茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法

摘要

一种茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法，采用HPLC-UV色谱法，同时对指纹图谱检测波长、色谱柱、流动相、柱流速、柱温、色谱条件时间、空白流动相、空白溶剂、供试品制备方法进行考察，选用各共有峰的相对保留时间、相对百分面积、相对百分高度、光谱相似系数、为表征参数，其特征在于：用210nm为茯苓药材脂溶性成分指纹图谱的检测波长。茯苓药材不同药用部位存在差异，茯苓药材脂溶性成分在210nm波长处的信息量最大，选用210nm为检测波长，使本方法简便、稳定、精密度高及重现性好。

权利要求

1.一种茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法，采用HPLC-UV色谱法，同时对指纹图谱检测波长、色谱柱、流动相、柱流速、柱温、色谱条件时间、空白流动相、空白溶剂、供试品制备方法进行考察，选用各共有峰的相对保留时间、相对百分面积、相对百分高度、光谱相似系数为表征参数，用210nm为茯苓药材脂溶性成分指纹图谱的检测波长；其特征在于：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters Symmetry 110A C18 250mm×4.6mm，5μm色谱柱；以乙腈为流动相A；以0.1％磷酸为流动相B；按照洗脱条件中的梯度进行洗脱；流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论塔板数按3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21酸(dehydrotrametenolic acid)峰计算，不低于3000；

洗脱条件如下：

时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)

0～70 45→95 55→5

70～85 95 5。

2.如权利要求1所述的茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法，其特征在于：根据液相色谱仪-质谱仪联用的LC-MS的方法指认出茯苓保留时间在54.13分钟的共有峰24号峰：

3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21-酸为对照品，对各产地的茯苓进行指纹图谱检测及各地茯苓相似度按照药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版》软件，评价不同产地样品之间的相似度值。

3.如权利要求1所述的茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法，其特征在于：确定28个色谱峰，利用LC-MS技术进行茯苓药材脂溶性成分指纹图谱检测。

说明书

茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法

技术领域

[0001] 中药材指纹图谱质控技术。

背景技术

[0002] 茯苓为野生、栽培兼有品种，主产于湖北、湖南、安徽、贵州、云南、河南、四川、广西、广东等省，由于产地不同，其品质存在着明显的差别。湖北罗田为茯苓道地产地之一，传统认为品质优良。《中国药典》2005版一部茯苓项下，对茯苓药材的质量控制只有性状、鉴别及检查等项，难以有效地控制茯苓药材的质量。

[0003] 茯苓脂溶性成分指纹图谱研究原理是，中药化学指纹图谱(简称指纹图谱)系指采用一定的分析手段得到的能够标示该中药材或中成药中主要化学成分的色谱或光谱图谱，作为中药质量控制的方法。

[0004] 目前国内有很多研究人员对茯苓指纹图谱进行了深入的研究，为中药指纹图谱技术的研究与应用奠定了坚实的基础。例如，由重庆大学生物力学与组织工程教育部重点实验室的易中宏、王龙联合重庆中药研究院郑一敏、胥秀英等多名专家教授采用HPLC色谱法，选用各共有峰的相对保留时间、相对百分面积、相对百分高度、光谱相似系数、三点纯度系数为表征参数，对茯苓药材指纹图谱模糊模式识别进行研究，并且建立了茯苓药材指纹图谱模式标准。结果表明其模式标准与样品有很好的相似性，能保持与形态学鉴定结果一致，且能从定性、定量角度对茯苓药材指纹图谱进行分析。同时国内也有不少研究人员对茯苓的三萜类化学成分指纹图谱的建立工作进行了研究，例如郑州大学的杨冉、李建军、屈凌波和中国药科大学分析中心的相秉仁、安登魁等多名专家对茯苓萜类的HPLC色谱的指纹图谱进行了研究。江苏康缘药业股份有限公司药物研究所的王振中、辛晨峰等人联合中国药科大学分析测试中心的丁岗、盛龙生等多位专家教授用HPLC-MS联用技术对其中的九个化学成分色谱峰进行了指认，更加明确的为茯苓药材及茯苓的各类产品提供了有效的质量控制手段。

