太子参不定根的诱导及组织培养方法

摘要

本发明是一种药物技术领域的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，包括：(1)取消毒好的太子参外植体，无菌条件下切割后接种在愈伤组织诱导培养基上，于无菌避光条件下诱导愈伤组织；(2)取生长快速、色泽淡黄的愈伤组织，置于含吲哚丁酸、萘乙酸、激动素中的一种或一种以上植物激素的1/2MS固体培养基上无菌避光诱导形成不定根；(3)太子参不定根液体培养：取获得的不定根置含吲哚丁酸、萘乙酸中的一种或一种以上植物激素的1/2MS液体培养基中培养。本发明方法简单、效率高，其中太子参的茎和叶片外植体的不定根诱导率均在90％以上，不定根生长快、接种量少，摇瓶培养18天增长率达46倍以上。

权利要求

1.一种太子参不定根的诱导及其组织培养方法，其特征在于，包括以下具体步骤：(1)太子参愈伤组织的诱导与培养：取太子参不同部位外植体，经消毒洗涤后，无菌条件下将外植体切割，置愈伤组织诱导培养基上，于无菌避光条件下诱导愈伤组织，小心剥离愈伤组织，置相同培养基上扩增培养，扩增的愈伤组织用于诱导不定根；

所述外植体是指：野生太子参的茎、叶片、块根和须根中的任一种；

所述的愈伤组织诱导培养基是指：含1.0mg/L～3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和

0.1mg/L～0.5mg/L激动素的MS固体培养基，所述MS固体培养基由MS液体培养基添加5g/L琼脂制成，pH 5.8；

(2)太子参不定根的诱导与培养：取来自不同部位的愈伤组织，置于1/2MS固体培养基中培养，并于无菌避光条件下诱导不定根；

所述1/2MS固体培养基为MS固体培养基中硝酸铵浓度减半，并添加以下六种激素组合中的任意一种的培养基：a)5mg/L吲哚丁酸、0.1mg/L萘乙酸和0.1mg/L激动素；

b)3mg/L吲哚丁酸和0.3mg/L激动素；

c)2mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L激动素；

d)0.1mg/L吲哚丁酸、3mg/L萘乙酸和0.5mg/L激动素；

e)3mg/L吲哚丁酸，1mg/L萘乙酸和0.1mg/L激动素；

f)3mg/L吲哚丁酸和0.2mg/L激动素；

(3)太子参不定根液体培养：取步骤(2)获得的不定根，置于1/2MS液体培养基中培养；

所述1/2MS液体培养基为MS液体培养基中硝酸铵浓度减半，并添加以下六种激素组合中的任意一种的培养基：i)5mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L萘乙酸；

ii)3mg/L吲哚丁酸和1mg/L萘乙酸；

iii)2mg/L吲哚丁酸和1mg/L萘乙酸；

iv)0.1mg/L吲哚丁酸和3mg/L萘乙酸；

v)3mg/L吲哚丁酸；

vi)3mg/L吲哚丁酸和3mg/L萘乙酸。

2.根据权利要求1所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中，所述的消毒洗涤是指：用75％乙醇浸泡消毒30秒和1％次氯酸钠浸泡消毒15～30分钟，无菌水洗涤5次。

3.根据权利要求1或2所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中，所述的将外植体切割是指：将茎和须根切1cm的段、叶片切1cm×1cm的片和块根切

0.5cm×0.5cm×0.3cm的块。

4.根据权利要求1或2所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中，所述的无菌避光条件下诱导愈伤组织是指：于20℃～25℃无菌避光条件下培养18天-28天诱导愈伤组织。

5.根据权利要求1所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其特征是，步骤(2)中，所述的无菌避光条件下诱导不定根是指：于20℃～25℃无菌避光条件下培养25天-35天诱导不定根。

6.根据权利要求1所述的太子参不定根诱导及其组织培养的方法，其特征是，步骤(3)中，所述的培养，是指在摇床转速为80r/min～120r/min、温度20℃～25℃条件下培养15天～21天。

说明书

太子参不定根的诱导及组织培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种植物技术领域的培养方法，特别是一种太子参不定根的诱导及组织培养方法。

