重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白及其制备方法和用途

摘要

本发明提供一种重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白，其包含人白细胞介素IL3片段和假单胞菌外毒素，其中，人白细胞介素IL3片段优选位于融合蛋白的N-末端，假单胞菌外毒素片段优选位于融合蛋白的C-末端，该人白细胞介素IL3片段与假单胞菌外毒素片段之间还可以设有桥接肽。

权利要求

1.一种重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.编码权利要求1所述的重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白的DNA，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：4所示。

3.权利要求1所述的重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白在制备治疗表达IL3受体的白血病的药物组合物中的应用。

说明书

重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及遗传工程技术领域，特别涉及一种用于靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 急性髓性白血病(Acute Myeloid leukemia，AML)是我国急性白血病的主要类型。近年来骨髓干细胞移植和大剂量化疗使AML的预后有显著改善，但仍然有相当比例患者复发死亡。难治与耐药也是治愈AML的重要障碍。此外，标准的治疗措施对白血病细胞选择性较低，常导致明显的毒副作用并增加治疗相关死亡率。

[0003] 现在认为，白血病复发的根本原因是处于静止期的白血病原始细胞(白血病干/祖细胞)对化/放疗存在天然抵抗。急性髓性白血病干/祖细胞对临床常用的柔红霉素、阿[2，7]糖胞苷敏感性很低 ，显然，化/放疗对处于增殖分裂期的白血病细胞可诱导临床缓解，但少量处于静止期的白血病干/祖细胞却“逃避”了损伤，一定条件下又可自动进入增殖期“重建”白血病而导致复发(D.GaryGilliland，Craig T.Jordan，and Carolyn A.Felix：The Molecular Basisof Leukemia.Hematology 2004：80-97)。异基因干细胞移植能使部分AML[4]
患者治愈，主要得益于其移植物抗白血病效应(GVL) ，该效应是一种免疫效应，其杀伤细胞机制与化放疗明显不同，可能对静止期白血病干/祖细胞有作用。因此，探索与化放疗杀伤机制不同的新颖的治疗方法现已成为AML治疗的重要研究方向。显然，理想的新方法应该是对不同增殖周期的白血病细胞都有显著的选择性杀伤作用并能够克服耐药。

[0004] 生物毒素对人体细胞的杀伤机制与化/放疗显著不同，由于其损伤是不可逆的，理论上无论处于静止或增殖期细胞都不能逃脱(欧阳晶，王健伟，脱厚珍：白喉毒素类免疫毒素研究进展；中国生物工程杂志；2004，23：36-41)。这一重要性质强烈提示可作为白血病干/祖细胞的杀伤因素。常用的生物毒素有植物毒素和细菌毒素，前者为双链蛋白质，属核糖体失活蛋白，以蓖麻毒素为代表；后者为单链蛋白质，通过催化链延长因子2(elongation factor 2，EF22)上的ADP核糖基化而抑制蛋白质合成，以白喉毒素及假单胞菌外毒素为代表。生物毒素毒力很强，1分子蓖麻或白喉毒素即可杀死1个细胞，其抗肿瘤作用近来是研究热点。由于生物毒素非特异性毒性较强，必须对其分子进行改造，并与单克隆抗体/细胞因子构成特异性免疫毒素才能用于治疗试验。早期用化学方法连接毒素与载体蛋白的免疫毒素因为活性低、渗透性差、非特异性毒性仍较大等缺点现已少用，目前主张用基因重组技术融合载体蛋白，产量及活性更高，副作用更少(熊玉宁，王健伟：免疫毒素治疗恶性血液病；国外医学输血及血液学分册2000，23：31410.郑菁，陈华庭，黎维勇：
蓖麻蛋白毒素的研究进展；中国医院药学杂志2005，25：164)。使用重组蓖麻毒素A链构成免疫毒素，其特异性取决于载体，虽然可以减少毒副反应，但疗效变得很不确定，现在认为B链对蓖麻毒仍然很重要。近来用白喉毒素与单抗或细胞因子构成免疫毒素治疗恶性肿瘤成为研究热点，但人群中因免疫预防常有白喉毒抗体，且白喉毒素治疗剂量与中毒剂量非常接近，其临床应用受到一定限制。

[0005] 假单胞菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin，PE)是一种非常重要的毒素分子。PE为单链蛋白，全长613个氨基酸，包括3个功能区域。从N端到C端依次为：Ia区、Ib区、II区，和III区。其中Ia区是结合区；Ib区作用不明；II区是转位区，可将有活性的毒素片段转移到细胞质；III区在细胞质内催化EF22的ADP2核糖基化，阻滞EF22促进肽链延长，从而抑制蛋白合成，使细胞死亡。将PE的Ia区去掉，即得到PE40，将PE40与载体嵌合形成免疫毒素，其特异性完全由载体决定，非特异毒副作用非常低，是理想的免疫毒制剂。由于PE40分子量较大，近来对其进一步改造，形成了渗透性更好、毒性更强的PE38KDEL。即将PE的部分Ib区去掉，可得到较小的PE38，进一步将PE的C端氨基酸由REDLK变为KDEL，将极大地提高其跨膜能力和结合活性，从而增强所构建免疫毒素的杀伤力。此外，假单胞菌外毒素对多药耐药(MDR)基因表达阳性的肿瘤细胞仍然敏感，这是假单胞菌外毒素作为抗肿瘤药物又一有利因素。近年来，用PE与单克隆抗体或细胞因子融合成免疫毒素治疗肿瘤的研究逐渐增多。将粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与PE40构成免疫毒素G-CSF-PE40，对表达G-CSF受体的AML白血病细胞有高度选择性杀伤作用，对正常造血影响很小。将其注射给正常小鼠，仅导致一过性白细胞减少，红细胞和血小板数量没有变化，显示出极强的细胞系列特异性。用白介素6与PE4E融合蛋白IL-6-PE4E治疗高表达IL-6受体的兔AML模型，最大耐受剂量275μg/kg/day，连续7天治疗后，白血病细胞负荷减少90％。此外，IL-6-PE4E、抗-Tac(Fv)-PE40近来还被成功应用于移植物肿瘤细胞净化处理。
在AML自体干细胞移植中，经过IL-6-PE4E处理的移植物回输自体后185天仍不能检测白血病残留病灶。除假单胞菌外毒素外，白喉毒素嵌合单克隆抗体、细胞因子治疗AML也是近来研究热点，体外和动物实验均取得一定疗效。

