一种萤火虫荧光素酶基因与应用转让专利
申请号 : CN200710119282.7
文献号 : CN101126096B
文献日 : 2010-10-06
发明人 : 王磊 , 李成伟 , 高飞
申请人 : 王磊 , 李成伟 , 高飞
摘要 :
本发明公开了一种萤火虫荧光素酶基因与应用。该萤火虫荧光素酶基因是如序列表中序列1所示的DNA分子。可利用该萤火虫荧光素酶基因构建重组表达载体，然后将重组表达载体导入宿主细胞，表达得到萤火虫荧光素酶。与目前现有的萤火虫荧光素酶生产方法相比，本发明的方法具有产品易于纯化、得率高、酶的纯度高、酶活保持好的特点，是一种高效的生产萤火虫荧光素酶的方法，适于工业生产中应用。
权利要求 :
1.一种萤火虫荧光素酶基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。
2.含有权利要求1所述基因的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pQE30的BamHI和SacI位点间插入序列表中序列1的自5’末端第1-1671位脱氧核糖核苷酸得到的pQE-mutLuc。
3.一种制备萤火虫荧光素酶的方法，是将权利要求2所述的重组表达载体转入宿主细胞，得到含有该重组表达载体的重组细胞，培养该重组细胞，表达得到萤火虫荧光素酶；所述宿主细胞为大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述方法中用IPTG诱导萤火虫荧光素酶基因表达，其中，诱导时间为2-3小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括纯化所得到的萤火虫荧光素酶的步骤。
说明书 :
技术领域
本发明涉及一种新的萤火虫荧光素酶基因，特别涉及该基因在生产萤火虫荧光素酶中的应用。
背景技术
萤火虫荧光素酶是一种能将化学能转化为光能的高效生物催化剂，它在ATP、Mg2+和O2存在的条件下，以荧光素为作用底物，进行氧化反应，化学反应如下：荧光素+ATP+O2＝氧化荧光素+AMP+PPi+CO2+光。该反应的量子产率约为0.88。在有过量底物和过量酶存在的情况下，发射光强度与反应系统中的ATP成正比，因此这种发光特性使得萤火虫荧光素酶能够在各种各样的测定ATP的研究和生产中广泛应用。
Jeffrey等1985年曾构建了含虫光素酶基因的重组载体pkw101。Matuda等也构建了含虫光素酶基因的重组体。并进而获得了能产生虫光素酶的重组大肠杆菌菌株。但是，利用Jeffrey构建的重组载体pkw101生产萤火虫荧光素酶，在细菌的培养过程中，要经过45℃热诱导30分钟的处理，再转到37℃培养才能产酶，影响酶的稳定性；利用Matuda构建的重组体生产萤火虫荧光素酶，存在提取虫荧光素酶的方法繁琐、工艺复杂的缺点。1989年日本专利(PCT/JP89/00811)的申请者曾从海洋甲壳类动物中获得荧光素酶基因，并构建了重组体DNA，但在大肠杆菌培养过程中仍存在同样的问题，1993年金振华等构建了具有分泌信号肽的虫荧光素酶重组DNA，可以分泌到周质空间，但当菌体破碎后，虫荧光素酶的纯化同样存在着分离困难，纯度低、得率低，酶活损失严重等问题(专利号：93117156)。
Jeffrey等1985年曾构建了含虫光素酶基因的重组载体pkw101。Matuda等也构建了含虫光素酶基因的重组体。并进而获得了能产生虫光素酶的重组大肠杆菌菌株。但是，利用Jeffrey构建的重组载体pkw101生产萤火虫荧光素酶，在细菌的培养过程中，要经过45℃热诱导30分钟的处理，再转到37℃培养才能产酶，影响酶的稳定性；利用Matuda构建的重组体生产萤火虫荧光素酶，存在提取虫荧光素酶的方法繁琐、工艺复杂的缺点。1989年日本专利(PCT/JP89/00811)的申请者曾从海洋甲壳类动物中获得荧光素酶基因，并构建了重组体DNA，但在大肠杆菌培养过程中仍存在同样的问题，1993年金振华等构建了具有分泌信号肽的虫荧光素酶重组DNA，可以分泌到周质空间，但当菌体破碎后，虫荧光素酶的纯化同样存在着分离困难，纯度低、得率低，酶活损失严重等问题(专利号：93117156)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新的突变萤火虫荧光素酶基因。
本发明所提供的突变萤火虫荧光素酶基因(mutLuc)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
序列表中的序列1由1671个脱氧核糖核苷酸组成，其编码序列是自序列1的5’末端的第1-1671位核苷酸，编码序列表中序列2的萤火虫荧光素酶。
