核酸,多肽,以及调节细胞凋亡的方法

摘要

本发明公开了核酸，多肽，以及调节细胞凋亡的方法。具体地，本发明涉及分离和/或纯化的大鼠细胞凋亡-特异性真核生物起始因子-5A(eIF-5A)和脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)的核酸及多肽。本发明还涉及使用细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS调节细胞凋亡的方法，以及用于这种方法中的细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS的反义寡核苷酸及表达载体。

权利要求

1.一种表达载体在制备用于增加癌症细胞凋亡的药物中的用途，其中所述表达载体含有如SEQ ID N0：3所示的分离的核苷酸序列。

说明书

核酸，多肽，以及调节细胞凋亡的方法

[0001] 本申请是申请日为2002年7月23日的中国专利申请02818632.X“核酸，多肽，以及调节细胞凋亡的方法”的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及细胞凋亡-特异性真核生物起始因子-5A(eIF-5A)和脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)的核酸及多肽，以及使用细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS调节细胞凋亡的方法。

背景技术

[0003] 细胞凋亡属于基因程序性细胞事件，其特征在于通过明确的形态学特征，如细胞皱缩，染色质凝聚，核断裂，以及膜起泡。Kerr等(1972)Br.J.Cancer，26，239-257；Wyllie等(1980)Int.Rev.Cytol.，68，251-306。它在正常组织发育和内环境稳定方面起着重要的作用，细胞凋亡程序的缺损被认为会导致从神经变性及自身免疫性疾病到肿瘤的多种人类 疾 病。Thompson(1995)Science，267，1456-1462；Mullauer等 (2001)Mutat.Res，488，211-231。虽然已经详细描述过凋亡细胞的形态学特征，但却刚刚开始阐述调节这一过程的分子途径。

[0004] 被认为在细胞凋亡中发挥重要作用的其中一类蛋白是半胱氨酸蛋白酶家族，其也被称作天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)，它似乎是绝大多数细胞凋亡途径所需的。Creagh & Martin(2001)Biochem.Soc. Trans，29，696-701；Dales等(2001)Leuk.Lymphoma，41，247-253。天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶引发细胞凋亡来应答由于剪切各种细胞蛋白所产生的细胞凋亡刺激物，从而导致细胞凋亡的典型表现形式，包括细胞皱缩，膜起泡和DNA断裂。Chang&Yahg(2000)Microbiol.Mol.Biol.Rev.，64，821-846。 [0005] 促细胞凋亡蛋白，如Bax或Bak也可释放天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化分子，如线粒体细胞色素c，由此通过细胞凋亡促进细胞死亡而在细胞凋亡途径中发挥重要作用。Martinou & Green(2001) Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.，2，63-67；Zou等(1997)Cell，90，405-413。抗-细胞凋亡蛋白，如Bcl-2，通过拮抗促细胞凋亡蛋白Bax和Bak的活性而促进细胞存活。Tsujimoto(1998)Genes Cells，3，697-707；Kroemer(1997)Nature Med.，
3，614-620。Bax：Bcl-2的比例被认为是决定细胞命运的其中一种方式；Bax过量会促进细胞凋亡，而Bcl-2过量则促进细胞存活。Salomons等(1997)Int.J.Cancer，71，959-965；
Wallace-Brodeur & Lowe(1999)Cell Mol.Life Sci.，55，64-75。

[0006] 涉及细胞凋亡的其它重要蛋白是由肿瘤抑制基因p53编码的。这种蛋白是调节细胞生长并诱导受损且遗传学上不稳定的细胞的凋亡的转录因子，据推测这大概是通过上调Bax而达到的。Bold等(1997)Surgical Oncology，6，133-142；Ronen等，1996；Schuler & Green(2001)Biochem.Soc.Trans.，29，684-688：Ryan等(2001)Curr.Opin.Cell Biol.，13，332-337； 等(2001)Biochem.Biophys.Acta，1551，F1-F37。

[0007] 描述正在经历凋亡的细胞的不同形态学特征可产生很多用于确定细胞凋亡开始和发展的方法。可用于其检测的凋亡细胞的其中一个这类特征是外转酶的活化，它可导致磷脂酰丝氨酸，即一种通常位于质膜内小叶的磷脂的外在化。Fadok等(1992)J.Immunol.，149，4029-4035。具有外在化磷脂酰丝氨酸的凋亡细胞可通过使用与荧光染料偶联的磷脂酰丝氨酸-结合蛋白，即膜联蛋白V染色而检测。在细胞凋亡过程中发生的特征性DNA断裂可通过使用荧光素一标记的脱氧核苷酸标记DNA片段的暴露3’-OH末端而检测。与核酸结合的荧光染料，如Hoescht 33258，可用于检测凋亡细胞中的染色质凝聚以及核断裂。细胞群中细胞凋亡的程度还可根据细胞提取物中天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性程度推断。

[0008] 作为一种遗传学确定的过程，细胞凋亡像任何其它发展程序一样，也可被突变破坏。据信细胞凋亡途径的改变在很多疾病过程，包括癌症中发挥着重要的作用。Wyllie等 (1980)Int.Rev.Cytol.，68，251-306；Thompson(1995)Science，267，1456-1462；Sen &D’Incalci(1992)FEBS Letters，307，122-127；McDonnell等(1995)Seminars in Cancer and Biology，6，53-60。对癌症发生和进展的 调查研究常常集中在细胞增殖。然而，目前细胞凋亡在肿瘤发生方面发挥的重要作用已经越来越明显。事实上，自从以恒定改变的方式控制肿瘤细胞凋亡后，现在很多有关细胞凋亡是什么的问题已经通过使用肿瘤模型有所了解。Bold等(1997)Surgical Oncology，6，133-142。

[0009] 细胞凋亡可通过各种信号在肿瘤发展过程中引发。胞外信号包括生长或存活因子缺失，低氧和电离辐射。可引发细胞凋亡的内部信号包括产生不适宜增殖信号的致癌突变，缩短端粒，和DNA损伤。Lowe & Lin(2000)Carcinogenesis，21，485-495。用于治疗恶性肿瘤的电离辐射和几乎所有的细胞毒性化疗剂被认为是通过引发内源性细胞凋亡机理，诱导细胞死亡而发挥作用的。Rowan & Fisher(1997)Leukemia，11，457-465；Kerr等(1994)Cancer，73，2013-2026；Martin &Schwartz(1997)Oncology Research，9，1-5。 [0010] 有证据表明，在癌症进展的早期，肿瘤细胞对诱导细胞凋亡的试剂(如电离辐射或化疗药物)较为敏感。然而，由于肿瘤的进展，细胞会发展对细胞凋亡刺激物的抗性。Naik等(1996)Genes andDevelopment，10，2105-2116。这就可解释为什么早期癌症对治疗的反应比更晚期病变要好。晚期癌症发生对化疗和放疗抗性的能力似乎与细胞凋亡途径的改变有关，它可限制肿瘤细胞应答细胞凋亡刺激物的能力。Reed等(1996)Journal of Cellular Biology，60，23-32；Meyn等(1996)Cancer Metastasis Reviews，15，119-131；
Hannun(1997)Blood，89，1845-1853；Reed(1995)ToxicologyLetters，82-83，155-158；
Hickman(1996)European Journal ofCancer，32A，921-926。对化疗的抗性分别与慢性淋巴细胞性白血病和结肠癌中抗-细胞凋亡基因bc1-2的过量表达和促细胞凋亡bax基因的缺失或突变有关。

[0011] 肿瘤细胞成功建立播散性转移的能力似乎也与细胞凋亡途径的改变有关。Bold等(1997)Surgical Oncology，6，133-142。例如，肿瘤抑制基因p53的突变被认为会在70％的肿瘤中发生。Evan等(1995)Curr.Opin.Cell.Biol.，7，825-834。灭活p53的突变可限制细胞诱导凋亡、应答DNA损伤、使细胞易受进一步突变的损害的能力。Ko & Prives(1996)Genes and Development，10，1054-1072。

[0012] 因此，细胞凋亡与肿瘤转化以及转移的发生和进展密切相关，通过对细胞凋亡途径的更好了解，可利用基因疗法，通过调节细胞凋亡途径而产生癌症治疗的新的有效目标。Bold等(1997)SurgicalOncology，6，133-142。

[0013] 已知脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)以及含有8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的真核生物翻译起始因子-5A(eIF-5A)在很多细胞过程，包括细胞生长和分化中起着重要的作用。8-羟-2，7，10-三氨基癸酸，一种独特的氨基酸，可在所有检验过的真核生物和古细菌中发现，但在真细菌中却没有发现，eIF-5A是唯一已知的、含有8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的蛋白。Park(1988)J.Biol.Chem.，263，7447-7449；Schümann & Klink(1989)System.Appl.Microbiol.，11，103-107；Bartig 等 (1990)System.Appl.Microbiol.，13，112-116；Gordon等(1987a)J.Biol.Chem.，262，16585-16589。活性eIF-5A是以两个翻译后步骤形成的：第一步是利用脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶催化，通过使亚精胺的
4-氨基丁基部分向前体eIF-5A的特异性赖氨酸的α-氨基转移而形成脱氧8-羟-2，7，
10-三氨基癸酸残基；第二步包括利用脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶使4-氨基丁基部分羟化，形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸。

[0014] 物种之间的eIF-5A的氨基酸序列较为保守，而且在eIF-5A中的8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基周围存在的氨基酸序列也是严格保守的，表明这种修饰对于存活而言较为重要。Park等(1993)Biofactors，4，95-104。这种假设可进一步由下列观察结果支持，即迄今为止，在酵母中发现的eIF5A同种型的失活，或DHS基因(其催化它们活化中的第一步)的失活，可阻断细胞分裂。Schnier等(1991)Mol.Cell.Biol.，11，3105-3114；Sasaki等(1996)FEBSLett.，384，151-154；Park等(1998)J.Biol.Chem.，273，1677-1683。然而，酵母中eIF-5A蛋白的缺失仅导致总蛋白合成的少量降低，表明eIF-5A是mRNA特定亚型的翻译、而不是蛋白全面合成所需的。Kang等(1993)，“起始因子eIF-5A缺失对细胞增殖及蛋白合成的影响”，Tuite，M.(ed.)，Protein Synthesis and Targetingin Yeast，NATO Series H。近来有关结合eIF-5A的配体共有高度保守基序的发现也可支持eIF-5A的重要性。Xu & Chen(2001)J.Biol. Chem.，276，2555-2561。此外，人们发现修饰的eIF-5A的8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基对于特异性结合RNA的序列较为重要，而且结合不会为核糖核酸酶提供保护。

[0015] eIF-5A的第一个cDNA是由Smit McBride等于1989年从人克隆的，从那以后，又从各种真核生物，包括酵母菌，大鼠，鸡胚，苜蓿，和番茄中克隆出eIF-5A的cDNA或基因。Smit McBride等 (1989a)J.Biol.Chem.，264，1578-1583；Schnier 等(1991)( 酵 母菌 )；Sano，A.(1995)Imahori，M. 等 (eds)，Polyamines，Basic and ClinicalAspects，VNU Science Press，The Netherlands，81-88(大鼠)；Rinaudo & Park(1992)FASEBJ.，6，A453(鸡胚)；Pay等(1991)Plant Mol.Biol.，17，927-929(苜蓿)；Wang等(2001)J.Biol.Chem.，276，17541-17549(番茄)。

[0016] 此外，eIF-5A的胞内缺失导致特定mRNA在核中大量积聚，表明eIF-5A可能涉及特定种类的mRNA从核到胞质的穿梭。Liu &Tartakoff(1997)Supplement to th
Molecular Biology of the Cell，8，426a。摘要第2476，37 American Society for Cell BiologyAnnual Meeting。eIF-5A在核孔相关核内丝的积聚及其与通用核输出受体的相互作用进一步表明，eIF-5A是一种核质穿梭蛋白，而不是多核糖体的成分。Rosorius等(1999)J Cell Science，112，2369-2380。

[0017] eIF-5A mRNA的表达已经在各种人类组织和哺乳动物细胞系中研究过。例如，在血清剥夺后，通过加入血清，已经在人成纤维细胞中观察到eIF-5A表达水平的改变。Pang & Chen(1994)J.CellPhysiol.，160，531-538。脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶活性与年龄有关的降低以及前体eIF-5A的充足已经在衰老的成纤维细胞中观察到，尽管如此其反映同种型差异改变平均化的可能性并不确定。Chen & Chen(1997b)J.Cell Physiol.，170，248-254。

[0018] 研究显示eIF-5A可能是病毒蛋白，如人免疫缺陷I型病毒Rev蛋白和人T细胞白血病I型病毒Rex蛋白的细胞靶。Ruhl等(1993)J.Cell Biol.，123，1309-1320；Katahira等(1995)J.Virol.，69，3125-3133。初步研究表明eIF-5A可通过与其它RNA-结合蛋白，如Rev相互作用而导向于RNA，表明这些病毒蛋白可募集用于病毒RNA加 工的eIF-5A。Liu等(1997)Biol.Signals，6，166-174。

[0019] 已知脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶以及eIP-5A在重要的细胞过程，包括细胞生长和衰老中发挥着重要的作用。例如，在植物中脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶表达的反义降低使叶子和果实延迟衰老，表明植物中存在诱导衰老的eIF-5A同种型。见WO01/02592；PCT/US01/44505；美国申请号第09/909,796。酵母菌中脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶或eIF-5A基因的失活导致细胞分裂的抑制。Schnier等(1991)Mol.Cell.Biol.，11，3105-3114；Sasaki等(1996)FEBS Lett.，384，151-154；Park等(1998)J.Bol.Chem.，273，1677-1683。

[0020] 亚精胺类似物已经成功用于体外抑制脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶，并用于体内抑制8-羟-2，7，10-三氨基癸酸的形成，还伴有蛋白合成及细胞生长的抑制。Jakus 等 (1993)J.Biol.Chem.，268，13151-13159；Park 等 (1994)J.Biol.Chem.，269，
27827-27832。多胺自身，特别是腐胺和亚精胺，似乎也在细胞增殖和分化方面起着重要的作用。Tabor & Tabor(1984)Annu.Rev.Biochem.，53，749-790；Pegg(1988)Cancer Res.，
48，759-774。例如，除非提供外源性多胺，否则其中的多胺生物合成途径已经被阻断的酵母菌突变体就不能生长。Cohn等(1980)J.Bacteriol.，134，208-213。

