本发明公开了一种含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶及其制备方法和用途。该复合凝胶中包括羟基磷灰石纳米粒、壳聚糖、聚乙烯醇，其中壳聚糖与聚乙烯醇质量比在1∶20～8∶1之间，羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比在0.5∶1～2∶1之间。本发明提供了两种制备该复合凝胶的方法，即直接添加法和原位生成法。用这两种方法制得的该复合凝胶既可作为药物载体，用于敏感类药物的缓释，也可作为可注射型医用材料，用于关节软骨的修复和作为组织工程支架材料，还可以应用于细胞的培养等方面。
1.一种含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶的制备方法，其特征是采用如下步骤：
(1)首先制备浓度为0.5～4wt％的壳聚糖酸溶液和浓度为0.5～10wt％聚乙烯醇溶液待用；
(2)将羟基磷灰石纳米粒分散于蒸馏水，然后按羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比为0.5∶1～2∶1的比例将分散于水中的羟基磷灰石纳米粒添加于壳聚糖酸溶液中，再将含有羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖酸溶液在冰浴条件下搅拌均匀并放置待用；
(3)将碱性盐溶解在聚乙烯醇溶液中，再将含有碱性盐的聚乙烯醇溶液冰浴放置至少
15min，所用碱性盐为NaHCO3，碱性盐的用量需保证将含有碱性盐的聚乙烯醇溶液与含有羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖酸溶液混合后，混合溶液的pH值在6.5～7.2之间；
(4)在冰浴和不断搅拌下，按壳聚糖与聚乙烯醇质量比为1∶20～8∶1的比例，将含有碱性盐的聚乙烯醇溶液缓慢滴入含有羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖酸溶液中形成混合液，将混合液放置于凝胶温度37℃下即可制得凝胶，该凝胶中包括羟基磷灰石纳米粒、壳聚糖、聚乙烯醇，其中壳聚糖与聚乙烯醇质量比在1∶20～8∶1之间，羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比在0.5∶1～2∶1之间。
2.根据权利要求1所述的含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶的制备方法，其特征在于：所用羟基磷灰石纳米粒的粒径位于100～500nm之间。
3.根据权利要求1所述的含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶的制备方法，其特征在于：得到的含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶中的羟基磷灰石纳米粒含量不超过0.0002Mol/l，羟基磷灰石含量为0.0001Mol/l时，凝胶强度最大，采用动态流变仪测定其为160Pa。
4.一种含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶的制备方法，其特征是采用如下步骤：
(1)首先制备浓度为0.5～4wt％的壳聚糖酸溶液和浓度为0.5～10wt％聚乙烯醇溶液待用；
(2)然后按氯化钙与壳聚糖的质量比为0.14∶1～0.56∶1的比例，将氯化钙完全溶解在壳聚糖酸溶液中，再将溶解有氯化钙的壳聚糖酸溶液在冰浴条件下搅拌均匀并放置待用；
(3)接着按十二水磷酸钠与聚乙烯醇的质量比为0.285∶1～1.14∶1的比例或无水磷酸钠与聚乙烯醇的质量比为0.123∶1～0.492∶1的比例，将碱性盐和磷酸钠完全溶解在聚乙烯醇溶液中，再将溶解有碱性盐和磷酸钠的聚乙烯醇溶液冰浴至少15min，所用碱性盐为NaHCO3，碱性盐用量要保证将溶解有碱性盐和磷酸钠的聚乙烯醇溶液与溶解有氯化钙的壳聚糖酸溶液混合后，混合溶液的pH值在6.5～7.2之间；