含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为在pQE-30(Qiagen公司)的BamHI和SacI位点间插入序列表中序列1的自5’末端第1-1671位脱氧核糖核苷酸得到的pQE-mutLuc。
在pQE-mutLuc中，由于萤火虫荧光素酶基因处于高效启动子PT5及乳糖操纵子LacO的控制之下，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在时，本发明的萤火虫荧光素酶基因能被高效诱导转录，并且转录得到的mRNA含有核糖体结合位点RBS；同时本发明对Luc基因密码子进行了优化，使得萤火虫荧光素酶转录本得到高效翻译，显著提高萤火虫荧光素酶的产量。
本发明的另一个目的是提供一种生产萤火虫荧光素酶的方法。
本发明所提供的生产萤火虫荧光素酶的方法，是将上述任一种重组表达载体导入宿主细胞，得到含有该重组表达载体的重组细胞，培养该重组细胞，表达得到萤火虫荧光素酶。
所述宿主细胞具体可为大肠杆菌，因大肠杆菌是基因工程中应用最广泛的无毒肠道杆菌，革兰氏阴性，可在LB固体或液体培养基中37℃培养，生长迅速。本发明中所使用的大肠杆菌BL21(DE3)(天根生物技术公司)。
培养含有重组表达载体pQE-mutLuc的大肠杆菌的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。含有重组表达载体pQE-mutLuc的大肠杆菌，能在含有蛋白胨、酵母粉的培基中迅速生长，菌体产量高，易于培养。
本发明利用大肠杆菌的偏爱密码子，优化了萤火虫荧光素酶基因，并利用该优化基因构建了重组表达载体pQE-mutLuc，将pQE-mutLuc导入大肠杆菌得到工程菌，利用该工程菌生产萤火虫荧光素酶的方法，与目前现有的萤火虫荧光素酶生产方法相比，本方法具有产品易纯化，得率高(每升发酵菌液中的酶蛋白大于2mg)，酶的纯度高(酶的比活力≥2.2×1010RLU/mg蛋白)，纯化速度快，可在30分钟以内完成，酶活保持好，是一种高效的生产萤火虫荧光素酶的方法，适于工业生产中应用。
本发明所提供的突变萤火虫荧光素酶基因(mutLuc)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。
序列表中的序列1由1671个脱氧核糖核苷酸组成，其编码序列是自序列1的5’末端的第1-1671位核苷酸，编码序列表中序列2的萤火虫荧光素酶。
含有本发明基因的重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为在pQE-30(Qiagen公司)的BamHI和SacI位点间插入序列表中序列1的自5’末端第1-1671位脱氧核糖核苷酸得到的pQE-mutLuc。
在pQE-mutLuc中，由于萤火虫荧光素酶基因处于高效启动子PT5及乳糖操纵子LacO的控制之下，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在时，本发明的萤火虫荧光素酶基因能被高效诱导转录，并且转录得到的mRNA含有核糖体结合位点RBS；同时本发明对Luc基因密码子进行了优化，使得萤火虫荧光素酶转录本得到高效翻译，显著提高萤火虫荧光素酶的产量。
本发明的另一个目的是提供一种生产萤火虫荧光素酶的方法。
本发明所提供的生产萤火虫荧光素酶的方法，是将上述任一种重组表达载体导入宿主细胞，得到含有该重组表达载体的重组细胞，培养该重组细胞，表达得到萤火虫荧光素酶。
所述宿主细胞具体可为大肠杆菌，因大肠杆菌是基因工程中应用最广泛的无毒肠道杆菌，革兰氏阴性，可在LB固体或液体培养基中37℃培养，生长迅速。本发明中所使用的大肠杆菌BL21(DE3)(天根生物技术公司)。
培养含有重组表达载体pQE-mutLuc的大肠杆菌的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。含有重组表达载体pQE-mutLuc的大肠杆菌，能在含有蛋白胨、酵母粉的培基中迅速生长，菌体产量高，易于培养。
本发明利用大肠杆菌的偏爱密码子，优化了萤火虫荧光素酶基因，并利用该优化基因构建了重组表达载体pQE-mutLuc，将pQE-mutLuc导入大肠杆菌得到工程菌，利用该工程菌生产萤火虫荧光素酶的方法，与目前现有的萤火虫荧光素酶生产方法相比，本方法具有产品易纯化，得率高(每升发酵菌液中的酶蛋白大于2mg)，酶的纯度高(酶的比活力≥2.2×1010RLU/mg蛋白)，纯化速度快，可在30分钟以内完成，酶活保持好，是一种高效的生产萤火虫荧光素酶的方法，适于工业生产中应用。
附图说明
图1为本发明中重组表达载体pQE-mutLuc结构示意图。
mutLuc：本发明的萤火虫荧光素酶基因；ampR：抗氨苄青霉素；PT5：T5启动子；LacO：LacZ操纵子；RBS：核糖体结合位点；ColE1：ColE1复制起始位点。
