一种用于检测副溶血弧菌的方法转让专利
申请号 : CN200710046637.4
文献号 : CN101140243B
文献日 : 2010-04-14
发明人 : 潘迎捷 , 徐芊 , 孙晓红 , 赵勇
申请人 : 上海水产大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种用于检测副溶血弧菌的方法，包括DNA模板的制备、采用引物设计软件设计LAMP引物以及引物的合成、副溶血弧菌的环介导等温扩增、产物检测，其特征在于：(1)DNA模板的制备：
a.取1.0mL细菌纯培养物，置于1.5mL离心管中，以12000转/分离心5分钟，弃上清液；
b.加入100μL无菌水，涡旋混匀，100℃水浴10分钟，立即冰浴2分钟；
c.12000转/分离心5分钟，取上清液备用，作为模板进行扩增；
(2)采用引物设计软件设计LAMP引物为采用primer primer5.0引物软件针对副溶血弧菌t1h基因M36437设计LAMP引物，设计的LAMP引物序列为：正向内引物FIP：
5’-GCCCATTCCCAATCGGTCG-TTTT-CTATGTTTCGCTGTTGGTATCG-3’；
反向内引物BIP：
5’-GTTCTACACCAACACGTCGCA-TTTT-TCGCCAAATCTAATGTTGCTTC-3’；
正向外引物F3：
5’-CAGCACGCAAGAAAACCA-3’；
反向外引物B3：
5’-ATTGTCAGCGGCGAAGAA-3’；
(3)采用副溶血弧菌的环介导等温扩增：
a.配置25uL反应体系，包括：100mM的MgSO4 1.5uL、10mM的dNTP 2.5uL、5M的甜菜碱4uL、20uM的正向内引物FIP 1.5uL、20uM的反向内引物BIP 1.5uL、10uM的正向外引物F3 0.5uL、10uM的反向外引物B3 0.5uL、8000U/mL的Bst DNA聚合酶大片段1uL、10×ThermoPol缓冲液2.5uL、DNA模板2uL、ddH2O 7.5uL；
b.混匀反应体系，于60℃温育60分钟；
c.80℃灭活10分钟；
(4)产物检测：肉眼观察反应体系的浊度变化或5000rpm离心反应体系10s后，观察反应管底部，若体系混浊或反应管底部出现白色沉淀，则待检细菌为副溶血弧菌，若否，则待检细菌不是副溶血弧菌。
说明书 :
[技术领域]
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种用于检测副溶血弧菌的方法。
[背景技术]
副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus隶属于弧菌科弧菌属，是一种革兰氏阴性菌，菌体一端有单鞭毛，运动活泼，为嗜盐性细菌，它是一类重要的病原菌，广泛分布于海岸线区域、海水沉积物、鱼贝类等水产动物以及海产品中，能感染人类以及鱼类、对虾、甲壳类等多种水产动物，人食用受了该菌污染的食物后会引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发热等典型胃肠炎反应，重症患者还会脱水、休克昏迷，甚至死亡。
副溶血弧菌发病呈世界性分布，尤其在沿海地区发病率较高，是进出口水产品检验的重要项目，在食品检测、食品中毒源调查、传染病源调查等工作中，也经常需要对该菌进行检测。
针对副溶血弧菌的检测方法主要是传统的培养及生化鉴定等方法，操作繁琐，费时耗力，检测周期长需要5～7天，并且无法对不可培养状态下的副溶血弧菌进行检测，又影响了检测的准确性，而聚合酶链式反应法，即PCR法，具有特异、敏感等特点，针对目前食品卫生标准中大量的“不得检出”也有着很好的应用前景，但是，该类方法通常需要昂贵、精密的仪器设备，对实验环境和操作者技术要求也比较高；同时，由于PCR相关反应需要经过DNA的热变性、长时间的温度循环等等，耗时较长，从3小时到20小时不等，不利于食品中毒的现场快速诊断和处理，所以就目前情况来看，在实验室研究中应用较多，在食品卫生实际检验工作中由于相对要求较高，推广应用上有一定难度。