[0006] 现已证明，白血病干/祖细胞的表型主要是CD34+及CD123+。CD123即IL3受体，正常造血早期细胞中可有此受体表达，但正常造血干细胞并不表达该受体，所以是AML干/祖细胞相对特异性标志。多数AML细胞表达IL3受体并对外源性IL3有反应，且IL3R与IL3结合后能迅速内化到细胞浆，因此IL3R自然成为较理想的AML干/祖细胞治疗靶点，利用IL3携带生物毒素杀伤白血病干/祖细胞就成为很有希望的治疗策略。1996年，Chunghuang chan(Chan C.H.，Blazar B.R.，Greenfield L et al：Reactivity of murine cytokine fusiontoxin，diphtheria toxin390-murine interleukin-3，with bone marrowprogenitor cell s.Blood，88：1445-1456，1996)等首先构建重组IL3-DT390重组融合蛋白，并初步证明对AML细胞有选择性杀伤，50％抑制活性仅需1.5ng/ml浓度。但IL3-DT390同时也抑制CFU集落形成，表明对造血祖细胞有杀伤作用。Michaela(Michaela Feuring-Buske，Arthur E.Frankel，Richard L et al.：A Diphtheria Toxin-Interleukin3 Fusion Protein Is Cytotoxic to PrimitiveAcute Myeloid Leukemia Progeni tors But Spares Normal Progeni tors.CancerResearch)等证明DT388IL3对AML原始早期细胞有细胞毒作用但对小鼠正常原始细胞无影响，进一步动物实验也证实DT388IL3的有效性。
但白喉毒素治疗剂量与中毒剂量非常接近，且人群中因免疫预防常有白喉毒抗体而影响其临床应用。假单胞菌外毒素与白喉毒素杀伤细胞机制类似，但对不同细胞，其免疫毒素的杀伤效力可有很大差别。分别用抗转铁蛋白受体单抗融合白喉毒素DT388或假单胞菌外毒素PE40处理A431、KB及MCF7细胞株时，PE40毒性是DT388的400-800倍。此外，去掉Ia区的PE其细胞毒特异性几乎完全取决于载体的特异性，因此非特异性毒副作用很低，在人体内最大耐受剂量可达数百μg/kg/day，治疗剂量空间更大。目前，用重组IL3与PE融合蛋白靶向治疗AML研究尚未见报道，有重要研究价值。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种新的免疫毒素，通过基因重组技术构建IL3与PE38KDEL融合蛋白，其载体IL3能够特异识别AML白血病细胞的IL3受体(IL3R)，经该受体快速内化机制将毒素PE38KDEL带至胞浆发挥毒作用，选择性杀伤AML白血病细胞。可以用于治疗表达IL3受体的白血病。

[0008] 本发明提供一种重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白，其包含人白细胞介素IL3片段和假单胞菌外毒素。其中，人白细胞介素IL3片段优选可以具有SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列；假单胞菌外毒素优选假单胞菌外毒素PE38KDEL片段，假单胞菌外毒素PE38KDEL片段优选可以具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

[0009] 本发明提供的重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白中，人白细胞介素IL3片段优选位于融合蛋白的N-末端，假单胞菌外毒素PE38KDEL片段优选位于融合蛋白的C-末端。

[0010] 本发明提供的重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白中，人白细胞介素IL3片段与假单胞菌外毒素片段之间还可以设有桥接肽。该桥接肽可以由1～50个氨基酸组成。其中优选方案时桥接肽为8个氨基酸，所述氨基酸序列为Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly。

[0011] 本发明提供的重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白优选具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

[0012] 本发明还提供一种编码上述重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白的DNA序列，其特征在于其具有SEQ ID NO：4所示的序列。

[0013] 本发明的重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白中，人白细胞介素IL3片段与假单胞菌外毒素片段之间可以设有桥接肽，也可以不用桥接肽连接，其中采用桥接肽的重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白的载体IL3特异识别AML白血病细胞的IL3受体(IL3R)和毒素PE38KDEL的毒作用效果良好。

[0014] 本发明还提供一种制备上述重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白的方法，其包括以下步骤(构建流程图见图1)：

[0015] (a)连结合成的双链DNALinker和载体PQE30，构建重组质粒PQE30-Linker；

[0016] (b)PCR扩增IL3基因片段，扩增产物经双酶切处理后克隆至上述质粒PQE30-Linker中，转化、筛选得到重组质粒PQE30-Linker-IL3；

[0017] (c)PCR扩增PE38KDEL基因片段，扩增产物经双酶切处理后克隆至上述(b)重组质粒PQE30-IL3-Liker中，转化、筛选得到融合基因PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL；

[0018] (d)诱导表达重组PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL融合蛋白；

[0019] (e)对重组PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL融合蛋白进行纯化及复性，得到纯化的重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白。

[0020] 本发明还提供上述重组靶向杀伤白血病细胞融合蛋白用于制备治疗表达IL3受体的白血病的药物组合物的用途。

[0021] 本发明首次构建了IL3-PE38KDEL重组融合基因蛋白，并研究了IL3-PE38KDEL对AML细胞的细胞毒作用，对探索AML新的治疗方法有十分重要的意义，构建的重组靶向杀伤白血病细胞融合蛋白具有广阔的应用前景。

[0022] 以下将通过示例的方式列出本发明较佳具体实施方式的细节。从以下详细说明和权利要求中，可以更加清楚地理解本发明的其他的特征、目的和优点。应该理解，以下所述各具体实施方式及其附图仅用于示例性说明本发明，而非用于限制本发明，所属技术领域的技术人员可以在不脱离本发明的实质和精神范围的情况下很容易地做出各种改变。

附图说明

[0023] 图1为根据本发明的质粒构建流程图。

[0024] 图2为人IL3 RT-PCR扩增产物的电泳图。

[0025] 图3为PE38KDEL基因片段的PCR产物电泳图，其中M1为1Kbp标记物，M2为DL2000标记物，1、2为PE38KDEL的PCR扩增产物。

[0026] 图4为重组质粒PQE30-IL3-PE38KDEL酶切鉴定电泳图，其中M1为DNA DL2000标记物，M2为1Kbp DNA标记物，1为融合基因经KpnI、HindIII双酶切得到长约1038bp的片段即PE38KDEL，2为融合基因经BamHI、KpnI双酶切得到长约499bp的片段即IL3，3为融合基因经BamHI、HindIII双酶切得到长约1500bp的片段即IL3-PE38KDEL。