[0005] 北京军事医学科学院毒物药物研究所的于能江、郭继芬、赵毅民、张永祥等多位教授采用HPLC/DAD/ESI-MS(高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱法)经过在线检测，选用各共有峰的相对保留时间、相对百分面积、相对百分高度、光谱相似系数分析其紫外图谱和质谱图谱，并与文献进行比较，鉴定出了15个茯苓三萜化学成分，同时也推测了其余的8个三萜化学成分，为茯苓三萜类化学成分的研究取得了重大突破。

[0006] 其原理：采用HPLC/DAD/ESI-MS(高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱法)经过在线检测，选用各共有峰的相对保留时间、相对百分面积、相对百分高度、光谱相似系数为表征参数，分析其紫外图谱和质谱图谱建立的指纹图谱。

[0007] 其步骤：

[0008] 选用HYPERSIL C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水((50∶50)(0~48min)→(60∶35)(48~68min)→(75∶25)(68~95min))(0.1％的磷酸)；进行高效液相分离，二极阵列管(DAD)和电喷雾质谱(ESI-MS)两种检测方法在线检测，流速为1.0ml/min，检测波长为242nm，柱温为25℃.

[0009] 现有的方法存在着下列缺点：

[0010] 1、在试验中发现，茯苓药材不同药用部位存在差异，如茯苓块及茯苓皮中很多三萜酸类成分在242nm处的紫外吸收很弱，只有在末端才有较强的吸收.

[0011] 2.该方法并未使用对照品对脂溶性指纹特征峰的质量进行评价，所以在检测中读取信息过多，使检测时间长，过程复杂。

[0012] 3.该方法只能够指认的特征峰数为23个，还不能更为明确地查明茯苓脂溶性中的成分，不利于高精度的评价茯苓质量。

发明内容

[0013] 本发明的目的是提供一种茯苓脂溶性成分指纹图谱检测方法，它具有简便、稳定、精密度高及重现性好的优点。

[0014] 本发明的技术方案是：一种茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法，采用HPLC-UV色谱法，同时对指纹图谱检测波长、色谱柱、流动相、柱流速、柱温、色谱条件时间、空白流动相、空白溶剂、供试品制备方法进行考察，选用各共有峰的相对保留时间、相对百分面积、相对百分高度、光谱相似系数、为表征参数，

[0015] 其特征在于：用210nm为茯苓药材脂溶性成分指纹图谱的检测波长。茯苓药材不同药用部位存在差异，茯苓药材脂溶性成分在210nm波长处的信息量最大，选用210nm为检测波长，使本方法简便、稳定、精密度高及重现性好。

[0016] 如上所述的茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法，其特征在于：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Waters Symmetry 110A C18(250nm×4.6mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A；以0.1％磷酸为流动相B；按照洗脱条件中的梯度进行洗脱；流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论塔板数按3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21酸(dehydrotrametenolic acid)峰计算，应不低于3000；

[0017] 洗脱条件如下：

[0018] 时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)

[0019] 0~70 45→95 55→5

[0020] 70~85 95 5。

[0021] 以乙腈为流动相A；以0.1％磷酸为流动相B，和柱温为30℃，可以得到更多的信息量；选用Waters Symmetry 110A C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，发现柱效较高，色谱峰分离效果最佳。

[0022] 如上所述的茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法，其特征在于：根据液相色谱仪-质谱仪联用的LC-MS的方法指认出茯苓保留时间在54.13分钟的共有峰24号峰：3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21-酸为对照品，对各产地的茯苓进行指纹图谱检测及各地茯苓相似度按照药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版》软件，评价不同产地样品之间的相似度值。

[0023] 如上所述的茯苓脂溶性成分的指纹图谱检测方法，其特征在于：确定28个色谱峰，利用LC-MS技术进行茯苓药材脂溶性成分指纹图谱检测，使建立的指纹图谱成分多，更加明确，方法更加科学、可靠，28个色谱峰是：

[0024]

[0025]

[0026]

[0027] 有益的效果

[0028] 本发明利用HPLC-UV方法(高效液相色谱仪-紫外检测器)建立了茯苓药材脂溶性成分的指纹图谱检测方法，并进行了系统适用性、供试品制备方法、方法学验证等项目考察，结果表明与现有的方法相比，本方法简便、准确、重现性好，并利用LC-MS(液相色谱仪-质谱仪联用)技术对茯苓药材脂溶性成分指纹图谱中部分色谱峰进行了鉴定，使建立的指纹图谱更加科学、可靠。