图2为本发明中的工程菌株pQE-mutLuc-E1在IPTG诱导和未诱导条件下的菌体生长曲线。
图3为IPTG诱导不同时间酶活测定曲线。
图4为萤火虫荧光素酶亲和层析纯化后10％SDS-PAGE电泳图。
S：纯化之前的上清液；A2-A8：不同时间的洗脱蛋白。
图5为A1-A10收集管中萤火虫荧光素酶的酶活测定。
mutLuc：本发明的萤火虫荧光素酶基因；ampR：抗氨苄青霉素；PT5：T5启动子；LacO：LacZ操纵子；RBS：核糖体结合位点；ColE1：ColE1复制起始位点。
图2为本发明中的工程菌株pQE-mutLuc-E1在IPTG诱导和未诱导条件下的菌体生长曲线。
图3为IPTG诱导不同时间酶活测定曲线。
图4为萤火虫荧光素酶亲和层析纯化后10％SDS-PAGE电泳图。
S：纯化之前的上清液；A2-A8：不同时间的洗脱蛋白。
图5为A1-A10收集管中萤火虫荧光素酶的酶活测定。
具体实施方式
本发明获得产萤火虫荧光素酶基因工程菌株及萤火虫荧光素酶的制备方法及检测流程为：
1.构建含萤火虫荧光素酶基因高效表达重组质粒pQE-mutLuc。
2.重组质粒DNA转化大肠杆菌，获得含有重组质粒pQE-mutLuc的菌株。
3.含萤火虫荧光素酶基因工程菌株的培养、诱导及菌体收集。
4.菌体破碎，收集含有萤火虫荧光素酶的上清液。
5.萤火虫荧光素酶的亲和层析纯化。
6.萤火虫荧光素酶的酶活检测，纯度检测，比活分析。
7.酶制品的制备及保存方法。
下面结合实施例和附图具体阐明本发明的技术方案。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、萤火虫荧光素酶基因的获得及其重组表达载体的构建
1、萤火虫荧光素酶基因的制备
根据萤火虫荧光素酶基因序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，对其密码子进行优化，人工直接合成该基因(奥科生物公司)，命名为mutLuc。然后将该基因连接在pGEM T vector(Promega公司)，测序(奥科生物公司)。测序结果表明获得的mutLuc基因的核苷酸序列是序列表中的序列1，其开放阅读框(ORF)为自序列表中序列1的自5′末端第1至1671位脱氧核糖核苷酸，编码序列表中序列2的萤火虫荧光素酶。将含有mutLuc的重组载体命名为pGEM-mutLuc。
2、萤火虫荧光素酶基因重组表达载体pQE-mutLuc的构建
取pGEM-mutLuc质粒3ug，加入BamH I和Sac I各20U，37度酶切完全后电泳，用胶回收试剂盒回收约1.67kb大小的mutLuc基因片段；取pQE-30(Qiagen公司)2ug，同样用BamH I和SacI酶切回收3.4kb载体片段；进行连接反应，连接反应体系：mutLuc片段50ng，pQE30片段20ng，T4DNA连接酶1uL，T4DNA连接酶缓冲液2uL，补水到终体积20uL，16度连接过夜，转化大肠杆菌JM109菌株；涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素(AmpR)的转化体；筛选出含有荧光素酶基因的阳性克隆，并进行酶切、测序鉴定，获得含有核苷酸序列是序列表中序列1的萤火虫荧光素酶基因的重组表达载体pQE-mutLuc(图1)。
实施例2、制备萤火虫荧光素酶及其特性检测
一、含萤火虫萤光素酶基因的工程菌株的获得和蛋白的诱导表达
1)工程菌株的获得
制作大肠杆菌BL21(DE3)(天根生物公司)的感受态细胞，将pQE-mutLuc质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素(AmpR)的转化体；提取质粒DNA，并进行酶切、测序鉴定，获得含有核苷酸序列是序列表中序列1的萤火虫荧光素酶基因的重组表达基因工程菌株，被命名为pQE-mutLuc-E1。
2)萤火虫萤光素酶的诱导表达
接种pQE-mutLuc-E1菌株到20mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，以此为种子，按1％(体积比)的接种量接种到1L新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养2.5小时，OD600约为0.6即进入对数生长期时，加入终浓度为3mM的IPTG(异丙基一β-D-硫代半乳糖苷)诱导萤火虫萤光素酶转录表达，诱导时间0～5小时。同时设未诱导处理的为对照。
在IPTG诱导后，分别在诱导后的0.5、1.5、2、2.5、3、4、5等不同时间取样，利用分光光度计测定OD600，获得菌体浓度。尽管菌体生长速度减慢，但仍可获得较多的菌体(图2)。
