一种测定植物的一氧化二氮排放量的方法转让专利
申请号 : CN200710158574.1
文献号 : CN101162216B
文献日 : 2010-07-28
发明人 : 陈冠雄 , 倪志龙 , 周丽沙 , 张颖 , 李慧 , 韩斯琴 , 史荣久 , 杨伟超 , 丁雷 , 徐慧
申请人 : 中国科学院沈阳应用生态研究所
摘要 :
本发明属于全球变化学-陆地生态系统-大气间温室气体交换领域，具体为一种测定植物一氧化二氮(N2O)排放量的方法。具体测定过程为：取新鲜植物枝叶，洗净后剪碎，放入匀浆杯中，加入适量预冷匀浆缓冲液后匀浆。将所得匀浆液放入透光容器内，封口，在光照条件下培养，用GC-ECD测定N2O体积浓度。根据培养时间内容器气相中N2O质量的增量、容器内的气相体积和植物干重计算出植物的N2O排放通量。本发明解决常用封闭式箱法存在的费时、容易损伤植物、不能用来测定个体高大或排放量小的植物等问题，它是一种适合植物个体大小不同、排放量不同的操作简便、费用低廉的测定植物N2O排放量的方法。
权利要求 :
1.一种测定植物的一氧化二氮排放量的方法，其特征在于：首先，取新鲜的植物的地上部材料，经洗净后，把能被匀浆的部分与不能被匀浆的部分分开，剪碎；然后，将可匀浆部分放入匀浆杯内，加入适量的预冷匀浆缓冲液，使植物鲜重(g)∶匀浆缓冲液体积(mL)＝1∶1～4，匀浆0.5～1.5分钟；再将所得匀浆液和剪碎的不能被匀浆的部分一并放入透光容器内，封口，立即用气密性注射器从容器内取零时气体样品；接着，将植物试样置于光照条件下培育一段时间，待N2O体积浓度与零时气体样品的浓度相比增加量大于10％后，从容器内取出终时气体样品，用带电子捕获检测器的气相色谱仪测定气体样品中的N2O体积浓度；
盛匀浆液的容器是惰性的，既不吸收也不排放N2O，且具有良好透光性，在培育过程中，容器置于适当光照条件下，光强范围为50-300μmol·m-2·s-1；
所用匀浆缓冲液的pH在7.5～8.8，且含有保护植物产生N2O的相关酶活性的成分。
2.按照权利要求1所述的测定植物的一氧化二氮排放量的方法，其特征在于：所用植物材料是新鲜的，依次经过自来水、蒸馏水、无菌水洗净。
3.按照权利要求1所述的测定植物的一氧化二氮排放量的方法，其特征在于：匀浆杯和匀浆缓冲液须在冰箱内3～5℃预冷。
4.按照权利要求1所述的测定植物的一氧化二氮排放量的方法，其特征在于：匀浆缓冲液为磷酸盐匀浆缓冲液或HEPES匀浆缓冲液，磷酸盐匀浆缓冲液的组成为：25mmol/L磷酸盐缓冲液+1mmol/L EDTA+10mmol/L半胱氨酸，pH8.8；HEPES匀浆缓冲液的组成为：20mmol/L HEPES+5mmol/L EDTA+5mmol/L半胱氨酸，pH7.5。
5.按照权利要求1所述的测定植物的一氧化二氮排放量的方法，其特征在于：利用多接头玻璃管同时制备多个用于测定N2O排放量的样品。
说明书 :
技术领域
本发明属于全球变化学-陆地生态系统-大气间温室气体交换领域，具体为一种测定植物一氧化二氮(N2O)排放量的方法。
背景技术
联合国所属“政府间气候变化专门委员会”(Intergovernmental Panel on ClimateChange，IPCC)报告(2007)指出，全球气候变暖很可能是由人类活动增强引起温室气体排放增加造成的。一氧化二氮(N2O)是一种重要温室气体，以克分子计，其增温潜势约分别为CO2的300倍和CH4的29倍。N2O属生物源温室气体，其排入大气总量的70～90％来自生物排放。以往认为，微生物的硝化-反硝化作用是产生N2O的唯一生物过程。1989年，中国学者在国际上首先报道植物自身也可以产生/排放N2O，并随后得到国内外同行实验的证实。植物排放N2O的发现为解决全球N2O源汇不平衡提供了一种可能。