(4)在冰浴和不断搅拌下，按氯化钙与磷酸钠中的Ca∶P质量比为1.67的比例，将溶解有碱性盐和磷酸钠的聚乙烯醇溶液缓慢滴入溶解有氯化钙的壳聚糖酸溶液中形成混合液，将混合液放置于凝胶温度37℃下即可制得凝胶，凝胶中包括羟基磷灰石纳米粒、壳聚糖、聚乙烯醇，其中壳聚糖与聚乙烯醇质量比在1∶20～8∶1之间，羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比在0.5∶1～2∶1之间。
5.根据权利要求4所述的含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶的制备方法，其特征在于：凝胶强度随羟基磷灰石纳米粒的含量增大而增大，当羟基磷灰石含量分别为0.00005、0.0001、0.0002Mol/l时，采用动态流变仪测定凝胶强度分别为530、590、
含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇凝胶的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇凝胶的制备方法，属于生物医用复合材料领域。
背景技术
[0002] 水凝胶由于具有良好的生物相容性、溶胀性及载药不失活等特性在药物释放和组织工程中得了广泛的应用。依据连接方式的不同，水凝胶可分为化学凝胶和物理凝胶。化学凝胶是在化学交联剂或引发剂的作用下，通过化学反应形成共价键连接而成，当其成形后残存的化学交联剂或引发剂具有一定的毒性。物理凝胶则是通过非共价键相互作用，避免了化学溶剂的使用，因而备受青睐。
[0003] 近年来原位形成凝胶体系由于可以应用于药物缓释，细胞培养和组织工程等生物用途，已经受到了广泛关注。原位形成凝胶体系在注射前保持溶液状态，注射后可在人体温度下形成凝胶。溶剂、紫外辐射、离子交联剂、pH和温度等因素都能够导致原位凝胶的形成。因为以上形成方式不需要有机溶剂，共聚剂和引发剂等化学试剂，所以可降低水凝胶的生物毒性。其中，通过温度改变实行溶液-凝胶转变可原位凝固的温敏型材料，也是可注射植入材料的研究热点。
[0004] 壳聚糖具有很好的生物相容性和生物可降解性，大分子链上含有氨基和羟基，是一种天然阳离子多糖，具有独特的pH值和温度双重响应，是一种用途非常广的生物材料。壳聚糖与聚乙烯醇可形成可注射型温度敏感凝胶，可用于药物缓释和组织工程，但不足之处是凝胶强度较弱、有药物突释现象和药物缓释时间较长。
发明内容
[0005] 为克服现有技术的不足，本发明提供了一种含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇凝胶及其制备方法和用途，本发明的制备条件简便温和，所制备的凝胶低温下能保持液态，人体温度下则可形成凝胶，该生物复合凝胶的机械强度和生物活性较壳聚糖/聚乙烯醇高。且制备方法简单有效、工艺安全、符合环保要求，可避免有机化学试剂及其它有害的物质，适合于药物缓释、组织工程和细胞培养等领域。
[0006] 本发明提供的技术方案是一种含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶，凝胶中包括羟基磷灰石纳米粒、壳聚糖、聚乙烯醇，其中壳聚糖与聚乙烯醇质量比在1∶20～8∶1之间，羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比在0.5∶1～2∶1之间。
[0007] 本发明还提供了这种复合凝胶的两种制备方法，其中一种制备方法是直接添加法，具体步骤为：
[0008] (1)首先制备浓度为0.5～4wt％的壳聚糖酸溶液和浓度为0.5～10wt％聚乙烯醇溶液待用；
