纯化或纯化乳糖酶制剂生产含GOS的低乳糖乳清粉。这两种方法的主要缺点是酶的纯化过程繁琐，耗时耗力，酶蛋白得率低，成本也较高。因此寻找一种简便快速制备含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的方法十分必要。
发明内容
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种简便快速制备含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的方法。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明的技术要点是用溶菌酶破壁乳酸菌细胞获得β-半乳糖苷酶粗酶液来处理乳清粉溶液，对乳清粉溶液进行酶解和转化，降低乳清中的乳糖含量并同时生成低聚半乳糖。经文献检索，目前国际上尚没有利用溶菌酶破壁乳酸菌细胞获得β-半乳糖苷酶粗酶液处理乳清粉溶液生产含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的报道。
[0008] 术语解释
[0009] 乳酸菌，现有技术中公知的益生菌，归类为公认的安全菌属(Generally Recognized asSafe，GRAS)范畴。
[0010] 产转糖基β-半乳糖苷酶的乳酸菌，能够产转糖基β-半乳糖苷酶的任一种乳酸菌菌株。
[0011] 发明详述
[0012] 一种含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的制备方法，步骤如下：
[0013] (1)将产转糖基β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株之一接种于MRS培养基进行活化，将活化菌以1～10％(v/v)的接种量接种于产酶发酵培养液中，30～45℃静止培养16～24小时；
[0014] 上述MRS培养基，其组分为：葡萄糖10g/L，胰蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母提取物5g/L，柠檬酸二铵2g/L，磷酸氢二钾2g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4·H2O0.25g/L，吐温80为1mL/L；
[0015] 上述产酶发酵培养基，依据选择乳酸菌菌株而定，其组分至少含有：5～20％体积比的10波美度麦芽汁作基础培养基，1～10g/L蛋白胨，1～10g/L牛肉膏和1～10g/L酵母粉；
[0016] (2)将步骤(1)获得的培养液以8000～10000转/分离心5～10分钟，收集乳酸菌细胞；
[0017] (3)将上述离心收集的乳酸菌细胞(以下称菌细胞)，以w/v＝g/mL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶3的比例，将菌细胞重悬于缓冲液中，制成菌细胞悬液，将10000U/mg的溶菌酶按溶菌酶∶菌细胞悬液＝0.1～10mg/mL的比例加入菌细胞悬液中，30～40℃破壁处理1～5小时，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
[0018] (4)将步骤(3)制得的β-半乳糖苷酶粗酶液与5～40％重量体积百分比的乳清粉水溶液按照1∶10体积比混合，于30～50℃反应1～5小时，即获得含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉溶液。
[0019] 根据应用目的，直接使用该含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉溶液，或进一步将该含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉溶液制备成干粉。
[0020] 上述步骤(1)所述的乳酸菌菌株可以是能够产转糖基β-半乳糖苷酶的任一种乳酸菌菌株，本发明不做特别限定。优选的，产转糖基β-半乳糖苷酶乳酸菌菌株为下列之一：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC 11842，罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)ATCC 55148，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)ATCC10797，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)ATCC 19987。本发明最优选产转糖基β-半乳糖苷酶乳酸菌菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC 11842。
[0021] 优选的，上述步骤(1)所述的产酶发酵培养基组分为10％体积比的10波美度麦芽汁作基础培养基，5g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏和5g/L酵母粉。
[0022] 优选的，上述步骤(3)所述的缓冲液是pH 6.5～7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液。
[0023] 高效液相色谱和薄层扫描定量分析所得产品乳清粉的糖组成：
[0024] 取本发明制得的乳清粉溶液用水稀释成重量体积百分比为2％的溶液，煮沸离心后上清用0.22μm的滤膜过滤，以高效液相色谱定量分析糖组分；取制得的乳清粉溶液用水稀释成重量体积百分比为5％的溶液，煮沸离心后上清在薄层层析板上点样后，在展层剂(正丁醇∶无水乙醇∶水＝5∶3∶2)中展开，雾喷显色剂(20％硫酸溶液十0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤5分钟，糖斑点显色后，进行薄层扫描定量分析糖组分。相关分析结果将在实施例中加以说明。
[0025] 本发明提供了一种简便快速制备含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉的方法，利用溶菌酶破壁乳酸菌细胞，将获得的β-半乳糖苷酶粗酶液直接处理乳清粉溶液，生产含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉。该方法大大降低了乳清粉中的乳糖，且GOS含量高；工艺简单合理，避免了繁杂的酶蛋白纯化工艺，省时省力，大大节约了成本，具有广阔的工业化前景。
具体实施方式
[0026] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
[0027] 实施例1：
[0028] 产转糖基β-半乳糖苷酶乳酸菌菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC 11842。
[0029] 将德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)ATCC 11842接种至MRS培养基中进行活化后，按照2％(v/v)的接种量接种于产酶发酵培养液中，37℃静止培养培养18小时，培养结束后，10000转/分离心10分钟，收集乳酸菌细胞。
[0030] 上述产酶发酵培养基配方为10％的10波美度麦芽汁作基础培养基，还补充5g/L蛋白胨，3g/L牛肉膏和5g/L酵母粉。
[0031] 取1g上述制备的乳酸菌细胞，悬浮于3mL、pH 7.0的50mmol/L磷酸钾缓冲液中制成乳酸菌细胞悬液，将3mg溶菌酶(活力单位：10000U/mg、美国Amresco公司产)加入上述3mL乳酸菌细胞悬液中，37℃破壁处理1小时，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
[0032] 应用上述粗酶液制备含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉溶液：
[0033] 取1mL上述粗酶液，加入到10mL、20％重量体积百分比乳清粉水溶液中，于45℃水浴摇床振荡反应4小时。即获得含低聚半乳糖的低乳糖乳清粉溶液。
[0034] 将上述产物进行高效液相色谱和薄层扫描分析，结果表明：所得的乳清粉溶液其糖组成为低聚半乳糖41.8％，乳糖5.0％，葡萄糖32.1％和半乳糖21.1％。
[0035] 上述高效液相色谱分析所用设备及条件如下：
[0036] 岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A示差检测器；BIO-RAD AminexHPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流动相为三蒸水，流速为0.4mL/min，柱温70℃；结果分析软件为Class-VP6.0。乳清粉溶液用水稀释成重量体积百分比为2％的溶液，煮沸离心后上清用0.22μm的滤膜过滤后，进样分析。
[0037] 上述薄层扫描分析所用设备及条件如下：
[0038] 取制得的乳清粉溶液用水稀释成重量体积百分比为5％的溶液，煮沸离心后上清0.5uL在薄层层析板(Silica gel60，Merck)上点样后，在展层剂(正丁醇∶无水乙醇∶水＝5∶3∶2)中展开，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤5分钟，糖斑点显色后，将薄板扫描后通过软件ImageJ v1.28(http://rsb.info.nih.gov/ij/)进行定量分析。
[0039] 实施例2：
[0040] 如实施例1所述，所不同的是所用的产转糖基β-半乳糖苷酶乳酸菌菌株为罗伊
