使用肽中间片段合成肽T-1249转让专利
申请号 : CN200580048841.9
文献号 : CN101133076B
文献日 : 2011-07-13
发明人 : Y-K·汉 , L·M·霍奇斯 , D·A·约翰斯顿 , H·N·翰特里
申请人 : 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
摘要 :
用于固相合成T-1249肽和肽中间体的方法，尤其涉及以低装载系数合成T-1249肽中间体以产生具有极好纯度和产率的产物的方法。
权利要求 :
1.制备序列为Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2的肽的方法，该方法包括步骤：(a)提供式Z-E-SUP的固相合成支持物树脂，其中SUP是支持物树脂，E是谷氨酸残基，并且Z是NH2-末端保护基，并且其中Z-E以0.2至0.5的装载系数在SUP上存在，(b)偶联氨基酸至Z-E-SUP以提供Z-WQEWEQKITALLEQAQIQQE-SUP；
(c)处理Z-WQEWEQKITALLEQAQIQQE-SUP以提供Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE-OH切割产物；和(d)使用Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE-OH与序列为H-KNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2的肽起反应以合成Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2。
2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中SUP包含三苯甲基。
3.权利要求2所述的方法，其中在步骤(a)中SUP包含氯-三苯甲基。
4.权利要求1至3任一项所述的方法，其中Z是Fmoc基团。
5.权利要求1至3任一项所述的方法，其中在步骤(a)中Z-E以0.2至0.45的装载系数在SUP上存在。
6.权利要求1至3任一项所述的方法，其中在步骤(a)中Z-E以0.2至0.4的装载系数在SUP上存在。
7.权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中氨基酸以1至1.5当量之间的量偶联至Z-E-SUP。
8.权 利 要 求1 所 述 的 方 法，其 中 H-KNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 是 通 过 使Z-KNEYELQKLDKWASLWEW-OH与苯丙酰胺起反应而形成的。
9.制备序列为Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2的肽的方法，该方法包括步骤：(a)提供式Z-W-SUP的固相合成支持物树脂，其中SUP是支持物树脂，W是色氨酸残基，并且Z是NH2-末端保护基，并且其中Z-W以0.2至0.5的装载系数在SUP上存在，(b)偶联氨基酸至Z-W-SUP以提供Z-KNEYELQKLDKWASLWEW-SUP；
(c)处理Z-KNEYELQKLDKWASLWEW-SUP以提供Z-KNEYELQKLDKWASLWEW-OH切割产物；和(d) 使 用 Z-KNEYELQKLDKWASLWEW-OH 与 苯 丙 酰 胺 起 反 应 以 形成 H-KNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2， 使 H-KNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 与Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE-OH起反应以合成WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF。
10.制备序列为Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2的肽的方法，该方法包括步骤：(a)提供序列为Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE-OH和Z-KNEYELQKLDKWASLWEW-OH的肽中间片段，其中肽中间片段已经在固相支持物上利用0.2至0.5的装载系数合成；
(b)在液相中使Z-KNEYELQKLDKWASLWEW-OH与苯丙酰胺残基起反应以提供序列H-KNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2；和(c)在液相中使Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE-OH与H-KNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2起反应以提供Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2。
11.权利要求10所述的方法，其中在步骤(a)中，肽中间片段已经在固相支持物上利用
0.2至0.45的装载系数合成。
12.权利要求10或11所述的方法，其中在步骤(a)中，肽中间片段已经在固相支持物上利用0.2至0.4的装载系数合成。
13.权利要求10所述的方法，其中在步骤(b)中，肽中间片段已经在固相支持物上利用已偶联至支持物的量在1至1.5当量之间的氨基酸合成。
说明书 :
使用肽中间片段合成肽T-1249
[0001] 本发明涉及利用固相方法和液相方法用于制备T-1249肽的方法，还涉及可以在这些方法中使用的T-1249中间肽片段。更具体而言，本发明涉及使用两个片段制备T-1249肽，其中所述的两个片段使用固相方法合成。
[0002] 用于肽合成的众多方法在文献(例如，见美国专利第6,015,881号；Mergler等 (1988)Tetrahedron Letters 29：4005-4008；Mergler 等 (1988)Tetrahedron Letters 29：4009-4012；Kamber等(编辑)，Peptides，Chemistryand Biology，ESCOM，Leiden(1992)525-526；Riniker 等 (1993)Tetrahedron Letters 49：9307-9320；Lloyd-Williams等(1993)TetrahedronLetters 49：11065-11133和Andersson等(2000)Biopolymers 55：227-250中描述。多种合成方法通过在其中合成进行的相的物理状态即液相或固相加以区别。
[0003] 在固相肽合成(SPPS)中，氨基酸或肽基团结合至固相支持物树脂。随后，连续的氨基酸或肽基团连接在结合支持物的肽上，直至目的肽材料形成。随后，结合支持物的肽通常从支持物上切下并接受进一步加工和/或纯化处理。在某些情况下，固相合成产生成熟的肽产物；在其它情况下，从支持物中切下的肽(即“肽中间片段”)用于制备更大的成熟的肽产物。
[0004] 从固相方法中生成的肽中间片段可以在液相合成方法(本文中称作“液相合成”)中偶联起来。液相合成可能在下列情况下特别有用，即此时通过固相合成有用的成熟肽是不可能的或是不可行的。例如在固相合成中，较长的肽在仍然连接在固相支持物上时最终可能获得不规则构象，因此导致终产物中的活性部分丧失或完全丧失。此外，当在支持物树脂上肽链变得更长时，加工步骤如偶联和去保护的效率可能受到损害。这接下来可以导致更长的加工时间以便弥补这些问题，此外还导致原材料如可活化氨基酸、共反应剂(co-reagents)和溶剂的损失增加。这些问题随肽的长度增加而增加，因此，找到仅使用固相方法合成长度大于30个氨基酸的成熟肽相当少见。
[0005] 在液相偶联中，两个肽中间片段或者一个肽中间片段和一个活性氨基酸在适宜的溶剂中偶联，并且通常存在促进偶联反应效率和质量的额外试剂。肽中间片段以活性方式加以排列以致一个片段的氨基端与另一个片段的羧基端形成偶联，或一个片段的羧基端与另一个片段的氨基端形成偶联。此外，固相合成期间存在的侧链保护基在液相偶联期间通常保留在片段上以确保片段末端的特异反应性。一般不去除这些侧链保护基直至成熟肽已经形成。
[0006] 为合成非常大的肽，对于多个待开展的液相偶联步骤而言使用三个或四个或多个肽中间片段并非罕见。当使用多个肽中间片段时，尽管在液相反应中末端对末端偶联反应的一般概念通常在理论上浅显易懂，但在实践中这几乎不可能。多种因素如杂质和肽产率可能显著地影响全长肽的质量和产率。因此，使用混合方案(hybrid schemes)合成肽往往具有挑战性，并且在很多情况下难以预测合成方案中的固有困难直至开展实际合成。
[0007] 在某些情况下，液相合成可因固相合成后的肽中间片段纯度不够受到影响。就此而言，可能需要使肽中间片段在使片段于液相方法中偶联前接受纯化步骤处理。纯化则可能引起肽中间片段产率的降低，因此引起终末肽产物产率的降低。
[0008] 成熟肽的产率还与合成成熟肽所需的液相步骤的数目成反比。在某些情况下，可能需要三个、四个或多于四个利用肽中间产物的液相步骤以生成成熟肽。每一额外的液相偶联步骤可以导致减少全长肽产物的回收。因此，为了提高总产率，通常需要使偶联中所涉及的步骤最少化。
[0009] 对整体合成方案的一个或多个步骤中的适度改进可以引起成熟肽制备的显著改进。这样的改进可以引起时间和试剂的明显节约，并还可以显著地改善终产物的纯度和产率。
[0010] 虽然对混合合成(hybrid synthesis)中改进的重要性的讨论适用于使用这些方法产生的任何类型的肽，但这在有治疗用途并且在商业医药用途规模上制造的肽的情况下特别重要。在合成小分子药物可能相对便宜的同时，相对而言，合成较大生物分子药物如治疗肽的成本可能非常高昂。因试剂成本、合成时间和其它因素，在这些较大生物分子药物的合成方法中非常小的改进可能甚至对生产这种药物在经济上是否可行具有重大影响。此类改进因为这些较大生物分子药物的高昂生产成本而是必需的，这基于如此事实，即在很多情况下几乎没有对这些类型的较大生物分子药物的合适治疗替代品。
[0011] 此状况可以在用于治疗因逆转录病毒感染所致免疫缺陷病的治疗肽的情况下清楚地见到。具有抗逆转录病毒活性的肽可以以包括通过阻止病毒粒子与宿主免疫细胞融合在内的不同方式发挥作用。存在对这类新的且有效的治疗肽的巨大需求，因为在很多情况下，常规使用的抗病毒药因突变所致的病毒耐药性而无法有效地治疗这些疾病。
[0012] 一类有前景的用于对付免疫免缺陷病的治疗肽是融合抑制剂。这些类型的治疗肽可以降低病毒滴度，并在免疫免缺陷病患者中显著改善生活质量。例如，36个氨基酸的合成肽 肽(也称作恩夫韦地(enfuvirtide)或T-20)、杂合肽T-1249及这些肽的衍生物和对应物在治疗人免疫缺陷病毒(HIV)和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)中作为融合抑制剂已经证实有益处。 肽及其衍生物是首个在感染HIV的人中表现出
一致的有效活性的HIV抑制剂。Kilby等(1998)Nat Med 4：1302和Kilby等(2002)AIDS Res Hum Retroviruses 18：685。
一致的有效活性的HIV抑制剂。Kilby等(1998)Nat Med 4：1302和Kilby等(2002)AIDS Res Hum Retroviruses 18：685。
[0013] 融合抑制剂如T-20肽和T-1249肽结合至参与病毒同宿主CD4+细胞融合的HIV1型病毒(HIV-1)包膜糖蛋白41的区域。Wild等(1993)AIDS Res.Hum.Retroviruses 9：1051。融合抑制剂仍留在细胞外并在HIV-1进入细胞前阻断HIV-1。 肽及其
衍生物在体外通过有效地且选择性地抑制HIV使药物的相互作用、副作用和毒性最小化。
衍生物在体外通过有效地且选择性地抑制HIV使药物的相互作用、副作用和毒性最小化。
[0014] 除了这些关注点之外，涉及对大规模生产肽的肽产物回收和产物纯度，以及试剂操作、贮存和处置的事项可明显地影响肽合成方案的可行性。因此，一直需要能够以改善的产率产生大批量商业目的肽材料的肽合成方法。在固相合成肽后，从支持物树脂回收切下的肽是合成中需要改进的一个方面。
[0015] 本发明涉及使用固相方法和液相(“混合(hybrid)”)方法合成T-1249肽的制备。通常，方法包括使用固相化学合成两种不同的T-1249肽中间片段(SEQ ID NO.2和SEQ ID NO：3或其对应物)。根据本发明的一些方面，已经发现在固相合成后，这些特定的T-1249中间序列本身是特别良好地适合于液相偶联步骤。此外，还发现导致这些肽中间片段形成的固相步骤可以按照本发明加以调整以显著地提高这些中间片段的产率和纯度。将这种改善的产率和纯度运用至液相偶联步骤，因而改进了整体合成过程。