背景技术

[0002] 太子参为石竹科植物孩儿参(Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax exPax ex Hoffm)的干燥块根，是《中国药典(第五版)》收载的常用补益类中药，具有益气健脾、生津润肺之功效，临床常用于治疗脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、自汗口渴和肺燥干咳等。民间常用作强壮滋补品，尤其用于治疗小儿脾虚而食欲不振。现代化学和药理学研究表明，太子参主要含有环肽类、三萜皂苷类、多糖及游离氨基酸等成分，具有抗应激、抗疲劳、耐缺氧和延缓衰老等功能。太子参中具有重要生理活性的一类物质是环肽类化合物，已鉴定结构的共有12种环肽。文献报道Pseudostellaria B具有显著地抑制酪氨酸激酶活性从而阻止黑色素的生成作用，环肽能形成限制性构象，与相应的线性肽相比具有更好的抗酶解和抗化学降解的能力，因此该类化合物在生物医药和化妆品等行业中具有重要应用前景。近年来，太子参的市场需求日益扩大，而野生资源遭到人为掠夺性采挖，导致市场价格不断上涨，影响了相关产业，如医药、化妆品等的应用发展。

[0003] 不定根是由植物愈伤组织诱导分化产生的离体植物器官，不定根培养是近年来发展起来的一项组织培养新技术。与药用植物的悬浮培养细胞相比，不定根有效成分含量稳定；和大田栽培的植物相比，不仅有效成分含量高且稳定、生长速度快，而且节省土地资源，因此不定根培养适合于药用植物尤其是根类药材如太子参的组织培养，以获得组织培养物或其有效成分。

[0004] 经对现有技术的查新，目前尚无有关太子参不定根的组织培养及其有效成分生产方法的文献报道和应用，而仅有的太子参悬浮细胞培养体系30天仅增长5倍。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种太子参不定根的诱导及组织培养方法，使其具有简便易行，不定根诱导率高、液体培养基中生长速度快的特点，所获得的太子参不定根生长速度可以达到18天增长46.1倍。

[0006] 本发明是通过下述技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

[0007] (1)太子参愈伤组织的诱导与培养：取太子参不同部位外植体，经消毒洗涤后，无菌条件下将外植体切割，置愈伤组织诱导培养基上，于无菌避光条件下诱导愈伤组织。小心剥离生长快速、色泽淡黄的愈伤组织，置相同培养基上扩增培养，扩增的愈伤组织用于诱导不定根；

[0008] (2)太子参不定根的诱导与培养：取来自不同部位生长快速、色泽淡黄的愈伤组织，置于含吲哚丁酸、萘乙酸、激动素中的一种或一种以上植物激素的1/2 MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导不定根；

[0009] (3)太子参不定根液体培养：取步骤(2)获得的不定根，置含有吲哚丁酸、萘乙酸中的一种或一种以上植物激素的1/2MS液体培养基中培养。

[0010] 步骤(1)中所述的外植体是指野生太子参的茎、叶片、块根和须根中的任一种。

[0011] 步骤(1)中所述的消毒洗涤是指经75％(v/v，下同)乙醇浸泡消毒30秒和1％(w/v，下同)次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15～30分钟，无菌水洗涤5次。

[0012] 步骤(1)中所述的将外植体切割是指将茎和须根切段(1cm)、叶片切片(1cm×1cm)和块根切块(0.5cm×0.5cm×0.3cm)。

[0013] 步骤(1)中所述的愈伤组织诱导培养基是指：含1.0mg/L～3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.1mg/L～0.5mg/L激动素的MS固体培养基，所述MS固体培养基由MS液体培养基添加5g/L琼脂制成，pH 5.8。

[0014] 步骤(1)中所述的无菌避光条件下诱导愈伤组织，是指于20℃～25℃无菌避光条件下培养18天-28天诱导愈伤组织。

[0015] 步骤(2)中所述的1/2MS固体培养基(MS固体培养基中硝酸铵浓度减半的培养基，下同)，是指含0.1mg/L～5mg/L吲哚丁酸、0.1mg/L～3mg/L萘乙酸、0.1mg/L～0.5mg/L激动素中的一种或一种以上植物激素的培养基。