[0027] 图5表示融合蛋白的表达及SDS-PAGE分析结果，其中M为蛋白质分子量标记物，P为融合蛋白IL3-PE38KDEL。

[0028] 图6表示不同浓度重组蛋白IL3-PE38KDEL对MO7e细胞及封闭IL3R后的MO7e细胞的杀伤结果。

具体实施方式

[0029] 本发明实施例所述的试剂除特别说明的外，其余的均采用市售的分析纯试剂。

[0030] 实施例1：质粒pGEX-4T-1-PE38KDEL制备方法

[0031] 1.PEA基因的扩增

[0032] 按常规方法提取绿脓杆菌PA103染色体DNA。参照Gray等公布的序列设计一对分别位于PEA结构基因两侧的引物。

[0033] 5’引物：5′-GAT CAG CCT CAT CCT TCA C-3’，

[0034] 3’引物：5′-GCT CGC GGC AGT TAC TT-3’。

[0035] 反应体系：5μl DNA模板(0.5μg)，5μl 10×PCR扩增缓冲液，5’引物及3’引物各2μl(100ng)，10mmol/L dNTP混合物1μl，50％甘油5μl，DMSO2.5μl，灭菌水27μl，TaqDNA聚合酶0.5μl(2.5u)，总体积50μl。反应条件：94℃变性4win，接着进入循环，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸3min，共循环30个周期。72℃终末延伸30min。

[0036] 2.PE40基因片断扩增

[0037] 引物a(正向)：5’-TAAGAAGGGAATTCACATATGGCCGAGGGC-3’(下划线为EcoRI酶切位点)；

[0038] 引物b(反向)：5’-CGGTCGCGAAGCTTACTTCAGGTCCTC-3’(下划线为Hind III酶切位点)；

[0039] 反 应 体 系：ddH2O 30.2μl，10×PCR buffer 5μl，BSA(0.1 ％ )5μl，dNTP(25mmol/L)4μl，PEA 1μl，引物a和b(20μmol/μl)各 1μl，甲酰胺2.5μl，pyrabest DNA聚合酶0.3μl。

[0040] PCR反应条件为：94℃5min；95℃1min，50℃1min，72℃3min，共4个循环；95℃1min，58℃1min，72℃3min，共23个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

[0041] 3.PE38基因扩增

[0042] 引物a(正向)：5’-TAAGAAGGGAATTCACATATGGCCGAGGGC-3’(下划线为EcoRI酶切位点)；

[0043] 引物c(反向)：5′-AGTTCACAGGGCCCGCGTTCGCCGC-3’(下划线为Apa I酶切位点)。

[0044] 反应体系基本同PE40扩增体系，其中采用引物a和c各1μl，模板PE401μl。

[0045] PCR反应条件为：95℃4min；96℃1min，50℃1min，72℃1min，共4个循环；96℃1min，58℃1min，72℃1min，共25个循环；72℃延伸5min，4℃保温。

[0046] 4.pGEX-4T-1-PE38KDEL构建

[0047] 引物a(正向)：5’-TAAGAAGGGAATTCACATATGGCCGAGGGC-3’(下划线为EcoRI酶切位点)；

[0048] 引物d(反向)：5’-CGGGCTGGCTAGCGTAGTCCGGCAGG-3’(下划线为Nhe I酶切位点)；

[0049] 单链寡核苷酸e(正向)：5’CTAGCCAGCCCGGCAAACCGCCGAAAGATGAACTGTAGTGC-3’；

[0050] 单链寡核苷酸f(反向)：5’-GGCCGCACTACAGTTCATCTTTCGGCGGTTTGCCGGGCTGG-3’。

[0051] 以PE38为模板，用引物a、d进行PCR反应，反应体系ddH2O 29.8μl，10×PCR buffer 5μl，BSA(0.1％)5μl，dNTP(25mmol/L)4μl，MgCl20.4μl，PE38基因1μl，引物a和d(20μmol/μl)各1μl，甲酰胺2.5μl，pyrabestDNA聚合酶0.3μl。PCR反应条件为：95℃4min；96℃1min，50℃1min，72℃2min，共4个循环；96℃1min，62℃1min，72℃2min，共22个循环；72℃延伸5min，4℃保温。将PCR产物用EcoRI和NheI双酶切；将单链寡核苷酸e、f链混合退火，得到两端含有Nhe I和Not I酶切位点的一段双链核苷酸序列，其中包含KDEL序列；将上述两段序列混合，并与经EcoR I和NotI双酶切的PGEX-4T-1载体连接，得到的转化子即PGEX-4T-1-PE38KDEL。

[0052] 实施例2：重组蛋白IL3-PE38KDEL表达及活性鉴定

[0053] 1.材料与方法

[0054] 1.1试剂

[0055] 各种限制性内切酶，TaqDNA聚合酶，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase酶，DL2000Marker，500bpMarker，蛋白质Marker，T4连接酶，质粒小抽试剂盒，胶回收试剂均购合于Takara公司，引物的合成由上海英骏公司完成。

[0056] IPTG，考马斯亮蓝R250购于Takara公司。

[0057] 镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)购于Novagen公司。

[0058] RPMI1640购于GIBCO公司。

[0059] 小牛血清购于杭州四季青生物材料有限公司。

[0060] MTT为Amresco公司产品。

[0061] 1.2融合基因PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL的构建

[0062] 1.2.1重组质粒PQE30-Linker的构建

[0063] 为确保融合基因表达的蛋白有好的空间结构，可以自由伸展，不影响药物学及生物学活性。故设计含5至15个氨基酸的疏水柔性肽作为Linker连在IL3与PE38KDEL之间，这里，以8个氨基酸的疏水柔性肽作为Linker的实例，其氨基酸序列为Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly。其中以谷氨酸和丝氨酸为主，设计单核苷酸序列：Linker1：5-cggaggtggaggttcaggaggtggactgca-3，Linker2：5-gtccacctcctgaacctccacctccggtac-3经变性退火后形成34bp大小的双链DNA，两端分别含有Kpn1，Pst1酶切位点的粘性末端。反应条件为：95℃变性5min，75℃30s，从75℃至30℃缓慢退火至少1h，用2％的琼脂糖凝胶电泳检测Linker合成后的结果。用Kpn1及Pst1双酶切表达质粒PQE30，从低熔点琼脂糖凝胶电泳中回收PQE30片段，再用胶回收试剂盒回收纯化。将合成的双链DNALinker与载体PQE30以摩尔比为10∶1的比例混合，在T4连接酶的作用下，14℃连接16h。将连接产物转化克隆受体菌DH5α感受态细胞中，涂布于含Amp青霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜。挑选平板上形成的单个菌落，经LB液体培养后，快速提取DNA。经测序结果显示表达载体PQE30-Linker构建成功。