[0016] 本发明的方法和本文中所述的肽中间片段是特别有利的，尤其因为以多种方式使T-1249合成过程更高效。具体而言，导致T-1249肽中间产物SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3形成的固相合成步骤利用具有第一氨基酸的支持物树脂，其中所述的第一氨基酸以低于标准固相技术中常规所用装载系数(loading factor)的装载系数偶联在支持物上。令人欣喜地是已经发现使用这种较低的装载系数，可以以改善的产率和改善的纯度产生通常作为长的固相合成片段的SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3T-1249肽中间产物。
[0017] 改善的纯度和产率显著地改善了用于液相偶联步骤的条件，因此导致T-1249整体合成的改进。
[0018] 直至目前，最成功的T-1249合成方法已经利用这样的液相偶联，在其中通过固相合成制备三种或多于三种肽中间片段。这些中间片段随后在液相偶联反应中使用以制备最终的T-1249成熟产物。尽管通常可在固相合成中间体的较高质量中观察到三(或多)片段方法的优点，但实际上对某些T-1249片段并非如此。具体而言，合成具有良好纯度的由27-38个残基和13-26个残基组成的T-1249肽中间片段本身已经是困难的。此外，伴随中间片段的杂质在使用特定溶剂用于分离的三片段方法中潜在地存在。
[0019] 另一个缺点是三(或多)片段方法相对于两片段方法包括更多的分离和纯化步骤，并且这些额外的步骤通常增加加工时间并且可能随后降低合成反应的整体产率。
[0020] 因为本发明仅利用经固相合成制备的两种肽中间片段，一个明显的有利之处是加工时间减少，并且去除加工步骤可以导致更高效地使用材料和试剂。这在合成T-1249中特别重要，因为T-1249是相对较长的包含5个色氨酸(W)残基的肽，而色氨酸是固相合成中的昂贵试剂。
[0021] 然而，伴随两片段方法的潜在不利之处是通过固相合成法合成较长的中间片段可能是复杂的并且往往导致困难的纯度问题和/或回收问题。尽管如此，如所描述，本发明证实如下方法成功地允许以良好产率和纯度产生中间片段，即选择具有基于SEQ ID NO：2或SEQ ID NO.3的序列的肽中间片段并且随后使用低的树脂装载系数通过固相合成法合成这些片段。此项成就对于使用组合的固相方法和液相方法以合成肽的常规方法而言是相当引人注目的。
[0022] 本发明还因肽纯度的其它方面得到改善而是有利的。具体而言，具有根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的序列的肽中间片段不包括氨基端谷氨酸(E)残基。任一的两种中间片段一定程度地包含谷氨酸残基，该残基位于中间片段的序列内或在其羧基端。当使用具有这些氨基酸整体顺序排列(如在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3中)的片段时，已经发现中间片段的纯度可以是显著较高的，因为在氨基端带谷氨酸的片段倾向于包含更多的焦谷氨酸杂质。
[0023] 因此，本发明在某些方面提供用于制备用来合成T-1249肽的肽中间片段的方法，该方法包括步骤(a)提供具有第一氨基酸的固相合成支持物树脂，其中与树脂偶联的第一氨基酸为谷氨酸(E)，其中谷氨酸以0.5或更小的装载系数偶联；谷氨酸优选地以0.2至0.5之间的装载系数偶联；(b)使后续的氨基酸偶联至已偶联支持物上的第一氨基酸以提供如下序列：
[0024] Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE-[支 持 物 ]；(c) 在 切 割 反 应 中 从 支 持 物上 移 走Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2) 肽 中 间 体，并 且 随 后 使 用Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2)肽中间体以合成具有全部或部分的Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO.1)的肽。
[0025] 在另外的方面，本发明提供用于制备用来合成T-1249肽的肽中间片段的方法，该方法包括步骤(a)提供具有第一氨基酸的固相合成支持物树脂，其中与树脂偶联的第一氨基酸为色氨酸(W)，其中色氨酸以0.5或更小的装载系数偶联；色氨酸优选地以0.2至0.5之间的装载系数偶联；(b)使后续的氨基酸偶联至已偶联支持物上的第一氨基酸以提供如下序列：KNEYELQKLDKWASLWEW-[支持物]；(c)在切割反应中从支持物上移走KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)肽中间体，并且随后使用KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)肽中间体以合成具有全部或部分的Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：1)的肽。
[0026] 最优选地，本发明提供用于制备T-1249肽的方法，该方法包括步骤(a)提供具有序列Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2)和KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)的肽中间片段，其中已经利用0.5或更小的装载系数、优选使用0.2至0.5之间的装载系数在固相支持物上合成肽中间片段；(b)在液相中，使KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)肽与苯丙酰胺(phenylalaninamide)残基起反应以提供序列KNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：4)，和 (c) 在 液 相 中，使Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2) 肽 与KNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：4)肽起反应以提供Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：1)肽。
[0027] 在另外的方面，在偶联步骤中第一氨基酸以小于0.5的装载系数存在于支持物上。在另外的方面，在偶联步骤中第一氨基酸以范围在0.2-0.45的装载系数或以范围在0.25-0.40的装载系数存在于支持物上。
[0028] 在又一方面，通过以1当量至1.5当量之间的量将氨基酸偶联至新生肽链上实施固相合成。
[0029] 以下描述的本发明实施方案不意图是排它性的或使本发明受限于如下详细描述中所公开的精确形式。相反，实施方案如此进行选择并描述以致本领域的其它技术人员可以认识并理解本发明的原理和实践。
[0030] 本文中所用的术语不意图限制本发明的范围。在本文通篇范围内，包括在附加的权利要求书中，除非上下文清楚地声明，否则单数形式“一个”和“该”包括复数指称。因此，例如称谓“一个氨基酸残基”是对一个或多个氨基酸残基的称谓并包括本领域技术人员已知的等效物。在本发明中，频繁使用某些术语，其意义在本文中提供。除非另外定义，否则本文中所用术语具有如本技术领域内一位普通技术人员通常所理解的相同含义。还可以稍后在说明书中更详细地解释某些术语。
[0031] 本发明涉及用于改善T-1249合成和T-1249对应物合成的方法，并且具体而言用于改善与固相合成T-1249肽中间片段相关的合成方面的方法。本发明的方法学对仅使用两种固相合成的肽片段产生T-1249肽及其对应物是有用的。虽然本发明总体上涉及T-1249合成，但本文中本发明的教授还可以应用于合成其它肽，尤其使用固相方法和液相方法的组合所合成的那些肽。本发明还用于合成伴随有杂质、尤其焦谷氨酸杂质的肽中间片段。
[0032] 本文中所述的方法特别适合于改善T-1249肽的放大(scaled-up)合成方面。通常开展放大的方法以提供用于分送的肽的量。例如放大的方法中肽的量可以是每批次500g或1kg，或更多，并且更经常是每批次数十公斤至数百公斤或更多。在放大的合成方法如大规模合成中，可以使用一个或多个大型反应容器。这些反应容器可以容纳用于合成过程中多个步骤的大量试剂，如树脂、溶剂、氨基酸和化学品，反应容器的大小允许产生大量如100-500公斤或更多的肽。
[0033] 本文中所述的方法特别适合于改善肽合成的方面，特别对于放大的方法。在优选的实施方案中，本发明的方法可以提供这样的改进以致于减少加工(合成)时间、改进产物产率、改进产物纯度并减少所需要的试剂和原材料的量。
[0034] T-1249肽具有39个氨基酸序列(从乙酰基端(对应于氨基端)阅读至酰胺端(对应于羧基端))
[0035] 乙酰基-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2(SEQ.ID NO.1)[0036] T-1249肽的代表性肽片段包括，但不限于具有如下表1中所描述氨基酸序列的那些肽片段和这些肽片段的对应物，例如在表中，在第39位置处的氨基酸(其为F)可以具有如在原始代谢物情况中的羧酸末端，或它可能被修饰为如在T-1249肽自身情况中的酰胺。
[0037] T-1249是用于治疗HIV-1感染的抗逆转录病毒药物。T-1249的功能是通过阻断膜融合所需要的构象改变而阻断HIV-1病毒粒子与宿主细胞的融合。具有此类型活性的肽在本文中称作具有T-1249活性。
[0038] T-1249合成通常同时利用固相方法和液相方法以便合成并组合成组的特定肽片段以产生T-1249产物。T-1249肽和产生T-1249肽及其片段的方法描述于美国专利第6,469,136号，该专利在本文中完整地引用作为参考。
[0039] 本发明还可用于合成T-1249对应物，包括全长的T-1249对应物及T-1249肽中间体对应物。如本文中所用，“T-1249对应物”指衍生自T-1249或T-1249中间片段的化合物。肽对应物包括但不限于肽类似物、肽衍生物、融合化合物等。因此，当提及具有序列SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的T-1249肽中间片段时，它们的对应物分别例如包括SEQ ID NO：2和SEQID NO：3的肽类似物、肽衍生物、融合化合物。
[0040] 如本文中所用，肽类似物通常指相对于另一种肽或肽对应物，具有例如由替换、缺失、倒位和/或添加一个或多个氨基酸所致的经修饰氨基酸序列的肽。替换优选地可以是保守性的或高度保守性的。保守性替换指一种氨基酸以具有通常相同的净电荷和通常相同的大小和形状的另一种氨基酸替代。例如，当侧链中的碳原子和杂原子总数的差异不超过大约4时，具有脂族氨基酸侧链或取代的脂族氨基酸侧链的氨基酸具有大致相同的大小。当侧链中分支的数目差异不超过大约1或2时，它们具有大致相同的形状。侧链中具有苯基或取代的苯基的氨基酸被视为具有大致相同的大小和形状。以下所列是五组氨基酸。将化合物中的一种氨基酸以来自相同组的另一种氨基酸替换通常产生保守性替换。
[0041] 组I：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和具有C1-C4脂族侧链或C1-C4经羟基取代的脂族侧链(直链或单分支的)的非天然存在氨基酸。
[0042] 组II：谷氨酸、天冬氨酸和具有经羧酸取代的C1-C4脂族侧链(未分支或单分支点)的非天然存在氨基酸。
[0043] 组III：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸和具有经胺或胍基取代的C1-C4脂族侧链(未分支或单分支点)的非天然存在氨基酸。
[0044] 组IV：谷氨酰胺、天冬酰胺和具有经酰胺取代的C1-C4脂族侧链(未分支或单分支点)的非天然存在氨基酸。
[0045] 组V：苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。
[0046] “高度保守性替换”是一种氨基酸以在侧链中具有相同的官能团和几乎相同的大小和形状的另一种氨基酸替换。当侧链中的碳原子和杂原子总数的差异不超过大约2时，具有脂族氨基酸侧链或取代的脂族氨基酸侧链的氨基酸具有几乎相同的大小。当它们在侧链中具有相同数目的分支时，这些氨基酸具有几乎相同的形状。高度保守性替换的实例包括用缬氨酸替换亮氨酸、用苏氨酸替换丝氨酸、用天冬氨酸替换谷氨酸、以及用苯基甘氨酸替换苯丙氨酸。
[0047] 肽衍生物通常指通常指具有在一个或多个其侧基团、α碳原子、末端氨基和/或末端羧酸基处的化学修饰的肽、肽类似物或其它肽对应物。例如，化学修饰包括但不限于添加化学部分、形成新化学建和/或去除化学部分。在氨基酸侧基团处的修饰包括而不限于赖氨酸ε-氨基的酰基化、精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化、谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化作用。末端氨基的修饰包括而不限于脱氨基修饰、N-低级烷基修饰、N-二-低级烷基修饰和N-酰基(例如-CO-低级烷基)修饰。末端羧基的修饰包括而不限于酰胺修饰、低级烷基酰胺修饰、二烷基酰胺修饰和低级烷基酯修饰。因此，部分或完全受保护的肽构成了肽衍生物。