[0016] 步骤(2)中所述的无菌避光条件下诱导不定根，是指于20℃～25℃无菌避光条件下培养25天-35天诱导不定根。

[0017] 步骤(3)中所述的培养基，是指含有0.1mg/L～5mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L～3mg/L萘乙酸中的一种或一种以上植物激素的1/2MS液体培养基(MS液体培养基中硝酸铵浓度减半的培养基，下同)。

[0018] 步骤(3)中所述的培养，是指在摇床转速为80r/min～120r/min、温度20℃～25℃条件下培养15天～21天。

[0019] 本发明诱导与培养方法简单、效率高，其中野生太子参的茎和叶片外植体的不定根诱导率均在90％以上；本发明诱导的不定根生长速度快，液体摇瓶18天增长率达46倍以上；不定根产物的收获简单，只需经过简单过滤冲洗即可。

具体实施方式

[0020] 下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0021] 本发明实施条件为：诱导愈伤组织的较优外植体为茎和叶片，经75％乙醇消毒30秒后再经1％次氯酸钠消毒15分钟～20分钟，置含1.5mg/L～2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.2mg/L～0.5mg/L激动素的1/2 MS固体培养基(pH 5.8)上无菌避光培养25天；所获得的愈伤组织置含1mg/L～3mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L～0.3mg/L激动素的1/2 MS固体培养基上培养25天～28天诱导形成不定根；选取诱导的不定根置含1mg/L～3mg/L吲哚丁酸和1mg/L萘乙酸的1/2 MS液体培养基中无菌避光震荡培养，摇床转速120r/min，温度22～24℃，培养时间为18天。

[0022] 实施例1：

[0023] 取太子参须根外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒20分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下将须根外植体切段(1cm)，置于含1.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.1mg/L激动素MS固体培养基上(pH 5.8)，于20℃无菌避光诱导28天获得生长快速、色泽淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组织置添加5mg/L吲哚丁酸、0.1mg/L萘乙酸和0.1mg/L激动素的1/2 MS固体培养基上，于20℃无菌避光条件下诱导28天生成不定根。取上述诱导的不定根，转入含5mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L萘乙酸的1/2 MS液体培养基中，80r/min、20℃无菌避光培养21天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。

[0024] 实施效果：愈伤组织诱导率达61％，不定根诱导率达90％，不定根短且多分支，无愈伤化现象。

[0025] 实施例2：

[0026] 取太子参茎外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下将茎外植体切段(1cm)，置于含2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.2mg/L激动素的MS固体培养基上(pH 5.8)，于22℃无菌避光诱导25天获得生长快速、色泽淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组织置添加3mg/L吲哚丁酸和0.3mg/L激动素的1/2MS固体培养基上，于22℃无菌避光条件下诱导25天生成不定根。取上述诱导的不定根，转入含
3mg/L吲哚丁酸和1mg/L萘乙酸的1/2MS液体培养基中，120r/min、22℃无菌避光培养18天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。

[0027] 实施效果：愈伤组织诱导率达80％，不定根诱导率达100％，不定根呈米白色、较长且多分支，无愈伤化现象。

[0028] 实施例3：

[0029] 取太子参茎外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下将茎外植体切段(1cm)，置于含1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.1mg/L激动素的MS固体培养基上(pH 5.8)，于25℃无菌避光诱导18天获得生长快速、色泽淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组织置添加2mg/L吲哚丁酸和0.1mg/L激动素的1/2MS固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导25天生成不定根。取上述诱导的不定根，转入含
2mg/L吲哚丁酸和1mg/L萘乙酸的1/2MS液体培养基中，120r/min、25℃无菌避光培养15天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。