[0021] 多胺还显示出可保护细胞使其不被诱导凋亡。例如，胸腺细胞凋亡已经通过与亚精胺和精胺接触而被阻断，其机理似乎是阻碍内切核酸酶活化。Desiderio等(1995)Cell Growth Differ.，6，505-513；Brune等(1991)Exp.Cell Res.，195，323-329。此外，外源性多胺已经显示出可抑制B细胞介导的细胞凋亡以及单细胞寄生物克鲁氏锥虫的细胞凋亡。Nitta等(2001)Exptl.Cell Res.，265，174-183；Piacenza等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，98，7301-7306。此外还观察到低浓度的精胺和亚精胺可减少在新生大鼠正常发育过程中损失的神经细胞数，并保护脑在脑局部缺血过程中免受神经元损害。Gilad等(1985)Brain Res.，348，363-366；Gilad&Gilad(1991)Exp.Neurol.，111，349-355。 多胺还可抑制植物组织的衰老，即一种程序性细胞死亡形式。亚精胺和腐胺已经显示出可延迟采摘后的康乃馨花和脱落的小萝卜叶的衰老。Wang & Baker(1980) HortScience，15，805-806(康乃馨花)；Altman(1982)Physiol.Plant.，54，189-193(脱落的小萝卜叶)。 [0022] 然而在其它研究中，细胞凋亡的诱导已经在应答外源性多胺时观察到。例如，人乳腺癌细胞系通过诱导细胞凋亡而应答多胺类似物，且过量腐胺已经显示出可诱导DH23A细胞的凋亡。McCloskey等(1995)Cancer Res.，55，3233-3236；Tome等(1997)Biochem.J，
328，847-854。

[0023] 使用多胺进行这些实验的结果全都表明，eIF-5A特异性同种型的存在对于细胞凋亡的诱导起着重要的作用。具体而言，该数据与存在由DHS活化的eIF-5A的细胞凋亡特异性同种型的观点一致。这种DHS反应需要亚精胺的事实与多胺引起天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，即一种细胞凋亡相关性蛋白水解的关键执行者的活化的发现一致。Stefanelli等 (2000)Biochem.J.，347，875-880；Stefanelli等 (1999)FEBS Lett.，451，
95-98。在类似的血管中，多胺合成的抑制剂可延迟细胞凋亡。Das等(1997)Oncol.Res.，
9，565-572；Monti 等 (1998)Life Sci.，72，799-806；Ray 等 (2000)Am.J.Physiol.，278，C480-C489；Packham & Cleveland(1994)Mol.CellBiol.，14，5741-5747。

[0024] 外源性多胺既可抑制又可促进细胞凋亡的发现可由下列事实解释，即根据所用水平的不同，它们或者抑制导致eIF-5A活化的DHS反应，并因此阻碍细胞凋亡，或者由于毒性诱导细胞凋亡。低浓度外源性多胺阻断植物和动物系统细胞凋亡的发现与低浓度多胺及其类似物作为DHS反应的竞争性抑制剂的事实一致。事实上，甚至是作为DHS反应底物的外源性亚精胺也会通过底物抑制而阻碍反应。Jakus等(1993)J.Biol.Chem.，268，13153-13159。

[0025] 然而，所有多胺及其类似物在高浓度时都是有毒的，并且能够诱导细胞凋亡。尽管它们具有抑制eIF-5A的推定细胞凋亡-特异性同种型的能力，但该过程发生还有两个原因。第一，活化eIF-5A具有长半衰期。Torrelio等(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.，145，1335-1341；Dou & Chen(1990)Biochim.Biophys.Acta.，1036，128-137。因此，由于抑制脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶活性而导致的活化的细胞凋亡特异性eIF-5A的缺失可能不能及时发生，以阻 断由亚精胺毒性作用引起的细胞凋亡。第二，多胺是脱氧
8-羟-2，7，10-三氨基癸酸反应的竞争性抑制剂，因此即使在毒性浓度下，也不能完全阻断该反应。

[0026] 本发明涉及eIF-5A cDNA的克隆，其在诱导细胞凋亡之前即时上调。这种细胞凋亡-特异性eIF-5A很可能是干预引起疾病状态的细胞凋亡的适宜目标，因为它似乎可以参与细胞凋亡途径的下游效应子和转录因子的转录后调节水平发挥作用。具体而言，细胞凋亡-特异性eIF-5A似乎可选择性促进编码细胞凋亡的下游效应子和转录因子的mRNA从核易位到胞质，它们随后即被翻译。引发细胞凋亡的最终决定似乎会阻止内部和外部促-和抗-细胞凋亡信号之间复杂的相互作用。Lowe & Lin(2000)Carcinogenesis，21，485-495。通过其促进下游细胞凋亡效应子和转录因子翻译的能力，与细胞凋亡有关的eIF-5A似乎会打破这些信号之间的平衡，促进细胞凋亡。

[0027] 正如前面所述，已经确立了抗癌试剂可诱导细胞凋亡，而细胞凋亡途径的改变可减弱药物-诱导的细胞死亡。Schmitt & Lowe(1999)J.Pathol.，187，127-137。例如，很多抗癌药物都可上调p53，而且已经失去p53的肿瘤细胞会发生对这些药物的抗性。然而，如果剂量充足，几乎所有化疗剂都可诱导独立于p53的细胞凋亡，表明即使在药物-抗性肿瘤中，细胞凋亡的途径也未被完全阻断。Wallace-Brodeur&Lowe(1999)Cell Mol.Life Sci.，55，64-75。这表明细胞凋亡eIF-5A的诱导，虽然它也许不能校正突变基因，但也许能避开p53-依赖性途径，并通过促进可替代途径而诱导细胞凋亡。

[0028] 与细胞凋亡有关的eIF-5A的诱导具有选择性导向于癌细胞的能力，同时对正常的相邻细胞具有很小的作用或没有作用。这种情况的出现是因为在肿瘤细胞中表达的促有丝分裂致癌基因可提供正常细胞中不存在的，特异性mRNA种类形式的细胞凋亡信号。Lowe等(1993)Cell，74，954-967；Lowe & Lin(2000)Carcinogenesis，21，485-495。例如，野生型p53在p53突变肿瘤细胞中的恢复可直接诱导细胞凋亡，并增加肿瘤细胞系和异种移植物中的药物敏感性(Spitz等，1996；Badie等，1998)。

[0029] 细胞凋亡-eIF-5A的选择性是由介导下游细胞凋亡效应子和转录因子从核向胞质中易位，从而选择性促进它们的mRNA翻译而产生的。 因此，为使细胞凋亡eIF-5A具有作用，这些效应子和转录因子的mRNA必须被转录。因为这些mRNA在癌细胞，而不是相邻的正常细胞中转录，因此预期细胞凋亡eIF-5A可促进癌细胞凋亡，但若有的话，对正常细胞的作用极小。因此，具有与细胞凋亡有关的eIF-5A的肿瘤细胞凋亡潜能的恢复可由于肿瘤细胞的选择性导向而降低癌症患者经受的毒性和副作用。细胞凋亡eIF-5A的诱导还具有加强肿瘤细胞对抗癌药物反应的能力，并由此提高这些试剂抗药物-抗性肿瘤的有效性。如此可减少达到功效所需的抗癌药物的剂量，并降低对患者的毒性。

发明内容

[0030] 本发明提供分离和/或纯化的大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS的核酸及多肽，以及细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS的反义寡核苷酸及表达载体。本发明还提供分离和/或纯化的人eIF-5A2(此处也称作增殖eIF-5A)。本发明还提供使用细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS调节细胞凋亡的方法。

附图说明

[0031] 图1描述大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A 3’末端的核苷酸序列及衍生氨基酸序列。

[0032] 图2描述大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A cDNA5’末端的核苷酸序列及衍生氨基酸序列。

[0033] 图3描述大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A全长cDNA的核苷酸序列。

[0034] 图4描述大鼠细胞凋亡-特异性DHS cDNA 3’末端的核苷酸序列及衍生氨基酸序列。

[0035] 图5是大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列与人eIF-5A的核苷酸序列(登记号BC000751或NM_001970，SEQ IDNO：3)的比对。

[0036] 图6是大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列与人eIF-5A的核苷酸序列(登记号NM_020390，SEQ ID NO：4)的比对。

[0037] 图7是大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A cDNA的全长核苷酸序列 与小鼠eIF-5A的核苷酸序列(登记号BC003889)的比对。小鼠的核苷酸序列(登记号BC003889)为SEQ ID NO：5。

[0038] 图8是大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A的衍生全长氨基酸序列与人eIF-5A的衍生氨基酸序列(登记号BC000751或NM_001970)的比对。

[0039] 图9是大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A的衍生全长氨基酸序列与人eIF-5A的衍生氨基酸序列(登记号NM_020390)的比对。

[0040] 图10是大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A的衍生全长氨基酸序列与小鼠eIF-5A的衍生氨基酸序列(登记号BC003889)的比对。

[0041] 图11是大鼠黄体细胞凋亡-特异性DHS cDNA的部分核苷酸序列与人DHS的核苷酸序列(登记号BC000333，SEQ ID NO：8)的比对。

[0042] 图12是大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A cDNA的限制性酶切图。

[0043] 图13是部分大鼠细胞凋亡-特异性DNS cDNA的限制性酶切图。

[0044] 图14是使用大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A cDNA的32P-dCTP-标记的3’-末端探测的总RNA的RNA印迹(上图)和溴化乙锭染色的凝胶(下图)。

[0045] 图15是使用大鼠黄体细胞凋亡-特异性DHS cDNA的32P-dCTP-标记的3’-末端探测的总RNA的RNA印迹(上图)和溴化乙锭染色的凝胶(下图)。

[0046] 图16描述DNA分梯(laddering)实验，其中超数排卵的大鼠黄体的细胞凋亡程度是在注射PGF-2α后检测的。

[0047] 图17是从细胞凋亡大鼠黄体中分离的基因组DNA的琼脂糖凝胶，它表示用PGF F-2α处理大鼠后的DNA分梯。

[0048] 图18描述DNA分梯实验，其中超数排卵的大鼠黄体的分散细胞凋亡程度是与前列腺素F-2α(PG F-2α)接触之前，在使用亚精胺处理过的大鼠中检测的。

[0049] 图19描述DNA分梯实验，其中超数排卵的大鼠黄体的细胞凋亡程度是在使用亚精胺和/或PGF-2α处理过的大鼠中检测的。

[0050] 图20是使用32P-dCTP-标记的部分大鼠黄体细胞凋亡-特异性eIF-5A cDNA探测的大鼠基因组DNA的DNA印迹。

[0051] 图21描述pHM6，一种哺乳动物表位标记表达载体(Roche MolecularBiochemicals)。

[0052] 图22是诱导细胞凋亡后，使用大鼠黄体细胞凋亡-特异性DHS cDNA的32
P-dCTP-标记的3’-非翻译区探测的从COS-7细胞中分离的总RNA的RNA印迹(上图)
和溴化乙锭染色的凝胶(下图)，其中细胞凋亡是通过血清剥夺诱导的。

[0053] 图23是说明瞬时转染COS-7细胞过程的流程图。

[0054] 图24是用pHM6转染后，COS-7细胞中外源蛋白瞬时表达的蛋白质印迹。

[0055] 图25说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性的增加反映的。

[0056] 图26说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，DNA断裂的增加反映的。

[0057] 图27说明细胞凋亡的检测，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，核断裂的增加反映的。

[0058] 图28说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，核断裂的增加反映的。

[0059] 图29说明细胞凋亡的检测，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，磷脂酰丝氨酸暴露的增加反映的。

[0060] 图30说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，磷脂酰丝氨酸暴露的增加反映的。

[0061] 图31说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，核断裂的增加反映的。

[0062] 图32说明使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时凋亡的增加。

[0063] 图33说明使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按 有义方向瞬时转染COS-7细胞时Bc1-2的下调。上图是考马斯-蓝染色的蛋白质印迹；下图是相应的蛋白质印迹。

[0064] 图34是将Bc1-2用作探针，使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按反义方向瞬时转染的COS-7细胞的考马斯蓝染色的蛋白质印迹(上图)和相应的蛋白质印迹(下图)。

[0065] 图35是将c-Myc用作探针，使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染的COS-7细胞的考马斯蓝染色的蛋白质印迹(上图)和相应的蛋白质印迹(下图)。

[0066] 图36是将p53用作探针，使用含有全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染的COS-7细胞的考马斯蓝染色的蛋白质印迹(上图)和相应的蛋白质印迹(下图)。

[0067] 图37是使用抗-[HA]-过氧化物酶探针时，pHM6-全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A在COS-7细胞中表达的考马斯蓝染色的蛋白质印迹和相应的蛋白质印迹，以及使用p53探针时，pHM6-全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A在COS-7细胞中表达的考马斯蓝染色的蛋白质印迹(上图)和相应的蛋白质印迹(下图)。

[0068] 图38是从RKO细胞中分离的人eIF5A2的序列与人eIF5A2的序列(Genbank登记号XM_113401)的比对。

[0069] 图39是描述瞬时转染后，RKO和RKO-E6中发生细胞凋亡百分比的图。RKO和RKO-E6细胞是用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1瞬时转染的。用放线菌素D处理并用
pHM6-eIF5A1转染的RKO细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染但没用放线菌素D处理的细胞增加了240％。用放线菌素D处理并用pHM6-eIF5A1转染的RKO-E6细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染但没用放线菌素D处理的细胞增加了105％。

[0070] 图40是描述瞬时转染后，RKO细胞中发生细胞凋亡百分比的图。RKO细胞是用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5Al，pHM6-eIF5A2，或pHM6-截短的eIF5A1瞬时转染的。用pHM6-eIF5A1转染的细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染的对照组细胞增加了25％。但是这种增加对于用pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染的细胞并不明显。

[0071] 图41是描述瞬时转染后，RKO细胞中发生细胞凋亡百分比的图。RKO细胞或者未被转染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5Al瞬时转染。校正转染效率后，用pHM6-eIF5A1转染的细胞有60％凋亡。

[0072] 图42提供瞬时转染后，RKO细胞凋亡的流式细胞术分析结果。RKO细胞或者未被转染，或者用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A1，pHM6-eIF5A2，或pHM6-截短的eIF5A1转染。该表描述了经历凋亡的细胞百分比，它是以每个峰下的面积为基础计算的。校正未转染细胞的背景凋亡和转染效率之后，有80％用pHM6-eIF5A1转染的细胞显示凋亡。用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染的细胞仅显示背景水平的凋亡。

[0073] 图43提供蛋白的蛋白质印迹，所述蛋白是从用0.25μg/ml放线菌素D处理0，3，7，24，和48小时的RKO细胞中分离出来的。上图描述使用抗-p53作为第一抗体的蛋白质印迹。中图描述使用抗-eIF5A1作为第一抗体的蛋白质印迹。下图描述用于抗-eIT5A1印迹的薄膜，所述印迹是在化学发光检测以证实等量加样后，用考马斯蓝染色的。p53和eIF5A1都是通过用放线菌素D处理而上调的。