收集诱导不同时间的菌液1ml，6000-8000g离心10分钟，弃上清，沉淀用20mL磷酸缓冲液(PBS)悬浮；悬浮液10000g离心3分钟，弃上清，用5-10mL PBS重悬菌体；超声波破碎菌体(1-2分钟)，10000g离心10分钟，取上清液置于冰水备用。1μL上清液，0.15mg/ml荧光素，1mM DTT，1mg/ml BSA，5mM MgSO4，25mM Tricine(pH7.8)，10-6M ATP，在25℃下反应10秒钟，用Promega Glomax 20/20发光检测仪记录10秒内光输出量(RLU)。实验设3次重复。结果表明酶活也随诱导时间的延长而增加(图3是3次实验的平均值)。
二、萤火虫萤光素酶的纯化
按照步骤一的方法培养诱导pQE-mutLuc-E1菌株，收集诱导3小时的发酵菌液1L，6000-8000g离心10分钟，弃上清，沉淀用20mL磷酸缓冲液(PBS)悬浮；悬浮液10000g离心3分钟，弃上清，用5mL PBS重悬菌体；超声波破碎菌体(1-2分钟)，10000g离心10分钟，取上清液5mL置于冰水备用。
取上述上清液2mL，用Amersham公司镍柱(HiTrap Chelating HP)进行蛋白的纯化，采用AKATA液相色谱蛋白分析仪，进行荧光素酶亲和层析纯化。纯化步骤和方法按照仪器使用说明书进行。洗脱液用含0.5M咪唑的20mM，pH7.2的磷酸缓冲液进行梯度洗脱，洗脱液的流速0.5mL/分钟，收集液按每管收集0.3mL，收集液的流速为速0.5mL/分钟，共收集10管：A1-A10；对收集的蛋白液进行10％SDS-PAGE分析，结果表明A6-A8收集管中的蛋白显示为一条约60kD的特异条带，且没有其它杂带(图4)，与预期结果相符，得到的纯化产物可以用来进行酶学特性的分析。
四、萤火虫萤光素酶制品的产率、酶活、纯度的检测
1)对A1-A10管收集液分别进行酶活测定，实验设3次重复。
酶活标准反应条件：1μL收集液，0.15mg/ml荧光素，1mM DTT，1mg/ml BSA，5mM MgSO4，25mM Tricine(pH7.8)，10-6M ATP，在25℃下反应10秒钟，用PromegaGlomax 20/20发光检测仪记录10秒内光输出量(RLU)，用光输出量RLU(Relativelight unit)表示酶活。结果如图5所示，表明其中A6-A8收集液酶活最高(图5是3次实验的平均值)，它们的酶活可达2.4X 1010RLU/mg纯化蛋白。
2)对A6-A8管中的蛋白用Bradford法进行定量分析，实验设3次重复。结果表明其含量分别为0.6mg/mL收集液、1.1mg/mL收集液、1.05mg/mL收集液，由此计算每升发酵菌液可获得2.06mg的萤火虫荧光素酶，该纯化的萤火虫荧光素酶蛋白的比活为2.2×1010RLU/mg。将SDS-PAGE电泳图，进行灰度扫描定量和计算，酶蛋白的纯度大于96％。
五、酶的保存
将收集的酶液置于透析袋中，在含有0.5mM DTT，10mM Tris-acetate(pH7.8)，0.1M(NH4)2SO4的缓冲液中于4℃透析过夜，在如下条件下储存：25mM Tris-acetate(pH7.8)，1mM EDTA，1mM DTT，0.2M(NH4)2SO4，15％甘油。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1671
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
atggaagacg ccaaaaacat caagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatggt 60
accgctggtg agcaactgca taaggctatg aagcgctacg ccctggttcc tggtacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcgtttgg cagaagctat gaaacgttat gggctgaata caaatcaccg catcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggtgtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caatcatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccagggt 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgatcatgaa ttcctctggt 600
tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatcgca ctgcctgcgt ccgcttctcg 660