[0009] (2)将羟基磷灰石纳米粒分散于蒸馏水，然后按羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比为0.5∶1～2∶1的比例将分散于水中的羟基磷灰石纳米粒添加于壳聚糖酸溶液中，再将含有羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖酸溶液在冰浴条件下搅拌均匀并放置待用；
[0010] (3)将碱性盐溶解在聚乙烯醇溶液中，再将含有碱性盐的聚乙烯醇溶液冰浴放置至少15min；
[0011] (4)在冰浴和不断搅拌下，按壳聚糖与聚乙烯醇质量比为1∶20～8∶1的比例，将含有碱性盐的聚乙烯醇溶液缓慢滴入含有羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖酸溶液中形成混合液，将混合液放置于凝胶温度下即可制得凝胶。
[0012] 在上述制备方法中，所用羟基磷灰石纳米粒的粒径位于100～500nm之间；得到的含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶中的羟基磷灰石纳米粒含量不超过0.0002Mol/l，羟基磷灰石含量为0.0001Mol/l时，凝胶强度最大，采用动态流变仪测定其为160Pa；所用碱性盐为NaHCO3，碱性盐用量需保证将含有碱性盐的聚乙烯醇溶液与含有羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖酸溶液混合后，混合溶液的pH值在6.5～7.2之间。
[0013] 另一种制备方法为原位生成法，其具体步骤如下：
[0014] (1)首先制备浓度为0.5～4wt％的壳聚糖酸溶液和浓度为0.5～10wt％聚乙烯醇溶液待用；
[0015] (2)然后按氯化钙与壳聚糖的质量比为0.14∶1～0.56∶1的比例，将氯化钙完全溶解在壳聚糖酸溶液中，再将溶解有氯化钙的壳聚糖酸溶液在冰浴条件下搅拌均匀并放置待用；
[0016] (3)接着按十二水磷酸钠与聚乙烯醇的质量比为0.285∶1～1.14∶1的比例或无水磷酸钠与聚乙烯醇的质量比为0.123∶1～0.492∶1的比例，将碱性盐和磷酸钠完全溶解在聚乙烯醇溶液中，再将溶解有碱性盐和磷酸钠的聚乙烯醇溶液冰浴至少15min；
[0017] (4)在冰浴和不断搅拌下，按氯化钙与磷酸钠中的Ca∶P质量比为1.67的比例，将溶解有碱性盐和磷酸钠的聚乙烯醇溶液缓慢滴入溶解有氯化钙的壳聚糖酸溶液中形成混合液，将混合液放置于凝胶温度下即可制得凝胶。
[0018] 在该制备方法中，所用碱性盐为NaHCO3，碱性盐用量要保证将溶解有碱性盐和磷酸钠的聚乙烯醇溶液与溶解有氯化钙的壳聚糖酸溶液的混合溶液pH值在6.5～7.2之间；所得凝胶的强度随羟基磷灰石纳米粒的含量增大而增大，当羟基磷灰石含量分别为0.00005、0.0001、0.0002Mol/l时，采用动态流变仪测定凝胶强度分别为530、590、760Pa。
[0019] 由上述技术方案可知，本发明提供的生物复合凝胶中不仅含有壳聚糖和聚乙烯醇，还含有羟基磷灰石纳米粒，而羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]是动物和人体骨骼的主要无机矿物成分，羟基磷灰石具有良好的生物相容性、生物活性、骨传导性及其与人体骨矿物相组分的相似性，是良好的骨替代物，已被广泛用于生物医用材料领域，如用作硬组织修复材料、药物载体等，且羟基磷灰石对肿瘤细胞的生长也有明显的抑制作用，因此本发明提供的这种含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶具有比现有的壳聚糖/聚乙烯醇凝胶更好的生物活性，且经过试验证明含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶的机械强度也优于壳聚糖/聚乙烯醇凝胶。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0021] (1)在现有技术的基础上增加对羟基磷灰石的利用，羟基磷灰石的生物复合提高了壳聚糖/聚乙烯醇凝胶的机械强度和生物活性。
