一种高浓度乙醇发酵方法转让专利

申请号 : CN200710012593.3

文献号 : CN101130789B

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发明人 : 张苓花郎亚军张春宇

申请人 : 大连海事大学

摘要 :

本发明属于微生物发酵技术领域,涉及一种高浓度乙醇发酵方法,其主要技术特征是通过添加1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)提高Zymomonas mobilis CICC10232在高葡萄糖浓度下的乙醇生成体积效率。在葡萄糖浓度为250g/L-300g/L的发酵培养基中进行乙醇发酵时,添加0.25mm-1.25mm的Ectoine,乙醇生成体积效率能够提高37.5%以上。本发明技术对于Zymomonas mobilis在高葡萄糖浓度下的乙醇发酵具有促进作用。

权利要求 :

1.一种高浓度乙醇发酵方法,其特征在于运动发酵单胞菌CICC10232(Zymomonasmobilis CICC10232)在葡萄糖浓度为250g/L-300g/L的发酵培养基中进行乙醇发酵时,添加0.25mM-1.25mM的1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine),乙醇生成体积效率提高37.5%-57.1%;

其中,菌种活化培养基:葡萄糖100g/L,酵母膏5g/L,(NH4)2SO41g/L,K2HPO41g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,pH 6.6;

菌种活化方法:活化培养基,30℃,静止培养24小时;

发酵培养基:葡萄糖150-300g/L,酵母膏5g/L,(NH4)2SO41g/L,K2HPO41g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,pH 6.6;

乙醇发酵方法:将100mL液体发酵培养基加入到300mL三角瓶中,安装加有5mL浓硫酸的发酵栓,接菌量5%,30℃,静止发酵至CO2生成量达到最高值。

2.根据权利要求1所述的一种高浓度乙醇发酵方法,其特征在于,所述的葡萄糖浓度为250g/L,1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸的添加量为1mM。

说明书 :

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域,涉及一种高浓度乙醇发酵方法,其主要技术特征是通过添加1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(Ectoine)提高Zymomonas mobilis CICC10232在高葡萄糖浓度下的乙醇生成体积效率。

背景技术

在糖质原料的乙醇发酵中,Zymomonas mobilis(Z.mobilis)与目前工业上普遍使用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)相比,糖醇转化率高、转化速度快、生物量低、发酵期间无需控制补氧等,作为替代酿酒酵母的新一代乙醇发酵菌种而受到重视[Jeffries,T.W,Nat.Biotechnol.,23,40-41,2005]。另外,高浓度发酵技术被认为是提高乙醇发酵效率、降低生产成本的有效方法之一,所以Z.mobilis的高浓度乙醇发酵技术对于提高糖质原料发酵生成乙醇的效率具有一定意义。
高浓度乙醇发酵中,发酵培养基中的高浓度糖所造成的高渗透压对Z.mobilis的乙醇发酵具有抑制作用。目前研究报道,采用蔗糖或葡萄糖和果糖的混合物作为发酵基质时,Z.mobilis能够通过葡萄糖-果糖氧化还原酶(glucose-fructose oxidoreductase)的作用而生成山梨醇,从而抵消有害的渗透压胁迫[Loos,H.,Krmer,R.,Sahm,H.,Sprenger,G.A.,J.Bacteriol.,176,7688-7693,1994]。但是这种情况下,由于形成副产物果聚糖和山梨醇等,乙醇产量会降低到葡萄糖为碳源时的70%[Viikari,L.,Appl.Micorbiol.Biot.,19,252-255,1984],所以,Z.mobilis以高浓度的葡萄糖进行乙醇发酵时,如何解决高渗透压抑制的方法研究具有一定意义。