具体实施方式

[0074] 本发明部分是以下列发现和特性描述为基础的，即从大鼠黄体中分离出来的、编码eIF-5A的全长cDNA涉及细胞凋亡(细胞凋亡-特异性)。因此，在其中一个实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，它含有编码大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽的核苷酸序列。本发明还提供一种纯化的多肽，它含有大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽的氨基酸序列。大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽是指对大鼠特异的任何多肽，它在凋亡细胞中差异表达，而且是由脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基的形成而产生，所述残基的形成是利用脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸合酶催化，使亚精胺的4-氨基丁基部分向前体eIF-5A的特异性保守赖氨酸的α-氨基转移，并利用脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶使4-氨基丁基部分羟化形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸，由此活化eIF-5A。

[0075] 此外，使用这里提供的指导和本领域那些技术人员熟知的技术，本发明的大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的核酸及多肽序列可用于从其它细胞、组织、器官或动物分离细胞凋亡-特异性核酸及多肽。本发明还提供适宜作为引物或杂交探针的核酸分子，从而检测编码本发明大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽的核酸。

[0076] 本发明的核酸可以是DNA，RNA，DNA/RNA双链体，蛋白-核酸(PNA)，或其衍生物。这里所用的核酸或多肽，当基本上没有细胞物质或没有化学前体或其它化学品时是“分离的”或“纯化的”。应认识到术语分离的或纯化的不指含有许多其它序列片段的文库型制品。
本发明的核酸或多肽可被纯化至均一或其它程度的纯度。纯化水平是以预期用途为基础的。重要的特征是，即使有大量其它成分存在，制品也能达到核酸或多肽的预期功能。 [0077] 分离多肽可从天然表达它的细胞纯化，从已被改变从而表达它的细胞(重组体)纯化，或使用已知的蛋白合成方法合成。例如，蛋白的重组产生包括将编码诱导细胞凋亡的eIF-5A或DHS的核酸分子克隆到表达载体中。将表达载体引入到宿主细胞中，并使蛋白在宿主细胞中表达。然后使用标准蛋白纯化技术，通过任何适宜的纯化方案将蛋白从细胞中分离出来。

[0078] 优选，编码本发明大鼠细胞凋亡-特异性eIF5A多肽的分离的核酸具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列，本发明的纯化的多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明的大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的核酸及多肽还包括分别与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2基本相同或同源的序列，及其功能衍生物和变体。

[0079] 这里所用的术语“序列基本同一”或“基本同源”用于说明一个序列与另外一个序列显示出基本相同的结构或功能。基本同一或基本同源的序列之间的任何结构或功能差异都是极小的(de minimus)；也就是说，它们不会影响序列在预期应用中发挥作用的能力。差异可能是由于不同物种之间密码子使用的固有差异，例如，如果两个或多个不同序列之间存在大量的序列重叠或类似，或如果不同序列即使长度或结构不同，也仍然显示相似的物理特性，那么结构差异被认为是极小的。这种特性包括，例如，在规定条件下杂交的能力，或蛋白的免疫交叉反应性，类似的酶活性等。技术人员可利用本领域已知的方法很容易地确定各种特性。

[0080] 此外，如果两个核苷酸序列之间具有至少约70％或更高，更优选80％或更高，甚至更优选约90％或更高，最优选约95％或更高的序列相似性，那么它们“基本互补”。如果两个氨基酸序列在多肽的活性或功能相关部分之间具有至少50％，优选至少70％，更优选至少80％， 甚至更优选至少90％，最优选至少95％的相似性，那么它们基本同源。 [0081] 为了测定两个序列的同一性百分比，将序列进行用于最佳比较目的的比对(例如，将空位引入到第一和第二个氨基酸或核酸序列的其中一个或两个中进行最佳比对，且为了进行比较，可忽略非-同源性序列)。在优选实施方案中，将至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％或更长的参考序列进行比对。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位置被与第二个序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位置是相同的(这里所用的氨基酸或核酸“同一性”与氨基酸或核酸“同源性”等价)。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的函数，考虑到空位数和每个空位的长度，需要引入它们进行两个序列的最佳比对。

[0082] 两个序列之间的比较和同一性及相似性百分比的确定可使用数学算法完成。(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis inMolecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；andSequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。 [0083] 本发明的核酸及蛋白序列可进一步被用作“查询序列”，在序列数据库中进行检索，从而鉴定其它家族成员或相关序列。这种检索可使用Altschul，等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可使用
NBLAST程序进行。BLAST蛋白检索可使用XBLAST程序进行，从而获得与本发明蛋白同源的氨基酸序列。为了比较目的而获得有空位的比对，可按照Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述，使用有空位的BLAST。当利用BLAST和有空位的BLAST程序时，可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。

[0084] 术语核酸的“功能衍生物”在这里是指基因或核苷酸序列的同源物 或类似物。功能衍生物可保留已知基因的至少一部分功能，用于本发明中。这里所述细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽的“功能衍生物”是细胞凋亡-特异性eIF-5A的片段，变体，类似物，或化学衍生物，它们可保留细胞凋亡-特异性eIF-5A的至少一部分活性或与对细胞凋亡-特异性eIF-5A特异的抗体的免疫交叉反应性。细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽的片段是指分子的任何亚型。

[0085] 功能变体还可包括类似氨基酸的取代，但功能不会发生改变或发生无关紧要的改变。对于功能而言较为重要的氨基酸可通过本领域已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham等(1989)Science 244：1081-1085)。后一个过程可将单丙氨酸突变引入到分子中的每个残基上。然后测试所得突变分子的生物活性，如激酶活性或体外增殖活性。对于结合配偶体/底物结合较为重要的位点还可通过结构分析，如结晶，核磁共振或光亲和标记测定(Smith等(1992)J.Mol.Biol.224：899-904；de Vos等(1992)Science 255：306-312)。

[0086] “变体”是指与完整基因或其片段基本相似的分子，如具有一个或多个取代核苷酸的核苷酸取代变体，但它仍然维持与特定基因杂交或编码与天然DNA杂交的mRNA转录物的能力。“同源物”是指来源于不同动物属或种的片段或变体序列。“类似物”是指与整个分子，其变体，或片段基本相似或有相关功能的非天然分子。

[0087] 变体肽包括天然存在的变体以及利用本领域熟知的方法制造的那些。这种变体可使用分子技术以及这里公开的序列信息很容易地鉴定/制造。此外，可以本发明eIF-5A或DHS蛋白的序列和/或结构同源性为基础，很容易地将这种变体与其它蛋白区别开来。同源性/同一性的程度主要以蛋白是功能变体还是非功能变体，共生同源物家族的趋异差异量，以及直向同源物间的进化距离为基础的。

[0088] 本发明的eIF-5A或DHS蛋白的非天然存在变体可使用重组技术很容易地产生。这种变体包括但不限制于蛋白氨基酸序列的缺失，添加和取代。例如，其中一类取代是保守氨基酸取代。这种取代是用具有相似特性的其它氨基酸取代蛋白中给定氨基酸的那些。通常所见的保守取代是将脂族氨基酸Ala，Val，Leu，和Ile中的一个替换为另一个；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn和Gln之间的取代；碱性残基Lys和Arg的交换；以及芳族 残基Phe和Tyr之间的替换。有关很可能是表型沉默的氨基酸改变的指导，见Bowie等，Science 247：1306-1310(1990)。

[0089] 可选择性而且优选地，编码本发明大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽的核酸在高度严格条件下，与SEQ ID NO：1的互补核苷酸序列杂交。这里所用术语“杂交”是指核酸在适宜的严格条件下杂交，根据探针序列和靶序列性质的不同，所述条件对于本领域那些技术人员而言是显而易见的。杂交和洗涤条件是本领域熟知的，根据所需严格程度的不同，通过改变温育时间，温度，和/或溶液的离子强度而对条件进行调节是很容易完成的。见，例如，Sambrook，J.等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarbourPress，Cold Spring Harbor，New York，1989。

[0090] 条件的选择取决于杂交序列的长度，特别是探针序列的长度，核酸中的相对G-C含量以及所允许的错配数。当需要在互补程度较低的链之间进行部分杂交时，优选低度严格条件。当需要完全或接近完全互补时，优选高度严格条件。对于典型的高度严格条件而言，杂交溶液含有6X S.S.C.，0.01M EDTA，1X Denhardt’s溶液和0.5％SDS。对于克隆DNA的片段而言，杂交在约68℃时进行约3-4小时，对于总真核生物DNA而言，进行约12-16小时。对于较低的严格程度而言，杂交温度降至约42℃，低于双链体的解链温度(Tm)。已知Tm是G-C含量和双链体长度以及溶液离子强度的函数。

[0091] 这里所用术语与DNA或RNA分子的“相应部分杂交”是指杂交分子，例如，寡核苷酸，多核苷酸，或任一核苷酸序列(按有义或反义方向)识别并与其它核酸分子序列杂交，其中所述其它核酸分子序列具有与该核苷酸序列近似相等的大小以及足够的序列相似性，从而在适宜条件下进行杂交。例如，100个核苷酸长的有义分子可识别并与核苷酸序列中大约100个核苷酸的部分杂交，只要两个序列之间有大约70％或更高的序列相似性。应当了解，“相应部分”的大小会造成杂交中的一些错配，如此“相应部分”可比与它杂交的分子更小或更大，例如，大或小20-30％，优选至多大或小约12-15％。

[0092] 此外，多肽的功能变体还可包括相似氨基酸的取代，但功能不会发生改变或发生无关重要的改变。对于功能而言较为重要的氨基酸可通过本领域已知的方法鉴定，如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变 (Cunningham等，Science 244：1081-1085)。后一个过程可将单丙氨酸突变引入到分子中的每个残基上。然后测试所得突变分子的生物活性。

[0093] 例如，细胞凋亡-特异性eIF-5A的类似物是指与整个蛋白或其片段基本相似的肽模拟物或非天然蛋白。细胞凋亡-特异性eIF-5A的化学衍生物含有通常不是肽或肽片段一部分的其它化学部分。另外，还可通过使肽的目标氨基酸残基与有机衍生剂反应而将修饰引入到肽或其片段中，其中所述有机衍生剂能够与所选择的侧链或末端残基反应。 [0094] 从大鼠黄体中分离的、编码细胞凋亡-特异性eIF-5A的全长cDNA的最初发现和表征导致编码DHS的部分cDNA克隆的发现和表征，它也是从大鼠黄体中分离的，并涉及细胞凋亡。因此，在另一实施方案中，本发明提供一种分离的核酸，它含有编码大鼠细胞凋亡-特异性DHS多肽的核苷酸序列。本发明还提供一种纯化的多肽，它含有大鼠细胞凋亡-特异性DHS多肽的氨基酸序列。大鼠细胞凋亡-特异性DHS多肽是指对大鼠特异的任何适宜多肽，它在凋亡细胞中差异表达，并且通过使亚精胺的4-氨基丁基部分向失活eIF-5A的特定保守赖氨酸的α-氨基转移，形成脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸，由此活化eIF-5A而催化脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基的形成。

[0095] 优选，编码本发明大鼠细胞凋亡-特异性DHS多肽的分离的核酸具有SEQ ID NO：22的核苷酸序列，本发明的纯化的多肽具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列。本发明大鼠细胞凋亡-特异性DHS的核酸及多肽还包括分别与SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23基本同一或同源的序列，和功能衍生物及其变体，前面已经对它们进行过描述。可选择性而且优选地，本发明的分离的核酸具有在高度严格条件下，与SEQ ID NO：22的互补序列杂交的核苷酸序列，这也已经在前面描述过。

[0096] 就这里所述大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A序列的核酸及多肽而言，本发明大鼠细胞凋亡-特异性DHS序列的核酸及多肽可用于从其它动物，包括人类分离细胞凋亡-特异性DHS的核酸及多肽。DHS序列从动物和人类的这种分离可以物种之间至少80％的序列相似性为基础，使用本领域已知的方法和这里提供的指导进行。本发明还提供适于作为引物或杂交探针的核酸分子，用来检测编码本发明大鼠细胞凋亡-特 异性DHS多肽的核酸。 [0097] 细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS是调节细胞凋亡，包括作为疾病过程基础的细胞凋亡的适宜靶，这是因为它很可能对涉及细胞凋亡途径的下游效应子和转录因子的翻译后调节发挥作用。因此，本发明还提供通过给予细胞一种调节细胞凋亡-特异性eIF-5A和/或DHS功能的试剂而调节细胞凋亡的方法。本领域技术人员应当认识到，所述试剂可以是仅调节细胞凋亡-特异性eIF5A功能的试剂，仅调节细胞凋亡-特异性DHS功能的试剂，或同时调节细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS功能的试剂。

[0098] 细胞凋亡可通过细胞中凋亡-特异性eIF-5A和/或DHS功能的正常水平的任何适宜改变而调节。正如这里预期的，修饰或改变可以是完全或部分的，且包括转录或翻译控制的改变或改变细胞中凋亡-特异性eIF-5A和/或DHS功能的其它改变。细胞凋亡-特异性eIF-5A或DHS的功能是指与脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸残基的形成有关的任何活性，所述残基的形成是利用DHS催化，使亚精胺的4-氨基丁基部分向前体eIF-5A的特异性保守赖氨酸的α-氨基转移，并利用脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶使4-氨基丁基部分羟化形成8-羟-2，7，10-三氨基癸酸，由此活化eIF-5A。

[0099] 在本发明其中一个实施方案中，所述试剂可抑制细胞凋亡-特异性eIF-5A和/或DHS的功能，由此抑制细胞凋亡。抑制细胞凋亡是指强度和/或数量的任何降低，和/或细胞凋亡的任一或所有明确的形态学特性，如细胞皱，染色质凝聚，核断裂，以及薄膜起泡开始的延迟。

[0100] 能够抑制细胞凋亡-特异性eIF-5A和/或DHS功能的其中一种试剂是反义寡核苷酸。优选，所述反义寡核苷酸具有编码细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽和/或细胞凋亡-特异性DHS多肽的-部分的核苷酸序列。很多编码细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽和/或DHS多肽的适宜核酸序列都是本领域已知的。例如，SEQ ID NOS：1，3，4，5，11，15，19，20，和
21(细胞凋亡-特异性eIF-5A的核酸序列)，SEQ ID NOS：6和8(细胞凋亡-特异性DHS的核酸序列)，SEQ ID NOS：12和16 eIF-5A(细胞凋亡-特异性多肽的序列)，和SEQ ID NO：7(细胞凋亡-特异性DHS多肽的序列)，或其一部分，都可提供适宜的序列。其它适宜的序列可使用已知序列作为探针，按照这里描述的方法找到。