[0022] (2)在以牛血清蛋白(BSA)为模型药的实验中，BSA的包封率可达90％，两天缓释仅仅40％，并且没有突释效应，说明本发明凝胶可作为药物载体和药物缓释，特别用于敏感类药物的缓释。
[0023] (3)制备条件简便温和，所制备的凝胶低温下保持液态，人体温度下可形成凝胶。
[0024] (4)工艺安全、简单有效、符合环保要求，可避免有机化学试剂及其它有害的物质，适合于药物缓释、组织工程和细胞培养等领域。
[0025] 因此该含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶既可作为药物载体，用于敏感类药物的缓释，也可作为可注射型医用材料，用于关节软骨的修复和作为组织工程支架材料，还可以应用于细胞的培养等方面。
具体实施方式
[0026] 实施例1：将200mg壳聚糖溶解在浓度为0.1mol/l的盐酸溶液中，配制成2wt％溶液；将100mg粒径位于100～500nm之间的羟基磷灰石纳米粒直接超声分散于1ml蒸馏水后，添加于壳聚糖溶液中，冰浴中搅拌15min；将200mg聚乙烯醇溶解后，配制成2wt％溶液；将碳酸氢钠84mg加入聚乙烯醇溶液中，同样在冰浴中放置15min；然后在不断搅拌下、冰浴下将聚乙烯醇溶液缓慢滴入壳聚糖盐酸溶液中，搅拌10min，混合后的溶液pH值为6.7。最后，将溶液在凝胶温度37℃放置30min制得凝胶，采用动态流变仪测定其强度为160Pa。凝胶中壳聚糖与聚乙烯醇质量比例为1∶1。以壳聚糖为参照，凝胶中羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比例为1∶2。
[0027] 通过实验可知，采用直接添加法，所得含羟基磷灰石纳米粒的壳聚糖/聚乙烯醇复合凝胶中的羟基磷灰石纳米粒含量不超过0.0002Mol/l，羟基磷灰石含量为0.0001Mol/l时，凝胶强度最大，采用动态流变仪测定其为160Pa
[0028] 实施例2：将200mg壳聚糖溶解在浓度为0.1mol/l的盐酸溶液中，配制成2wt％溶液；将28mgCaCl2溶解于壳聚糖溶液中，冰浴中搅拌15min；将100mg聚乙烯醇溶解后，配制成1wt％溶液；将84mg NaHCO3和57mgNa3PO4·12H2O(或相应量的无水Na3PO4)加入聚乙烯醇溶液中，同样在冰浴中放置15min；然后在不断搅拌下、冰浴下将聚乙烯醇溶液缓慢滴入壳聚糖盐酸溶液中，搅拌10min，混合后的溶液pH值为6.8。最后，将溶液在凝胶温度37℃放置30min制得凝胶，采用动态流变仪测定其强度为530Pa。凝胶中壳聚糖与聚乙烯醇质量比例为2∶1。以壳聚糖为参照，凝胶中羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比例为1∶4。
[0029] 实施例3：将400mg壳聚糖溶解在盐酸溶液中，配制成4wt％溶液；将56mgCaCl2溶解于壳聚糖溶液中，冰浴中搅拌15min；将100mg聚乙烯醇溶解后，配制成1wt％溶液；将168mgNaHCO3和114mgNa3PO4·12H2O加入聚乙烯醇溶液中，同样在冰浴中放置15min；然后在不断搅拌下，冰浴下将聚乙烯醇溶液缓慢滴入壳聚糖盐酸溶液中，搅拌10min，混合后的溶液pH值为7.0。最后，将溶液在凝胶温度37℃放置30min制得凝胶，采用动态流变仪测定其强度为590Pa。凝胶中壳聚糖与聚乙烯醇质量比例为4∶1。以壳聚糖为参照，凝胶中羟基磷灰石纳米粒与壳聚糖的质量比例为1∶4。
[0030] 实施例4：将200mg壳聚糖溶解在浓度为0.1mol/l的盐酸溶液中，配制成2wt％溶液；将112mgCaCl2溶解于壳聚糖溶液中，冰浴中搅拌15min；将200mg聚乙烯醇溶解后，配制成2wt％溶液；将牛血清白蛋白、NaHCO384mg和228mgNa3PO4·12H2O加入聚乙烯醇溶液中，同样在冰浴中放置15min；然后在不断搅拌、冰浴下将聚乙烯醇溶液缓慢滴入壳聚糖盐酸溶