[0064] 1.2.2重组载体PQE30-IL3-Linker的构建

[0065] 以重组质粒GM-CSF-IL3(含IL3片段为模板用PCR方法扩增目片段，据Genbank人类细胞因子IL3基因全序列(序列号NM_000588)去除信号肽设计引物：IL3-F：5-acaggcatgcgctcccatga cccagacaa-3(含Sphl酶切位点)；IL3-R：5-cggggtaccaaagatcgcgaggctcaaa8-3(含KpnI酶切位点)，用PrimeSTARTM HSDNA Polymerase酶扩增出目的片段IL3，PCR反应条件为：98℃预变性5min，然后98℃变10s，63℃退火10s，72℃聚合延伸反应30s，共循环30次。最后于72℃聚合延伸反应5min。PCR产物回收提纯后以Sph1/Kpn1进行双酶切，并克隆至具有相同酶切位点的质粒PQE30-Linker中，转化感受态大肠杆菌E.coliDH5α。经氨苄青霉素(100μg/ml)筛选后得到重组质粒PQE30-Linker-IL3。

[0066] 1.2.3 PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL融合基因构建及鉴定

[0067] 以重组铜绿假单胞菌外毒素表达质粒pGEX4T-1-PE38KDEL(含PE38KDEL基因片段为模板，根据其序列设计引物

[0068] F：5-ATCCTGCAGGAGGGCGGCAGCCTGGCCG-3(含Pst1酶切位点)

[0069] R：5-ACAAAGCTTTTAGAGCTCGTCTTTCGGCG-3(含HindIII酶切位点)上、下游引物各引入Pst1、HindIII酶切位点，用PrimeSTARTM HS DNA Polymerase酶扩增目的片段PE38KDEL。反应参数如下：98℃预变性5min，98℃变性10s，65℃退火10s，72℃聚合延伸反应1min，共循环30次。最后72℃聚合延伸反应5min。PCR产物回收提纯后以Pst1/HindIII进行双酶切处理，并克隆至具有相同酶切位点的重组质粒PQE30-IL3-Linker中，转化感受态大肠杆菌E.coliDH5 α。经氨苄青霉素(100μg/ml)筛选，挑单菌落接种于含Amp的LB中培养，37℃振摇过夜。

[0070] 1.3重组阳性克隆的筛选及核苷酸序列测定

[0071] 取过夜菌小剂量制备质粒，用Sph1及HindIII双酶切，37℃消化12小时，经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得1600bp大小的目的片段及3400bp大小的载体片段。挑取阳性克隆菌保种，将PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL重组载体送测序。

[0072] 1.4重组PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL融合蛋白的诱导表达

[0073] 将重组表达载体pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL转化感受态大肠杆菌SG13009，挑单个菌落接种入LB培养液(含100mg/L氨苄青霉素，35mg/L氯霉素)中，37℃振摇过夜，再将饱和培养物按1∶20接种至含相同抗生素浓度的LB培养液中，37℃振摇培养大约2小时，待OD600＝0.2-0.6时加IPTG(终浓度＝1mmol/L)诱导表达，对诱导时间和诱导温度分别进行优化。表达后离心收集表达菌，冰浴超声破碎细胞，离心，将上清和沉淀分别制成电泳样品进行SDS-PAGE电泳分析，以确定外源性蛋白的表达情况。

[0074] 1.5重组PQE30-IL3-Iinker-PE38KDEL融合蛋白的纯化及复性

[0075] 取培养过夜的工程菌按1∶100的比例接种于含氨苄和氯霉素抗性的LB培养基中，37℃振摇培养2小时至A600nm为0.2～0.6，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L。37℃诱导表达4小时后4℃离心收获细菌，以Binding Buffer(NaCl500mmol/L，Tris-HCl
20mmol/L，咪唑5mmol/L)洗涤一次，冰上超声破菌；将细菌超声破碎液以12000g低温离心
1h，收集上清液，同时以相同上清液体积的超声破碎缓冲液重悬沉淀，SDS-PAGE分析。将洗涤后的超声破菌沉淀用含8mol/L尿素的Binding Buffer(pH 7.9)重悬，冰浴1h，混匀数次以充分溶解包涵体，离心，上清用0.45μm滤膜过滤，滤液转入镍层析柱内，依次加入含
8mol/L尿素的Binding Buffer(pH7.9)，Wash Buffer(咪唑20mmol/L，NaCl 500mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L，pH＝7.9)洗柱，最后Elute Buffer(咪唑400mmol/L，NaCl 500mmol/L，Tris-HCl 2mmol/L，尿素8mol/L，pH＝7.9)进行目的蛋白洗脱，测定各洗脱管的A280值。收集Elute Buffer洗脱蛋白，依次以6mmol/L、4mmol/L、2mmol/L、0mmol/L尿素溶液进行透析(NaCl 500mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L，pH＝7.5)，Bradford法蛋白定量，12％SDS-PAGE检测目的蛋白纯化情况，用凝胶图像分析系统分析蛋白质纯度。对纯化后的重组融合蛋白IL3-PE38KDEL进行N末端氨基酸测序和活性鉴定。纯化蛋白真空冷冻干燥保存备用。

[0076] 1.6融合蛋白IL3-PE38KDEL的免疫印记分析及氨基酸序列测定

[0077] 样品以12％SDS-PAGE进行电泳，然后以380mA电流转移30min，切胶将蛋白质转移至PVDF膜上，膜以封闭液(PBS，PH7.4，含5％的脱脂奶粉和0.5％的Tween-20)于封闭1小时，加入以封闭液稀释(1∶200)的抗His抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次
10min，羊抗兔的IgG-HRP(1∶1000)37℃温育1h，TBST洗膜4次后，洗去二抗后以ECL发光试剂盒进行显色，X光片曝光后进行显影定影。对纯化后的蛋白行N末端氨基酸序列测定。