但如何精确估算植物在土壤-植物系统N2O排放中的贡献，在方法上一直存在困难。目前，普遍用于植物或土壤-植物系统N2O排放测定的方法是封闭式箱法。该方法虽然可用来测定个体较小的植物的N2O排放，但在实际操作中需要把植物与土壤分隔开时，不仅非常费时(有时甚至不可能)，而且容易损伤植物，更重要的是它不能用来测定个体高大或排放量小的植物的N2O排放。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定植物的一氧化二氮排放量的方法，解决常用封闭式箱法存在的费时、容易损伤植物、不能用来测定个体高大或排放量小的植物等问题。
本发明采用的技术方案为：
一种测定植物的一氧化二氮排放量的方法，具体步骤如下：
(1)采集植物的地上部(对于个体较矮小的植物，如蔬菜，采集全部地上部；对于个体较高大的植物，如树木，采集地上部不同部位的枝叶，使采集的样品具有代表性)，并保持其新鲜状态。
(2)依植物样品的可获得性、氮含量高低、匀浆杯的容积等因素，从采集的样品中随机取3～5份10～200克的植物试材，用自来水→蒸馏水→无菌水洗净。将能被匀浆的部分(如叶片)与不能被匀浆的部分(如粗茎/枝条)分开，并分别剪碎。
(3)将剪碎的叶片放入预冷的匀浆杯中，依叶片不同特性(如纤维素含量、水分含量等)加入适量的匀浆缓冲液，使植物试材重量(克)：匀浆缓冲液体积(毫升)＝1∶1～4，匀浆0.5～1.5分钟，得匀浆液。
本发明所用的匀浆缓冲液的pH应在7.5～8.8，且应含有保护植物产生N2O的相关酶活性的成分。本方法所用的匀浆缓冲液有两种，即磷酸盐匀浆缓冲液和HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-thanesulfonic acid)匀浆缓冲液，它们的组成分别为：25mmol/L磷酸盐缓冲液+1mmol/L EDTA+10mmol/L半胱氨酸，pH 8.8和20mmol/L HEPES+5mmol/L EDTA+5mmol/L半胱氨酸，pH7.5。实验表明，在保持植物产生N2O的相关酶活性方面，HEPES匀浆缓冲液显著优于磷酸盐匀浆缓冲液。
其中，磷酸盐缓冲液的配比如下：取磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)0.91g，与磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)42.44g，加水使成1000ml，即得。
匀浆杯和匀浆缓冲液须在冰箱内(3～5℃)预冷。
(4)将所得匀浆液及剪碎的茎/枝条一并放入适当体积的玻璃瓶或惰性的透光塑料袋内，封口(或用不含N2O的人工配制的空气置换瓶内的空气后封口)，用气密性注射器取零时气样后，置于光照条件下培育，光强范围为50-300μmol·m-2·s-1。
(5)约每隔1小时采一次气样，待玻璃瓶(或塑料袋)内的N2O体积浓度比零时的浓度增加量大于10％后，即可终止采样。
(6)用GC-ECD(气相色谱法)测定气样中的N2O体积浓度。
(7)根据所用植物试材的干重、瓶的气相体积和培育时间内N2O质量的增量，计算出植物N2O排放量(μgN h-1Kg-1dw)，具体计算公式如下：
F＝Δm/Δt×w
式中：F为植物N2O排放通量，Δm为培养时间Δt(小时)内，培养瓶内N2O-N质量的增量(μg)，w为植物试材的烘干重(Kg)。
本发明的有益效果是：
(1)本发明取新鲜植物枝叶，洗净后剪碎，放入匀浆杯中，加入适量预冷匀浆缓冲液后匀浆。将所得匀浆液放入透光容器内，封口，在光照条件下培养，用GC-ECD测定N2O体积浓度。根据培养时间内容器气相中N2O质量的增量、容器内的气相体积和植物干重计算出植物的N2O排放通量。本发明克服了常用封闭式箱法的缺点，设计了一种适合植物个体大小不同、排放量不同的操作简便、费用低廉的测定植物N2O排放量的方法。