[0101] 因此，本发明还提供编码细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽和/或细胞凋亡-特异性DHS多肽的一部分的反义寡核苷酸，及其互补序列。本发明的反义寡核苷酸可以是RNA或DNA，例如，cDNA，基因组DNA，或合成RNA或DNA的形式。DNA可以是双链或单链的，且如果是单链，可以是编码链或非编码链。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交会妨碍核酸的正常功能，通常被称作“反义的”。受到妨碍的DNA功能包括复制和转录。受到妨碍的RNA功能包括所有功能，例如RNA向蛋白翻译位点的易位，蛋白从RNA的翻译，产生一个或多个mRNA种类的RNA剪接，和涉及或由RNA促进的催化活性。这种反义寡核苷酸的全部作用是抑制细胞凋亡-特异性eIF-5A和/或DHS的表达和/或减少所产生的活化细胞凋亡-特异性eIF-5A的量。

[0102] 可选择性地，细胞凋亡特异性DHS对细胞凋亡-特异性eIF-5A的活化可通过给予抑制DHS酶反应的化学剂抑制。例如，在通过注射PGF-2α诱导细胞凋亡后，当使用亚精胺，一种DHS反应的抑制剂处理动物时，大鼠黄体中反映细胞凋亡的DNA分梯的开始延迟了(图18-19)。Jakus等，(1993)J.Biol.Chem.268：13151-13159。

[0103] 细胞凋亡还通过加入使细胞凋亡-特异性eIF-5A的DNA，RNA，或蛋白降解，或使细胞凋亡-特异性DHS的DNA，RNA，或蛋白降解，由此防止细胞凋亡-特异性DHS将细胞凋亡-特异性eIF-5A活化的试剂而被抑制或大大降低。在本发明另一实施方案中，内源性哺乳动物细胞凋亡-特异性DHS，细胞凋亡-特异性eIF-5A，或两者表达的抑制是通过使用核酶进行的。适宜药物的例子包括抑制细胞凋亡-特异性DHS将细胞凋亡-特异性eIF-5A活化的那些，抑制脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶将细胞凋亡-特异性eIF-5A活化的那些，抑制细胞凋亡-特异性DHS的转录和/或翻译的那些，抑制细胞凋亡-特异性脱氧8-羟-2，7，10-三氨基癸酸羟化酶的转录和/或翻译的那些，以及抑制细胞凋亡特异性eIF-5A的转录或翻译的那些。抑制细胞凋亡-特异性DHS将eIF-5A活化的药物的例子是亚精胺，1，3-二氨基-丙烷，1，4-二氨基-丁烷(腐胺)，1，7-二氨基-庚烷，或1，8-二氨基-辛烷。

[0104] 还可通过使细胞中编码细胞凋亡-特异性eIF-5A的基因失活而抑制细胞凋亡-特异性eIF-5A。这种失活可通过使细胞中的基因缺失，或向基因中引入缺失或突变而发生，由此使基因失活而发生。此外， 还可通过将其它DNA片段插入到基因中而使基因失活，如此，内源性细胞凋亡-特异性eIF-5A蛋白的表达就不会发生。同样，可通过使细胞中编码细胞凋亡-特异性DHS的基因失活而抑制细胞凋亡-特异性eIF-5A的活化。将突变，如缺失和插入引入到真核细胞基因中的方法是本领域已知的，例如，美国专利号第5,464,764。用于进行细胞基因突变的寡核苷酸及表达载体可按照本领域已知的方法和这里提供的指导制造；例如，用于制造和表达反义寡核苷酸的方法可用于制造进行细胞基因突变的寡核苷酸及表达载体。

[0105] 还可通过抑制细胞中编码细胞凋亡-特异性eIF-5A的基因表达而抑制细胞凋亡-特异性eIF-5A的表达。这种失活可通过共抑制完成，例如，将编码细胞凋亡-特异性eIF-5A的核苷酸序列引入到细胞中，如此进行共抑制。同样，它可经由共抑制，通过抑制细胞中编码细胞凋亡特异性DHS的基因表达而抑制细胞凋亡特异性eIF-5A活化。用于进行共抑制的寡核苷酸及表达载体可按照本领域已知的方法和这里提供的指导制造；例如，用于制造和表达反义寡核苷酸的方法可用于制造进行共抑制的寡核苷酸及表达载体。进行共抑制的方法是本领域已知的，例如，美国专利号第5,686,649。

[0106] (通过，例如，反义，突变，或共抑制)抑制的其中一个结果是内源性可翻译的、编码细胞凋亡特异性eIF-5A或DHS的mRNA量降低。因此，所产生的细胞凋亡-特异性DHS蛋白的量降低，由此减少活化eIF-5A的量，从而降低细胞凋亡-特异性蛋白的翻译。因此，细胞凋亡被抑制或延迟，这是因为蛋白重新合成是细胞凋亡开始所需的。

[0107] 在本发明另一实施方案中，所述试剂可诱导细胞凋亡-特异性eIF-5A或DHS的功能，由此诱导细胞凋亡。诱导细胞凋亡是指强度或数量的增加，或细胞凋亡的任一或所有明确的形态学特征，例如，细胞皱缩，染色质凝聚，核断裂，以及膜起泡开始的加速。 [0108] 可使用任何诱导细胞凋亡-特异性eIF-5A和/或DHS功能的适宜试剂。本领域技术人员可认识到，可给予细胞凋亡-特异性eIF-5A的失活及活性形式。如果给予失活形式，或8-羟-2，7，10-三氨基癸酸-未修饰形式，那么天然的细胞凋亡-特异性DHS可活化eIF-5A。很多编码细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽和/或DHS多肽的适宜核酸序列都是本领域已知的。例如，SEQ ID NOS：1，3，4，5，11，15，19，20，和 21(细胞凋亡-特异性eIF-5A的核酸序列)，SEQ ID NOS：6和8(细胞凋亡-特异性DHS的核酸序列)，SEQ ID NOS：12和16 eIF-5A(细胞凋亡-特异性多肽的序列)，和SEQ ID NO：7(细胞凋亡-特异性DHS多肽的序列)，或其一部分，可提供适宜的序列。其它适宜的序列可使用已知序列作为探针，按照这里所述的方法找到。

[0109] 例如，可将裸露核酸(裸露DNA载体，如寡核苷酸或质粒)，或多肽，包括重组产生的多肽给予细胞。重组产生的多肽是指将编码eIF-5A或DHS蛋白的DNA序列放入适宜的表达载体中，这将在下面详细描述。宿主是用表达载体转染的，随后产生所需的多肽。然后从宿主细胞中分离多肽。诱导重组细胞凋亡的eIF-5A蛋白可在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中制造，并由本领域那些技术人员使用重组DHS活化。Wang等(2001)J.Biol.Chem.，276，17541-17549；Eriksson等，(2001)Semin.Hematol，38，24-31。所述多肽还可以是利用已知蛋白合成方法合成的。

[0110] 多肽摄取可使用配体促进，例如，来源于炭疽的配体，它可介导在各种细胞中的摄取。Liu等(2001)J.Biol.Chem.，276，46326-46332。此外，还可利用脂质体将重组蛋白给予哺乳动物的靶细胞，组织，和器官。含蛋白的脂质体是静脉内给予的。可通过将特异性细胞受体的配体掺入到脂质体中而实现导向。见，例如，Kaneda，Adv DrugDelivery Rev 43：197-205(2000)。

[0111] 可诱导细胞凋亡-特异性eIF-5A或DHS功能的其中一种优选试剂是表达载体。因此，本发明提供表达载体，它们具有与编码细胞凋亡-特异性eIF-5A多肽和/或DHS多肽的核酸可操纵连接的启动子。本发明的表达载体可以是RNA或DNA，例如，cDNA，基因组DNA，或合成RNA或DNA的形式。DNA可以是双链或单链的，如果是单链，可以是编码链或非-编码链。可使用任何适宜的表达载体(见，例如，Pouwels等，Cloning Vectors：A Laboratory Manual(Elsevior，N.Y.：1985))。优选，表达载体具有与编码细胞凋亡-特异性(相关)eIF-5A多肽和/或细胞凋亡-特异性(相关)DHS多肽的核苷酸序列可操纵连接的启动子序列。

[0112] 在表达载体内，所需核酸与启动子是可操纵连接的，如此启动子才能驱动核酸的表达。可使用任何适宜的启动子，只要核酸被表达。这 种适宜启动子的例子包括各种病毒启动子，真核启动子，和组成型活化的启动子。只要维持这种可操纵连接，表达载体就可含有不止一种核酸(例如，编码细胞凋亡-特异性eIF-5A和/或DHS的核酸)。表达载体可任选含有其它元件，如聚腺苷酸化序列，核糖体进入位点，转录调节元件(例如，增强子，沉默子等)，用于提高载体或转录物的稳定性或提高细胞内所需转录物的翻译或加工的其它序列(例如，分泌信号，前导序列，等)，或任何其它适宜的元件。

[0113] 表达载体可来源于病毒，如腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，逆转录病毒或慢病毒。还可将本发明的表达载体转染到宿主细胞中，所述宿主细胞包括但不限制于，细菌，哺乳动物或昆虫的宿主细胞系统，包括杆状病毒系统(见，例如，Luckow等，Bio/Technology，6，
47(1988))，和已经确立的细胞系，如293，COS-7，C127，3T3，CHO，HeLa，BHK等。 [0114] 优选腺病毒载体，这是因为和质粒及其它病毒载体(例如，单纯性疱疹病毒)不同，腺病毒载体可同时在分裂细胞和未分裂细胞中获得基因转移，以及蛋白在心血管相关位点，如心肌，血管内皮和骨骼肌中的高水平表达。此外，腺病毒载体可将基因转移到染色体外位置，并因此很少会出现将转移基因不适当插入到宿主基因组关键位点中的危险。而且希望腺病毒载体在病毒复制所需的至少一个基因功能方面有缺陷。优选，腺病毒载体在腺病毒基因组E1，E2，和/或E4区的至少一个重要基因功能方面有缺陷。更优选，载体在腺病毒基因组E3区的至少一个部分有额外缺陷(例如，E3区的XbaI缺失)。

[0115] 通过简单地向培养基中加入病毒可将重组腺病毒递送给所培养的细胞。宿主动物/人的感染可通过将病毒颗粒直接注射到血流或预定组织中获得。病毒在血清中的半衰期可通过使病毒与脂质体(例如Lipofectin，Life Technologies)或聚乙二醇复合而延长。腺病毒载体常常通过病毒纤维蛋白隆突结构域和柯萨奇病毒及腺病毒受体CAR之间的相互作用而进入细胞。病毒载体可通过对病毒进行基因工程改造，使其表达对特定细胞受体特异的配体，来针对特定的细胞或不表达CAR的细胞。

[0116] 在可选择性的实施方案中，细胞凋亡可通过使用化学品对内源性细胞凋亡-特异性eIF-5A，或细胞凋亡-特异性DHS，或两者的转录进行 化学上调，或通过化学提高细胞凋亡-特异性eIF-5A的活化而引发或提高。在其中一个实施方案中，将PGF-2α给予动物/人的癌细胞或肿瘤，从而上调DHS和eIF-5A的转录。

[0117] 细胞凋亡-特异性eIF-5A是调节细胞凋亡，包括作为疾病过程基础的细胞凋亡的适宜目标，这是因为它有可能在涉及细胞凋亡途径的下游效应子和转录因子的转录后调节方面发挥作用。单独或结合进行的、本发明调节细胞凋亡-特异性eIF-5A和细胞凋亡-特异性DHS的方法可在动物细胞中完成，诱导或提高细胞凋亡，并产生治疗和预防疾病的新方法及组合物，所述疾病的病因与细胞没有能力经历凋亡有关。

[0118] 很多重要的人类疾病都是由细胞凋亡控制中的异常而引起。这些异常可导致细胞(例如，癌细胞)数的病理性增加或细胞损耗(例如，变性疾病)。作为非限制性的实例，本发明的方法和组合物可用于预防或治疗下列与细胞凋亡有关的疾病和病症：神经病/神经变性疾病(例如，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷顿氏舞蹈病，肌萎缩性侧索硬化(Lou Gehrig氏病)，自身免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化)，杜兴氏肌性营养不良(DMD)，运动神经元病，局部缺血，慢性心力衰竭，中风，婴儿脊肌萎缩，心搏停止，肾衰竭，变应性皮炎，脓毒症和脓毒性中风，AIDS，肝炎，青光眼，糖尿病(1型和2型)，哮喘，色素性视网膜炎，骨质疏松症，异种移植排斥，和烧伤。

[0119] 本发明的方法可用于治疗带有癌细胞或患有肿瘤的动物，所用的量分别要足以杀死癌细胞或抑制肿瘤的进展。足以实现该目标的量被定义为治疗有效的剂量。用于这种用途的有效量取决于疾病的严重程度和动物自身免疫系统的一般状况。

[0120] 肿瘤生长的抑制是指阻碍或降低肿瘤的进展，例如，肿瘤的生长，侵入，转移和/或复发。本发明的方法可用于治疗任何适宜的肿瘤，包括，例如，乳腺，心脏，肺，小肠，结肠，脾，肾，膀胱，头和颈，卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾丸，子宫颈或肝的肿瘤。动物，优选哺乳动物，更优选人，可使用本发明的组合物和方法治疗。因此，本发明的方法可在体外，离体，或体内进行。

[0121] 给药方案还可根据动物的疾病状况和状态而改变，通常每天单次团决给药一次或连续输注或多次给药(例如，每4-6小时)，或根据治疗和动物的情况而定。然而应当注意的是，本发明不限于任何特定的剂量。

[0122] 在本发明中，可使用任何适宜的方法或途径给药，例如，口服，静脉内，腹膜内，皮下，或肌内给药。所给予拮抗剂的剂量取决于多种因素，包括，例如，所给予分子的类型，所治疗肿瘤的类型和严重程度，以及给药途径。然而，应当强调的是，本发明不限于任何特定的给药方法或途径。

[0123] 在其中一个可选择性的实施方案中，本发明的方法可与一种或多种常规疗法联合使用。例如，可使用适宜的抗肿瘤剂，如化疗剂或进行放疗。在其它可选择性的实施方案中，本发明的方法可与一种或多种适宜的佐剂联合使用，例如，细胞因子(IL-10和IL-13)或其它免疫刺激剂。

