分选蛋白SNX10抑制肿瘤细胞生长的用途

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及人分选蛋白基因、含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主，以及利用转化体生产的该基因的表达产物及其应用。通过直接观察SNX10对肿瘤细胞生长的影响作用，并结合SNX10对内涵体的调节机制，探索其抑制肿瘤细胞生长的机理，并最终为以SNX10为靶点设计、开发抗肿瘤药物奠定基础。本发明在从机制上阐明分选蛋白SNX10对内涵体的调节机制的同时，证实了SNX10抑制肿瘤细胞生长的作用，提供了该分选蛋白SNX10基因作为肿瘤治疗新手段或新药物的应用方式。

权利要求

1.如SEQ ID NO：2所示的分选蛋白SNX10在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的应用。

2.如SEQ ID NO：2所示的分选蛋白SNX10在制备抑制乳腺癌细胞生长的药物中的应用。

说明书

分选蛋白SNX10抑制肿瘤细胞生长的用途

[技术领域]

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及人分选蛋白基因、含有该基因的重组载体、用该载体转化的宿主，以及利用转化体生产的该基因的表达产物及其应用。[背景技术]

[0002] 分选蛋白(SNX)是一类与膜受体转运及胞内蛋白分选相关的蛋白，主要负责细胞内蛋白质的转运与分选，参与细胞膜蛋白内吞和蛋白运输等重要过程。研究表明，SNXs能和多种重要的细胞膜受体及酶相互作用，从而影响细胞的正常功能。SNXs家族蛋白在结构上都含有一个保守的PX结构域，包含100-130个氨基酸，可以与磷脂酰肌醇磷酸、磷脂酰肌醇-3-磷酸结合，使得SNX蛋白定位于细胞内吞途径的膜上。SNX家族的基因存在于酵母和多种哺乳动物细胞中，其中在人和小鼠中已经查明共有30多个不同的SNXs。有研究表明，SNXs家族蛋白可参与表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源生长因子、胰岛素及瘦素受体(Leptin Receptor)等蛋白的内吞、转运过程，因此预计可以影响癌症、血液系统疾病、肥胖(医源性或遗传性)的发生、发展和治疗。目前，大部分SNXs蛋白功能还不清楚，大部分是未知功能的基因，这些蛋白的结构和生理功能的研究还有待于进一步的开展。 申请人对SNX10在结构和功能方面进行了全面而系统的研究(序列结构见序列表)。发现：SNX10的表达主要集中在血液系(全血)、神经系统(包括：脑部、脊髓、神经元等)、免疫细胞(B细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞、骨髓细胞等)、胰岛及直肠腺癌中表达量较高(图1)；同时，SNX10在调节细胞内涵体动态平衡方面起着重要的作用。截至到2005年底，与SNXs家族蛋白相关的文献报道只有23篇，在中国未见SNXs相关研究报道及专利申请，SNXs家族蛋白在抑制肿瘤生长方面的报道在国际上也是空白。因此对SNXs家族蛋白的研究是一个全新的研究领域，具有科学的创新性。[发明内容]

[0003] 本发明通过直接观察SNX10对肿瘤细胞生长的影响作用，并结合SNX10对内涵体的调节机制，探索其抑制肿瘤细胞生长的机理，并最终为以SNX10为靶点设计、开发抗肿瘤药物奠定基础。

[0004] 本发明的技术方案包括：人SNX10基因克隆、载体构建；慢病毒的制备；慢病毒感染肿瘤细胞及其鉴定；建立稳定表达SNX10的肿瘤细胞株；细胞生长实验；动物实验；细胞对中性红染料的吞噬实验等。

[0005] 1、研究SNX10对内涵体的调节机制：

[0006] 利用多种蛋白相互作用研究手段，寻找与SNX10相互作用或密切相关的关键蛋白，研究它们怎样参与调节内涵体的调节，从而阐明SNX10调节内涵体的机制。

[0007] 2.研究SNX10抑制肿瘤细胞生长的机制：

[0008] 利用现有的SNX10稳定转染细胞系，深入研究其细胞周期，细胞分裂，细胞迁移，细胞贴壁特性，以及利用从裸鼠身上取出的肿瘤快进行的组织培养细胞以上各方面特性的研究，力图阐明SNX10在那些过程中抑制了肿瘤细胞的生长。