catgcccgcg atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggtatgttt actacactcg gttatttgat ctgtggtttt 780
cgtgtcgtct taatgtatcg ctttgaagaa gagctgtttt tacgttccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatccg tcaaggttat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagcg cggcgaatta tgtgtccgcg gtcctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggttg gctacattct 1260
ggtgacatcg cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggtta tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat cttgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacggt aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gtggtgttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggtaaactc gacgcacgca aaatccgcga gatcctcatc 1620
aaggccaaga agggcggtaa gtccaaattg caccaccacc accaccacta a 1671
<210>2
<211>556
<212>PRT
<213>萤火虫(Photinus pyralis)
<400>2
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ser Lys Leu His His His His His His
545 550 555
1.构建含萤火虫荧光素酶基因高效表达重组质粒pQE-mutLuc。
2.重组质粒DNA转化大肠杆菌，获得含有重组质粒pQE-mutLuc的菌株。
3.含萤火虫荧光素酶基因工程菌株的培养、诱导及菌体收集。
4.菌体破碎，收集含有萤火虫荧光素酶的上清液。
5.萤火虫荧光素酶的亲和层析纯化。
6.萤火虫荧光素酶的酶活检测，纯度检测，比活分析。
7.酶制品的制备及保存方法。
下面结合实施例和附图具体阐明本发明的技术方案。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、萤火虫荧光素酶基因的获得及其重组表达载体的构建
1、萤火虫荧光素酶基因的制备
根据萤火虫荧光素酶基因序列，在不改变其氨基酸序列的前提下，对其密码子进行优化，人工直接合成该基因(奥科生物公司)，命名为mutLuc。然后将该基因连接在pGEM T vector(Promega公司)，测序(奥科生物公司)。测序结果表明获得的mutLuc基因的核苷酸序列是序列表中的序列1，其开放阅读框(ORF)为自序列表中序列1的自5′末端第1至1671位脱氧核糖核苷酸，编码序列表中序列2的萤火虫荧光素酶。将含有mutLuc的重组载体命名为pGEM-mutLuc。
2、萤火虫荧光素酶基因重组表达载体pQE-mutLuc的构建
取pGEM-mutLuc质粒3ug，加入BamH I和Sac I各20U，37度酶切完全后电泳，用胶回收试剂盒回收约1.67kb大小的mutLuc基因片段；取pQE-30(Qiagen公司)2ug，同样用BamH I和SacI酶切回收3.4kb载体片段；进行连接反应，连接反应体系：mutLuc片段50ng，pQE30片段20ng，T4DNA连接酶1uL，T4DNA连接酶缓冲液2uL，补水到终体积20uL，16度连接过夜，转化大肠杆菌JM109菌株；涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素(AmpR)的转化体；筛选出含有荧光素酶基因的阳性克隆，并进行酶切、测序鉴定，获得含有核苷酸序列是序列表中序列1的萤火虫荧光素酶基因的重组表达载体pQE-mutLuc(图1)。
实施例2、制备萤火虫荧光素酶及其特性检测
一、含萤火虫萤光素酶基因的工程菌株的获得和蛋白的诱导表达
1)工程菌株的获得