[0078] 1.7融合蛋白IL3-PE38KDEL的体外毒性实验

[0079] 采用MTT法分析免疫毒素IL3-PE38KDEL对急性髓性白血病细胞株MO7e的生长抑制作用。MO7e细胞培养于含有10％小牛血清RPMI1640的完全培养液中，培养至细胞处于对数生长期，取1×105细胞/mL加入96孔板中，其中48孔每孔加过量抗IL3R单抗2μl培养24小时(封闭MO7e细胞的IL3R)37℃，5％CO2条件下培养。再往96孔板中加入不-11 -10 -9 -8 -7同浓度的重组蛋白，使终浓度为0，10 ，10 ，10 ，10 ，10 mol/L，实验中共设6个平行孔，培养72小时后每孔加入10μl MTT(5mg/ml)，待有明显的蓝紫色颗粒结晶时，每孔再加入
100μl的10％SDS-HCL终止反应。蓝紫色颗粒结晶溶解完全后，以酶标仪在560nm波长处测OD值。以蛋白质的不同浓度及不同时间对MO7e细胞生长的抑制率作图可得剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(IC50)。

[0080] 细胞生长抑制率＝(1-药物组OD值/对照组OD值)×100％

[0081] 2.结果

[0082] 2.1人类细胞因子IL3及假单胞菌外毒素PE38KDEL的PCR扩增

[0083] PCR扩增得到了相应的目的片段，大小分别为399bp、1038bp，参见图2、图3[0084] 2.2重组融合质粒IL3-PE38KDEL的序列及酶切鉴定

[0085] 将已构建构的重组质粒PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL分别经Pst I、HindIII；Sph I、Kpn I；Sph I、HindIII行双酶切鉴定，其酶切后的小片段分别为1038bp、399bp、1475bp与预期相符。大连宝生物公司DNA序列报告显示，所构建的融和基因核苷酸序列及表达框无误，该质粒PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL构建成功。其序列如SEQ ID NO：4序列所示：酶切结果见图4

[0086] 2.4融合蛋白的表达及SDS-PAGE分析

[0087] 将重组质粒PQE30-IL3-PE38KDEL从克隆菌DH5α中提出，转入表达宿主菌SG13009，经IPTG诱导后，与空载体转化的相同菌株的表达产物比较，都出现了新的蛋白条带，分子量为57KD与预期的分子量大小相当。结果显示融合蛋白IL3-PE38KDEL表达成功。如图5所示：

[0088] 2.5重组IL3-PE38KDEL融合蛋白的纯化及复性

[0089] 经SDS-PAGE分析表明，在37℃培养条件下，诱导表达的融合蛋白主要以包涵体的形式表达，上清液中融合蛋白含量很少，在SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图中几乎不可见。用凝胶薄层扫描显示，外源性蛋白表达量占菌体总蛋白的19.8％。该融合蛋白为一种免疫毒素，对宿主菌有一定的毒性作用，故融合蛋白是以包涵体的形式表达，且表达量相对较少。在多次大量收集工程菌，Binding Buffer重悬超声破碎。反复洗涤包涵体，去掉细菌内毒素等杂质，用8mmol/L的尿素充分溶解，变错乱的蛋白质三级空间结构为一级结构，肽链充分伸展。我们利用带6-His识别标志的金属镍合层析柱，纯化变性的蛋白，上柱前先用低浓度咪唑平衡镍柱，以降低杂蛋白与亲和层析柱的特异性结合，提高蛋白纯度。调整流速使其缓慢过柱，目的蛋白与层析柱充分结合，最后经高浓度咪唑洗脱目的蛋白。经SDS-PAGE分析证实目的蛋白的纯度达85％。由于该蛋白是以无生物学活性的包涵体形式表达，故在纯化蛋白后我们利用浓度梯度透析复性的办法恢复其生物学活性。复性后融合蛋白回收率90％。

[0090] 2.6融合蛋白IL3-PE38KDEL的免疫印记分析及序列测定

[0091] 利用特异抗组氨酸标签的抗体对目的蛋白行免疫印记分析表明，在分子量约57KD的地方出现明显的目的条带，与预期相符。证实了表达产物能够被抗组氨酸标签的单克隆抗体特异性的结合。说明构建的免疫毒素PQE30-IL-Linker-PE38KDEL在宿主菌中得到表达。利用Applied Biosystems公司的492蛋白序列仪，采用Edman降解法，对纯化的重组IL3-PE38KDEL融合蛋白的N端10个氨基酸进行序列测定结果与预计的序列一致。氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。

[0092] 2.7融合蛋白IL3-PE38KDEL对HL60细胞生长的影响

[0093] 72小时连续杀伤作用显示出重组蛋白IL3-PE38KDEL对靶细胞MO7e的半细胞致死剂量(ID50)为(0.96±0.07)×10-9mol/L，封闭受体后的MO7e的半细胞致死剂量(ID50)为(0.80±0.09)×10-7mol/L，为前者的80倍(P＜0.01)见图6

[0094] 实施例3：重组蛋白IL3-Linker-PE38KDEL的表达及活性鉴定

[0095] 1.材料与方法

[0096] 1.1试剂

[0097] 各种限制性内切酶，TaqDNA聚合酶，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase酶，DL2000Marker，500bpMarker，蛋白质Marker，T4连接酶，质粒小抽试剂盒，胶回收试剂均购合于Takara公司。

[0098] 引物的合成由上海英骏公司完成。

[0099] IPTG，考马斯亮蓝R250购于Takara公司。

[0100] 镍离子亲和层析柱(Ni2+-NTA)购于Novagen公司。

[0101] RPMI1640购于GIBCO公司。

[0102] 小牛血清购于杭州四季青生物材料有限公司。

[0103] MTT为Amresco公司产品。

[0104] 1.2合成引物：

[0105] Primer1(上游)5’-TCGCGCATGCGCTCCCATGACCCAG-3’(下划线为sph I酶切位点)，

[0106] Primer2(下游)5’-AGGCTGCAGTCCACCTCCTGAACCTCCACCTCCGGTACCAAAGATCGCGAGGCTC-3’(下划线为Pst I酶切位点)，