[0048] 参考如下组的肽，其包括如表1中所述的T-1249和T-1249中间片段。
[0049] 表1
[0050]SEQID 氨基酸序列 T-1249的相应编号的
NO： 氨基酸序列
1 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE 1-39
KNEYELQKLDKWASLWEWF
2 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE 1-20
3 KNEYELQKLDKWASLWEW 21-38
4 KNEYELQKLDKWASLWEWF 21-39
NO： 氨基酸序列
1 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE 1-39
KNEYELQKLDKWASLWEWF
2 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE 1-20
3 KNEYELQKLDKWASLWEW 21-38
4 KNEYELQKLDKWASLWEWF 21-39
[0051] 为提供概述，当基于本发明的方法，如下是用于T-1249 肽的整体合 成 方 案。T-1249(SEQ ID NO：1) 通 过 包 括 固 相 合 成T-1249 肽 中 间 片 段Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2)和KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)的步骤制备。这些肽使用本文中所述的方法合成并随后以侧链受保护的形式从固相树脂上切下。
苯丙酰胺残基随后在溶液中与KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)肽中间体偶联以产生KNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：4)。KNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：4)随后在溶液中与Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2)偶联以产生Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：1)。
苯丙酰胺残基随后在溶液中与KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)肽中间体偶联以产生KNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：4)。KNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：4)随后在溶液中与Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2)偶联以产生Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：1)。
[0052] 根据本发明，使用固相合成技术以制备T-1249的具有20个氨基酸序列Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2)的第一肽片段(中间片段1)或其对应物。就参考优选的固相合成方法而言，在肽的羧基端部分存在的氨基端谷氨酸(E)残基(即SEQ ID NO：2的第20号残基)是这样的第一氨基酸残基，其与固相树脂偶联并因此就其相对于固相支持物树脂的位置而言构成片段的α氨基酸。在这个优选的方法中，固相合成因而通过从氨基端至羧基端连续地添加氨基酸残基，以对应于目的序列的方式依次添加氨基酸而继续下去。氨基端残基(例如SEQ ID NO：2的氨基端色氨酸(W))添加至新生肽链后，肽中间片段的合成完成。
[0053] 还使 用 固相 合 成技 术以 便 制备 T-1249的具 有18个 氨 基酸 序 列KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)的第二肽片段(中间片段2)或其对应物。就参考优选的固相合成方法而言，在肽的羧基端部分上存在的氨基端色氨酸(W)残基(即SEQ ID NO：3的第18号残基)是这样的第一氨基酸残基，其与固相树脂偶联并因此就其相对于固相支持物树脂的位置而言构成片段的α氨基酸。在这个优选的方法中，固相合成也通过从氨基端至羧基端连续地添加氨基酸残基，以对应于目的序列的方式依次添加氨基酸而继续下去。氨基端残基(例如SEQ ID NO：3的氨基端赖氨酸(K))添加至新生肽链后，肽中间片段的合成完成。
[0054] 有利地，中间片段1或中间片段2均不包含氨基端谷氨酸(E)残基。任一的两种中间片段一定程度地包含谷氨酸残基，该残基位于中间片段的序列内或在其羧基端。当使用具有这些氨基酸整体顺序排列的片段时，已经发现中间片段的纯度可以是显著较高的，因为在氨基端处带谷氨酸的片段倾向于包含更多的焦谷氨酸杂质。
[0055] 还指出的是中间片段1和2均包括至少18个氨基酸残基。这些片段在固相合成的环境中是相当大的肽片段，然而，本发明的原理允许以高产率和高纯度合成如此大的片段和最终的T-1249。
[0056] 根据本发明，已经发现通过适度地控制在固相树脂上所合成肽的相对量，可以在肽中间片段的产率和纯度方面获得有利的效果。所合成肽的相对量可以由装载系数控制，其中所述装载系数指与一定量树脂偶联的α氨基酸的量，通常表述为每克固相树脂毫摩尔α氨基酸，例如装载系数0.25将对应于实际上与100g固相树脂偶联的25mmol的α氨基酸。将得到理解的是第一氨基酸与固相树脂偶联的反应可能不是完全高效的，并且因此偶联的实际量可能低于基于100％偶联效率和起始试剂量的理论量。偶联材料的实际量可以在反应已经进行后加以测定。为测定实际的偶联，可以从树脂上切下肽并通过使用例如HPLC分析法相对于标准物进行测定。用于测定偶联的第一氨基酸残基的实际量的方法在本文中描述。
[0057] 根据本发明，已经发现相对长的肽片段(如肽中间片段SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3序列)的产率和纯度和所得T-1249肽的产率和纯度总是在相对较低的装载系数如0.5或更少下是较高的。然而，当装载系数例如低于0.2时，则产物通量可能受到损害。权衡这些因素，装载系数对于片段1和片段2中的至少一种片段，优选地同时对片段1和片段2在约0.2至约0.50之间，优选地在约0.2至约0.45范围内，并且更优选地约0.2至约
0.40范围内。例如，在一个代表性实践模式中，使用约0.34的装载系数将是适合的。
0.40范围内。例如，在一个代表性实践模式中，使用约0.34的装载系数将是适合的。
[0058] 为说明这个方面，可以开展如下固相方法。得到合适的树脂并通过在适宜的溶剂中洗涤而准备好此树脂。接下来，向经洗涤的树脂添加含有处于可活化且受保护形式的第一氨基酸的溶液。为获得所需范围内的装载系数，可以选择氨基酸的量和/或浓度，和/或其它反应因子如共反应剂如HOBT的存在和浓度、偶联反应的持续期、偶联反应的温度等。
[0059] 利用Fmoc化学的固相合成可以用于制备与树脂偶联的T-1249中间片段(如包括SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的肽中间片段)。在树脂上合成肽中间片段后，使用切割试剂切割肽中间片段以在溶液中产生处于受保护形式下的肽中间片段。随后从树脂中分离肽中间片段。在某些情况下肽中间片段与沉淀剂的接触作为在开展液相偶联之前纯化肽中间片段的手段。
[0060] 使用固相法用于肽合成的方法在本领域是众所周知的。因此，本发明考虑使用任何固相合成法，利用低的装载系数以制备可以在T-1249终产物的制备中使用的肽中间片段。
[0061] 例如，本文中所述的T-1249肽中间片段可以使用标准Fmoc方案通过SSPS技术合成。Fmoc方案例如在Carpin等(1970)，J.Am.Chem.Soc.92(19)：5748-5749；Carpin等(1972)，J.Org.Chem.37(22)：3404-3409，″FmocSolid Peptide Sythesis″，编者Weng C.Chan和Peter D.White.(2000)Oxford University Press Oxford Eng中描述。
[0062] 可以使用适合实施固相肽合成的任何类型的支持物。在优选的实施方案中，支持物包含可以从一种或多种聚合物、共聚物或聚合物的组合中制造的树脂，如聚酰胺、聚磺酰胺、取代的聚乙烯、聚乙二醇、酚醛树脂、多糖或聚苯乙烯。聚合物支持物还可以是对于肽合成中所用的溶剂基本上不可溶的并呈惰性的任何固体。固相支持物一般包括这样的连接部分，其在合成期间与增长的肽偶联并可以在需要的条件下加以切割以从支持物中释放肽。合适的固相支持物可以具有光可切割的、TFA可切割的、HF可切割的、氟化物离子可切割的、还原可切割的；Pd(O)-可切割的；亲核可切割的或自由基可切割的(radically-cleavable)接头。优选的连接部分是在如此条件下可切割的以致于切割的肽仍基本上受到整体保护。
[0063] 在一个优选的合成方法中，肽中间片段在包含三苯甲基的酸敏感固相支持物上合成，优选地在包含具有附加氯基的三苯甲基的树脂上合成，例如2-氯三苯甲基氯化物(2-CTC)树脂(Barlos等(1989)TetrahedronLetters30(30)：3943-3946)。所述树脂的实例还包括三苯甲基氯化物树脂、4-甲基三苯甲基氯化物树脂、4-甲氧基三苯甲基氯化物树脂、4-氨基丁-1-醇2-氯三苯甲基树脂、4-氨甲基苯甲酰基2-氯三苯甲基树脂、3-氨基丙-1-醇2-氯三苯甲基树脂、溴乙酸2-氯三苯甲基树脂、氰基乙酸2-氯三苯甲基树脂、4-氰基苯甲酸2-氯三苯甲基树脂、glicinol2-氯三苯甲基树脂、丙酸2-氯三苯甲基树脂、乙二醇2-氯三苯甲基树脂、N-Fmoc羟胺2-氯三苯甲基树脂、肼2-氯三苯甲基树脂。一些优选的固相支持物包括可以与二乙烯基苯共聚化的聚苯乙烯以形成活性基团所固着的支持物材料。
[0064] 肽材料一般连接在树脂珠上，既在珠子表面，也在珠子内部。Fmoc和侧链受保护的肽使用合适酸性试剂如DCM中的稀TFA或乙酸轻易地从该树脂上在受保护的状态中被切下。
[0065] 可用于固相合成中的其它树脂包括包含苯乙烯与带4-羟甲基苯氧甲基结合团的二乙烯基苯的共聚物的″Wang″树脂(Wang，S.S.1973，J.Am.Chem.Soc)和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂(Richter等(1994)，Tetrahedron Letters35(27)：4705-4706)。Wang树脂、2-氯三苯甲基氯化物树脂和4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸树脂可以从例如Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，California购买。
[0066] 为提供具有偶联的第一氨基酸的支持物，树脂可以例如通过洗涤随后与含有活化的受保护氨基酸的溶液温育进行制备。第一氨基酸和偶联至树脂的后续氨基酸一般包含氨基端保护基、侧链保护基(取决于具体的氨基酸)和与来自树脂的悬空基团起反应的基团，或与未定氨基酸起反应的基团。
[0067] 在优选的方面，第一氨基酸在羧基端与支持物连接，同时根据需要氨基端和侧链基团受到保护基的保护。作为示例性描述，Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2)肽中间片段的固相合成通过向2-氯三苯甲基氯化物(2-CTC)树脂上首先装载受保护的谷氨酸残基从羧基端至氨基端方向得以实施。
[0068] 保护基的性质和使用在本领域是众所周知的。通常，合适的保护基是可以帮助阻止原子或与该原子结合的部分例如氧或氮在加工和合成期间参与不为所需的反应的任何类型基团。保护基包括侧链保护基和氨基保护基或氨基端保护基。保护基还可以阻止羧酸、硫醇等的反应或结合。
[0069] 侧链保护基指与氨基酸的侧链(即氨基酸通式H2N-C(R)(H)-COOH中的R基)偶联的化学部分，其帮助阻止侧链的部分与肽的合成、加工等步骤中所用的化学品起反应。选择侧链保护基可能取决于多种因素，例如开展的合成的类型、肽将进行的加工和所需的中间产物或终产物。侧链保护基的性质还取决于氨基酸本身的性质。通常，选择在固相合成期间在去保护α-氨基期间不被去除的侧链保护基。因此，α-氨基保护基和侧链保护基通常是不相同的。
[0070] 在某些情况下，并取决于在固相合成和肽的其它加工中所用的试剂类型，氨基酸可能不需要侧链保护基的存在。此类氨基酸一般在侧链中不包含活性氧、活性氮或其它活性部分。