[0124] 在其它可选择性的实施方案中，与细胞凋亡有关的疾病的诊断可使用细胞凋亡-特异性eIF-5A和增殖eIF-5A进行，其与利用不同启动子从不同位置转录的细胞凋亡-特异性eIF-5A不同；尽管两者在结构上同源，但羧基末端有差异。本发明的诊断方法包括比较给定细胞中增殖eIF-5A的量和同一细胞中细胞凋亡-特异性eIF-5A的量。在正常发挥作用的过程中，细胞具有的增殖eIF-5A(这里也称作eIF-5A2)的量要高于细胞凋亡-特异性eIF-5A(这里也称作eIF-5A1)的量。然而，在某些癌细胞中，由于正常的调节机理出错，使得细胞凋亡-特异性eIF5A的量相对于增殖eIF-5A的量发生了改变。因此该方法可在细胞发生任何表型改变之前，诊断细胞为癌细胞。

[0125] 在另一实施方案中，增殖eIF-5A与细胞凋亡-特异性eIF-5A的比值可用于筛选药物。这种方法还包括比较给定细胞中增殖eIF-5A的量和同一细胞中细胞凋亡-特异性eIF-5A的量。将增殖eIF-5A与细胞凋亡-特异性eIF-5A的正常比值和细胞与候选药物接触之后，增殖eIF-5A与细胞凋亡-特异性eIF-5A的比值进行比较。接触后，增殖eIF-5A与细胞凋亡-特异性eIF-5A比值的改变可用于鉴定那些具有细胞凋亡-调节活性的候选药物。具有细胞凋亡-调节活性的候选药物可通过抑制或诱导细胞凋亡而用于治疗与细胞凋亡有关的疾病。此外， 增殖eIF-5A与细胞凋亡-特异性eIF-5A比值的改变可用于调节细胞凋亡，还可用于治疗这里所述与异常细胞凋亡有关的任何状况。

[0126] 使用该方法可有效筛选很多潜在的候选药物，即候选药物库，从而鉴定调节细胞凋亡的库成员。任何候选药物或候选药物库都可使用该方法筛选。例如，已经被确定可以作为细胞凋亡调节剂的生物学反应修饰物，包括改变信号转导途径的单克隆抗体，细胞因子如TRAIL(Apo2配体)，视黄酸/类固醇家族核受体的配体，以及结合并抑制蛋白激酶的小分子化合物都可使用本发明方法来筛选明确的细胞凋亡-调节活性。

[0127] 其中一种适宜的候选物是蛋白激酶C-α反义寡核苷酸，ISIS3521(ISISPharmaceuticals，Inc.，Carlsbad，CA)，它具有抗肿瘤活性。其它具体的特异性候选物包括天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(IdunPharmaceuticals，San Diego，CA)，已知它可在导致癌症和神经变性疾病的各种类型细胞中引发并完成细胞凋亡的方面发挥重要作用；
TM
GENASENSE (Genta，Inc.，Berkeley Heights，NJ)，它是一种阻断Bcl-2产生的反义药物；
INGN 241(IntrogenTherapeutics，Inc.，Houston，TX)，它是针对p53的基因疗法；利妥希玛(IDEC Corporation，Osaka，Japan)，它是抗-CD20单克隆抗体；和用于心血管疾病和癌症的通用细胞凋亡驱动疗法(EgeraTherapeuticsInc.，Quebec，Canada)。

[0128] 应当了解，本发明用于动物预防或治疗目的的核酸及多肽可以组合物的形式给药，所述组合物还含有药学上可接受的载体。适宜的药学上可接受的载体包括，例如，一种或多种水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，及其组合。药学上可接受的载体还可含有微量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，它们可提高结合蛋白的保质期或有效性。正如本领域熟知的，还可配制成注射用组合物，从而在给予哺乳动物后，提供活性成分的快速，持续或延迟释放。

[0129] 本发明的组合物可以各种形式存在。这些包括，例如，固体，半固体，和液体剂型，如片剂，丸剂，粉剂，液体溶液，分散液或混悬液，脂质体，栓剂，可注射及可输注的溶液。优选形式取决于预定的给药方式和治疗应用。

[0130] 这种组合物可按照药物领域熟知的方式制备。在制备组合物时，通常将活性成分与载体混合，或用载体稀释，和/或包封在载体中，它可以是胶囊，小药囊，纸或其它容器的形式。当载体起稀释剂的作用时，它可以是固体，半-固体，或液体物质，充当活性成分的媒介物，赋形剂或介质。因此，所述组合物可以是片剂，锭剂，小药囊，扁囊剂，酏剂，混悬液，气溶胶(固体或存在于液体介质中)，含有10重量％活性化合物的软膏剂，软和硬的明胶胶囊，栓剂，注射液，混悬液，无菌包装的粉剂和局部贴剂。

[0131] 参考为了进行举例说明而提供的下列实施例，可更容易理解本发明的一般性描述。提出实施例的目的在于理解本发明，但不是，也不应被解释为是以任何方式限制本发明的范围。实施例不包括常规方法的详细描述。这种方法是本领域那些普通技术人员熟知的，并且已经在很多公开出版物中描述过。常规方法，如构造载体和质粒，将编码多肽的核酸插入到这种载体和质粒中，将质粒引入到宿主细胞中，以及表达并测定其基因和基因产物时所用那些方法的详细描述可从很多公开出版物获得，包括Sambrook，J.等，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。这里提到的所有参考文献都整体引入。

[0132] 实施例

[0133] 实施例1

[0134] 本实施例可证实编码大鼠eIF-5A核酸的全长cDNA的分离和表征，所述核酸具有细胞凋亡-特异性表达。

[0135] 超数排卵及大鼠黄体中细胞凋亡的诱导

[0136] 给未成熟的(21-30日龄)雌性大鼠皮下注射50IU的PMSG(孕母马血清促性腺激素)，60-65小时后，注射50 IU的HCG(人绒毛膜促性腺激素)，使它超数排卵。用HCG处理7天后，皮下注射500mg的PGF-2α，诱导黄体细胞凋亡。用PGF-2α处理后，在不同时间(例如，1，8，和24小时)处死大鼠，切除黄体，放在液氮中。对照组的黄体组织是在进行PGF-2α处理之前，立即处死大鼠获得的。

[0137] 大鼠卵巢黄体细胞的分散

[0138] 超数排卵后6-9天，给大鼠多位点皮下注射500mg PGF-2α。15-30分钟后，切除超数排卵大鼠的卵巢，放在冰上的EBSS(Gibco)中，吸干并称重。剔除结缔组织，用刮刀将卵巢精细切碎，并用EBSS 2X清洗两次。胶原酶溶液是通过将6.5mg胶原酶(Sigma，Catologue#C5138)在5ml EBSS中涡旋而制备的。将来源于8个卵巢的切碎的组织加入到50ml Erlenmeyer烧瓶中的5ml胶原酶EBSS溶液中，并通过在Diamed移液管中抽取若干次而轻轻搅拌。然后在95％空气，5％CO2 下，将含有切碎的组织的烧瓶放在37℃的水浴中轻轻振摇20分钟(GFL温育箱上的位置45)。

[0139] 温育之后，把烧瓶放在冰上，用塑料移液管将细胞悬浮液转移到装配有Swiss Nitex尼龙单丝(75m)的Nitex过滤器上。把滤液收集在15ml Falcon试管中。将胶原酶溶液(6.5mg胶原酶/5ml EBSS)的第二份等分试样(2.5ml)加入到50ml Erlenmeyer烧瓶的剩余切碎的组织中，使用移液管轻轻搅拌，温育10分钟，并按照上述过滤。将两份滤液混合，室温在临床离心机(约200g)中离心5分钟。用移液管吸出约2ml上清液并弃去，将沉淀的细胞在剩余的2ml上清液中重悬浮。

[0140] 按照上面所述，通过加入5ml MEM，离心并重悬浮而将细胞清洗2次。把清洗过的细胞重悬浮在50ml Erlenmeyer烧瓶的30ml含10mm谷氨酰胺的MEM中，95％空气，5％CO2，37℃时，在没有振摇的情况下温育1小时。如上所述，通过离心使细胞沉淀，并将细胞重悬浮在含10mM谷氨酰胺的MEM中。

[0141] 分散细胞的浓度是使用血细胞计数器测定的，存活力是利用台盼蓝染色确定的。5
将2-5×10 个细胞的等分试样放在12×75mm的试管中，37℃，95％空气，5％CO2时，在没有振摇的情况下温育2-5小时。在此期间，细胞凋亡的进展是通过测定DNA分梯的程度而监测的。

[0142] 利用DNA分梯观察大鼠黄体中的细胞凋亡

[0143] 细胞凋亡的程度是利用DNA分梯测定的。基因组DNA是按照制造商的指导，使用QIAamp DNA血液试剂盒(Qiagen)，从分散的黄体细胞或切除的黄体组织中分离的。黄体组织是在用PGF-2α处理诱导细胞凋亡之前，诱导细胞凋亡后1和24小时切除的。分离的32
DNA是通过用 0.2μCi[α- p]dCTP，1mM Tris，0.5mM EDTA，3个单位的克列诺酶，和分别为
0.2 pM的dATP，dGTP，和dTTP室温温育500ng DNA30分钟而末端标记的。按照Sambrook等所述，使样品通过1ml Sepadex G-50柱而除去未掺入的核苷酸。然后利用Tris-醋酸盐-EDTA(1.8％)凝胶电泳分离样品。室温真空干燥凝胶30分钟，-80℃时，暴露于X-射线胶片24小时。

[0144] 在其中一个实验中，超数排卵大鼠黄体中细胞凋亡的程度是在注射PGF-2α后0，1，24小时检测的。在0小时的对照组中，切除没有注射PGF-2α的卵巢。可反映与细胞凋亡有关的核酸酶活性的低分子量DNA片段的分梯在对照组黄体组织中并不明显，该对照组黄体组织是在用PGF-2α处理前切除的，但在诱导细胞凋亡后的1小时内就可看出，并在诱导细胞凋亡24小时后更显著，如图16所示。在该图中，上面是用大鼠黄体细胞凋亡特异
32
性DHS cDNA的 P-dCTP-标记的3′-未翻译区探测的RNA印迹的放射自显影照片。下面是总RNA的溴化乙锭染色的凝胶。每道含有10μg RNA。该数据表明，血清剥夺后，存在着eIF-5A转录物的下调。

[0145] 在另一个实验中，用盐水代替PGF-2α处理相应的对照组动物。用盐水或PGF-2α处理15分钟后，切除动物的黄体。在切除动物组织3和6小时后，从黄体中分离基因组DNA。DNA分梯和基因组DNA末端标记的增加在从用PGF-2α处理过的动物中切除黄体组织6小时后变得较为明显，但在切除组织3小时后并不明显。见图17。当用PGF-2α处理15分钟后切除黄体，并在体外条件下的EBSS(Gibco)中维持6小时的时候，反映细胞凋亡的DNA分梯也很显著。从基因组DNA更广泛的末端标记可以看出，与细胞凋亡有关的核酸酶活性也很显著。

[0146] 在另一个实验中，皮下注射500μg PGF-2α诱导超数排卵。对照组大鼠是用相等体积的盐水溶液处理的。15-30分钟后，切除卵巢，并用胶原酶切碎。将使用PGF-2α处理过的大鼠的分散细胞在10mm谷氨酰胺+10mm亚精胺中温育1小时，然后在没有亚精胺的10mm谷氨酰胺(第2道)中再温育5小时或在10mm谷氨酰胺+10mm亚精胺中温育1小时，然后在10mm谷氨酰胺+1mm亚精胺中再温育5小时(第3道)。用盐水处理过的大鼠的对照细胞是用胶原酶分散的，并温育1小时，然后仅在谷氨酰胺中再温育5小时(第1道)。
32
利用克列诺酶，使用[α- P]-dCTP标记各样品的500纳克DNA，在1.8％琼脂糖凝胶上分离，并暴露于胶片24小时。结果在图18中给出。

[0147] 在另一个实验中，给超数排卵的大鼠皮下注射1mg/100g体重的亚精胺，并0.333mg/100g体重的三次相等剂量，在皮下注射500μgPGF-2α之前的24，12和2小时给药。将对照组大鼠分成3组：没有注射，注射3次亚精胺，但没注射PGF-2α；以及在进行PGF-2α处理之前，注射3次相等体积的盐水。在进行前列腺素处理后1小时35分钟或3
32
小时45分钟，切除大鼠卵巢，用于分离DNA。利用克列诺酶，使用[α- p]-dCTP标记各样品的500纳克DNA，在1.8％琼脂糖凝胶上分离，并暴露于胶片24小时：第1道，没有注射(在与第3-5道相同的时间处死动物)；第2道，注射3次亚精胺(在与第3-5道相同的时间处死动物)；第3道，注射3次盐水，然后注射PGF-2α(用PGF-2α处理1小时35分钟后，处死动物)；第4道，注射3次亚精胺，然后注射PGF-2α(用PGF-2α处理后1小时35分钟，处死动物)；第5道，注射3次亚精胺，然后注射PGF-2α(用PGF-2α处理后1小时35分钟，处死动物)；第6道，注射3次亚精胺，然后注射PGF-2α(用PGF-2α处理3小时45分钟后，处死动物)；第7道，注射3次亚精胺，然后注射PGF-2α(用PGF-2α处理后3小时
45分钟，处死动物)。结果在图19中给出。

[0148] RNA分离

[0149] 总RNA是在用PGF-2α诱导细胞凋亡后的不同时间，从大鼠切除的黄体组织中分离的。简言之，将所述组织(5g)在液氮中磨碎。将磨碎的粉末与30ml胍缓冲液(4M异硫氰酸胍，2.5mM NaOAc pH 8.5，0.8％β-巯基乙醇)混合。通过4层Miracloth将混合物过滤，并于4℃时，10,000g离心30分钟。然后使上清液经过11,200g的氯化铯密度梯度离心达20个小时。用75％乙醇清洗成颗粒状的RNA，将其重悬浮在60ml EDPC-处理过的水中，然后在-70℃时，使用1.5ml 95％乙醇和60ml 3M NaOAc沉淀RNA。

[0150] 基因组DNA的分离和分梯

[0151] 基因组DNA是根据制造商的指导，使用QIAamp DNA血液试剂盒 (Qiagen)从提取32
的黄体组织或分散的黄体细胞中分离的。DNA是通过用0.2μCi[α- p]dCTP，1mM Tris，
0.5mM EDTA，3个单位的克列诺酶，和分别为0.2 pM的dATP，dGTP，和dTTP室温温育500ng DNA30分钟而末端标记的。按照Maniatis等所述的方法，使样品通过1mlSepadex G-50柱而除去未掺入的核苷酸。然后利用Tris-醋酸盐-EDTA(2％)凝胶电泳分离样品。室温真空干燥凝胶30分钟，-80℃时，暴露于X-射线胶片24小时。