[0107] Primer 3(上游)5’-GGCTGCAGGAATTCGAGGGCGGCAG-3’(下划线为Pst I酶切位点)，

[0108] Primer 4(下游)5’-GCCCAAGCTTGCGGCCGCTTAGAGC-3’(下划线为HimdIII酶切位点)。

[0109] 1.3IL3基因片断的RT-PCR扩增

[0110] 采用Ficoll密度梯度法从人外周血分离出单个核细胞，约3.5×105/ml，用TRIZOL等试剂提取总RNA，取5μl RNA进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，于紫外光下观察18S、28S RNA带，以确定RNA提取效果。以提取的RNA为模板，以Primer1、Primer2为引物，
42℃1h后，94℃2min完成逆转录过程，然后以逆转录产物为模板进行PCR反应，反应条件是：94℃变性1min，65℃退火45s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃再延伸10min，取扩增产物5μL进行10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物用胶回收试剂盒回收纯化。

[0111] 1.4 PCR产物在PQE30载体上的克隆

[0112] 将IL3片断用sph I、Pst I双酶切，酶切产物用T4DNA连接酶连到同样双酶切的质粒PQE30，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，平铺于含氨卞青霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜，经菌落PCR，酶切签定筛选出含IL3片段的重组质粒及PQE30-IL3，将筛选出的阳性菌落测序。

[0113] 1.5 PE38KDEL基因片断的PCR扩增

[0114] 以PGEX-4T-1PE38KDEL为模板，Primer 3、Primer4为引物，用LA Taq酶进行PCR反应，反应条件为94℃变性30s，67℃退火30s，72℃延伸1min10s，30个循环后，72℃再延伸5min，用8g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，将PCR产物用胶回收试剂盒回收纯化。

[0115] 1.6重组质粒PQE30-IL3-PE38KDEL的构建

[0116] 将PE38KDEL片断用Pst I、HimdIII双酶切，酶切产物用T4DNA连接酶连到同样双酶切的质粒PQE30-IL3，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，平铺于含氨卞青霉素的琼脂平板上，37℃培养过夜，经菌落PCR，酶切签定筛选出含PE38KDEL片段的重组质粒即PQE30-IL3-PE38KDEL，将筛选出的阳性菌落测序。

[0117] 1.7重组PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL融合蛋白的诱导表达

[0118] 将重组表达载体pQE30-IL3-Linker-PE38KDEL转化感受态大肠杆菌SG13009，挑单个菌落接种入LB培养液(含100mg/L氨苄青霉素，35mg/L氯霉素)中，37℃振摇过夜，再将饱和培养物按1∶20接种至含相同抗生素浓度的LB培养液中，37℃振摇培养大约2小时，待OD600＝0.2-0.6时加IPTG(终浓度＝1mmol/L)诱导表达，对诱导时间和诱导温度分别进行优化。表达后离心收集表达菌，冰浴超声破碎细胞，离心，将上清和沉淀分别制成电泳样品进行SDS-PAGE电泳分析，以确定外源性蛋白的表达情况。

[0119] 1.8重组PQE30-IL3-Iinker-PE38KDEL融合蛋白的纯化及复性

[0120] 取培养过夜的工程菌按1∶100的比例接种于含氨苄和氯霉素抗性的LB培养基中，37℃振摇培养2小时至A600nm为0.2～0.6，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L。37℃诱导表达4小时后4℃离心收获细菌，以Binding Buffer(NaCl 500mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L，咪唑5mmol/L)洗涤一次，冰上超声破菌；将细菌超声破碎液以12000g低温离心1h，收集上清液，同时以相同上清液体积的超声破碎缓冲液重悬沉淀，SDS-PAGE分析。将洗涤后的超声破菌沉淀用含8mol/L尿素的Binding Buffer(pH7.9)重悬，冰浴1h，混匀数次以充分溶解包涵体，离心，上清用0.45μm滤膜过滤，滤液转入镍层析柱内，依次加入含8mol/L尿素的Binding Buffer(pH7.9)，Wash Buffer(咪唑20mmol/L，NaCl 500mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L，pH＝7.9)洗柱，最后Elute Buffer(咪唑400mmol/L，NaCl500mmol/L，Tris-HCl 2mmol/L，尿素8mol/L，pH＝7.9)进行目的蛋白洗脱，测定各洗脱管的A280值。
收集Elute Buffer洗脱蛋白，依次以6mmol/L、4mmol/L、2mmol/L、0mmol/L尿素溶液进行透析(NaCl 500mmol/L，Tris-HCl 20mmol/L，pH＝7.5)，Bradford法蛋白定量，12％SDS-PAGE检测目的蛋白纯化情况，用凝胶图像分析系统分析蛋白质纯度。对纯化后的重组融合蛋白IL3-PE38KDEL进行N末端氨基酸测序和活性鉴定。纯化蛋白真空冷冻干燥保存备用。

[0121] 1.9融合蛋白IL3-PE38KDEL的免疫印记分析及氨基酸序列测定

[0122] 样品以12％SDS-PAGE进行电泳，然后以380mA电流转移30min，切胶将蛋白质转移至PVDF膜上，膜以封闭液(PBS，PH7.4，含5％的脱脂奶粉和0.5％的Tween-20)于封闭1小时，加入以封闭液稀释(1∶200)的抗His抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次
10min，羊抗兔的IgG-HRP(1∶1000)37℃温育1h，TBST洗膜4次后，洗去二抗后以ECL发光试剂盒进行显色，X光片曝光后进行显影定影。对纯化后的蛋白行N末端氨基酸序列测定。

[0123] 1.10融合蛋白IL3-PE38KDEL的体外毒性实验

[0124] 采用MTT法分析免疫毒素IL3-PE38KDEL对急性髓性白血病细胞株MO7e的生长抑制作用。MO7e细胞培养于含有10％小牛血清RPMI1640的完全培养液中，培养至细胞处于5
对数生长期，取1×10 细胞/mL加入96孔板中，其中48孔每孔加过量抗IL3R单抗2μl培养24小时(封闭MO7e细胞的IL3R)37℃，5％CO2条件下培养。再往96孔板中加入不同浓-11 -10 -9 -8 -7
度的重组蛋白，使终浓度为0，10 ，10 ，10 ，10 ，10 mol/L，实验中共设6个平行孔，培养
72小时后每孔加入10μlMTT(5mg/ml)，待有明显的蓝紫色颗粒结晶时，每孔再加入100μl的10％SDS-HCL终止反应。蓝紫色颗粒结晶溶解完全后，以酶标仪在490nm波长处测OD值。以蛋白质的不同浓度对MO7e细胞生长的抑制率作图可得剂量反应曲线，从中求出半数抑制浓度(LC50)。