[0071] 侧链保护基的实例包括乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、叔丁基、三苯基甲基(三苯甲基)、四氢吡喃基、二苄醚(Bzl)和2，6-二氯苄基(DCB)、叔丁氧羰基(BOC)、硝基、对甲苯磺酰基(Tos)、金刚烷氧羰基、呫吨基(Xan)、苄基、2，6-二氯苄基、甲酯、乙酯和叔丁酯、苄氧羰基(Z)、2-氯苄氧羰基(2-Cl-Z)、Tos、叔戊氧基羰基(Aoc)和芳族或脂族的尿烷型保护基、光不稳定基团如硝基veritryl氧基羰基(NVOC)、以及氟化物不稳定基团，如三甲基甲硅烷基氧基羰基(TEOC)。
[0072] 优选的侧链保护基包括用于Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)氨基酸残基的叔丁基；用于His(H)、Gln(Q)和Asn(N)氨基酸残基的三苯甲基(trt)基团和用于Lys(K)和Trp(W)氨基酸残基的Boc基。
[0073] 例如，表1中所列肽片段的氨基酸残基的任何一个或多个侧链可以用标准保护基如叔丁基(t-Bu)、三苯甲基(trt)和叔丁氧羰基(Boc)加以保护。(t-Bu)基是用于氨基酸残基Tyr(Y)、Thr(T)、Ser(S)和Asp(D)的优选的侧链保护基；(trt)基是用于氨基酸残基His(H)、Gln(Q)和Asn(N)的优选的侧链保护基并且Boc基是用于氨基酸残基Lys(K)和Trp(W)的优选的侧链保护基。
[0074] 优选地，本发明每一肽片段的全部天冬酰胺残基均受到保护。此外，优选色氨酸残基以Boc基保护。
[0075] 氨基端保护基包括与氨基酸的α氨基偶联的化学部分。通常，氨基端保护基在待添加至生长的肽链上的下一个氨基酸添加前在去保护反应中去除，但是当肽从支持物上切下时可以得到维持。选择氨基端保护基可能取决于多种因素，例如所开展合成的类型和所需的中间产物或终产物。
[0076] 氨基端保护基的实例包括(1)酰基型保护基，如甲酰基、烯丙酰(Acr)、苯甲酰基(Bz)和乙酰基(Ac)；(2)芳族尿烷型保护基，如苄氧羰基(Z)和取代的Z，如对氯苄氧羰基，对硝基苄氧羰基、对溴苄氧羰基、对甲氧基苄氧羰基；(3)脂族尿烷保护基，如叔丁氧羰基(BOC)、二异丙基甲氧羰基、异丙氧羰基、乙氧羰基、烯丙氧羰基；(4)环烷基尿烷型保护基，如9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)、环戊基氧羰基、金刚烷氧羰基和环己基氧羰基和(5)硫代尿烷型保护基，如苯基硫羰基。优选的保护基包括9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)、2-(4-联苯基)-丙基(2)氧羰基(Bpoc)、2-苯丙基(2)-氧羰基(Poc)和叔丁氧羰基(Boc)。
[0077] 根据本发明，保护基一般在整个固相合成期间保留在肽中间片段上并且进入并在整个液相偶联反应仍保留在肽中间片段上(通常，在液相偶联步骤结束后，开展去保护步骤以从肽上去除一个或多个保护基)。
[0078] 具有特定保护基的第一氨基酸的具体实例可以分别是FmocGlu(OtBu)OH和FmocTrp(Boc)OH，其中所述第一氨基酸可以与用于合成具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的肽中间片段的树脂偶联。
[0079] 为准备好用于固相合成的树脂，可以在溶剂中对树脂预洗涤。例如，将固相树脂如2-CTC树脂添加至肽室并以合适的溶剂进行预洗涤。可以开展洗涤以便为与待偶联于树脂的第一氨基酸接触而准备好树脂。实质上，可以开展预洗涤以促进第一氨基酸高效偶联于树脂。可以基于偶联反应中所用溶剂(或溶剂混合物)的类型选择预洗涤溶剂或反之亦然。
[0080] 适合于洗涤并还适合于后续偶联反应的溶剂包括二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷(DCE)、二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷等以及这些试剂的混合物。其它有用的试剂包括DMSO、吡啶、氯仿、二噁烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮及其混合物。在某些情况下，偶联可以在二元溶液系统中开展，如DMF和DCM的混合物。
[0081] 如本文中所述，需要将第一α氨基酸在树脂上的装载系数控制在约0.2至约0.50，优选地是约0.2至约0.45，并且更优选地是约0.2至约0.40范围。因此，制备如此的溶液，其具有可提供目标范围内的偶联系数的氨基酸量。在知道偶联效率对于特定反应是多少时，这通常可以确定。例如，当需要具有约0.34的预期装载系数，并且若已知偶联效率是约80％，则应当使用对每克树脂含有0.425mmol氨基酸的偶联溶液(0.34/0.8)。
[0082] 偶联反应可以在增强或改善偶联反应的一种或多种化合物存在下开展。可以提高反应速率并降低副反应速率的化合物包括可以在叔碱例如二异丙基乙胺(DIEA)和三乙胺(TEA)存在下使受保护的氨基酸转换成活化种类(例如BOP、PyBOPO、HBTU和TBTU均生成HOBt酯)的鏻盐和脲盐。其它试剂通过提供保护剂有助于防止外消旋化。这些试剂包括具有添加的辅助亲核体(例如1-羟-苯并三唑(HOBt)、1-羟-氮杂苯并三唑(HOAt)或HOSu)的碳二亚胺(例如DCC或WSCDI)。可以使用的另一种试剂是TBTU。如同氮化物方法，还使用利用含有或不含添加的辅助亲核体的氯甲酸异丁酯的混合酐方法，原因是该方法伴随有低的外消旋化。这些类型的化合物还可以增加碳二亚胺介导性偶联的速率，并防止Asn和Gln残基的脱水。
[0083] 偶联完成可以如本文中所述以定量性茚三酮试验监测。在确定偶联完成后，偶联反应混合物用溶剂洗涤，并且对肽材料中的每一后续氨基酸残基重复偶联循环。在终末偶联循环后，树脂用溶剂如NMP洗涤，并随后用惰性的第二溶剂如DCM洗涤。
[0084] 为偶联后续氨基酸，氨基端保护基(例如，Fmoc基)的去除一般通过用包含在溶剂如N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)中的20-50％(以重量为基础)哌啶的试剂处理而实现。在去除Fmoc保护基后，一般开展数次洗涤以除去残留的哌啶和Fmoc副产物(如二苯并富烯及其哌啶加合物)。
[0085] 在第一氨基酸已经以所需的装载系数与树脂偶联并且氨基端保护基已经去除后，可以添加后续的氨基酸以制备肽中间片段。后续的氨基酸可以相对于该装载系数以化学计量过量的氨基酸加以利用。然而，已发现合成本文中所述的特定T-1249中间片段不需要在固相合成这些片段中使用非常过量的氨基酸(和对应的试剂)。通常，偶联步骤中所用氨基酸的量至少等于第一氨基酸在树脂上的装载系数(1当量或更多)。优选地，偶联步骤中所用氨基酸的量是1.3当量(0.3过量)或更多，并且最优选地是约1.5当量(0.5过量)。在某些情况下，例如，偶联步骤利用范围在1至1.5之间(大于1而小于1.5)的氨基酸的数量当量。
[0086] 已经发现这种过量的氨基酸(例如约1.5)对偶联反应进行至结束是足够的。这种过量还有助于反应耐受来自去保护剂的过量碱。
[0087] 可以重复偶联步骤、洗涤步骤、氨基端保护基去保护步骤和洗涤步骤直至形成所需的T-1249中间产物。
[0088] 在固相合成后并且为了从树脂上移走T-1249中间肽，切割处理以如此方式实施以致于已切割的T-1249中间肽仍携带足够的侧链保护基和末端保护基。在原来位置上保留保护基有助于阻止在切割期间或切割之后不需要的肽片段偶联或其它不需要的反应。当使用FMOC或相似的化学以合成肽时，受保护的切割可以以任何所需要的方式完成，如通过使用相对弱的酸试剂如乙酸或在溶剂如DCM中的稀TFA，其还可以使树脂溶胀用于切割和分离过程。优选使用在DCM中的0.5至10重量百分比、优选地是1至3重量百分比的TFA。见例如美国专利第6,281,335号。
[0089] 从固相树脂上切下肽中间片段的步骤可以沿着如下示例性方法的路径进行。然而，可以使用从树脂上有效地切下肽中间片段的任何合适方法。例如，向容器添加大约5至20体积、优选地是约10体积的含有酸性切割试剂的溶剂。树脂珠子随后浸泡于该试剂内。
当液体内容物在合适的温度搅拌合适时间长度后，进行切割反应。搅拌有助于防止珠子结块。合适的时间和温度取决于如所用的酸性试剂、肽的性质、树脂的性质等因素。作为一般指导，在从约-15℃至约5℃、优选地从约-10℃至约0℃搅拌约5分钟至2小时、优选地是约25分钟至约45分钟是合适的。切割时间可以是从约10分钟至约2小时。对于大规模生产，优选的切割时间是从约15分钟至50分钟。切割在这样的冷却温度范围内受欢迎地实施以致于容纳了通常可能在反应期间出现的反应热。此外，较低的切割反应温度防止在此阶段去除酸敏感侧链保护基如trt基。
当液体内容物在合适的温度搅拌合适时间长度后，进行切割反应。搅拌有助于防止珠子结块。合适的时间和温度取决于如所用的酸性试剂、肽的性质、树脂的性质等因素。作为一般指导，在从约-15℃至约5℃、优选地从约-10℃至约0℃搅拌约5分钟至2小时、优选地是约25分钟至约45分钟是合适的。切割时间可以是从约10分钟至约2小时。对于大规模生产，优选的切割时间是从约15分钟至50分钟。切割在这样的冷却温度范围内受欢迎地实施以致于容纳了通常可能在反应期间出现的反应热。此外，较低的切割反应温度防止在此阶段去除酸敏感侧链保护基如trt基。
[0090] 在切割处理结束时，例如通过向容器添加合适的碱(如吡啶等)使反应猝灭，并继续搅拌并搅拌额外的时间长度如额外的5分钟至2小时，优选地是约20分钟至约40分钟。碱的添加和连续搅拌引起容器内容物的温度上升。在搅拌结束时，容器内容物的温度可以是从约0℃至约15℃，优选地约5℃至约10℃。
[0091] 如使树脂溶胀并收缩以改善肽回收方面的因素可以任选地掺入整个合成方法中。
[0092] 例如，切割后，支持物可以任选地用溶胀试剂洗涤一次或多次以将切割的肽提取至得到的洗液内，并且收集该洗液以便从这些洗液中回收肽。例如，使用在DCM中的稀TFA从2-CTC树脂上切割肽将还构成全部或部分的溶胀处理。在切割后并在溶胀处理结束后，可使支持物接受任选的一种或多种收缩性洗涤处理，其中所述收缩性洗涤允许额外量的肽从该收缩性洗液中回收并增强从任选的一种或多种后续的收缩性洗液中回收额外肽的能力。可以在收缩处理结束后实施构成额外溶胀处理的后续的任选溶胀性洗涤。
[0093] 因为可以使用溶胀溶剂如DCM作为切割试剂中的成分，切割处理还可以构成第一溶胀处理，在其中显著量的切割的肽将被提取至液体内。当以DCM中的TFA溶胀时，珠子体积总是在切割处理开始时最大。珠子仍是溶胀的，但是当肽提取至液体内，珠子的体积缩小。
[0094] 在猝灭后，倒出并收集容器内容物以回收提取至洗液内的肽。可以使用压力以迫使含有肽材料的液体混合物通过滤器并流出容器，其中所述肽材料由液体携带。留在容器内的珠子仍含有残余DCM并仍将溶胀至某种程度。显著量的残余肽也总是留在珠子内，并且后续的收缩处理和溶胀处理有助于回收大部分的残余肽。
[0095] 作为选择，可能需要在通过蒸馏等浓缩前用水洗涤所收集的切割试剂，通常在某种浓缩已经实现后。认为在切割后的水洗涤对提高肽质量并且因此某种程度上对提高产率有用。认为水洗涤有助于去除残余的TFA及其副产物。在水洗涤/提取处理后，液体混合物可以转移至蒸馏装置中，在其中通过除去例如DCM等进一步浓缩混合物。
[0096] 在从容器中倒出并收集切割的混合物用于肽回收后，容器内容物可以接受一次或多次额外的溶胀洗涤，额外的肽可以被提取至其中并随后得以回收。这些额外的溶胀洗涤还有助于洗涤容器并去除残留的切割试剂和副产物。在收缩处理进行前，需要去除此类成分以致于收缩液体将不与它们起反应。例如，需要在添加含有乙醇的收缩液体前从容器中去除TFA，因为乙醇可以与TFA起反应。常规的溶胀洗涤处理可以以搅拌约2分钟至2小时，优选地是约10分钟至约50分钟时间进行。在洗涤完成后，洗液从容器中移出并随后与其它的溶胀洗液一起添加至蒸馏容器。任选地，在添加至蒸馏罐前，这些额外的溶胀洗液(若有的话)可以接受水提取处理以去除杂质。
[0097] 在某些方面，肽中间片段可以通过开展增强其纯度的步骤例如通过结晶而为液相偶联加以制备。一种或多种T-1249肽中间片段可以以含有IPA的溶液如IPA与DCM或IPA与水的混合物加以处理以结晶肽中间片段。
[0098] 在固相合成、从树脂上切割和任何地洗涤或纯化肽中间体后，使具有序列KNEYELQKLDKWASLWEW(SEQ ID NO：3)的肽中间片段与苯丙酰胺(F-NH2)残基起反应以产生具有序列KNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：4)的肽中间片段。这种液相反应可以如本文中所述在合适的液相反应溶液内开展。这种肽中间产物可以沉淀于非溶剂(例如水)内并得以洗涤以改善纯度。
[0099] 在溶液中T-1249的侧链受保护的肽中间片段