(2)本发明匀浆杯和匀浆缓冲液预冷，以防止匀浆过程产生过热，破坏植物的组织。
(3)本发明仅仅通过利用多接头玻璃管就可同时制备多个用于测定N2O排放量的样品，比目前常用的箱法既经济又省时。
(4)本发明方法应用范围广，不仅可以代替目前用于测定个体矮小、排放量较大的植物N2O排放的封闭式箱法，而且还可用来测定因个体高大无法应用箱法的植物N2O排放。此外，该方法通过用不含N2O的人造空气置换盛装匀浆液的容器气相中的空气，还可用于测定排放量小的植物的N2O排放。
本发明采用的技术方案为：
一种测定植物的一氧化二氮排放量的方法，具体步骤如下：
(1)采集植物的地上部(对于个体较矮小的植物，如蔬菜，采集全部地上部；对于个体较高大的植物，如树木，采集地上部不同部位的枝叶，使采集的样品具有代表性)，并保持其新鲜状态。
(2)依植物样品的可获得性、氮含量高低、匀浆杯的容积等因素，从采集的样品中随机取3～5份10～200克的植物试材，用自来水→蒸馏水→无菌水洗净。将能被匀浆的部分(如叶片)与不能被匀浆的部分(如粗茎/枝条)分开，并分别剪碎。
(3)将剪碎的叶片放入预冷的匀浆杯中，依叶片不同特性(如纤维素含量、水分含量等)加入适量的匀浆缓冲液，使植物试材重量(克)：匀浆缓冲液体积(毫升)＝1∶1～4，匀浆0.5～1.5分钟，得匀浆液。
本发明所用的匀浆缓冲液的pH应在7.5～8.8，且应含有保护植物产生N2O的相关酶活性的成分。本方法所用的匀浆缓冲液有两种，即磷酸盐匀浆缓冲液和HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-thanesulfonic acid)匀浆缓冲液，它们的组成分别为：25mmol/L磷酸盐缓冲液+1mmol/L EDTA+10mmol/L半胱氨酸，pH 8.8和20mmol/L HEPES+5mmol/L EDTA+5mmol/L半胱氨酸，pH7.5。实验表明，在保持植物产生N2O的相关酶活性方面，HEPES匀浆缓冲液显著优于磷酸盐匀浆缓冲液。
其中，磷酸盐缓冲液的配比如下：取磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)0.91g，与磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)42.44g，加水使成1000ml，即得。
匀浆杯和匀浆缓冲液须在冰箱内(3～5℃)预冷。
(4)将所得匀浆液及剪碎的茎/枝条一并放入适当体积的玻璃瓶或惰性的透光塑料袋内，封口(或用不含N2O的人工配制的空气置换瓶内的空气后封口)，用气密性注射器取零时气样后，置于光照条件下培育，光强范围为50-300μmol·m-2·s-1。
(5)约每隔1小时采一次气样，待玻璃瓶(或塑料袋)内的N2O体积浓度比零时的浓度增加量大于10％后，即可终止采样。
(6)用GC-ECD(气相色谱法)测定气样中的N2O体积浓度。
(7)根据所用植物试材的干重、瓶的气相体积和培育时间内N2O质量的增量，计算出植物N2O排放量(μgN h-1Kg-1dw)，具体计算公式如下：
F＝Δm/Δt×w
式中：F为植物N2O排放通量，Δm为培养时间Δt(小时)内，培养瓶内N2O-N质量的增量(μg)，w为植物试材的烘干重(Kg)。
本发明的有益效果是：
(1)本发明取新鲜植物枝叶，洗净后剪碎，放入匀浆杯中，加入适量预冷匀浆缓冲液后匀浆。将所得匀浆液放入透光容器内，封口，在光照条件下培养，用GC-ECD测定N2O体积浓度。根据培养时间内容器气相中N2O质量的增量、容器内的气相体积和植物干重计算出植物的N2O排放通量。本发明克服了常用封闭式箱法的缺点，设计了一种适合植物个体大小不同、排放量不同的操作简便、费用低廉的测定植物N2O排放量的方法。