[0152] 质粒DNA的分离，DNA测序

[0153] Sambrook等所述的碱裂解法可用于分离质粒DNA。使用双脱氧测序法对全长阳性cDNA克隆进行测序。Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74：5463-5467。可读框是利用BLAST检索(GenBank，Bethesda，MD)编辑并分析的，序列比对是利用BCM Search Launcher：Multiple Sequence Alignments Pattern-Induced MultipleAlignment Method进行的(见F.Corpet，Nuc.Acids Res.，16：10881-10890，(1987)。序列和序列比对在图5-11中给出。

[0154] 大鼠黄体RNA的RNA印迹杂交

[0155] 在细胞凋亡的不同阶段，从大鼠黄体中分离的20毫克总RNA是在1％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离的，并固定在尼龙薄膜上。利用随机引物试剂盒(Boehringer)，使用32 7
P-dCTP标记的全长大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A cDNA(SEQ ID NO：1)探测薄膜7×10。
32
可选择性地，利用随机引物试剂盒(Boehringer)，使用 P-dCTP标记的全长大鼠细胞凋
7
亡-特异性DHS cDNA(SEQ ID NO：6)探测薄膜(7×10cpm)。室温用1×SSC，0.1％SDS清洗薄膜一次，65℃时用0.2× SSC，0.1％SDS清洗3次。干燥薄膜，并于-70℃时，暴露于X-射线胶片过夜。

[0156] 从中看出，eIF-5A和DHS在细胞凋亡黄体组织中都是上调的。在用低浓度PGF-2α处理从而诱导细胞凋亡后的0时间，细胞凋亡-特异性eIF-5A的表达显著提高，在处理的1小时内大大增加，在处理的8小时内仍然增加，在处理的24小时内稍稍增加(图14)。DHS的表达在0时间时较低，在处理的1小时内大大增加，在处理的8小时内仍然增加，在处理的24小时内稍稍增加(图15)。

[0157] 使用基于酵母菌，真菌和人eIF-5A序列的引物

[0158] 生产细胞凋亡大鼠黄体的RT-PCR产物

[0159] 与基因3’末端对应的部分细胞凋亡-特异性eIF-5A序列(SEQ IDNO：11)是使用从酵母菌，真菌和人eIF-5A序列设计的寡核苷酸引物对，利用RT-PCR，从细胞凋亡大鼠黄体RNA模板生产的。用于分离大鼠eIF-5A基因3’末端的上游引物是20个核苷酸的简并引物：5’TCSAARACHGGNAAGCAYGG3’(SEQ ID NO：9)，其中S选自C和G；R选自A和G；H选自A，T，和C；Y选自C和T；N是任意的核酸。用于分离大鼠eIF-5A基因3’末端的下游引物含有42个核苷酸：5’GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’(SEQ IDNO：10)。进行逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。简单地说，使用5mg下游引物合成cDNA的第一个链。然后将第一个链用作RT-PCR的模板，RT-PCR中同时使用上游和下游引物。 [0160] 在琼脂糖凝胶上分离的RT-PCR产物揭示存在一个900bp的片段，然后利用平端TM
连接将其亚克隆到pBluescript (Stratagene CloningSystems，LaJolla，CA)中，并测序(SEQ ID NO：11)。3’末端的cDNA序列是SEQ ID NO：11，3’末端的氨基酸序列是SEQ ID NO：12。见图1-2。

[0161] 与基因5’末端对应，并与3’末端重叠的部分细胞凋亡-特异性eIF-5A序列(SEQ ID NO：15)是利用RT-PCR，从细胞凋亡大鼠黄体RNA模板产生的。5’引物是具有序列5’CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3’(SEQID NO：13)的24聚体，它是从人eIF-5A序列设计的。3’引物是具有序列5’ATATCTCGAGCCTTGATTGCAACAGCTGCC3’(SEQ ID NO：14)的30聚体，它是根据3’末端的RT-PCR片段设计的。进行逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。简单地说，使用5mg下游引物合成cDNA的第1个链。然后将第1个链用作RT-PCR中的模板，RT-PCR中同时使用上游和下游引物。

[0162] 在琼脂糖凝胶上分离的RT-PCR产物揭示存在一个500bp的片段，然后使用分别存TM在于上游和下游引物中的XbaI和XhoI克隆位点将其亚克隆到pBluescript (Stratagene Cloning Systems，LsJolla，CA)中，并测序(SEQ ID NO：15)。5’末端的cDNA序列是SEQ ID NO：15， 5’末端的氨基酸序列是SEQ ID NO：16。见图2。

[0163] 大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的3’和5’末端序列(分别为SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：15)重叠，产生全长cDNA序列(SEQ ID NO：1)。将该全长序列与Genbank数据库中的序列进行比对。见图1-2。cDNA克隆编码计算的分子量为16.8KDa、具有154个氨基酸的多肽(SEQ IDNO：2)。利用RT-PCR获得的大鼠细胞凋亡-特异性黄体eIF-5A基因的全长cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO：1在图3中描述，相应的衍生氨基酸序列是SEQ ID NO：9。将eIF-5A的衍生全长氨基酸序列与人和小鼠eIF-5A的序列进行对比。见图7-9。 [0164] 使用基于人DHS序列的引物生产细胞凋亡大鼠黄体的RT-PCR产物

[0165] 与基因3’末端对应的部分细胞凋亡-特异性DHS序列(SEQ ID NO：6)是使用从人DHS序列设计的一对寡核苷酸引物，通过RT-PCR从细胞凋亡大鼠黄体RNA模板产生的。5’引物是具有序列5’GTCTGTGTATTATTGGGCCC3’(SEQ ID NO：17)的20聚体；3’引物是具有序列5’GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’(SEQID NO：18)的42聚体。
进行逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)。简单地说，使用5mg的下游引物合成cDNA的第1个链。然后将第1个链用作RT-PCR的模板，RT-PCR同时使用上游和下游引物。

[0166] 在琼脂糖凝胶上分离的RT-PCR产物揭示存在一个606bp的片段，利用平端连接将TM其亚克隆到pBluescript (Stratagene CloningSystems，LsJolla，CA)中，并测序(SEQ ID NO：6)。通过RT-PCR获得的大鼠细胞凋亡-特异性黄体DHS基因的部分cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)在图4中描述，对应的衍生氨基酸序列是SEQ ID NO：7。

[0167] 基因组DNA的分离和DNA分析

[0168] 进行DNA印迹的基因组DNA是从切除的大鼠卵巢中分离出来的。将大约100mg的卵巢组织分成小份，放在15ml试管中。使用1ml PBS，通过轻轻振摇组织混悬液而将组织清洗两次，然后使用移液管吸出PBS。将组织重悬浮在2.06ml的DNA-缓冲液(0.2M Tris-HCl pH 8.0和0.1mM EDTA)中，加入240μl的10％SDS和100μl的蛋白酶K(Boehringer Manheim；10mg/ml)。将组织放在45℃的水浴中振摇 过夜。第2天，再加入100μl蛋白酶K(10mg/ml)，然后在45℃的水浴中温育组织混悬液4小时。温育后，用相等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取组织混悬液1次，然后用相等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)提取1次。提取后，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2个体积的乙醇。用本生灯将玻璃移液管密封，并弯成钩状，用于从溶液中拉出DNA丝，并将DNA转移到干净的微量离心管中。将DNA在70％乙醇中清洗1次，风干10分钟。将DNA颗粒状物溶解在500μl的10mM Tris-HCl(pH8.0)中，加入10μl RNA酶A(10mg/ml)，37℃温育DNA1小时。用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA一次，通过加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2个体积的乙醇而使DNA沉淀。4℃时，通过13,000xg离心10分钟而使DNA成颗粒状物。将DNA颗粒状物在70％乙醇中清洗1次，然后通过4℃时，使DNA旋转过夜而将其溶解在200μl的10mM Tris-HCl(pH 8.0)中。

[0169] 为了进行DNA印迹分析，用各种限制酶消化从大鼠卵巢中分离的基因组DNA，所述限制酶或者不在内源性基因中切割，或者仅切割一次。为了实现这一点，使10μg基因组DNA，20μl 10X反应缓冲液和100U限制酶在总共200μl的反应体积中反应5-6小时。将消化的DNA加样到0.7％琼脂糖凝胶上，40伏电泳6小时或15伏电泳过夜。电泳后，使凝胶在0.2N HCl中脱嘌呤10分钟，接着在变性溶液(0.5MNaOH，1.5M NaCl)中清洗两次，每次15分钟，然后在中和缓冲液(1.5MNaCI，0.5M Tris-HCl pH7.4)中清洗两次，每次15分钟。将DNA转移到尼龙薄膜上，使薄膜在杂交溶液(40％甲酰胺，6X SSC，5XDenhart′s溶液(1X Denhart′s溶液是0.02％Ficoll，0.02％PVP，和0.02％BSA)，0.5％SDS，和1.5mg32
变性鲑鱼精子DNA)中预杂交。利用随机引物，使用[α- P]-dCTP标记大鼠eIF-5A cDNA
6
3’UTR的700bp PCR片段(650bp的3’UTR和50bp的编码)，然后以1×10cpm/ml加到薄膜上。

[0170] 同样，利用随机引物，使用[α-32P]-dCTP标记大鼠DHS cDNA的606bp PCR片段6
(450bp的编码和156bp的3’UTR)，然后以1×10cpm/ml加入到第2张相同的薄膜上。印迹在42℃杂交过夜，42℃用2×SSC和0.1％SDS清洗1次，然后42℃用1×SSC和0.1％SDS清洗2次。然后使印迹暴露于胶片3-10天。

[0171] 按照图20所示，用限制酶切割大鼠黄体基因组DNA，并用32P-dCTP-标记的全长eIF-5A cDNA探测。高度严格条件下的杂交揭示了全长cDNA探针与每个限制酶消化的DNA样品的若干限制片段杂交，表明若干eIF-5A同种型的存在。特别值得注意的是，当使用EcoRV(它在细胞凋亡-特异性eIF-5A的可读框内具有一个限制位点)消化大鼠基因组DNA时，在DNA印迹中可检测到eIF-5A细胞凋亡-特异性同种型的2个限制片段。这两个片段在图20中用双箭头表示。与eIF-5A细胞凋亡-特异性同种型对应的限制片段在标记了EcoRI和BamHI的道中是用单箭头表示的，所述限制酶在可读框内没有切割位点。这些结果表明，细胞凋亡-特异性eIF-5A在大鼠中是单拷贝基因。如图5-13所示，物种间的eIF-5A基因高度保守，从而预期在任何物种的同种型间，存在大量保守。

[0172] 图21表示用32P-dCTP-标记的部分大鼠黄体细胞凋亡-特异性DHScDNA探测的DNA印迹。基因组DNA是用EcoRV，一种不会切割被用作探针的部分cDNA的限制酶切割的。其中有两个限制片段非常明显，表明基因有两个拷贝，或该基因含有带EcoRV位点的内含子。 [0173] 实施例2

[0174] 本实施例证实使用细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS调节细胞凋亡。

[0175] COS-7细胞的培养和RNA的分离

[0176] COS-7，一种使用编码野生型T抗原的SV40突变体转化的非洲绿猴肾成纤维细胞样细胞系，可用于所有以转染为基础的实验。COS-7细胞是在Dulbecco’s修饰Eagle’s培养基(DMEM)中培养的，每升培养基含有0.584克L-谷氨酰胺，4.5g葡萄糖，和0.37％碳酸氢钠。培养基中还补充了10％的胎牛血清(FBS)和100个单位的青霉素/链霉素。细胞在37℃、5％CO2和95％空气的湿润环境下生长。每3-4天，通过用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA的溶液使粘着的细胞分离而再次培养该细胞。将分离的细胞以1∶10的比例分散在含有新鲜培养基的新的培养皿中。

[0177] 用于分离RNA的COS-7细胞是在150-mm组织培养皿(Corning)中 生长的。通过用胰蛋白酶-EDTA溶液分离它们而采集细胞。将采集的细胞收集在离心管中，通过3000rpm离心5分钟而使细胞成颗粒状物。除去上清液，将细胞颗粒状物在液氮中瞬间冷冻。按照制造商的建议，使用GenElute哺乳动物总RNA微量制备试剂盒(Sigma)分离冷冻细胞的RNA。

[0178] 重组质粒的构建和COS-7细胞的转染

[0179] 携带有义方向大鼠细胞凋亡eIF-5A的全长编码序列，携带反义方向大鼠细胞凋亡eIF-5A的3’未翻译区(UTR)的重组质粒是使用哺乳动物表位标记表达载体，pHM6(Roche Molecular Biochemicals)构建的，如图21所示。所述载体含有下列：CMV启动子-人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子；来源于流感血细胞凝集素的HA-九肽表位标记；BGH pA-牛生长激素聚腺苷酸化信号；flori-f1起点；SV40ori-SV40早期启动子和起点；
新霉素-新霉素抗性(G418)基因；SV40pA-SV40聚腺苷酸化信号；Col E1-Col E1起点；
氨苄西林-氨苄西林抗性基因。大鼠细胞凋亡eIF-5A的全长编码序列和大鼠细胞凋亡eIF-5A的3’UTR是通过PCR，从pBluescript中的原始大鼠eIF-5A的RT-PCR片段扩增的(SEQ IDNO：1)。为了扩增全长eIF-5A，所用引物如下：正向5’GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG3’(Hind3)(SEQ ID NO：22)和反向5’CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG3’(EcoR1)(SEQ ID NO：23)。为了扩增3’UTR大鼠eIF-5A，所用引物如下：正向5’AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC3’(EcoR1)(SEQ ID NO：24 )和反向5’GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’(Hind3)(SEQ ID NO：10)。

[0180] 进行琼脂糖凝胶电泳后分离的全长大鼠eIF-5A PCR产物的长度为430bp，而3’UTR大鼠eIF-5A PCR产物的长度为697bp。将两个PCR产物亚克隆到pHM6的Hind3和EcoR1位点中，从而制备pHM6-全长eIF-5A和pHM6-反义3’UTR eIF-5A。用来源于多克隆位点上游的流感血细胞凝集素(HA)的九肽表位标记将全长大鼠eIF-5A PCR产物亚克隆到读框中，从而使用抗-[HA]-过氧化物酶抗体检测重组蛋白。表达是由人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子驱动的，从而确保在哺乳动物细胞系中高水平表达。所述质粒还可提供用于选择稳定转染子的新霉素抗性(G418)基因，以及在表达SV40大型T抗原的细胞，如COS-7细胞中进行附加型复制的SV40早期启动子和起点。