[0100] Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE(SEQ ID NO：2)与KNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：4)偶联起来以形成具有Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SEQ ID NO：1)的全长T-1249肽。这些肽中间片段按化学方式排列，其中KNEYELQKLDKWASLWEWF肽中间片段的氨基端与Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQE肽片段的羧基端偶联。
[0101] 优选地，向偶联反应提供基于HPLC特性的纯度水平是80％或更高，或更优选地是82.5％，并且最优选地是85％或更高的肽。根据本发明的方法，采用低装载系数的固相合成是制备具有较高纯度水平的T-1249肽中间片段的主要方面。
[0102] 肽偶联反应在例如New Trends in Peptide Coupling Reagents；Albericio，Fernando；Chinchilla，Rafeal；Dodsworth，David J.；以 及 Najera，Armen；Organic Prepearations and Procedures International(2003)，33(3)，203-303中综述。
[0103] 肽中间片段的偶联可以使用原位(in situ)偶联试剂例如BOP、邻(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、HATU、二环己基碳二亚胺(DCC)、水溶性碳二亚胺(WSCDI)或邻(苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)实施。其它偶联技术可以使用活性酯如羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和对硝基苯酚(HONp)酯；使用对称酐；N-羧基酐(NCA)；或酰基卤如酰氟和酰氯开展。
[0104] 可在偶联反应中使用合适的偶联溶剂。可以理解的是所用的偶联溶剂可以影响已形成的肽键的外消旋化程度、肽和/或肽片段的溶解度以及偶联反应速率。
[0105] 在一些实施方案中，偶联反应包括水混溶性溶剂。水混溶性溶剂的实例包括例如DMSO、吡啶、氯仿、二噁烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、N-甲基吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、二噁烷或其混合物。
[0106] 在另一些实施方案中，偶联反应包括非水混溶性溶剂。示例的非水混溶性溶剂是二氯甲烷。在这些实施方案中，非水混溶性溶剂优选地与去保护反应相容；例如若使用非水混溶性溶剂，这种非水混溶性溶剂优选地没有不利地影响去保护反应。
[0107] 在肽中间片段已经得以偶联以产生T-1249肽后，产物可以接受去保护步骤处理以去除侧链保护基。
[0108] 通过整体去保护去除侧链保护基一般利用包含切割侧链保护基的酸解剂的去保护溶液。用于整体去保护的常用酸解剂包括纯的三氟乙酸(TFA)、HCl、路易斯酸如BF3Et2O或Me3SiBr、液体氢氟酸(HF)、溴化氢(HBr)、三氟甲烷硫酸和其组合。去保护溶液还包括一种或多种合适的阳离子清除剂，例如二硫苏糖醇、茴香醚、对甲酚、乙二硫醇或二甲基硫化物。去保护溶液还可以包括水。如本文中所用，存在于去保护组合物内的试剂的量一般以如此比率表述，其中单个成分的量表述为“份”如“重量份”或“体积份”中的分子并且分母是组合物中的总份数。例如，含有比例为90∶5∶5(重量/重量/重量)TFA∶H2O∶DTT的去保护溶液含有90/100重量份的TFA、5/100重量份的H2O和5/100重量份的DTT。
[0109] 在一些实施方案中，可以开展这样的去保护反应，其中去保护组合物中的酸解剂(优选地是TFA)的量大于90/100重量份。其它优选的去保护组合物包括如此量的酸解剂，即量为93/100重量份或更多或量在93/100重量份至95/100重量份范围内。
[0110] 在T-1249肽已经得以去保护并且是最终形态后，批次肽可以任选地接受如此方法的处理，即该方法使在整个合成方案的这个阶段可能出现的聚集的肽解聚集。
[0111] 可以如此开展解聚集，即通过在含水的碱内溶解肽样品并随后酸化这种含水的混合物以便在至少一种盐和共溶剂存在下使肽沉淀。优选地，盐和共溶剂可以存在于解聚集溶液内。解聚集可以通过在相对的低温下相对迅速地(至少在酸化的第一阶段，其中碱性介质的pH降低至6至7.5的范围内，此后酸化至最终所需要的pH例如3至6可以更缓慢地进行)使肽沉淀得以实施。
[0112] 用于解聚集的缓冲的碱性水溶液通常衍生自包含水、至少一种盐和足量的至少一种碱以提供所需的溶解pH的成分。T-1249肽和组成缓冲的碱性水溶液的多种成分可以以任意顺序组合。在一个实践模式中，自溶液的组成成分制备溶液并且随后向已制备的溶液添加肽。在另一个实践模式中，肽可以添加至包含盐的水溶液内，其中该溶液具有低到溶解不发生的pH。随后向该混合物添加碱以便使pH升高至溶解会发生的值。仍作为又一个替代，盐可以在溶解前、溶解期间和/或溶解后添加至溶液中。然而，盐通常在以如以下进一步所述的方式降低pH以引起肽沉淀前加入溶液。
[0113] 溶液中肽的浓度可以大幅度变化。作为一般指导，溶液中T-1249肽浓度的范围可以是约3g/L至约6g/L。
[0114] 多种形式的一种或多种碱可以加入溶液以提供所需的pH。合适碱的代表性实例包括氢氧化物碱，如NaOH和碳酸氢盐和碳酸盐碱，如碳酸氢钠或碳酸氢钾或者碳酸钠或碳酸钾。优选氢氧化钠，尤其是0.5N至1NNaOH。使用碱以调节pH至在合理的时间量中肽将溶解于溶液内的值。对于众多肽，该值对应于约8至约11的溶解pH。
[0115] 溶液的盐成分改善了所得的沉淀肽的溶解特征。具体而言，当盐以适宜浓度存在时，可更一致地制备轻易地溶解于较低pH水溶液中的可溶性肽。
[0116] 本发明的实践中将使用多种盐。盐的实例包括碳酸钠、乙酸钠、碳酸铵、乙酸铵、碳酸氢钠、碳酸氢铵、这些盐的钠盐和钾盐、这些盐的组合等。最优选乙酸铵。
[0117] 溶液中盐的浓度可以大幅度变化。使用1至200mM当量的盐将是适合的盐浓度范围的一个实例。在具体的实践模式中，发现使用约5mM至约50mM，更优选地约10mM当量的盐、尤其乙酸铵是合适的。
[0118] 溶解温度通常指肽在其中溶解的水溶液的温度。溶解可以在任何合适的温度下进行。通常，将优选在维持于约10℃至约30℃、优选地是约10℃至约25℃、更优选地是约15℃至约20℃范围内一个或多个温度下的溶液内溶解肽。
[0119] 优选地向溶液加入共溶剂以致随后肽的沉淀在共溶剂存在下进行。共溶剂可以在溶解之前、期间和/或之后添加至溶液，但是优选地在溶解肽后迅速加入。共溶剂指一种或多种额外的溶剂，在其中肽在溶解pH处是可溶解的。优选地，当使肽充分地解聚集以致于肽的测量分子量与肽的理论分子量的比例在约2∶1至约1∶1范围内时，肽也可溶解于25℃和生理pH下的共溶剂内。共溶剂的实例包括乙腈、甲醇、它们的组合等等。
[0120] 在本发明的优选实施方案中，向溶液中添加足量的共溶剂以致于溶液含有约2至50体积百分数、优选地约5至约30体积百分数并且更优选地约10至约20体积百分数的共溶剂。
[0121] 溶解后，并且受欢迎地在添加共溶剂后，任选地还通过添加额外的碱升高溶液的pH以便根据需要促进肽的进一步解聚集。溶液随后受欢迎地立即进行过滤。经过0.2微米滤器的压力过滤是合适的。滤液任选地在真空下脱气，此后溶液可以在接受其它加工前老化合适的时间以便完成解聚集过程。通常，肽如此进行老化以致于肽在升高的pH处的总时间(不仅包括老化时间，还包括过滤时间、脱气时间等)范围是约5分钟至约6小时，更优选地是约30分钟至约2小时。老化后，溶液可以任选地再次进行过滤。
[0122] 老化后，在有效地引起肽沉淀的条件下使溶液pH降低，例如酸化。作为一般指导，范围从约3至约6、优选4至约6的终末pH可能是适合的。作为具体的实例，对于T-1249肽需要5.3至5.5的终末pH。
[0123] 溶液的pH优选地通过向溶液添加一种或多种酸得以降低。酸的实例包括HCl、硫酸、乙酸、草酸、这些酸的组合等等。优选乙酸。例如，已发现5％或10％的乙酸水溶液是适合的。
[0124] 在一些实践模式中，如果相对快速地添加酸以便将pH仅降低至中间pH，则仍然可以得到具有优秀溶解特性的肽产物。在此后，再次以较低的速率添加酸以降低溶液的pH至所需的终末pH。合适的中间pH值范围可能是从约6至约8、更优选地是约6.0至约7.5。受欢迎的是最初快速降低pH在少于约1小时、优选地30分钟或更少、更优选地15分钟或更少的时间段内进行。
[0125] 例如，一个合适的实践模式包括降低pH最初是11的T-1249溶液的pH。相对快速地在10分钟时间内添加足量的酸以使pH降低至中间值约6.0。随后经过10分钟至20分钟较缓慢地添加酸以使pH降低为5.3至5.5。
[0126] 混合物受欢迎地在酸添加期间得到充分混合以引起肽的沉淀。作为一般指导，优选在添加酸时尽可能快速地搅拌混合物，同时留下足够安全性富余，避免使混合物起泡沫。
[0127] 添加酸以引起肽的沉淀可以使用在任何合适温度下的溶液实施。作为指导，在10℃至30℃、优选地是15℃至25℃、最优选地是16℃至18℃的温度范围实施沉淀是合适的。
[0128] 在沉淀后，肽需要在与其它成分组合前加以分离并干燥、冻干、包装、贮藏、进行其它加工和/或用其它方法操作。根据一个合适的方法，肽通过过滤收集、以大量水洗液进行洗涤以使最终的盐浓度减少至合适水平，并随后进行干燥。
[0129] 若肽以不适合过滤的形态沉淀(例如当沉淀物呈“凝胶样”)，沉淀物可以接受老化过程处理，同时加以合适搅拌，在搅拌中使肽颗粒结团以“硬化”颗粒。
[0130] 在优选的实践模式中，这种老化-硬化处理包括在冷却/加热/冷处理期间用搅拌使肽老化。该处理改善肽的过滤特征而没有过度地损坏肽的三级结构。在具体的实践模式中，处理包括使颗粒在含水的混合物中在低于环境温度的第一温度下老化5分钟至48小时、优选地30分钟至8小时、更优选地是30分钟至2小时，其中所述的第一温度优选地是高于0℃至约20℃，优选地是10℃至20℃，更优选地是约16℃。需要利用搅拌以确保老化期间颗粒充分地分散。
[0131] 接下来，混合物的温度升高约2℃至约30℃，优选地约5℃至约15℃而升高至中度较温暖的温度，其中转换至较温暖的温度在搅拌的同时经过约1分钟至约48小时，优选地5分钟至8小时，更优选地20分钟至2小时进行。优选地，新的中等较温暖的温度仍为环境温度或低于环境温度。在具体实践模式中，发现在约1小时内将温度从16℃升高至21℃是适合的。在这种温度转换期间希望连续搅拌。混合物随后在较温暖的温度处老化5分钟至8小时，优选地是20分钟至4小时，更优选地约3小时，伴随搅拌。
[0132] 在这个老化步骤后，混合物的温度降低约2℃至约30℃、优选地约5℃至约15℃而降低至中度较凉的温度，其中转换至较凉的温度在搅拌的同时经过约1分钟至约48小时、优选地5分钟至8小时、更优选地20分钟至4小时进行。优选地，新的中等较凉的温度是在高于约3℃至约18℃的范围，更优选地是约10℃。在具体实践模式中，发现在约2小时内将温度从21℃降低至10℃是适合的。混合物随后在较凉的温度优选地进一步老化5分钟至48小时，更优选地是约6小时。
[0133] 这种老化处理改善了沉淀的颗粒的过滤特征以致于更容易地从滤液中过滤和分离肽颗粒，而没有不当地改变肽的二级结构。
[0134] 因此，在这种老化后，过滤沉淀物，优选地进行加压过滤，如1psig N2加压过滤。滤饼可以用水洗涤一次或多次，所述的水受欢迎地被预冷至温度范围约3℃至约20℃，优选地5℃至约15℃、更优选地约10℃。这有助于降低滤饼的盐含量，然后滤饼可以部分地或完全地得到干燥，例如通过使合适温度的氮气穿过滤饼持续合适的时间段，如1分钟至48小时、优选地是5分钟至8小时、更优选地是约6小时。使用在大约环境温度下的氮气是便利和适合的。可以定期地混匀滤饼以促进干燥。干燥任选地可以在独立的干燥装置内完成。此类任选的干燥优选地在真空例如小于40毫巴下在合适的温度进行以致于不降解肽，例如低于约30℃、优选地是低于约28℃的温度。
[0135] 本发明的原理现在以如下说明性实施例进一步进行说明。实施例
[0136] 对于如下实施例，采用如下标准试剂和命名：
[0137] 氯醌试验：氯醌试验溶液通过添加一滴甲苯中的氯醌饱和溶液至约1ml丙酮内制备。NMP洗涤物通过添加一滴洗涤物至氯醌试验溶液进行测试。蓝色或紫色是存在仲胺的阳性指示，表明Fmoc去保护的副产物和/或残余的哌啶仍存在。
[0138] 茚三酮(Reiser)试验：在定量性茚三酮试验中，抽取2-20mg树脂样品，并且用NMP洗涤和随后用DCM或甲醇洗涤。向样品添加三滴在乙醇中76％的苯酚溶液、六滴在吡啶中的0.2mM KCN溶液和三滴在乙醇中的0.28M茚三酮溶液，并将样品在约100℃的加热块内放置约5分钟。取出样品并立即以乙醇/水溶液(9∶1)稀释。蓝色或紫色是存在游离胺的阳性指示，表明偶联反应仍未完成。如果在偶联反应1小时后观察到阳性茚三酮试验，偶联反应继续进行额外一小时。如果阳性茚三酮试验在偶联反应3小时后出现，则倒空容器，并使用约1当量的活化氨基酸和试剂重复进行偶联。