(2)本发明匀浆杯和匀浆缓冲液预冷，以防止匀浆过程产生过热，破坏植物的组织。
(3)本发明仅仅通过利用多接头玻璃管就可同时制备多个用于测定N2O排放量的样品，比目前常用的箱法既经济又省时。
(4)本发明方法应用范围广，不仅可以代替目前用于测定个体矮小、排放量较大的植物N2O排放的封闭式箱法，而且还可用来测定因个体高大无法应用箱法的植物N2O排放。此外，该方法通过用不含N2O的人造空气置换盛装匀浆液的容器气相中的空气，还可用于测定排放量小的植物的N2O排放。
具体实施方式
为了进一步理解本发明的方法，下面的实施例用来进一步说明本发明，但并不意味对本发明的任何限制。
本发明取新鲜的植物地上部材料，经洗净后，把能被匀浆的部分(如叶片)与不能被匀浆的部分(如粗茎/枝条)分开，剪碎。将能被匀浆的部分放入匀浆杯内，加入适量的预冷匀浆缓冲液(植物鲜重(g)∶匀浆缓冲液体积(mL)＝1∶1～4)，匀浆0.5～1.5分钟。将所得匀浆液和剪碎的粗茎/枝条一并放入透光容器内(如：玻璃瓶、塑料袋等)，封口，立即用气密性注射器从容器内取零时气体样品。将植物试样置于光照条件下培育一段时间后，再从容器内取终时气体样品。用带电子捕获检测器(ECD)的气相色谱仪(GC)测定气体样品中的N2O体积浓度。
实施例1
1.称取5份新鲜菠菜，每份20克，用自来水—蒸馏水—无菌水将其洗净，并用滤纸吸去表面水分。
2.将上述样品剪成小段后，分别放到预冷的匀浆杯内，再加入预冷的30mLHEPES匀浆缓冲液(菠菜重量(克)∶HEPES匀浆缓冲液体积(毫升)＝1∶1.5)，匀浆杯和匀浆缓冲液均事先在冰箱内(4℃左右)预冷过夜，达到恒温为止。
3.匀浆30秒。
4.将匀浆液分别装入300mL体积的滴流瓶内，用反口塞封口后，立刻用注射器从瓶内取零时气样。
5.将玻璃瓶置于光强100μmol·m-2·s-1条件下培育2小时，从瓶内取终时气样。
6.用带ECD检测器的气相色谱仪(Shimadzu GC-14A)测定气样中的N2O体积浓度。
7.根据培养瓶的气相体积、供试植物材料的干重和培养时间内培养瓶内N2O的质量增量，依上述公式计算出菠菜的平均N2O排放通量为45.5μgN h-1Kg-1dw。
实施例2
1.称取5份新鲜芹菜，每份30克，洗净并吸去表面水分。
2.将上述试样剪成小段后，分别放入预冷匀浆杯内，再加入60mL预冷HEPES匀浆缓冲液，匀浆杯和匀浆缓冲液均事先在冰箱内(4℃左右)预冷过夜，达到恒温为止。
3.匀浆40秒。
4.将匀浆液分别装入500mL体积的滴流瓶内，用反口塞封口后，立刻用注射器从瓶内取零时气样。
5.将玻璃瓶置于90μmol·m-2·s-1光强条件下培育3小时，从瓶内取终时气样。
6.用GC-ECD测定气样中的N2O体积浓度。
7.根据培养瓶内的气相体积、供试植物材料的干重和培养时间内培养瓶内N2O质量的增量，依上述公式计算出芹菜的平均N2O排放通量为20.3μg Nh-1Kg-1dw。
实施例3
1.从田间采集处于开花初期的大豆植株20棵，在实验室无氮培养液中培养过夜，达到恒温为止。
2.取大豆植株的地上部，洗净吸干。
3.剪下叶片、叶柄和茎，分别称重，并计算叶与叶柄和叶与茎的重量比例。
4.随即称取5份叶片，每份100克，并按3计算出的比例，称取相应重量的叶柄和茎，并剪成小段。
5.将叶片剪碎后分别放入预冷的匀浆杯内，加入400mL预冷HEPES匀浆缓冲液，匀浆杯和匀浆缓冲液均事先在冰箱内(4℃左右)预冷过夜，达到恒温为止。
6.匀浆1分钟。
7.将匀浆液和相应的叶柄和茎装入体积2500mL的透光塑料袋内，封口，用注射器从袋内取零时气样。
8.将塑料袋置于200μmol·m-2·s-1光强下培育3小时，从袋内取终时气样。