附图说明

[0029] 图1，采用本发明的茯苓药材脂溶性成分指纹图谱共有模式。

[0030] 图2，210nm时茯苓药材脂溶性成分指纹图谱的三维图。

[0031] 图3，茯苓药材脂溶性成分在不同波长条件下的指纹图谱。

[0032] 图4，全国各地17份茯苓药材脂溶性成分指纹图谱。

[0033] 图5，全国各地茯苓脂溶性指纹图谱的对比。

[0034] 图6，茯苓个药材与茯苓皮药材代表性指纹图谱对比图及放大图。图中，L-茯苓皮；M-茯苓个。具体的实施方式

[0035] 茯苓药材脂溶性成分指纹图谱检测标准草案

[0036] 照《中国药典》2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定。

[0037] 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，WatersSymmetry110A C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；以乙腈为流动相A；以0.1％磷酸为流动相B；按照表1中的梯度进行洗脱；流速为1.0ml/min，检测波长为210nm，柱温为30℃，理论塔板数按
3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21酸(dehydrotrametenolic acid)峰计算，应不低于3000。

[0038] 茯苓药材脂溶性成分指纹图谱检测梯度洗脱条件(表1)

[0039]

[0040] 对照品溶液的制备取3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21酸对照品适量，精密称定，用乙腈制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得。

[0041] 供试品溶液的制备取茯苓药材粉末(过4号筛)约1.5g，精密称定，置50ml具塞三角瓶中，精密加入25ml甲醇，密塞，摇匀，冷浸1.0hr，振摇后，用0.2μm微孔滤膜滤过，即得。

[0042] 测定法分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，记录85分钟的色谱图，即得。

[0043] 供试品指纹图谱与对照指纹图谱比较，在相应的保留时间应出现相同的色谱峰，采用指纹图谱相似度软件评价，其相似度应不低于0.8。

[0044] 指纹图谱描述：指纹图谱应检出至少28个明显的色谱峰，其中24号峰为3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21酸峰，茯苓药材脂溶性成分指纹图谱共有模式见图1。

[0045] 湖北罗田茯苓特征指纹图谱的表征：指纹图谱呈现明显的4组峰，其中5min～20min的色谱峰，即色谱峰1～7号较低；20min～28.5min有11个明显的色谱峰，即8～
15号色谱峰，一般15#＞＞11#(13#)＞12#＞9#(17#)峰；28.5min～48min有5个明显的色谱峰，即16～23号色谱峰，23#＞＞21#＞22#＞19#(20#)峰；50min～62min有5个明显的色谱峰，即24～28号色谱峰，其中24、26、27、28号色谱峰呈依次降低的趋势。在整个指纹图谱中，色谱峰15、23和24为三个较高峰，一般高度为依次较低(见图1)。

[0046] 本发明与现有技术相比的区别点和优点

[0047] 创新点(1)确定210nm为茯苓药材脂溶性成分指纹图谱的检测波长，本方法简便、稳定、精密度高及重现性好。

[0048] 我们选用大多数文献报道的242nm作为检测波长，做了脂溶性成分指纹图谱研究的大部分考察项目，在试验中发现，茯苓药材不同药用部位存在差异，如茯苓块及茯苓皮中很多三萜酸类成分在242nm处的紫外吸收很弱，只有在末端才有较强的吸收，根据收集的三维图谱(见图2)，并同时收集210nm、215nm、220nm、230nm、242nm波长处的图谱(见图3)，综合考察，茯苓药材脂溶性成分在210nm波长处的信息量最大，因此最后确定210nm为茯苓药材脂溶性成分指纹图谱的检测波长。