[0139] 实施例1
[0140] 制备Fmoc-Glu(OtBu)-填充的2-CTC树脂
[0141] 向经氮气清洗的1L肽反应器填充40g 2-CTC树脂和400ml DCM。在25±2℃搅拌30分钟。同时，向1L烧瓶填充9.7g Fmoc-Glu(OtBu)OH、280ml DMF、40ml DCM和5.5g DIEA。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体。
[0142] 从反应器排流DCM并填充以上制备的Fmoc-Glu(OtBu)OH溶液。混合物在25±2℃搅拌2小时并将反应器排流。
[0143] 向反应器填充DIEA∶MeOH(40∶360ml)的混合物。内容物在25±2℃搅拌1小时并将反应器排流。
[0144] 树脂床用1×400ml DMF、1×200ml DMF和4×400ml DCM洗涤。通过阴性UV试验检测最后的洗液
[0145] 树脂床用3×400ml异丙醇洗涤。在40±2℃真空干燥树脂至恒定重量。
[0146] 产量：48.9g
[0147] 装载系数分析：0.44mmole/g
[0148] 实施例2
[0149] 固相合成T-1249中间片段Ac-AA(1-20)OH(SEQ ID NO：2)
[0150] 向SPPS室填充25.0g Fmoc-Glu(OtBu)-O-2-CTC(实施例1)树脂和250ml DCM。混合物在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并用3×150mlNMP洗涤树脂床。向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。
[0151] 向烧瓶填充10.1g Fmoc-Gln(Trt)OH、2.82g 6-氯HOBT、2.45g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0152] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Gln(Trt)OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0153] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0154] 向烧瓶填充10.1g Fmoc-Gln(Trt)OH、2.84g 6-氯HOBT、2.45g DIEA和80ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0155] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Gln(Trt)OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0156] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0157] 向烧瓶填充5.83g Fmoc-Ile-OH、2.84g 6-氯HOBT、2.42g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0158] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Ile-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150ml NMP洗涤树脂床。
[0159] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0160] 向烧瓶填充11.75g Fmoc-Gln(Trt)OH、3.3g 6-氯HOBT、2.84g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0161] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Gln(Trt)OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0162] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0163] 向烧瓶填充5.45g Fmoc-Ala-OH、3.3g 6-氯HOBT、2.85g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0164] 在独立的烧瓶中填充6.18g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Ala-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150ml NMP洗涤树脂床。
[0165] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0166] 向烧瓶填充11.75g Fmoc-Gln(Trt)OH、3.2g 6-氯HOBT、3.1g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0167] 在独立的烧瓶中填充7.9g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Gln(Trt)OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0168] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0169] 向烧瓶填充8.2g Fmoc-Glu(OtBu)OH、3.2g 6-氯HOBT、2.84g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0170] 在独立的烧瓶中填充6.18g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Glu(OtBu)OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0171] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0172] 向烧瓶填充5.83g Fmoc-Leu-OH、2.8g 6-氯HOBT、2.42g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0173] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Leu-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。烧瓶以50ml DCM洗涤并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150ml NMP洗涤树脂床。
[0174] 将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0175] 向烧瓶填充5.83g Fmoc-Leu-OH、2.8g 6-氯HOBT、2.42g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0176] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Leu-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150ml NMP洗涤树脂床。
[0177] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0178] 向烧瓶填充5.14g Fmoc-Ala-OH、2.8g 6-氯HOBT、2.42g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0179] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Ala-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150ml NMP洗涤树脂床。
[0180] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0181] 向烧瓶填充6.6g Fmoc-Thr(tBu)-OH、2.8g 6-氯HOBT、2.42g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0182] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-The(tBu)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0183] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0184] 向烧瓶填充5.83g Fmoc-Ile-OH、2.8g 6-氯HOBT、2.42g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0185] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Ile-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150ml NMP洗涤树脂床。
[0186] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0187] 向烧瓶填充7.73g Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.8g 6-氯HOBT、2.42g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0188] 在独立的烧瓶中填充5.3g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Lys(Boc)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0189] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0190] 向烧瓶填充13.44g Fmoc-Gln(Trt)-OH、3.73g 6-氯HOBT、3.13gDIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0191] 在独立的烧瓶中填充7.06g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Gln(Trt)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0192] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0193] 向烧瓶填充9.36g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、3.73g 6-氯HOBT、3.13gDIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0194] 在独立的烧瓶中填充7.06g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Glu(OtBu)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0195] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0196] 向烧瓶填充11.6g Fmoc-Trp(Boc)-OH、3.73g 6-氯HOBT、3.13g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0197] 在独立的烧瓶中填充7.06g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Trp(Boc)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0198] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0199] 向烧瓶填充9.36g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、3.73g 