9.用GC-ECD测定气样中的N2O体积浓度。
10.根据塑料袋的气相体积、供试大豆材料的干重和培养时间内塑料袋气相内N2O质量的增量，依上述公式计算出大豆的平均N2O排放通量为27.4μgNh-1Kg-1dw。
实施例结果表明，本发明是一种适用范围广、操作简便、费用低廉的测定植物N2O排放量的方法。
本发明取新鲜的植物地上部材料，经洗净后，把能被匀浆的部分(如叶片)与不能被匀浆的部分(如粗茎/枝条)分开，剪碎。将能被匀浆的部分放入匀浆杯内，加入适量的预冷匀浆缓冲液(植物鲜重(g)∶匀浆缓冲液体积(mL)＝1∶1～4)，匀浆0.5～1.5分钟。将所得匀浆液和剪碎的粗茎/枝条一并放入透光容器内(如：玻璃瓶、塑料袋等)，封口，立即用气密性注射器从容器内取零时气体样品。将植物试样置于光照条件下培育一段时间后，再从容器内取终时气体样品。用带电子捕获检测器(ECD)的气相色谱仪(GC)测定气体样品中的N2O体积浓度。
实施例1
1.称取5份新鲜菠菜，每份20克，用自来水—蒸馏水—无菌水将其洗净，并用滤纸吸去表面水分。
2.将上述样品剪成小段后，分别放到预冷的匀浆杯内，再加入预冷的30mLHEPES匀浆缓冲液(菠菜重量(克)∶HEPES匀浆缓冲液体积(毫升)＝1∶1.5)，匀浆杯和匀浆缓冲液均事先在冰箱内(4℃左右)预冷过夜，达到恒温为止。
3.匀浆30秒。
4.将匀浆液分别装入300mL体积的滴流瓶内，用反口塞封口后，立刻用注射器从瓶内取零时气样。
5.将玻璃瓶置于光强100μmol·m-2·s-1条件下培育2小时，从瓶内取终时气样。
6.用带ECD检测器的气相色谱仪(Shimadzu GC-14A)测定气样中的N2O体积浓度。
7.根据培养瓶的气相体积、供试植物材料的干重和培养时间内培养瓶内N2O的质量增量，依上述公式计算出菠菜的平均N2O排放通量为45.5μgN h-1Kg-1dw。
实施例2
1.称取5份新鲜芹菜，每份30克，洗净并吸去表面水分。
2.将上述试样剪成小段后，分别放入预冷匀浆杯内，再加入60mL预冷HEPES匀浆缓冲液，匀浆杯和匀浆缓冲液均事先在冰箱内(4℃左右)预冷过夜，达到恒温为止。
3.匀浆40秒。
4.将匀浆液分别装入500mL体积的滴流瓶内，用反口塞封口后，立刻用注射器从瓶内取零时气样。
5.将玻璃瓶置于90μmol·m-2·s-1光强条件下培育3小时，从瓶内取终时气样。
6.用GC-ECD测定气样中的N2O体积浓度。
7.根据培养瓶内的气相体积、供试植物材料的干重和培养时间内培养瓶内N2O质量的增量，依上述公式计算出芹菜的平均N2O排放通量为20.3μg Nh-1Kg-1dw。
实施例3
1.从田间采集处于开花初期的大豆植株20棵，在实验室无氮培养液中培养过夜，达到恒温为止。
2.取大豆植株的地上部，洗净吸干。
3.剪下叶片、叶柄和茎，分别称重，并计算叶与叶柄和叶与茎的重量比例。
4.随即称取5份叶片，每份100克，并按3计算出的比例，称取相应重量的叶柄和茎，并剪成小段。
5.将叶片剪碎后分别放入预冷的匀浆杯内，加入400mL预冷HEPES匀浆缓冲液，匀浆杯和匀浆缓冲液均事先在冰箱内(4℃左右)预冷过夜，达到恒温为止。
6.匀浆1分钟。
7.将匀浆液和相应的叶柄和茎装入体积2500mL的透光塑料袋内，封口，用注射器从袋内取零时气样。
8.将塑料袋置于200μmol·m-2·s-1光强下培育3小时，从袋内取终时气样。
9.用GC-ECD测定气样中的N2O体积浓度。
10.根据塑料袋的气相体积、供试大豆材料的干重和培养时间内塑料袋气相内N2O质量的增量，依上述公式计算出大豆的平均N2O排放通量为27.4μgNh-1Kg-1dw。
实施例结果表明，本发明是一种适用范围广、操作简便、费用低廉的测定植物N2O排放量的方法。