[0181] 转染实验中使用的COS-7细胞或者在24孔细胞培养平板(Corning)中培养，用于提取细胞的蛋白，或者在4室培养载玻片(Falcon)中培养，用于将细胞染色。细胞在补充了10％FBS，但没有青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长至50-70％融合。24-孔平板的其中一个孔或培养载玻片所需的转染培养基是通过将0.32μg质粒DNA在42.5μl无血清的DMEM中稀释，并在室温温育混合物15分钟而制备的。将1.6μl的转染试剂，脂转染胺(Gibco，BRL)在42.5μl无血清的DMEM中稀释，室温温育5分钟。5分钟后，将脂转染胺混合物加入到DNA混合物中，室温共同温育30-60分钟。在覆盖转染培养基之前，用无血清的DMEM清洗待转染的细胞1次，然后将细胞放回到生长室中温育4小时。

[0182] 温育后，向细胞中加入0.17ml的DMEM+20％FBS。在先于染色进行的、诱导细胞凋亡之前，或采集进行蛋白质印迹分析之前，将细胞再培养40小时。作为对照，还要进行模拟转染，其中的转染培养基中没有质粒DNA。

[0183] 蛋白提取和蛋白质印迹

[0184] 进行蛋白质印迹的蛋白是通过在PBS(8g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，和0.24g/L KH2PO4)中将细胞清洗2次，然后加入150μl热的SDS凝胶-加样缓冲液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，和10％甘油)而从转染细胞中分离出来的。将细胞的溶胞产物收集在微量离心管中，95℃加热10分钟，然后13,000xg离心10分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，-20℃贮存备用。

[0185] 为了进行蛋白质印迹，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离2.5或5μg的总蛋白。将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后将薄膜在封闭溶液(5％脱脂乳粉末，0.02％叠氮化钠的PBS溶液)中温育1小时，并在PBS-T(PBS+0.05％吐温-20)中清洗3次，每次15分钟。将薄膜在4℃的PBS-T中贮存过夜。第2天温热至室温后，将薄膜在1μg/ml的聚乙烯醇中封闭30秒。将薄膜在去离子水中清洗5次，然后在5％乳汁的PBS溶液中封闭30分钟。在与薄膜温育前，将第一抗体在5％乳汁的PBS溶液中预温育30分钟。 [0186] 可使用多种第一抗体。使用1∶5000稀释的抗-[HA]-过氧化物酶抗体(Roche Molecular Biochemicals)检测重组蛋白的表达。因为这种抗体与过氧化物酶偶联，因此无需第二抗体，清洗印迹并利用化学发光显色。可使用的其它第一抗体是来源于Oncogene的单克隆抗体，它可识别p53(Ab-6)，Bcl-2(Ab-1)，和c-Myc(Ab-2)。p53的单克隆抗体是以0.1μg/ml的稀释度使用的，Bcl-1和c-Myc的单克隆抗体是以0.83μg/ml的稀释度使用的。用第一抗体温育60-90分钟后，将薄膜在PBS-T中清洗3次，每次15分钟。然后将第二抗体在1％乳汁的PBS溶液中稀释，与薄膜温育60-90分钟。当使用p53(Ab-6)作为第一抗体时，所用的第二抗体是1∶1000稀释的、与碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG(Rockland)。当使用Bcl-2(Ab-1)和c-Myc(Ab-2)作为第一抗体时，使用1∶5000稀释的、与过氧化物酶偶联的兔抗-小鼠IgG(Sigma)。用第二抗体温育后，将薄膜在PBS-T中清洗3次。

[0187] 比色法和化学发光法这两种检测方法用于使印迹显色。仅当使用p53(Ab-6)作为第一抗体，以及碱性磷酸酶-偶联的第二抗体时，使用比色法。结合抗体是通过在黑暗中，在0.33mg/mL硝基蓝四唑 ，0.165mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，100mM NaCl，5mM MgCl2，和100mM Tris-HCl(pH 9.5)的溶液中温育而目测观察的。显色反应通过在2mM EDTA的PBS溶液中温育印迹而终止。化学发光检测法可用于所有其它的第一抗体，包括抗-[HA]-过氧化物酶，Bcl-2(Ab-1)，和c-Myc(Ab-2)。ECL Plus蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham PharmaciaBiotech)用于检测过氧化物酶偶联的结合抗体。简单地说，将薄膜轻轻吸干，然后在黑暗中，与试剂A和试剂B的40∶1混合物温育5分钟。将薄膜吸干，放在醋酸盐层之间，暴露于X-射线胶片接触10秒-10分钟。

[0188] 在COS 7细胞中诱导细胞凋亡

[0189] 血清剥夺以及用放线菌素D，链霉菌(Calbiochem)处理这两种方法都可用于在转染的COS-7细胞中诱导细胞凋亡。对于两种处理方法而言，转染后40小时除去培养基。对于血清饥饿实验而言，用无血清和抗生素的DMEM替换培养基。将在补充了10％FBS、没有抗生素的DMEM中生长的细胞用作对照。对于放线菌素D诱导的细胞凋亡而言，用补 充了10％FBS和1μg/ml放线菌素D的甲醇溶液、且没有抗生素的DMEM替换培养基。对照组细胞是在补充了10％FBS和相等体积甲醇、且没有抗生素的DMEM中生长的。对于两种方法而言，凋亡细胞的百分比是在用Hoescht或膜联蛋白V-Cy3染色48小时后测定的。细胞凋亡的诱导还可通过RNA印迹分析加以证实，如图22所示。

[0190] Hoescht染色

[0191] 核染料Hoescht用于标记转染的COS-7细胞的核，从而鉴定以形态学特征，如核断裂及凝聚为基础的凋亡细胞。使用前，即时制备固定的，由无水甲醇和冰醋酸的3∶1混合物组成的固定剂。然后向在培养载玻片上生长的COS-7细胞培养基中加入相等体积的固定剂，并温育2分钟。除去细胞中的培养基/固定剂混合物，并弃去，向细胞中加入1ml的固定剂。5分钟后，弃去固定剂，向细胞中加入1ml新鲜的固定剂，温育5分钟。弃去固定剂，在加入1ml的Hoescht染色剂(0.5μg/ml Hoescht 33258的PBS溶液)前，将细胞风干4分钟。在黑暗中温育10分钟后，弃去染色溶液，用去离子水清洗载玻片3次，每次1分钟。清洗后，向细胞中加入1ml的McIlvaine’s缓冲液(0.021M柠檬酸，0.058M Na2HPO4.7H2O；
pH5.6)，并在黑暗中温育20分钟。弃去缓冲液，将细胞在黑暗中风干5分钟，并除去分离培养载玻片各孔的室。在载玻片上加几滴荧光Vectashield封固剂(VectorLaboratories)，并盖上盖玻片。在使用UV滤光器的荧光显微镜下可观察到染色的细胞。将鲜明染色或核断裂的细胞记录为细胞凋亡。

[0192] 膜联蛋白V-Cy3染色

[0193] 膜联蛋白V-Cy3细胞凋亡检测试剂盒(Sigma)用于荧光标记凋亡细胞上外在化的磷脂酰丝氨酸。按照制造商的方案使用该试剂盒，并进行下列改进。简单地说，用PBS清洗在四室培养载玻片上生长的转染的COS-7细胞2次，用1X结合缓冲液清洗3次。加入150μl染色溶液(溶解在1X结合缓冲液中的1μg/ml AnnCy3)，在黑暗中温育细胞10分钟。然后除去染色溶液，用1X结合缓冲液清洗细胞5次。除去培养载玻片上的室壁，并将几滴1X结合缓冲液放在细胞上，盖上盖玻片。使用绿色滤光器，通过荧光显微镜检查分析染色的细胞，从而观察到 阳性染色(凋亡)细胞的红色荧光。总细胞群是通过在可见光下计算细胞数而测定的。

[0194] 实施例3

[0195] 本实施例证实使用细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS调节细胞凋亡。

[0196] 使用前面实施例描述的方法和一般过程，图23是举例说明COS-7细胞瞬时转染的流程图，其中将无血清培养基中的细胞在脂转染胺的质粒DNA中温育4小时，加入血清，将细胞再温育40小时。或者在进行分析之前，将细胞在含有血清的规则培养基中再培养48小时(即，没有进一步的处理)，或者在进行分析之前，使血清缺失48小时而诱导细胞凋亡，或者在进行分析之前，用放线菌素D处理48小时而诱导细胞凋亡。

[0197] 图22是举例说明使用pHM6转染后，外源性蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达。蛋白是在模拟转染，或用pHM6-LacZ，pHM6-反义3’rF5A(pHM6-反义3’UTR大鼠细胞凋亡eIF-5A)，或pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠细胞凋亡eIF-5A)转染48小时后，从COS-7细胞中分离出来的。各样品的5μg蛋白是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到PVDF薄膜上，使用抗-[HA]-过氧化物酶进行蛋白质印迹。利用化学发光检测结合抗体，并使其暴露于X-射线胶片30秒。LacZ(第2道)和有义大鼠细胞凋亡eIF-5A(第4道)的表达清晰可见。

[0198] 如上所述，或者模拟转染或者用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染COS-7细胞。转染40小时后，通过剥夺血清48小时而诱导细胞经历凋亡。使用荧光同源性天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶测定试剂盒(Roche Diagnostics)测量转染细胞提取物中的天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性。还可使用FragEL DNA断裂细胞凋亡检测试剂盒(Oncogene)测量DNA的断裂，该试剂盒使用荧光素-标记的脱氧核苷酸标记DNA片段的暴露3’OH末端。

[0199] 模拟转染或用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染其它COS-7细胞。转染40小时后，使细胞在含血清的常规培养基中再生长48小时(没有进一步的处理)，通过剥夺血清48小时而诱导细胞经历凋亡，或通过用0.5μg/ml放线菌素D处理48小时而诱导细胞经历凋 亡。或者用Hoescht 33258将细胞染色，它可描述伴随细胞凋亡的核断裂，或者用膜联蛋白V-Cy3将细胞染色，它可描述伴随细胞凋亡的磷脂酰丝氨酸暴露。此外，还可使用绿色滤光器，通过荧光显微镜检查观察染色的细胞，并进行计数，从而测定经历凋亡的细胞百分比。总细胞群是在可见光下计数的。

[0200] 图25说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A表达导致天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性增加60％。

[0201] 图26说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，DNA断裂的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A表达导致DNA断裂增加273％。图27说明细胞凋亡的检测，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，核断裂的增加反映的。图28说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，核断裂的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A表达分别导致非-血清饥饿样品和血清饥饿样品对照组中的核断裂增加27％和63％。

[0202] 图29说明细胞凋亡的检测，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，磷脂酰丝氨酸暴露的增加反映的。图30说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，磷脂酰丝氨酸暴露的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A表达分别导致非-血清饥饿样品和血清饥饿样品对照组中的磷脂酰丝氨酸暴露增加140％和198％。

[0203] 图31说明细胞凋亡的增加，它是通过使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，核断裂的增加反映的。大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A表达分别导致未处理样品和处理样品对照组中的核断裂增加115％和62％。图32说明在使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞的条件下，细胞凋亡增加的对比，其中对COS-7细胞没有 进行进一步的处理或进行了处理而诱导细胞凋亡。

[0204] 实施例4

[0205] 本实施例证实给予细胞凋亡-特异性eIF-5A和DHS后，调节细胞凋亡活性。 [0206] 此外，或者模拟转染，或者用pHM6-LacZ转染，或者用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染COS-7细胞，温育40小时。各样品的5μg蛋白提取物样品是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到PVDF薄膜上，使用可识别Bcl-2的单克隆抗体进行蛋白质印迹。将与过氧化物酶偶联的兔抗-小鼠IgG用作第二抗体，利用化学发光检测结合抗体，并使其暴露于X-射线胶片。结果如图32所示。与使用pHM6-LacZ转染的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中仅检测到更少量的Bcl-2；因此，Bcl-2是下调的。 [0207] 或者模拟转染，用pHM6-反义3’rF5A(大鼠细胞凋亡-特异性eIF-5A的pHM6-反义3’UTR)转染，或者用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠细胞凋亡特异性eIF-5A)转染其它COS-7细胞。转染40小时后，通过剥夺血清48小时而诱导细胞经历凋亡。各样品的5μg蛋白提取物样品是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到PVDF薄膜上，使用可识别Bcl-2的单克隆抗体进行蛋白质印迹。将与过氧化物酶偶联的兔抗-小鼠IgG用作第二抗体，利用化学发光检测结合抗体，并使其暴露于X-射线胶片。

[0208] 此外，或者模拟转染，或者用pHM6-LacZ转染，或者用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染COS-7细胞，温育40小时。各样品的5μg蛋白提取物样品是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到PVDF薄膜上，使用可识别p53的单克隆抗体进行蛋白质印迹。将与碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG用作第二抗体，利用比色法检测结合抗体。 [0209] 最后，或者模拟转染，或者用pHM6-LacZ转染，或者用pHM6-有义rF5A(pHM6-全长大鼠eIF-5A)转染COS-7细胞，温育40小时。各样品的5μg蛋白提取物样品是通过SDS-PAGE分级分离的，然后转移到PVDF薄膜上，使用可识别p53的单克隆抗体探作为探针进行杂交。相应的蛋白印迹是用抗-[HA]-过氧化物酶探测的，从而测定大鼠细胞凋 亡-特异性eIF-5A的表达水平。将与碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG用作第二抗体，利用化学发光法检测结合抗体。

[0210] 图33说明当使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，Bcl-2的下调。上面是考马斯蓝染色的蛋白印迹；下面是相应的蛋白质印迹。与使用pHM6-LacZ转染的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中检测到更少量的Bcl-2。

[0211] 图34说明当使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按反义方向瞬时转染COS-7细胞时，Bcl-2的上调。上面是考马斯蓝染色的蛋白印迹；下面是相应的蛋白质印迹。与模拟转染或使用pHM6-有义rF5A转染的那些相比，在使用pHM6-反义3’rF5A转染的细胞中检测到更多的Bcl-2。

[0212] 图35说明当使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，c-Myc的上调。上面是考马斯蓝染色的蛋白印迹；下面是相应的蛋白质印迹。与使用pHM6-LacZ或模拟对照组转染的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中检测到更多的c-Myc。

[0213] 图36说明当使用含有全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A的pHM6，按有义方向瞬时转染COS-7细胞时，p53的上调。上面是考马斯蓝染色的蛋白印迹；下面是相应的蛋白质印迹。与使用pHM6-LacZ或模拟对照组转染的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中检测到更多的p53。