6-氯HOBT、3.13gDIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0200] 在独立的烧瓶中填充7.06g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Glu(OtBu)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0201] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0202] 向烧瓶填充13.44g Fmoc-Gln(Trt)-OH、3.73g 6-氯HOBT、3.13gDIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0203] 在独立的烧瓶中填充7.06g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Gln(Trt)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0204] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0205] 向烧瓶填充11.6g Fmoc-Trp(Boc)-OH、3.73g 6-氯HOBT、3.13g DIEA和113ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0206] 在独立的烧瓶中填充7.06g TBTU和68ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Trp(Boc)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用50ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×150mlNMP洗涤树脂床。
[0207] 向反应器填充125ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充125ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×150ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0208] 向烧瓶填充5.62g乙酐、7.11g DIEA和100ml NMP。该溶液经混合并冷却至10℃。添加冷却的乙酐溶液至SPPS反应器内，用50ml NMP淋洗烧瓶并添加洗浆至反应器内。混合物在30±3℃搅拌1小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用5×180ml NMP洗涤树脂床。用5×180ml DCM、5×180ml异丙醇洗涤树脂床。树脂在40±2℃真空干燥。
[0209] 产量：57.83g
[0210] 实施例3
[0211] 自固相树脂切下并纯化Ac-AA(1-20)OH(SEQ ID NO：2)
[0212] 向SPPS反应器填充30g的以上已建成的树脂和300ml DCM。在环境温度搅拌约5分钟。将反应器排流并重复DCM洗涤多于一次。冷却反应器至-10±5℃。
[0213] 制备6ml三氟乙酸和294ml DCM的溶液。冷却溶液至0±5℃。
[0214] 将冷却的TFA溶液填充至反应器并在0±5℃搅拌浆液45分钟。添加7.6ml吡啶并在0±5℃搅拌额外5分钟。将反应器排流并在环境温度用1×300ml DCM和6×200ml DCM洗涤树脂床。用200ml水洗涤DCM溶液。浓缩DCM溶液至约40ml体积并添加300ml异丙醇。在50mm真空中蒸馏4小时去除DCM。产物经过滤，用2×100ml异丙醇(23ml)洗涤并在40±2℃真空干燥。
[0215] 产量：14.1g(54.1％)。从母液中得到第二批产物7.85g(30.1％)。
[0216] 实施例4
[0217] 制备FmocTrp(Boc)-填充的2-CTC树脂
[0218] 开展方法以制备FmocTrp(Boc)-填充的2-CTC树脂。
[0219] 向经氮气清洗的1L肽反应器填充40g 2-CTC树脂和400ml DCM。在25±2℃搅拌30分钟。与此同时，向1L烧瓶填充12.66gFmoc-Trp(Boc)OH、280ml DMF、40ml DCM和5.7g DIEA。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体。
[0220] 从反应器中排流DCM并填充以上已制备的Fmoc-Trp(Boc)OH溶液。混合物在25±2℃搅拌2小时并将反应器排流。
[0221] 向反应器填充DIEA∶MeOH(40∶360ml)的混合物。内容物在25±2℃搅拌1小时并将反应器排流。
[0222] 用400ml DMF、200ml DMF和3×400ml DCM洗涤树脂床。为阴性UV试验检测最后的洗液。
[0223] 用3×400ml NMP洗涤树脂床并向反应器填充275ml在NMP中的20％哌啶。在28±2℃搅拌混合物30分钟。将反应器排流并再次重复此步骤30分钟。将反应器排流并用5×300ml NMP、5×300ml DCM和3×300ml异丙醇洗涤树脂床。树脂在40±2℃真空干燥至恒定重量。
[0224] 产量：47.4g
[0225] 装载系数分析：0.4mmole/g
[0226] 实施例5
[0227] 固相合成T-1249中间片段Fmoc-AA(21-38)OH(SEQ ID NO：3)
[0228] 向SPPS室填充20.0g的H-Trp(Boc)-O-2-CTC树脂(实施例4)和200ml DCM。混合物在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并用3×120mlNMP洗涤树脂床。
[0229] 向烧瓶填充5.14g Fmoc-Glu(OtBu)OH、2.1g 6-氯HOBT、1.81g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0230] 在独立的烧瓶中填充3.88g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Glu(OtBu)OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0231] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0232] 向烧瓶填充6.33g Fmoc-Trp(Boc)OH、2.04g 6-氯HOBT、1.77g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0233] 在独立的烧瓶中填充3.86g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Trp(Boc)OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0234] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0235] 向烧瓶填充4.26g Fmoc-Leu-OH、2.04g 6-氯HOBT、1.81g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0236] 在独立的烧瓶中填充3.87g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Leu-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用3×120ml NMP洗涤树脂床。
[0237] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0238] 向烧瓶填充4.62g Fmoc-Ser(tBu)-OH、2.06g 6-氯HOBT、1.8g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0239] 在独立的烧瓶中填充3.88g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Ser(tBu)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用3×120mlNMP洗涤树脂床。
[0240] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0241] 向烧瓶填充3.75g Fmoc-Ala-OH、2.05g 6-氯HOBT、1.76g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0242] 在独立的烧瓶中填充3.89g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Ala-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用3×120ml NMP洗涤树脂床。
[0243] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0244] 向烧瓶填充6.32g Fmoc-Trp(Boc)-OH、2.06g 6-氯HOBT、1.82gDIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0245] 在独立的烧瓶中填充3.87g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Trp(Boc)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0246] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0247] 向烧瓶填充5.64g Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.06g 6-氯HOBT、1.79gDIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0248] 在独立的烧瓶中填充3.87g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Lys(Boc)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0249] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。以4×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0250] 向烧瓶填充4.95g Fmoc-Asp(OtBu)-OH、2.09g 6-氯HOBT、1.76gDIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0251] 在独立的烧瓶中填充3.88g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Asp(OtBu)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24mlDCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120ml NMP洗涤树脂床。
[0252] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0253] 向烧瓶填充4.25g Fmoc-Leu-OH、2.09g 6-氯HOBT、1.78g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0254] 在独立的烧瓶中填充3.86g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Leu-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120ml NMP洗涤树脂床。