发明内容

为了解决高葡萄糖浓度对Z.mobilis乙醇发酵的抑制,本发明提供一种Z.mobilis高葡萄糖浓度下的乙醇发酵方法。通过添加渗透压补偿溶质Ectoine促进高渗透压环境下的细胞生长和葡萄糖的利用、提高发酵终了(CO2生成量达到最大值)的乙醇浓度、缩短发酵周期,从而提高乙醇生成体积效率。
本发明所采用的技术方案:分别用含有250g/L-300g/L葡萄糖的发酵培养基进行Z.mobilisCICC10232乙醇发酵,分别添加0.25mM-1.25mM的Ectoine,其中250g/L葡萄糖浓度时添加1mM Ectoine效果最好。
通过测定CO2生成量,优化Ectoine添加浓度。在优化的条件下比较添加和不添加Ectoine的细胞生长、葡萄糖利用,测定发酵终了时的乙醇浓度、糖醇转化率、乙醇生成体积效率等发酵参数。
为了考察不同浓度的葡萄糖对Z.mobilis CICC10232乙醇发酵进程的影响,使用150g/L-300g/L葡萄糖浓度的发酵培养基分别进行乙醇发酵,测定CO2减重量,并计算CO2生成率(CO2减重量与其发酵培养基中初始葡萄糖量的百分比)。结果表明CO2生成率随葡萄糖浓度的增加而减小,150g/L、200g/L、250g/L、300g/L的葡萄糖浓度所对应的CO2生成率(发酵终了时的CO2生成率)分别为40.6%、38.0%、28.0%和23.5%,发酵终了时的乙醇浓度分别为55.1g/L、72.5g/L、66.4g/L和65.6g/L。葡萄糖浓度≥250g/L时,乙醇发酵浓度降低。
高浓度葡萄糖对Z.mobilis乙醇发酵的抑制作用是由于高渗透压造成的[Struch,T.,Neuss,B.,Bringer-Meyer,S.,Sahm,H.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,34,518-523,1990]。Ectoine是由嗜盐菌在高渗透压诱导下合成的一种渗透压补偿溶质,Ectoine普遍存在于中度嗜盐菌中[Costa,M.S.,Santos,H.,Galinski,E.A.,Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.,61,117-158,1998]。与许多渗透压补偿溶质相同,Ectoine对蛋白质、核酸、细胞等在逆环境下具有保护作用[Lippert,K.,Galinski,E.A.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,37,61-65,1992;Schnoor,M.,Voss,P.,Cullen,P.,Boking,T.,Galla,H.J.,Galinski,E.A.,Lorkowski,S.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,322,867-872,2004;Zhang,L.H.,Wang,Y.,Zhang,C.Y.,Wang,Y.J.,Zhu,D.C.,Wang,C.X.,Nagata,S.,J.Biosci.Bioeng.,102,560-563,2006;Nagata,S.,Maekawa,Y.,Ikeuchi,T.,Wang,Y.B.,Ishida,A.,J.Biosci.Bioeng.,94,384-389,2002]。本发明利用Ectoine保护Z.mobilis CICC10232在250g/L-300g/L葡萄糖下的细胞生长和生理活性,提高乙醇生成体积效率。
为了考察Ectoine对Z.mobilis CICC10232在高葡萄糖浓度下的乙醇发酵过程的影响,在葡萄糖浓度为250g/L-300g/L发酵培养基中分别添加终浓度为0.25mM-1.25mM的Ectoine,测定CO2生成量并优化Ectoine添加浓度。在优化的条件下测定细胞生长和葡萄糖利用,测定乙醇浓度、糖醇转化率、CO2生成效率、葡萄糖利用效率和乙醇生成体积效率。
本发明的效果是:在葡萄糖浓度为250g/L-300g/L时,添加0.25mM-1.25mM的Ectoine,乙醇生成体积效率能够提高37.5%以上。其中250g/L葡萄糖浓度时添加1mM Ectoine效果最好,与未添加Ectoine的相比较,发酵终了时的细胞干重提高了20.0%,残余葡萄糖浓度降低了43.2%,乙醇浓度提高了18.2%,糖醇转化率提高了16.7%,CO2生成效率、葡萄糖利用效率分别提高了57.1%和57.9%,乙醇生成体积效率提高了57.1%。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是不同葡萄糖浓度对CO2生成的影响。Z.mobilis CICC10232分别在150g/L-300g/L葡萄糖浓度的发酵培养基中进行乙醇发酵,测定CO2生成率。
图2是Ectoine对CO2生成量的影响。在葡萄糖浓度为250g/L发酵培养基中分别添加终浓度为0.25mM-1.25mM的Ectoine,进行乙醇发酵,测定CO2生成量。
图3是Ectoine对细胞生长和葡萄糖利用的影响。在葡萄糖浓度为250g/L发酵培养基中添加终浓度为1mM的Ectoine,进行乙醇发酵,测定细胞生长量和葡萄糖浓度。