[0049] 创新点(2)我们根据LC-MS的方法指认出茯苓保留时间在54.13分钟的共有峰24号峰：3β-羟基-羊毛甾-7，9(11)，24-三烯-21-酸为对照品，对全国各产地的茯苓进行指纹图谱检测及全国各地茯苓相似度按照药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统，2004A版》软件，评价不同产地样品之间的相似度值除贵州产样品以外，其余三个产地的样品差别不大，从结果上看，湖北产的药材质量稳定，有效成分含量高，质量最佳；湖南产两批药材，色谱峰分布趋势及面积峰值与湖北产药材相近，说明药材产地距离临近药材质量差别不大，贵州产药材图谱中除有一个区别于其它产地药材的特征性成分外，其余成分与湖北、湖南两产地的药材基本一致，云南产药材指纹图谱色谱峰分布与湖北、湖南相当，但部分色谱峰含量明显偏低。

[0050] 创新点(3)本发明研究的指纹图谱峰信息量较现有技术多，并利用LC-MS技术对茯苓药材脂溶性成分指纹图谱中28个色谱峰进行了鉴定，使建立的指纹图谱成分更加明确，方法更加科学、可靠。(见表2)

[0051] HPLC谱图中28个色谱峰的数据信息(表2)

[0052]

[0053]

[0054]

[0055] 注：在表2的峰编号栏中，1)“a”表示依据文献的保留时间推测所得结构；2)“b”表示根据分子量及三萜类化合物质谱裂解规律推测的结构。

[0056] 17批样品的具体实施过程如下

[0057] 一、茯苓药材样品的收集

[0058] 本品主产于湖北、安徽、河南、云南、贵州、四川等省，我们共收集了17批样品。

[0059] 二、全国各地17份茯苓药材脂溶性成分指纹图谱见图4。

[0060] 三、全国各地茯苓脂溶性指纹图谱的对比见图5。

[0061] 四、全国各地茯苓脂溶性指纹图谱部分共有峰相似度匹配数据：17批茯苓(个)脂溶性指纹图谱部分共有峰相似度匹配数据见表3；17批茯苓(皮)脂溶性指纹图谱部分共有峰相似度匹配数据见表4。

[0062]

[0063]

[0064] 创新点(4)：对湖北罗田2号药材产自湖北罗田胜利镇黄家铺三组新垸右山，其茯苓个与茯苓皮部分的脂溶性成分指纹图谱与相应部分的对照指纹图谱相似度均较高，选取此两张图谱作为代表性图谱进行茯苓皮与茯苓个药材部分指纹图谱特征分析，见图6；为便于辩认和分析比较，将整个色谱图分为I、II、III、IV四个区，图中标号的28个色谱峰为17份茯苓个药材脂溶性成分指纹图谱的共有色谱峰。

[0065] 图6中的下图是上图的放大图。

[0066] 对图6的分析结果详细叙述如下：皮中共有成分高于个的含量；同时皮中具有特征性成分是个中不具有的。

[0067] ①I区共有7个共有峰(请在图中标出)，由放大的对比图谱可看出，茯苓皮与茯苓个中均有这七个色谱峰，1#峰在皮与个药材中峰高度相当，可判断在整个菌核中均有分布，而其它6个色谱峰(2#～7#)在皮中的峰值明显高于茯苓个，因此可判断这六个成分主要来源于皮部分。

[0068] ②II区共有11个共有峰，其中明显的色谱峰有峰9，11，12，13，15，17号峰。可以看出峰11#、15#和17#在皮中的含量远远高于菌核，说明这三个成分主要在皮中含有，而其它三个成分在皮中的含量也高于菌核。

[0069] ③III区有五个共有峰，各色谱峰在皮及整个茯苓菌核色谱图中的峰高趋势基本相同，只是皮中的含量高于菌核，但23#峰在菌核中与其它峰相比，含量相对较高，与皮中较接近，说明该成分在菌核中含量相对较高。另外，在皮的指纹图谱中23#峰后有一明显的色谱峰(峰A，非共有峰)，而在菌核中含量很低，该成分可作为茯苓皮区别于菌核的特征性成分。

[0070] ④IV区有五个明显的共有峰，由这五个色谱峰在两个药用部位中的分布趋势相似，表明这五个成分存在于整个茯苓菌核中，但皮中的含量明显高于菌核。在皮部分药材图谱中24号峰前有一组具肩峰的明显的色谱峰(峰B，非共有峰)，而在菌核中几乎未检出，说明这二个成分为茯苓皮的特征性成分。另外，菌核中28号峰后面出现的色谱峰峰值均较低，故认为这些成分主要来源于茯苓皮部分。