环介导等温扩增技术Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP是一种新颖的核酸扩增技术，它依赖于能够识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，具有高特异性、快速灵敏、高效、操作简便等特点，目前尚未见利用不耐热溶血毒素基因tlh通过环介导等温扩增法技术快速检测副溶血弧菌的报道。
[发明内容]
本发明的目的是克服现有技术的不足，利用针对副溶血弧菌tlh基因保守区的六个序列而设计的4条特异性引物，和Bst DNA聚合酶，以及四种核苷酸单体dNTP等成份，并采用环介导等温扩增技术，而提供的一种用于检测副溶血弧菌的方法。
为实现上述目的，设计一种用于检测副溶血弧菌的方法，包括DNA模板的制备、采用引物设计软件设计LAMP引物以及引物的合成、副溶血弧菌的环介导等温扩增、产物检测，其特征在于：
(1)DNA模板的制备：
a.取1.0mL细菌纯培养物，置于1.5mL离心管中，以12000转/分离心5分钟，弃上清液；
b.加入100μL无菌水，涡旋混匀，100℃水浴10分钟，立即冰浴2分钟；
c.12000转/分离心5分钟，取上清液备用，作为模板进行扩增；
(2)采用引物设计软件设计LAMP引物为采用primer primer5.0引物软件针对副溶血弧菌tlh基因M36437设计LAMP引物，设计的LAMP引物序列为：
正向内引物FIP：
5’-GCCCATTCCCAATCGGTCG-TTTT-CTATGTTTCGCTGTTGGTATCG-3’；
反向内引物BIP：
5’-GTTCTACACCAACACGTCGCA-TTTT-TCGCCAAATCTAATGTTGCTTC-3；
正向外引物F3：
5’-CAGCACGCAAGAAAACCA-3’；
反向外引物B3：
5’-ATTGTCAGCGGCGAAGAA-3’；
(3)采用副溶血弧菌的环介导等温扩增：
a.配置25uL反应体系，包括：100mM MgSO4 1.5uL、10mM dNTP2.5uL、5M betaine 4uL、20uM正向内引物FIP 1.5uL、20uM反向内引物BIP 1.5uL、10uM正向外引物F3 0.5uL、10uM反向外引物B3 0.5uL、8000U/mL Bst DNA聚合酶大片段1uL、10×ThermoPol buffer 2.5uL、DNA模板2uL、ddH2O 7.5uL；
b.混匀反应体系，于60℃温育60分钟；
c.80℃灭活10分钟；
(4)产物检测：肉眼观察反应体系的浊度变化或5000rpm离心反应体系10s后，观察反应管底部，若体系混浊或反应管底部出现白色沉淀，则待检细菌为副溶血弧菌，若否，则待检细菌不是副溶血弧菌。
所述的正向内引物FIP包括F1的互补序列F1c、TTTT连接子和F2。
所述的反向内引物BIP包括B1的互补序列B1c、TTTT连接子和B2。
F2的5’端与B2的5’端之间的碱基数为120-180bp；F2(B2)的5’端与F1(B1)的3’端之间的碱基数为40-60bp；F2(B2)与F3(B3)之间的碱基数＜20bp；F2、B2的Tm值为55℃-65℃，且F3(B3)Tm值＜F2(B2)Tm值＜F1(B1)Tm值；各引物GC％值为40-60％；F1c(B1c)的5’端、F2(B2)的3’端和F3(B3)的3’端的6个碱基的dG值＜-4kcal/mol；引物3’端碱基按碱基互补配对原则配对。
本发明同现有技术相比，检测方法简便，耗时短，成本低廉，四条特异性引物保证了检测不同来源的副溶血弧菌菌株的可靠性，引物的检测灵敏度高，是简易的常规检测手段，尤其适用于基层检验检疫机构及养殖场，对于提高食品卫生水平、保证食品安全和推动食品国际贸易发展具有重要的意义。
[附图说明]
图1为本发明中副溶血弧菌标准菌株LAMP检测结果的电泳图。
图2为本发明中副溶血弧菌标准菌株LAMP检测结果的目测图。
图3是本发明中Mg2+浓度对LAMP反应的影响结果的电泳图。
图4是本发明中dNTPs浓度对LAMP反应的影响结果的电泳图。
图5是本发明中betaine浓度对LAMP反应的影响结果的电泳图。
图6是本发明中外引物与内引物的浓度比对LAMP反应的影响结果的电泳图。
图7是本发明中反应温度对LAMP反应的影响结果的电泳图。