[0030] 实施效果：愈伤组织诱导率达75％，不定根诱导率达90％，不定根呈米白色、长且多分支，无愈伤化现象。

[0031] 实施例4：

[0032] 取太子参块根外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒30分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下将块根外植体切段(1cm)，接种在含3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.5mg/L激动素的MS固体培养基上(pH 5.8)，于20℃无菌避光诱导28天获得生长快速、色泽米黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组织置添加0.1mg/L吲哚丁酸、3mg/L萘乙酸和0.5mg/L激动素的1/2MS固体培养基上，于20℃无菌避光条件下诱导35天生成不定根。取上述诱导的不定根，转入含0.1mg/L吲哚丁酸和3mg/L萘乙酸的1/2MS液体培养基中，
100r/min、20℃无菌避光培养18天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。

[0033] 实施效果：愈伤组织诱导率达45％，不定根诱导率达80％，不定根色泽淡黄、较长且分支较少，无愈伤化现象。

[0034] 实施例5：

[0035] 取太子参叶片外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次，再经1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下将叶片外植体用打孔器切圆片(1cm×1cm)，置于含1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.2mg/L激动素的MS固体培养基上(pH 5.8)，于25℃无菌避光诱导25天获得生长快速、色泽淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组织置添加3mg/L吲哚丁酸，1mg/L萘乙酸和0.1mg/L激动素的1/2MS固体培养基上，于25℃无菌避光条件下诱导25天生成不定根。取上述诱导的不定根，转入含3mg/L吲哚丁酸的1/2MS液体培养基中，120r/min、25℃无菌避光培养15天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。

[0036] 实施效果：愈伤组织诱导率达90％，不定根诱导率达90％，不定根呈白色、较长且多分支，无愈伤化现象。

[0037] 实施例6：

[0038] 取太子参叶片外植体，经75％乙醇浸泡消毒30秒，无菌水冲洗5次后，再经1％次氯酸钠(有效氯含量)浸泡消毒15分钟，无菌水洗涤5次，于无菌条件下将叶片外植体用打孔器切圆片(1cm×1cm)，置于含2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.1mg/L激动素的MS固体培养基上(pH 5.8)，于22℃无菌避光诱导21天获得生长快速、色泽淡黄的愈伤组织。小心剥取愈伤组织，置相同培养基上继续培养，扩增的愈伤组织置添加3mg/L吲哚丁酸和0.2mg/L激动素的1/2MS固体培养基上，于22℃无菌避光条件下诱导28天生成不定根。取上述诱导的不定根，转入含3mg/L吲哚丁酸和3mg/L萘乙酸的1/2MS液体培养基中，100r/min、22℃无菌避光培养18天，即获得快速繁殖的太子参不定根液体培养体系。

[0039] 实施效果：愈伤组织诱导率达80％，不定根诱导率达100％，不定根呈白色、长且多分支，无愈伤化现象。

[0040] 实施例7：

[0041] 取实施例2获得的摇瓶震荡培养14天的太子参不定根，以每250mL容量锥形瓶装75mL液体培养基计算，分别按0.2％(即0.2g新鲜不定根/100mL培养液，下同)、0.4％、
0.6％、0.8％、1.0％、1.5％和2％接种新鲜不定根，按实施例2中的培养条件培养18天，结果发现：(1)随着接种量的增加，不定根的收获量也增加，但是当接种量超过1％(1g新鲜不定根/100mL)后，不定根的收获量反而降低，因此1％接种量获得不定根的最大收获量；(2)随着接种量的增加生长指数(收获量/接种量)逐渐下降，最低接种量即0.2％获得最高的生长指数。综合考虑，选择0.2％接种量为最佳接种量。

[0042] 取实施例2获得的液体培养的生长14天的太子参不定根，以1/2MS液体培养基(pH 5.8)为基本培养基研究吲哚丁酸和萘乙酸两种激素对太子参不定根生长的影响，两种激素的浓度均设定0.1、1、3和5mg/L以及空白对照，接种量均为0.2％，其它条件同实施例2，培养14天后进行统计，结果发现不定根生长对萘乙酸更为敏感，1mg/L的萘乙酸使太子参不定根在14天内增长33.7倍，比5mg/L吲哚丁酸所引起的32.1倍增长率还高。因此选择1mg/L萘乙酸为基本激素，并进一步研究组合添加0.1、1、3和5mg/L吲哚丁酸及空白对