制作大肠杆菌BL21(DE3)(天根生物公司)的感受态细胞，将pQE-mutLuc质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，涂含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基平皿，分离抗氨苄青霉素(AmpR)的转化体；提取质粒DNA，并进行酶切、测序鉴定，获得含有核苷酸序列是序列表中序列1的萤火虫荧光素酶基因的重组表达基因工程菌株，被命名为pQE-mutLuc-E1。
2)萤火虫萤光素酶的诱导表达
接种pQE-mutLuc-E1菌株到20mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，以此为种子，按1％(体积比)的接种量接种到1L新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养2.5小时，OD600约为0.6即进入对数生长期时，加入终浓度为3mM的IPTG(异丙基一β-D-硫代半乳糖苷)诱导萤火虫萤光素酶转录表达，诱导时间0～5小时。同时设未诱导处理的为对照。
在IPTG诱导后，分别在诱导后的0.5、1.5、2、2.5、3、4、5等不同时间取样，利用分光光度计测定OD600，获得菌体浓度。尽管菌体生长速度减慢，但仍可获得较多的菌体(图2)。
收集诱导不同时间的菌液1ml，6000-8000g离心10分钟，弃上清，沉淀用20mL磷酸缓冲液(PBS)悬浮；悬浮液10000g离心3分钟，弃上清，用5-10mL PBS重悬菌体；超声波破碎菌体(1-2分钟)，10000g离心10分钟，取上清液置于冰水备用。1μL上清液，0.15mg/ml荧光素，1mM DTT，1mg/ml BSA，5mM MgSO4，25mM Tricine(pH7.8)，10-6M ATP，在25℃下反应10秒钟，用Promega Glomax 20/20发光检测仪记录10秒内光输出量(RLU)。实验设3次重复。结果表明酶活也随诱导时间的延长而增加(图3是3次实验的平均值)。
二、萤火虫萤光素酶的纯化
按照步骤一的方法培养诱导pQE-mutLuc-E1菌株，收集诱导3小时的发酵菌液1L，6000-8000g离心10分钟，弃上清，沉淀用20mL磷酸缓冲液(PBS)悬浮；悬浮液10000g离心3分钟，弃上清，用5mL PBS重悬菌体；超声波破碎菌体(1-2分钟)，10000g离心10分钟，取上清液5mL置于冰水备用。
取上述上清液2mL，用Amersham公司镍柱(HiTrap Chelating HP)进行蛋白的纯化，采用AKATA液相色谱蛋白分析仪，进行荧光素酶亲和层析纯化。纯化步骤和方法按照仪器使用说明书进行。洗脱液用含0.5M咪唑的20mM，pH7.2的磷酸缓冲液进行梯度洗脱，洗脱液的流速0.5mL/分钟，收集液按每管收集0.3mL，收集液的流速为速0.5mL/分钟，共收集10管：A1-A10；对收集的蛋白液进行10％SDS-PAGE分析，结果表明A6-A8收集管中的蛋白显示为一条约60kD的特异条带，且没有其它杂带(图4)，与预期结果相符，得到的纯化产物可以用来进行酶学特性的分析。
四、萤火虫萤光素酶制品的产率、酶活、纯度的检测
1)对A1-A10管收集液分别进行酶活测定，实验设3次重复。
酶活标准反应条件：1μL收集液，0.15mg/ml荧光素，1mM DTT，1mg/ml BSA，5mM MgSO4，25mM Tricine(pH7.8)，10-6M ATP，在25℃下反应10秒钟，用PromegaGlomax 20/20发光检测仪记录10秒内光输出量(RLU)，用光输出量RLU(Relativelight unit)表示酶活。结果如图5所示，表明其中A6-A8收集液酶活最高(图5是3次实验的平均值)，它们的酶活可达2.4X 1010RLU/mg纯化蛋白。
2)对A6-A8管中的蛋白用Bradford法进行定量分析，实验设3次重复。结果表明其含量分别为0.6mg/mL收集液、1.1mg/mL收集液、1.05mg/mL收集液，由此计算每升发酵菌液可获得2.06mg的萤火虫荧光素酶，该纯化的萤火虫荧光素酶蛋白的比活为2.2×1010RLU/mg。将SDS-PAGE电泳图，进行灰度扫描定量和计算，酶蛋白的纯度大于96％。
五、酶的保存
将收集的酶液置于透析袋中，在含有0.5mM DTT，10mM Tris-acetate(pH7.8)，0.1M(NH4)2SO4的缓冲液中于4℃透析过夜，在如下条件下储存：25mM Tris-acetate(pH7.8)，1mM EDTA，1mM DTT，0.2M(NH4)2SO4，15％甘油。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1671
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
atggaagacg ccaaaaacat caagaaaggc ccggcgccat tctatcctct agaggatggt 60