[0125] 细胞生长抑制率＝(1-药物组OD值/对照组OD值)×100％

[0126] 2.结果

[0127] 2.1人IL3基因扩增及纯化

[0128] 本实验扩增的IL3片断共399个碱基，加上5’端的酶切序列及柔性连接肽理论上是448个碱基，IL3 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，紫外线下观察，可见一预期大小的条带，说明IL3mRNA提取成功，逆转录合成的cDNA完整，IL3扩增成功(结果见附图2)。

[0129] 2.2质粒PQE30-IL3-L的构建

[0130] PCR扩增的IL3片断经sph I、Pst I双酶切后与同样双酶切的PQE30片段相连接，转化于E.coli DH5α中，经菌落PCR、酶切及测序鉴定筛选出阳性重组子，即PQE30-IL3重组质粒。

[0131] 2.3 PE38KDEL基因片断的PCR扩增结果

[0132] 扩增长度与预期相符，约1070bp。见图3

[0133] 2.4重组载体的构建

[0134] PCR扩增的PE38KDEL片断经Pst I、HimdIII双酶切后与同样双酶切的PQE30-IL3片段相连接，转化于E.coli DH5α中，经菌落PCR、酶切及测序鉴定筛选出阳性重组子，即PQE30-IL3-PE38KDEL重组质粒。序列如SEQ ID NO：4序列所示：酶切结果见图4[0135] 2.5融合蛋白的表达及SDS-PAGE分析

[0136] 将重组质粒PQE30-IL3-PE38KDEL从克隆菌DH5α中提出，转入表达宿主菌SG13009，经IPTG诱导后，与空载体转化的相同菌株的表达产物比较，都出现了新的蛋白条带，分子量为57KD与预期的分子量大小相当。结果显示融合蛋白IL3-PE38KDEL表达成功。见图5

[0137] 2.4重组IL3-PE38KDEL融合蛋白的纯化及复性

[0138] 经SDS-PAGE分析表明，在37℃培养条件下，诱导表达的融合蛋白主要以包涵体的形式表达，上清液中融合蛋白含量很少，在SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图中几乎不可见。用凝胶薄层扫描显示，外源性蛋白表达量占菌体总蛋白的19.8％。该融合蛋白为一种免疫毒素，对宿主菌有一定的毒性作用，故融合蛋白是以包涵体的形式表达，且表达量相对较少。在多次大量收集工程菌，Binding Buffer重悬超声破碎。反复洗涤包涵体，去掉细菌内毒素等杂质，用8mmol/L的尿素充分溶解，变错乱的蛋白质三级空间结构为一级结构，肽链充分伸展。我们利用带6-His识别标志的金属镍合层析柱，纯化变性的蛋白，上柱前先用低浓度咪唑平衡镍柱，以降低杂蛋白与亲和层析柱的特异性结合，提高蛋白纯度。调整流速使其缓慢过柱，目的蛋白与层析柱充分结合，最后经高浓度咪唑洗脱目的蛋白。经SDS-PAGE分析证实目的蛋白的纯度达85％。由于该蛋白是以无生物学活性的包涵体形式表达，故在纯化蛋白后我们利用浓度梯度透析复性的办法恢复其生物学活性。

[0139] 2.5融合蛋白IL3-PE38KDEL的免疫印记分析及序列测定

[0140] 利用特异抗组氨酸标签的抗体对目的蛋白行免疫印记分析表明，在分子量约57KD的地方出现明显的目的条带，与预期相符。证实了表达产物能够被抗组氨酸标签的单克隆抗体特异性的结合。说明构建的免疫毒素PQE30-IL-Linker-PE38KDEL在宿主菌中得到表达。利用Applied Biosystems公司的492蛋白序列仪，采用Edman降解法，对纯化的重组IL3-PE38KDEL融合蛋白的N端10个氨基酸进行序列测定结果与预计的序列一致。

[0141] 2.6重组蛋白的特异杀伤作用

[0142] 72小时连续杀伤作用显示出重组蛋白IL3-PE38KDEL对靶细胞MO7e的半细胞-9致死剂量(LD50)为0.95×10 mol/L，封闭受体后的MO7e的半细胞致死剂量(LD50)为-7
0.99×10 mol/L，为前者的100倍(P＜0.01)见图6及表1。

[0143] 表1

[0144]-11 -10 -9 -8 -7
OD490nm值 空白对照 10 mol/L 10 mol/L 10 mol/L 10 mol/L 10 mol/L
MO7e细胞 0.503 0.458 0.407 0.257 0.106 0.030
封闭IL3R后的
0.512 0.481 0.461 0.425 0.384 0.205
MO7e细胞

[0145] 由于MO7e细胞是典型的表达IL3R的白血病细胞株，由此，从融合蛋白IL3-PE38KDEL的体外毒性实验可以表明，融合蛋白IL3-PE38KDEL用于治疗表达IL3R的白血病，效果良好。同样，融合蛋白IL3-PE38KDEL用于治疗其他表达IL3R的肿瘤疾病，可以达到本发明同样的效果。

[0146] 本实施例虽然采用人白细胞介素IL3片段和假单胞菌外毒素PE38KDEL片段构建重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白，可以用于治疗表达IL3受体的白血病，杀伤力强，治疗效果好的优点。因此本领域的技术人员在阅读了本专利申请说明书的内容，可以知道采用白细胞介素IL3片段和假单胞菌外毒素的任何毒性片段同样可以构建重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白，并且同样可以用于治疗表达IL3受体的白血病。

[0147] 序列表

[0148] <110>重庆医科大学附属第二医院

[0149] <120>重组靶向杀伤白血病细胞的融合蛋白及其制备方法和用途

[0150] <130>

[0151] <160>6

[0152] <170>PatentIn version 3.3

[0153] <210>1

[0154] <211>133

[0155] <212>PRT

[0156] <213>Artificial

[0157] <220>

[0158] <223>人白细胞介素3(IL-3)的氨基酸序列

[0159] <400>1

[0160] Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn[0161] 1 5 10 15[0162] Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln Pro[0163] 20 25 30[0164] Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln[0165] 35 40 45[0166] Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala[0167] 50 55 60[0168] Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu[0169] 65 70 75[0170] Ser Ile Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala[0171] 80 85 90[0172] Ala Pro Thr Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn[0173] 95 100 105[0174] Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn[0175] 110 115 120[0176] Ala Gln Ala Gln Gln Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe

[0177] 125 130

[0178] <210>2

[0179] <211>345

[0180] <212>PRT

[0181] <213>假单胞菌外毒素PE38KDEL

[0182] <400>2

[0183] Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His[0184] 1 5 10 15[0185] Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp[0186] 20 25 30[0187] Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala[0188] 35 40 45[0189] Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val[0190] 50 55 60[0191] Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly[0192] 65 70 75[0193] Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr[0194] 80 85 90[0195] Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly[0196] 95 100 105[0197] Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp[0198] 110 115 120[0199] Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly[0200] 125 130 135[0201] Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp[0202] 140 145 150[0203] Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg[0204] 155 160 165[0205] Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala[0206] 170 175 180[0207] Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu[0208] 185 190 195[0209] Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu[0210] 200 205 210[0211] Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg[0212] 215 220 225[0213] Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser[0214] 230 235 240[0215] Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu[0216] 245 250 255[0217] Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu[0218] 260 265 270[0219] Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu[0220] 275 280 285[0221] Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile[0222] 290 395 300[0223] Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu[0224] 305 310 315[0225] Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu[0226] 320 325 330[0227] Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu[0228] 335 340 345[0229] <210>3

[0230] <211>490

[0231] <212>PRT

[0232] <213>Artificial

[0233] <220>

[0234] <223>人白细胞介素3与假单胞菌外毒素PE38KDEL融合蛋白的氨基酸序列，其中人白细胞介素3位于融合蛋白的N-末端，假单胞菌外毒素PE38KDEL融合蛋白的C-末端，两者之间由桥接肽“GGGGSGGG”进行连接

[0235] <400>3

[0236] Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn[0237] 1 5 10 15[0238] Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln Pro[0239] 20 25 30[0240] Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln[0241] 35 40 45[0242] Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala[0243] 50 55 60[0244] Phe Asn Arg Ala Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu[0245] 65 70 75[0246] Ser Ile Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala[0247] 80 85 90[0248] Ala Pro Thr Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn[0249] 95 100 105[0250] Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn[0251] 110 115 120[0252] Ala Gln Ala Gln Gln Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile Phe Gly Thr[0253] 125 130 135[0254] Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gln Glu Gly Gly Ser Leu[0255] 140 145 150[0256] Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr[0257] 155 160 165[0258] Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln[0259] 170 175 180[0260] Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala[0261] 185 190 195[0262] Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu[0263] 200 205 210[0264] Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu[0265] 215 220 225[0266] Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu[0267] 230 235 240[0268] Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly[0269] 245 250 255[0270] Ala Ala Asn Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg[0271] 260 265 270[0272] Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val[0273] 275 280 285[0274] Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu[0275] 290 295 300[0276] Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val[0277] 305 310 315[0278] Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe[0279] 320 325 330[0280] Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg[0281] 335 340 345[0282] Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala[0283] 350 355 360[0284] Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala[0285] 365 370 375[0286] Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr[0287] 380 385 390[0288] Arg Thr Gly Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val[0289] 395 400 405[0290] Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile[0291] 410 415 420[0292] Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly[0293] 425 430 435[0294] Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro[0295] 440 445 450[0296] Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile[0297] 455 460 465[0298] Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser[0299] 470 475 480[0300] Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

[0301] 485 490

[0302] <210>4

[0303] <211>1473

[0304] <212>DNA

[0305] <213>Artificial

[0306] <220>

[0307] <223>编码人IL3与假单胞菌外毒素PE38KDEL融合蛋白的DNA序列

[0308] <400>5

[0309] gctcccatga cccagacaac gcccttgaag acaagctggg ttaactgctc taacatgatc 60[0310] gatgaaatta taacacactt aaagcagcca cctttgcctt tgctggactt caacaacctc 120[0311] aatggggaag accaagacat tctgatggaa aataaccttc gaaggccaaa cctggaggca 180[0312] ttcaacaggg ctgtcaagag tttacagaac gcatcagcaa ttgagagcat tcttaaaaat 240[0313] ctcctgccat gtctgcccct ggccacggcc gcacccacgc gacatccaat ccatatcaag 300[0314] gacggtgact ggaatgaatt ccggaggaaa ctgacgttct atctgaaaac ccttgagaat 360[0315] gcgcaggctc aacagacgac tttgagcctc gcgatctttg gtaccggagg tggaggttca 420[0316] ggaggtggac tgcaggaggg cggcagcctg gccgcgctga ccgcgcacca ggcttgccac 480[0317] ctgccgctgg agactttcac ccgtcatcgc cagccgcgcg gctgggaaca actggagcag 540[0318] tgcggctatc cggtgcagcg gctggtcgcc ctctacctgg cggcgcggct gtcgtggaac 600[0319] caggtcgacc aggtgatccg caacgccctg gccagccccg gcagcggcgg cgacctgggc 660[0320] gaagcgatcc gtgagcagcc ggagcaagcc cgtctggccc tgaccctggc cgccgccgag 720[0321] agcgagcgct tcgtccggca gggcaccggc aacgacgagg ccggcgcggc caacggcccg 780[0322] gcggacagcg gcgacgccct gctggagcgc aactatccca ctggcgcgga gttcctcggc 840[0323] gacggcggcg acgtcagctt cagcacccgc ggcacgcaga actggacggt ggagcggctg 900[0324] ctccaggcgc accgccaact ggaggagcgc ggctatgtgt tcgtcggcta ccacggcacc 960[0325] ttcctcgaag cggcgcaaag catcgtcttc ggcggggtgc gcgcgcgcag ccaggacctc 1020[0326] gacgcgatct ggcgcggttt ctatatcgcc ggcgatccgg cgctggccta cggctacgcc 1080[0327] caggaccagg aacccgacgc acgcggccgg atccgcaacg gtgccctgct gcgggtctat 1140[0328] gtgccgcgct cgagcctgcc gggcttctac cgcaccggcc tgaccctggc cgcgccggag 1200[0329] gcggcgggcg aggtcgaacg gctgatcggc catccgctgc cgctgcgcct ggacgccatc 1260[0330] accggccccg aggaggaagg cgggcgcctg gagaccattc tcggctggcc gctggccgag 1320[0331] cgcaccgtgg tgattccctc ggcgatcccc accgacccgc gcaacgtcgg cggcgacctc 1380[0332] gacccgtcca gcatccccga caaggaacag gcgatcagcg ccctgccgga ctacgccagc 1440[0333] cagcccggca aaccgccgaa agacgagctc taa 1473