[0009] 3、以SNX10为靶点，开发肿瘤治疗的基因疗法和药物开发：

[0010] 肿瘤治疗中存在的最大问题是耐药性。研究表明SNX10蛋白具有抑制肿瘤细胞生长和增加肿瘤细胞吞噬能力的功能。SNX10可以做为抑制肿瘤细胞生长基因和肿瘤细胞药物增敏基因。因此，将以SNX10来开发基因治疗的方法，用于多种实体肿瘤的治疗。采用将SNX10基因构建在腺病毒(Adenovirus)载体系统中(包括AV，AVV等)。通过该载体系统将SNX10导入耐药的肿瘤组织中，可以提高该肿瘤部位的化疗效果。SNX10基因治疗的制备方法，可按照基因药物领域的方法进行制备。SNX10将通过直接注射的方法给药。SNX10通过腺病毒载体导入靶向癌细胞来减低肿瘤的生长，提高对化合物的敏感性，达到治疗效果。

[0011] 本发明在从机制上阐明分选蛋白SNX10对内涵体的调节机制的同时，证实了SNX10抑制肿瘤细胞生长的作用，提供了该分选蛋白SNX10基因作为肿瘤治疗新手段或新药物的应用方式。[附图说明]

[0012] 图1：SNX10在人体器官中的表达谱。

[0013] 图2：SNX10转染不同的细胞系，发现可以在细胞质中引起大的空泡。

[0014] 图3：SNX10成的泡状细胞器属于内涵体类细胞器。

[0015] 图4：

[0016] 图4A：利用Western Blot鉴定挑取的单克隆细胞的蛋白表达。

[0017] 图4B：细胞有大的泡状结构。

[0018] 图4C：SNX10可以显著降低MCF7的生长。

[0019] 图4D：肿瘤生长曲线。

[0020] 图4E、图4F：对肿瘤块进行称重统计。

[0021] 图5：

[0022] 图5A：稳定表达SNX10的MCF7细胞对中性红染料的吞噬作用增加。

[0023] 图5B：OD550实验检测细胞裂解液中的中性红浓度。[具体实施方式]

[0024] 一、人SNX10基因克隆、载体构建：

[0025] (1)基因克隆：根据人SNX10编码序列(NM_013322.2)，设计引物(上游引物：ACCatgtttccggaacaacagaaagaggaatttgt，下游引物：ggattcctgcggagctgtatttactttacat)，以人外周血细胞cDNA为模板用TaKaRa的PyrobestDAN合成酶扩增基因，将纯化后的PCR产物连接到真核表达载体pCR3.1-uni中，通过酶切，测序鉴定为人SNX10序列。

[0026] (2)转染与表型：将该基因转染不同的细胞系，发现可以在细胞质中引起大的空泡结构(图2)，进一步利用共转染，可发现SNX10成的泡状细胞器属于内涵体类细胞器(图3)，从而发现了一个可以导致内涵体增大的基因SNX10。

[0027] (3)重组慢病毒载体的构建与病毒制备：

[0028] 为了研究高表达SNX10对于细胞的影响，可构建重组慢病毒载体：首先将用于siRNA的慢病毒载体pLentiLox3.7改造成高表达载体(改造方法为如下：用Notl和Apal酶切(从NEB公司购买)，去掉pLentiLox3.7载体中的U6启动子，并用T4DNA聚合酶(从NEB公司购买)将粘性末端补平，并用T4DNA连接酶(从NEB公司购买)连接。同时，合成24个碱基的DNA小片断NotI-XhoI(由Takara公司合成)，用EcoR1酶切后加入，将该载体命名为pLXN。同时，将BfrB1位点单切，连接细胞筛选抗生素Blasticidin的读码框，该读码框来自Invitrogen的pCDNA6T/R的EM-7-Blasticidin-SV40Pa一段，将该载体命名为pLXNB)。使用感受态菌株HB101(从Takara购买)，分别筛选重组成功的克隆，扩大培养，利用碱裂解法提取病毒的包装载体pLP1，pLP2，pLP/VSVG和重新改造的慢病毒载体pLXNB-SNX10的质粒，定量。