具体实施方式

实施例1(不同葡萄糖浓度对CO2生成的影响)
菌种:运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis CICC10232),购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。
Ectoine:购自德国Bitop公司。
菌种活化培养基(g/L):葡萄糖100,酵母膏5,(NH4)2SO4 1,K2HPO4 1,MgSO4·7H2O 0.5,pH6.6。
发酵培养基(g/L):葡萄糖(150-300),酵母膏5,(NH4)2SO4 1,K2HPO4 1,MgSO4·7H2O 0.5,pH6.6。
乙醇发酵方法:发酵装置为100mL液体发酵培养基加入到300mL三角瓶中,安装发酵栓(其中加入5mL浓硫酸),接菌量5%(菌种活化:活化培养基,30℃,活化培养24小时),30℃,静止发酵。
CO2生成量测定:按上述乙醇发酵方法进行乙醇发酵,其间定时称量发酵装置的重量,其减重量即为CO2生成量。
乙醇浓度测定:发酵醪测定体积后蒸馏乙醇,当蒸馏液达到原体积的70%后,停止蒸馏,加水补充至原体积。比重瓶法测定蒸馏液的比重,按乙醇溶液的比重与密度关系表得到相应的乙醇浓度[食品分析技术,中国轻工业出版社,北京,2001]。
为了考察不同葡萄糖浓度对乙醇发酵CO2的影响,按上述方法使用150g/L-300g/L葡萄糖浓度的发酵培养基分别进行乙醇发酵,测定CO2减重量,并计算CO2生成率(CO2减重量与其发酵培养基中葡萄糖量的百分比),结果见图1。由图1可见,CO2生成率随葡萄糖浓度的增高而降低,150g/L、200g/L、250g/L、300g/L的葡萄糖浓度所对应的最大CO2生成率(发酵终了时的CO2生成率)分别为40.6%、38.0%、28.0%和23.5%,发酵终了时的乙醇浓度分别为55.1g/L、72.5g/L、66.4g/L和65.6g/L。结果表明葡萄糖浓度≥250g/L时,Z.mobilis CICC10232乙醇发酵受到抑制。
实施例2(Ectoine对CO2生成量的影响)
在250g/L葡萄糖浓度的发酵培养基中添加终浓度为0.25mM-1.25mM的Ectoine,通过测定CO2生成量(测定方法同实施例1)考察Ectoine对乙醇发酵的影响,同时优化Ectoine添加浓度,结果见图2。如图2所示,Ectoine能够提高发酵进程中CO2生成量,并且缩短到达发酵终了的时间。其中1mM Ectoine添加效果最好,与未添加Ectoine的相比,发酵终了时CO2生成量提高了16.2%,到达发酵终点的时间缩短了24小时(从未添加Ectoine的96小时减少到72小时)。
实施例3(Ectoine对细胞生长和葡萄糖利用的影响)
细胞生长测定:发酵液离心收集细胞,洗涤2次后测定600nm波长下细胞悬浮液的吸光值。
葡萄糖浓度测定:试剂盒(Code No.439-90901),日本和光纯药工业株式会社。
在250g/L葡萄糖的发酵培养基中添加终浓度为1mM的Ectoine,按实施例1方法进行乙醇发酵,其间定时测定细胞生长量和葡萄糖浓度,并与未添加Ectoine的相比较,结果如图3。如图3所示添加1mM Ectoine促进了细胞生长和葡萄糖利用。
实施例4(250g/L葡萄糖浓度下添加1mM Ectoine的乙醇发酵参数)
按实施例1方法,250g/L葡萄糖浓度、添加1mM Ectoine进行乙醇发酵,测定发酵参数,结果见表1。其中:
细胞干重:发酵终了时离心收集细胞,洗涤2次,≤100℃烘干至恒重,称重。
残余葡萄糖浓度:发酵终了时的葡萄糖浓度,按实施例3方法测定。
乙醇浓度:发酵终了时的乙醇浓度,按实施例1方法测定。
糖醇转化率:发酵终了时转化为乙醇的葡萄糖量(根据测定的乙醇生成量,由反应式C6H12O6→2C2H5OH+2CO2计算)与发酵初始的葡萄糖量的百分比。
CO2生成体积效率:从发酵开始至发酵终了,单位时间、单位发酵液体积所生成的CO2量。
葡萄糖利用体积效率:从发酵开始至发酵终了,单位时间、单位发酵液体积所减少的葡萄糖量。
乙醇生成体积效率:从发酵开始至发酵终了,单位时间、单位发酵液体积所生成的乙醇量。
由表1可见,添加1mM Ectoine与未添加Ectoine的相比,发酵终了时细胞干重提高了20.0%,残余葡萄糖浓度降低了43.2%,乙醇浓度提高了18.2%,糖醇转化率提高了16.7%,CO2生成效率、葡萄糖利用效率分别提高了57.1%和57.9%,乙醇生成体积效率提高了57.1%。
表1  250g/L葡萄糖浓度下添加1mM Ectoine的乙醇发酵参数
    发酵参数             Ectoine(mM)     0     1     细胞干重(g CDW/L)    残余葡萄糖浓度(g/L)    乙醇浓度(g/L)    糖醇转化率(%)    CO2生成效率(g/L.h)    葡萄糖利用效率(g/L.h)    乙醇生成体积效率(g/./h)     1.5±0.1    66.7±3.8    66.4±0.8    52.0±0.6    0.7±0.0    1.9±0.0    0.7±0.0     1.8±0.1    37.9±1.9    78.5±1.6    60.7±1.4    1.1±0.0    3.0±0.0    1.1±0.0