[0255] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0256] 向烧瓶填充6.40g Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.33g 6-氯HOBT、2.13gDIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0257] 在独立的烧瓶中填充4.41g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Lys(Boc)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0258] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0259] 向烧瓶填充8.35g Fmoc-Gln(Trt)-OH、2.33g 6-氯HOBT、2.09g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0260] 在独立的烧瓶中填充4.38g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Gln(Trt)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0261] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0262] 向烧瓶填充4.83g Fmoc-Leu-OH、2.33g 6-氯HOBT、2.06g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0263] 在独立的烧瓶中填充4.37g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Leu-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用3×120ml NMP洗涤树脂床。
[0264] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0265] 向烧瓶填充5.81g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.35g 6-氯HOBT、2.08gDIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0266] 在独立的烧瓶中填充4.39g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Glu(OtBu)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0267] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0268] 向烧瓶填充6.29g Fmoc-Tyr(OtBu)-OH、2.33g 6-氯HOBT、2.11gDIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0269] 在独立的烧瓶中填充4.39g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Tyr(OtBu)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用3×120mlNMP洗涤树脂床。
[0270] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0271] 向烧瓶填充5.81g Fmoc-Glu(OtBu)-OH、2.34g 6-氯HOBT、2.06gDIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0272] 在独立的烧瓶中填充4.37g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Glu(OtBu)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0273] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。用5×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0274] 向烧瓶填充8.13g Fmoc-Asn(Trt)-OH、2.32g 6-氯HOBT、2.17g DIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0275] 在独立的烧瓶中填充4.37g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Asn(Trt)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时.为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。一旦反应完成，将反应器排流并用4×120mlNMP洗涤树脂床。
[0276] 向反应器填充100ml在NMP中的20％哌啶并在30±3℃搅拌30分钟。将反应器排流并填充100ml在NMP中的20％哌啶。混合物在30±3℃搅拌30分钟并将反应器排流。以4×120ml NMP洗涤树脂床。采集最后的洗液用于通过定量性茚三酮试验测定哌啶水平。
[0277] 向烧瓶填充6.38g Fmoc-Lys(Boc)-OH、2.33g 6-氯HOBT、2.16gDIEA和54ml NMP。内容物在环境温度下搅拌以溶解固体并随后冷却至10℃。
[0278] 在独立的烧瓶中填充4.39g TBTU和32ml NMP。在环境温度下搅拌以溶解固体并冷却至10℃。添加冷却的TBTU溶液至Fmoc-Lys(Boc)-OH溶液并且将该溶液填充至SPPS反应器。用24ml DCM洗涤烧瓶并且将洗液填充至SPPS反应器。混合物在30±3℃搅拌3小时。为确定反应的完成(Keiser试验)对树脂珠采样。Kaiser试验显示不完全的反应。树脂床用30ml NMP中的2.83g Fmoc-Lys(Boc)OH、1.04g 6-氯HOBT、1.01g DIEA处理。添加22ml NMP中的1.94g TBTU的溶液并且将混合物额外搅拌3小时并采样。一旦反应完成，将反应器排流并用5×120ml NMP洗涤树脂床。用6×120ml DCM、4×120ml异丙醇洗涤树脂床。在40±2℃真空干燥树脂。
[0279] 产量：46.77g
[0280] 实施例6
[0281] 自固相树脂切下并纯化Fmoc-AA(21-38)OH(SEQ ID NO：3)
[0282] Fmoc-Lys-Asn-Glu-Tyr-Glu-Leu-Gln-Lys-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Glu-Trp-O-2-CTC树脂[片段Fmoc-AA(21-38)O-2-CTC树脂]的切割
[0283] 向SPPS反应器填充200ml的2％v/v三氟乙酸/DCM溶液。溶液冷却至0±5℃并添加20.02g的Fmoc-AA(21-38)-O-2-CTC树脂。搅拌混合物45分钟。添加5.1ml吡啶并加温混合物至环境温度。将反应器排流并用7×100ml DCM洗涤树脂床。用2×250ml水洗涤合并的DCM洗液。在真空下浓缩DCM溶液至约250ml体积。添加250ml庚烷并继续蒸馏直至收集额外的200ml馏出液。添加250ml庚烷并继续蒸馏直至产生沉淀。产物经过滤并用3×50ml庚烷洗涤。潮湿的滤饼在250ml庚烷中混悬，并在环境温度搅拌30分钟。产物经过滤并用2×75ml庚烷洗涤。真空干燥产物。
[0284] 产量：12.34g(89.8％)
[0285] 实施例7
[0286] 液相合成H-AA(21-39)NH2(SEQ ID NO：4)
[0287] 通过PheNH2与Fmoc-AA(21-38)OH的液相偶联制备T-1249中间片段H-AA(21-39)NH2。
[0288] H-AA(21-39)NH2的制备以3.00g Fmoc-AA(21-38)OH开始加以实施。如实施例6中所述的Fmoc-AA(21-38)OH(3.00g)、PheNH2-HCl(0.74g，3.68mmol，1.3当量)和6-氯HOBT(0.96g，5.66mmol，2.0当量)溶解于DMF(100ml，8.3体积)。溶液冷却至-10℃并添加在DMF(5ml，3.6体积)中的DIEA(1.4ml，7.92mmol，2.8当量)。添加一份TBTU(1.2g，
3.68mmol，1.3当量)，随后添加DMF(15ml)树脂。反应混合物在-10℃搅拌过夜并加温至环境温度。搅拌继续进行额外的4小时。反应的完成通过HPLC分析监测，该分析显示存在
0.4％最初的Fmoc-AA(21-38)OH。添加哌啶(1.23ml，14.43mmol，5.1当量)并在30℃搅拌溶液3小时。去除Fmoc的完成通过HPLC分析监测，该分析显示Fmoc-AA(21-38)NH2＜1％。
添加水(100ml，8.3体积)以沉淀产物。固体通过抽吸过滤收集，用水洗涤。在环境温度过夜干燥提供11.85g(101％，％AN HPLC)产物。
3.68mmol，1.3当量)，随后添加DMF(15ml)树脂。反应混合物在-10℃搅拌过夜并加温至环境温度。搅拌继续进行额外的4小时。反应的完成通过HPLC分析监测，该分析显示存在
0.4％最初的Fmoc-AA(21-38)OH。添加哌啶(1.23ml，14.43mmol，5.1当量)并在30℃搅拌溶液3小时。去除Fmoc的完成通过HPLC分析监测，该分析显示Fmoc-AA(21-38)NH2＜1％。
添加水(100ml，8.3体积)以沉淀产物。固体通过抽吸过滤收集，用水洗涤。在环境温度过夜干燥提供11.85g(101％，％AN HPLC)产物。
[0289] 中间体Fmoc-AA(21-39)NH2用哌啶处理以去除Fmoc保护基并且产物H-AA(21-39)NH2通过抽吸过滤收集。潮湿的滤饼在1∶1 EtOH∶水中混悬30分钟。过滤后，则在1∶2 MTBE∶庚烷中混悬并且经干燥产生2.67g(90.7％)的H-AA(21-39)NH2，纯度84.1％(AN HPLC)。
[0290] HPLC条件：
[0291] 柱：β碱性C-18，150×4.6mm，3μm，
[0292] 流速：1.5ml/分钟
[0293] 检测：在262nM UV
[0294] 流动相：A：0.15％TFA/水
[0295] B；0.05％TFA/ACN
[0296] C：0.05％TFA/THF
[0297] 保留时间：大约12分钟
[0298] 实施例8
[0299] 液相合成Ac-AA(1-39)NH2(SEQ ID NO：1)
[0300] 通过Ac-AA(1-20)OH与H-AA(21-39)NH2的液相偶联制备T-1249终产物。
[0301] H-AA(21-39)NH2(2.07g，0.53mmol，1.2当量)、Ac-AA(1-20)OH(2.0g，0.44mmol，1当量)和6-氯HOBT(0.15g，0.89mmol，2.0当量)溶解于DMF(33ml，16体积，15分钟)。溶液冷却至0±5℃并且添加DIEA(0.16g，1.3mmol，3.0当量)，随后添加TBTU(0.18g，0.57mmol，1.3当量)。在0℃搅拌1.5小时，将溶液加温至环境温度并搅拌直至反应结束。逐滴添加水(40ml)。得到的浆液在环境温度搅拌0.8小时并且产物通过抽吸过滤分离。在环境温度过夜干燥产生4.07g(95.1％)Ac-AA(1-39)NH2，纯度72.1％(AN HPLC)。
[0302] HPLC条件：
[0303] 柱：β碱性C-18，150×4.6mm，3μm，
[0304] 流速：1.5ml/分钟
[0305] 检测：在262nM UV
[0306] 流动相：A：0.15％TFA/水
[0307] B：0.05％TFA/CAN
[0308] C：0.05％TFA/THF
[0309] 保留时间：大约25分钟
[0310] 实施例9
[0311] 通过Ac-AA(1-39)NH2的侧链去保护制备T-1249
[0312] Ac-AA(1-39)NH2(5.00g)溶解于DCM(50ml，10体积)并以35ml新鲜制备的TFA∶DTT∶水(35mlTFA∶2.52g DTT∶0.85ml水)溶液处理。溶液在环境温度搅拌6.5小时并冷却至0±5℃。添加MTBE(150ml)并且通过抽吸过滤收集沉淀。细粉在乙腈(130ml)、DIEA(2.6ml)、乙酸(1.91ml)和水(5.6ml)的溶液中混悬。浆液在40℃搅拌过夜以允许色氨酸中吲哚侧链的脱羧，冷却至环境温度并且通过抽吸过滤收集产物。在真空炉内的过夜干燥产生2.98g(100.4％)T-1249。T-1249的纯度是61％(AN)及42％(重量/重量)。
[0313] HPLC条件：
[0314] 柱：β碱性C-18，150×4.6mm，3μm，
[0315] 流速：1.6ml/分钟
[0316] 检测：在220nM的UV
[0317] 流动相：A：水中的0.10％TFA/ACN中的0.075％TFA/MeOH，55/41/0.4[0318] B：水中的0.10％TFA/ACN中的0.075％TFA/MeOH，42/54/0.4
[0319] C：CAN中的0.075％TFA
[0320] 保留时间：大约9分钟