[0029] 二、使用磷酸钙共沉淀法在293T细胞中制备慢病毒：

[0030] 本发明利用293T细胞作为慢病毒包装细胞，293T细胞生长于含10％胎牛血清(Hyclone)、100mg/L的双抗(青霉素+链霉素)，高糖DMEM(Hyclone公司)培养基中，每6cm6
细胞培养盘中，加入3.5ml的培养基。接种约1.5×10 个细胞，在37℃、含有5％CO2的湿润培养箱中培养。第二天，即可采用标准的磷酸钙共沉淀法转染制备慢病毒。每6cm盘中，共需加入慢病毒包装质粒(pLP1，pLP2，pLP/VSVG)和病毒质粒(pLXNB)共12ug， 比例为
3∶1.5∶1.8∶6。转染24小时后即可看到GFP蛋白的绿色荧光，转染后36小时后可收集慢病毒。收集293T细胞上清液，以2000转/分钟离心10分钟，收上清，弃去沉淀。病毒的富集和纯化使用超速离心机(Beckman Coulter)在130,000G，离心1.5小时，弃去上清，用PBS溶液将沉淀重悬过夜。病毒滴度检测采用慢病毒感染293T细胞或3T3细胞后，使用
8
流式细胞仪，通过细胞中GFP蛋白的表达来检测。通过此法得到的慢病毒滴度约为10 左右。采用本方法制备包装有慢病毒空载体(pLXNB)和包含目的基因SNX10的慢病毒。

[0031] 三、肿瘤细胞培养、慢病毒感染肿瘤细胞及其鉴定：

[0032] MCF—7细胞为乳腺癌细胞系，采用的培养基成分为：RPMI 1640培养基(Hyclone)培养液，同时添加10％的胎牛血清(Hyclone)、100ug/ml的双抗(青霉素/链霉素)；在37℃，含有5％CO2的湿润培养箱中培养，待用。将已富集和纯化的慢病毒感染MCF7细胞，
6
其中细胞的密度为20-30％，使用病毒的量为10/24孔。

[0033] 四、建立稳定表达SNX10的肿瘤细胞株：

[0034] 在感染后36小时，将以上细胞以1/100的密度接种到10cm培养盘中，待细胞贴壁后，用10ug/ml剂量的Blasticidin筛选10天，在细胞培养盘中可找到肉眼可见单克隆，挑单克隆，分盘培养，继续用2ug/ml的Blasticidin维持。利用Western Blot鉴定挑取的单克隆细胞的蛋白表达(图4A)；细胞有大的泡状结构(图4B)，将表达呈阳性的克隆继续传代，冻存备用。

[0035] 五、细胞生长实验：

[0036] 为了研究SNX10对细胞生长的影响，在2块24孔板中分别接种2×104个细胞培养7天，每天对3个孔的细胞进行计数，绘制细胞生长曲线，可发现，与空载体细胞MCF7-pLXNB相比，SNX10可以显著降低MCF7的生长(图4C)。

[0037] 六、动物实验：

[0038] 裸鼠成瘤实验：取对数生长期细胞制备成细胞悬液接种雌性裸鼠，接种量2×106个细胞/注射点，观察成瘤率、肿瘤潜伏期及肿瘤生长曲线(图4D)。当瘤体直径达1cm以上时，照相后处死，对肿瘤块进行称重统计(图4E、图4F)，同时取出肿瘤块作病理组织学检查，部分裸鼠对全身重要脏器进行病理学检查，注意有无局部淋巴结及全身转移。结果发现，SNX10可以显著抑制肿瘤的生长。

[0039] 七、细胞对中性红染料的吞噬实验：

[0040] 在稳定表达SNX10蛋白的MCF7乳腺癌细胞培养皿中，加入中性红染料，共同培养后发现，MCF7—SNX10细胞对中性红染料的吞噬作用大大增加(图5A、图5B)。这提示SNX10蛋白可以提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的吞噬能力，进而可以影响肿瘤细胞对于抗肿瘤药物的敏感性。

[0041] 分选蛋白SNX10抑制肿瘤细胞生长的用途

[0042] <110>中国科学院广州生物医药与健康研究院

[0043] <120>分选蛋白SNX10抑制肿瘤细胞生长的用途

[0044] <160>2

[0045] <170>PatentIn Version 2.1

[0046] <210>1

[0047] <211>609

[0048] <212>DNA

[0049] <213>人(Homo sapiens)

[0050] <220>

[0051] <221>CDS

[0052] <222>(4)…(609)

[0053] <223>n＝a或g或c或t

[0054] <220>

[0055] <221>prim_bind

[0056] <222>(1)...(35)

[0057] <223>n＝a或g或c或t

[0058] <220>

[0059] <221>prim_bind

[0060] <222>(576)...(606)

[0061] <223>n＝a或g或c或t

[0062] <400>1

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[0075] <212>PRT

[0076] <213>人(Homo sapiens)

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[0104] 200