accgctggtg agcaactgca taaggctatg aagcgctacg ccctggttcc tggtacaatt 120
gcttttacag atgcacatat cgaggtgaac atcacgtacg cggaatactt cgaaatgtcc 180
gttcgtttgg cagaagctat gaaacgttat gggctgaata caaatcaccg catcgtcgta 240
tgcagtgaaa actctcttca attctttatg ccggtgttgg gcgcgttatt tatcggtgtt 300
gcagttgcgc ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag tatgaacatt 360
tcgcagccta ccgtagtgtt tgtttccaaa aaggggttgc aaaaaatttt gaacgtgcaa 420
aaaaaattac caatcatcca gaaaattatt atcatggatt ctaaaacgga ttaccagggt 480
tttcagtcga tgtacacgtt cgtcacatct catctacctc ccggttttaa tgaatacgat 540
tttgtaccag agtcctttga tcgtgacaaa acaattgcac tgatcatgaa ttcctctggt 600
tctactgggt tacctaaggg tgtggccctt ccgcatcgca ctgcctgcgt ccgcttctcg 660
catgcccgcg atcctatttt tggcaatcaa atcattccgg atactgcgat tttaagtgtt 720
gttccattcc atcacggttt tggtatgttt actacactcg gttatttgat ctgtggtttt 780
cgtgtcgtct taatgtatcg ctttgaagaa gagctgtttt tacgttccct tcaggattac 840
aaaattcaaa gtgcgttgct agtaccaacc ctattttcat tcttcgccaa aagcactctg 900
attgacaaat acgatttatc taatttacac gaaattgctt ctgggggcgc acctctttcg 960
aaagaagtcg gggaagcggt tgcaaaacgc ttccatcttc cagggatccg tcaaggttat 1020
gggctcactg agactacatc agctattctg attacacccg agggggatga taaaccgggc 1080
gcggtcggta aagttgttcc attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa 1140
acgctgggcg ttaatcagcg cggcgaatta tgtgtccgcg gtcctatgat tatgtccggt 1200
tatgtaaaca atccggaagc gaccaacgcc ttgattgaca aggatggttg gctacattct 1260
ggtgacatcg cttactggga cgaagacgaa cacttcttca tcgttgaccg cttgaagtct 1320
ttaattaaat acaaaggtta tcaggtggcc cccgctgaat tggaatcgat cttgttacaa 1380
caccccaaca tcttcgacgc gggcgtggca ggtcttcccg acgatgacgc cggtgaactt 1440
cccgccgccg ttgttgtttt ggagcacggt aagacgatga cggaaaaaga gatcgtggat 1500
tacgtcgcca gtcaagtaac aaccgcgaaa aagttgcgcg gtggtgttgt gtttgtggac 1560
gaagtaccga aaggtcttac cggtaaactc gacgcacgca aaatccgcga gatcctcatc 1620
aaggccaaga agggcggtaa gtccaaattg caccaccacc accaccacta a 1671
<210>2
<211>556
<212>PRT
<213>萤火虫(Photinus pyralis)
<400>2
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ser Lys Leu His His His His His His
545 550 555