图8是本发明中反应时间对LAMP反应的影响结果的电泳图。
图9是本发明中LAMP特异性试验结果的电泳图。
图10是本发明中LAMP检测副溶血弧菌基因组DNA的灵敏度试验结果的电泳图。
图11是本发明中LAMP检测副溶血弧菌纯培养物的灵敏度试验结果的电泳图。
图12是本发明中副溶血弧菌tlh基因M36437序列图。
图13是本发明中LAMP引物及靶DNA示意图。
指定图13为摘要附图。
参见附图1和附图2，1为副溶血弧菌标准菌株电泳结果；2为以水作为模板扩增后电泳结果。
参见附图3，M为100bp marker；1为阴性对照；2为2mM；3为4mM；4为6mM；5为8mM；6为10mM；7为12mM；8为14mM；9为16mM；10为18mM。
参见附图4，M为100bp marker；1为阴性对照；2为0mM；3为0.2mM；4为0.4mM；5为0.6mM；6为0.8mM；7为1.0mM；8为1.2mM；9为1.4mM；10为1.6mM；11为1.8mM。
参见附图5，M为100bp marker；1为阴性对照；2为0M；3为0.2M；4为0.4M；5为0.6M；6为0.8M；7为1.0M；8为1.2M。
参见附图6，M为100bp marker；1为阴性对照；2为1∶1；3为1∶2；4为1∶4；5为1∶6；6为1∶8。
参见附图7，M为100bp marker；1为阴性对照；2为53℃；3为55℃；4为58℃；5为60℃；6为63℃；7为65℃.
参见附图8，M为100bp marker；1为阴性对照；2、4、6分别为以副溶血弧菌1基因组DNA为模板反应30、45、60分钟的电泳结果；3、5、7分别为以副溶血弧菌2基因组DNA为模板反应30、45、60分钟的电泳结果。
参见附图9，M为100bp marker；1为阴性对照；2为副溶血弧菌1；3为副溶血弧菌2；4为副溶血弧菌3；5为坎普氏弧菌；6为河弧菌；7为哈维氏弧菌；8为金黄色葡萄球菌；9为沙门氏菌；10为英诺克李斯特菌；11为威尔氏李斯特菌；12为单增李斯特菌1；13为单增李斯特菌2.
参见附图10，M为100bp marker；1为阳性对照；2为90ng；3为9ng；4为900pg；5为90pg；6为9pg；7为900fg；8为90fg；9为9fg；10为0.9fg；11为阴性对照。
参见附图11，M为100bp marker；1为阳性对照；2为2.39×106cfu/mL；3为2.39×105cfu/mL；4为2.39×104cfu/mL；5为2.39×103cfu/mL；6为2.39×102cfu/mL；7为2.39×101cfu/mL；8为2.39×100cfu/mL；9为2.39×10-1cfu/mL；10为阴性对照。
参见附图12，其中划线部分为副溶血弧菌tlh基因M36437中序列中用于引物设计的靶序列。
[具体实施方式]
下面对本发明作进一步的说明，本发明对本专业技术领域的人来说还是比较清楚的。
一、DNA模板的制备：
a.取1.0mL细菌纯培养物，置于1.5mL离心管中，以12000转/分离心5分钟，弃上清液；
b.加入100μL无菌水，涡旋混匀，100℃水浴10分钟，立即冰浴2分钟；
c.12000转/分离心5分钟，取上清液备用，作为模板进行扩增；
二、引物的设计：
根据GenBank公布的副溶血弧菌tlh基因——Accession number：M36437的保守序列，采用primer primer5.0引物软件设计一套特异性的LAMP引物，引物包括正向外引物F3、反向外引物B3，正向内引物FIP、反向内引物BIP，FIP引物包括F1的互补序列F1c、TTTT连接子和F2，BIP引物包括B1的互补序列B1c、TTTT连接子和B2。四条特异性引物序列如下：
正向内引物FIP：
5’-GCCCATTCCCAATCGGTCG-TTTT-CTATGTTTCGCTGTTGGTATCG-3’；
反向内引物BIP：
5’-GTTCTACACCAACACGTCGCA-TTTT-TCGCCAAATCTAATGTTGCTTC-3’；
正向外引物F3：
5’-CAGCACGCAAGAAAACCA-3’；
反向外引物B3：
5’-ATTGTCAGCGGCGAAGAA-3’；
三、采用副溶血弧菌的环介导等温扩增：
扩增前先进行反应体系的建立和优化，体系建立前的优化包括：
Mg2+浓度的优化：选择Mg2+浓度为2mM～18mM进行LAMP反应，最后确定体系中Mg2+最佳浓度为8mM，参见附图3。
dNTPs浓度的优化：选择dNTPs浓度为0mM～1.8mM进行LAMP反应，最后选定1.0mM为体系中最佳dNTPs浓度，参见附图4。
betaine浓度的优化：选择betaine浓度范围0M～1.2M进行LAMP反应，最后选定0.8M为体系中最佳betaine浓度，参见附图5。
内外引物浓度比的优化：选择体系中外引物与内引物的浓度比1∶1-1∶8进行LAMP反应，最后确定1∶6为体系中外引物与内引物的最佳浓度比，参见附图6。
利用上述引物进行反应体系的建立，最后确定采用的副溶血弧菌环介导等温扩增反应体系为25μL体系，包括：100mM MgSO4 1.5uL、10mM dNTP2.5uL、5M betaine 4uL、20uM正向内引物FIP 1.5uL、20uM反向内引物BIP 1.5uL、10uM正向外引物F3 0.5uL、10uM反向外引物B3 0.5uL、8000U/mL Bst DNA聚合酶大片段1uL、10×ThermoPol buffer 2.5uL、DNA模板2uL、ddH2O 7.5uL。
2、然后，反应条件的优化，具体如下：
反应温度的优化：采用优化的反应体系，选择反应温度53℃，55℃，58℃，60℃，63℃，65℃进行LAMP反应，最后确定60℃为最佳反应温度，参见附图7。
反应时间的优化：采用优化的反应体系，选择反应时间30、45、60分钟进行LAMP反应，经过多次实验综合评估，选定最佳反应时间为60min，参见附图8。
利用上述引物和优化的反应体系进行反应条件的优化，确定采用的环介导等温扩增反应条件为：60℃温育60min，80℃灭活10min。
3、最后，进行副溶血弧菌的环介导等温扩增：
利用本发明中的一套特异性LAMP引物，采用上述优化的反应体系和反应条件，对副溶血弧菌标准菌株进行环介导等温扩增，使用2.0％琼脂糖凝胶电泳以及目测法分析扩增结果。
四、产物检测：
上述采用环介导等温扩增后的副溶血弧菌标准菌株，肉眼观察反应管，发现副溶血弧菌标准菌株反应管中反应体系较反应前混浊，而阴性对照管未见混浊，5000rpm离心数秒，可见阳性管底部有少量白色沉淀，而阴性对照管未出现：电泳结果分析，发现副溶血弧菌标准菌株泳道产生阶梯状条带，以水作为模板的阴性对照未有条带出现，表明使用此套特异性引物能够有效地扩增副溶血弧菌tlh基因M36437，参见附图1、2。
五、特异性试验：
利用本发明中的一套特异性LAMP引物，采用优化的反应体系和反应条件，对3株副溶血弧菌、1株坎普氏弧菌、1株河弧菌、1株哈维氏弧菌、1株金黄色葡萄球菌、1株沙门氏菌、1株英诺克李斯特菌、1株威尔氏李斯特菌、2株单增李斯特菌进行环介导等温扩增，使用2.0％琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，发现，仅3株副溶血弧菌出现阶梯状扩增条带，其他9株非副溶血弧菌均未出现阶梯状条带，表明该套引物检测特异性强，参见附图9。
六、灵敏度试验：
采用基因组DNA检测灵敏度：测得基因组DNA检测灵敏度试验中DNA模板的原始浓度为449ng/μL，10倍倍比稀释DNA原液至10-1～10-9，各取2μL作为模板，则各反应体系中模板含量分别为90ng、9ng、900pg、90pg、9pg、900fg、90fg、9fg、0.9fg，进行环介导等温扩增，结果体系中含基因组DNA 90fg时仍出现阶梯状条带，因此该套引物副溶血弧菌基因组DNA检测灵敏度可达到90fg，参见附图10。
采用细菌纯培养物检测灵敏度：将过夜培养的副溶血弧菌菌液10倍倍比稀释至10-1～10-8，取各稀释度菌液100μL进行平板计数，测得原始菌液浓度为2.39×107cfu/mL；同时，取各稀释度菌液1mL，制备模板DNA，各取2μL进行环介导等温扩增，结果当菌液浓度为2.39×101cfu/mL时仍出现阶梯状条带，因此该套引物细菌纯培养物检测灵敏度可达到24cfu/mL，参见附图11。