[0214] 图37说明p53上调依赖于pHM6-全长大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-5A在COS-7细胞中的表达。在使用抗-[HA]-过氧化物酶探测蛋白质印迹中，上面是考马斯蓝染色的蛋白质印迹，下面是相应的蛋白质印迹。与第2次转染相比，在第1次转染中检测到更多的大鼠细胞凋亡-诱导的eIF-SA。在使用抗-p53作为探测蛋白质印迹中，A中上面是相应的考马斯蓝染色的蛋白印迹，下面是使用p53的蛋白质印迹。对于第1次转染而言，与使用pHM6-LacZ或模拟对照组转染的那些相比，在使用pHM6-有义rF5A转染的细胞中检测到更多的p53。对于其中大鼠细胞凋亡诱导的eIF-5A表达水平较低的第2次转染而言，在使用pHM6-有义rF5A，pHM6-LacZ或模拟对照组转染的细胞之间，没有检测到p53 水平的差异。 [0215] 实施例5

[0216] 本实施例证实细胞凋亡-特异性eIF-5A可诱导具有活性p53的细胞(RKO细胞)以及没有活性p53的细胞(RKO-E6细胞)凋亡，表明细胞凋亡-特异性eIF-5A可通过与p53不同的途径引发细胞凋亡。这还可支持我们的观点，即它在上游发挥作用，很可能杀死多种不同类型的癌症。

[0217] 本实施例还表明eIF-5A1的活性位点是蛋白的羧基末端(即，见，使用截短eIF-5A进行的实验)，它很可能含有RNA结合域。

[0218] 此外，本实施例还可证实人eIF-5A2最可能是增殖eIF-5A，这是因为它不能诱导细胞凋亡。因此，据信人数据库中的两种eIF-5A基因，细胞凋亡-特异性eIf-5A1是细胞凋亡基因，eIF-5A2是增殖基因。

[0219] RKO和RKO-E6细胞的培养

[0220] RKO(美国典型培养物保藏中心CRL-2577)，一种表达野生型p53的人结肠癌细胞系，和RKO-E6(美国典型培养物保藏中心CRL-2578)，一种来源于RKO的细胞系，其含有稳定整合的人乳头状瘤病毒E6致癌基因，可导致正常p53水平和功能的降低，上述这两种细胞都可用于以转染为基础的实验。RKO和RKO-E6细胞是在含有非必需氨基酸，Earle’s盐，和L-谷氨酰胺的极限必需培养基Eagle(MEM)中培养的。培养基中还补充了10％胎牛血清(FBS)和100个单位的青霉素/链霉素。细胞在37℃、5％CO2和95％空气的湿润环境中生长。每3-4天，通过使用0.25％胰蛋白酶和1mM EDTA的溶液分离粘着的细胞而将细胞再次培养。将分离的细胞以1∶10-1∶12的比例分散在新培养皿中的新鲜培养基中。

[0221] 入eIF5A2的克隆

[0222] 使用根据从Genbank获得的人eIF-5A2序列设计的引物(ACCESSION XM_113401)，通过RT-PCR，从RKO细胞的RNA中分离人eIF5A2。图38提供从RKO细胞中分离的人eIF-5A的序列与人eIF-5A2的序列的对比。RNA是使用GenElute哺乳动物总RNA微
量制备试剂盒 (Sigma)从RKO细胞中分离的。用于扩增eIF5A2的正向引物具有序列
5’AAACTACCATCTCCCCTGCC3’，反向引物具有序列5’TGCCCTACACAGGCTGAAAG3’。将所得的
936bp PCR产物亚克隆到pGEM-T Easy载体(Promega)中，并测序。

[0223] 然后将pGEM-T Easy-eIF5A2构建体用作模板，产生亚克隆到哺乳动物表达载体pHM6(Roche)的读框中的eIF5A2 PCR片段。用于扩增人eIF5A2的正向引物是5’ATCAAGCTTGCCCACCATGGCAGACG3’，反向引物是5’AACGAATTCCATGCCTGATGTTTCCG3’。所得的505bpPCR产物是用Hind3和EcoR1消化的，并亚克隆到pHM6的Hind3和EcoR1位点中。

[0224] pHM6-截短的eIF5A1的构建

[0225] 为了确定eIF5A1的羧基末端是否对其诱导细胞凋亡的活性很重要，构建羧基末端缺失的eIF5A1。编码氨基酸1-127的截短的eIF5A1是使用pBS-大鼠eIF5A1作为模板，利用PCR产生的。正向PCR引物是5’GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG3’，反向引物是5’TCCGAATTCGTACTTCTGCTCAATC3’。所得的390bp PCR产物是用Hind3和EcoR1消化的，并被亚克隆到pHM6的Hind3和EcoR1位点中。

[0226] 转染

[0227] 转染实验中所用的RKO或RKO-E6细胞进行Hoecht染色时，是在8孔室培养载玻片(Falcon)中培养的，通过流式细胞术进行分析时，是在6孔平板中培养的。所述细胞在补充了10％胎牛血清，但没有青霉素/链霉素的MEM培养基中生长至70-80％融合。8孔培养载玻片的其中一个孔所需的转染培养基是通过将0.425μg质粒DNA稀释在22μl无血清的MEM中，室温温育混合物15分钟而制备的。将0.85μl的转染试剂，脂转染胺(Gibco，BRL)稀释在22μl无血清的MEM中，室温温育5分钟。5分钟后，将脂转染胺混合物加入到DNA混合物中，室温温育30-60分钟。在向转染培养基中加入44μl MEM，并将它覆盖在细胞上之前，用无血清的MEM清洗细胞1次。将细胞放回到生长室中达4小时。温育后，向细胞中加入88μl的MEM+20％FBS。然后将细胞再培养44小时，并按照前面所述用Hoescht33258染色。在另一组实验中， 在转染并用Hoescht染色20小时后，用0.25μg/ml的放线菌素D处理8-孔培养载玻片中的RKO或RKO-E6细胞。在6-孔平板中进行的转染是以相同方式完成的，区别在于所有试剂都增加了4.81倍。转染48小时后，采集在6孔平板中转染的RKO细胞，并将其固定，从而按照下面所述利用流式细胞术进行分析。

[0228] 转染效率的测定

[0229] 转染效率是用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL)将pHM6-LacZ转染的细胞染色而测定的。染成蓝色的细胞是表达LacZ的转染细胞，转染效率是通过用染成蓝色的细胞数除以总细胞数而计算的。转染48小时后，将转染的细胞染色。用PBS清洗细胞2次，然后室温时，在0.5％gluteraldehyde/PBS中固定10分钟。用1mMMgCl2/PBS清洗细胞3次，然后用染色溶液[5mM K4Fe(CN)6.3H2O，5mMK3Fe(CN)6，1mM MgCl2，0.1％X-GAL的PBS溶液]温育，直到出现染成蓝色的细胞。

[0230] Hoescht染色

[0231] 核染料Hoescht用于标记转染RKO和RKO-E6细胞的核，从而根据核断裂及凝聚鉴定凋亡细胞。无水甲醇与冰醋酸的3∶1混合物组成的固定剂是在使用前即时制备的。然后向在培养载玻片上生长的细胞培养基中加入相等体积的固定剂，温育2分钟。除去细胞中的培养基/固定剂混合物，并弃去，向细胞中加入1ml固定剂。5分钟后，弃去固定剂，向细胞中加入1ml新鲜的固定剂，温育5分钟。弃去固定剂，在加入1ml的Hoescht染料(0.5μg/ml Hoescht 33258的PBS溶液)之前，将细胞风干4分钟。在黑暗中温育10分钟后，弃去染色溶液，用去离子水清洗载玻片3次，每次1分钟。清洗后，向细胞中加入1ml的McIlvaine’s缓冲液(0.021M柠檬酸，0.058M Na2HPO4.7H2O；pH5.6)，并在黑暗中温育20分钟。弃去缓冲液，将细胞在黑暗中风干5分钟，并除去分隔培养载玻片的孔的室。在载玻片上加几滴荧光Vectashield封固剂(Vector Laboratories)，并盖上盖玻片。在使用UV滤光器的荧光显微镜下可观察到染色的细胞。将鲜明染色或核断裂的细胞记录为细胞凋亡。 [0232] 利用流式细胞术检测DNA断裂

[0233] 利用荧光素-FragELTM DNA断裂检测试剂盒(Oncogene ResearchProducts)，使用荧光素标记的脱氧核苷酸标记在细胞凋亡过程中产生的DNA片段。转染48小时后，通过胰蛋白酶消化采集用各种构建体在6孔培养平板中转染的细胞，然后按照制造商的指导将细胞固定并标记。简单地说，4℃时，1000xg、5分钟，使细胞成颗粒状物，在PBS(8g/LNaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L Na2HPO4，和0.24g/LKH2PO4)中清洗1次。然后将细胞重悬浮在4％甲醛/PBS中，室温温育10分钟。再次使细胞成颗粒状物，重悬浮在1ml 80％乙醇中，4℃贮存。
6
在进行分析当天，将1ml的固定细胞(1×10 个细胞/ml)转移到微量离心管中，通过1000xg离心5分钟而使细胞成颗粒状物。将成颗粒状物的细胞重悬浮在200μl的1×TBS(20mM Tris pH7.6，140mM NaCI)中，室温温育10-15分钟。然后再次使细胞成颗粒状物，重悬浮在
100μl 20μg/ml的蛋白激酶K中，室温温育5分钟。使细胞成颗粒状物，重悬浮在100μl的1×TdT平衡缓冲液中，室温温育10-30分钟。然后通过离心使细胞成颗粒状物，并重悬浮在60μl TdT标记反应混合物中，黑暗中温育1-1.5小时。温育后，离心使细胞成颗粒状物，在200μl 1×TBS中清洗2次。将细胞重悬浮在0.5ml终体积的1×TBS中，并在装配有488nm氩离子激光源的流式细胞器上进行分析。

[0234] 蛋白提取和蛋白质印迹

[0235] 为了进行蛋白质印迹，通过在PBS中清洗细胞2次，然后加入150μl的热SDS凝胶-加样缓冲液(50mM Tris-HCl pH 6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，和10％甘油)而从转染细胞中分离蛋白。将细胞的溶胞产物收集在微量离心管中，95℃加热10分钟，然后13,000xg离心10分钟。将上清液转移到新的微量离心管中，-20℃贮存备用。 [0236] 为了进行蛋白质印迹，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离5μg或10μg的总蛋白。将分离的蛋白转移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后将薄膜在封闭溶液(5％脱脂乳粉末，0.02％叠氮化钠的PBS溶液)中温育1小时，并在PBS-T(PBS+0.05％吐温-20)中清洗3次，每次15分钟。

[0237] 将薄膜在4℃的PBS-T中贮存过夜。第2天温热至室温后，将薄膜在1μg/ml的聚乙烯醇中封闭30秒。在去离子水中清洗薄膜5次，然后在5％乳汁的PBS溶液中封闭30分钟。在与薄膜温育前，将第一抗体在5％乳汁的PBS溶液/0.025％吐温-20中预温育30分钟。

[0238] 使用可识别p53(Ab-6)、来源于Oncogene的单克隆抗体，或针对合成肽(氨基-CRLPEGDLGKEIEQKYD-羧基)的多克隆抗体在薄膜上印迹，所述合成肽与在鸡中含量较高的人eIF5A1的C-末端同源。p53的单克隆抗体是以0.1μg/ml的稀释度使用的，eIF5A1的抗体是以1∶1000的稀释度使用的。用第一抗体温育60-90分钟后，将薄膜在PBS-T中清洗3次，每次15分钟。然后将第二抗体在1％乳汁的PBS溶液/0.025％吐温-20中稀释，与薄膜温育60-90分钟。当使用p53(Ab-6)作为第一抗体时，所用的第二抗体是1∶1000稀释的、与碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG(Rockland)。当使用抗-eIF5A1作为第一抗体时，使用1∶10000稀释的、与过氧化物酶偶联的兔抗-鸡IgY(Gallus Immunotech)。用第二抗体温育后，将薄膜在PBS-T中清洗3次。

[0239] 比色法和化学发光法这两种检测方法都可用于使印迹显色。仅当使用p53(Ab-6)作为第一抗体，以及与碱性磷酸酶-偶联的第二抗体时，使用比色法。结合抗体是通过在黑暗中，在0.33mg/mL硝基蓝四唑 ，0.165mg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，100mM NaCl，5mM MgCl2，和100mM Tris-HCl(pH 9.5)的溶液中温育而目测观察的。显色反应是通过在2mM EDTA的PBS溶液中温育印迹而终止的。化学发光检测法可用于所有其它的第一抗体，包括抗-[HA]-过氧化物酶和抗-eIF5A1。ECLPlus蛋白质印迹检测试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)用于检测与过氧化物酶偶联的结合抗体。简单地说，将薄膜轻轻吸干，然后在黑暗中，与试剂A和试剂B的40∶1混合物温育5分钟。将薄膜吸干，放在醋酸盐层之间，暴露于X-射线胶片10秒-10分钟。

[0240] 图39是描述瞬时转染后，RKO和RKO-E6中发生细胞凋亡百分比的图。RKO和RKO-E6细胞是使用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1瞬时转染的。24小时后，用0.25μg/ml的放线菌素D或相等体积的甲醇(对照组)处理细胞。用Hoescht 20将细胞染色20小时后，使用UV滤光器在荧光显微镜下观察。将由于染色质凝聚而鲜明染色的细胞记录为细 胞凋亡。上述实验说明，用pHM6-eIF5A1转染、并用放线菌素D处理的RKO细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染、但没用放线菌素D处理的细胞增加了240％。用放线菌素D处理、并用pHM6-eIF5A1转染的RKO-E6细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染、但没用放线菌素D处理的细胞增加了105％。

[0241] 图40是描述瞬时转染后，RKO细胞中发生细胞凋亡百分比的图。RKO细胞是用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A1，pHM6-eIF5A2，或pHM6-截短的eIF5A1瞬时转染的。44小时后用Hoescht将细胞染色后，使用UV滤光器在荧光显微镜下观察。将由于染色质凝聚而鲜明染色的细胞记录为细胞凋亡。用pHM6-eIF5A1转染的细胞的凋亡相对于用pHM6-LacZ转染的对照组细胞增加了25％。这种增加对于使用pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染的细胞似乎并不明显。

[0242] 图41是描述瞬时转染后，RKO细胞中发生细胞凋亡百分比的图。RKO细胞或者未被转染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-eIF5A1瞬时转染。44小时后用Hoescht将细胞染色后，使用UV滤光器在荧光显微镜下观察。将由于染色质凝聚而鲜明染色的细胞记录为细胞凋亡。校正转染效率之后，用pHM6-eIF5A1转染的细胞有60％凋亡。

[0243] 图42提供瞬时转染后，RKO细胞凋亡的流式细胞分析。RKO细胞未被转染，或者用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A1，pHM6-eIF5A2，或pHM6-截短的eIF5A1转染。48小时后，采集细胞并固定。反映细胞凋亡的断裂DNA是用与脱氧核苷酸偶联的荧光素标记的，并在装配有488nm的氩离子激光源的流式细胞器上进行分析。E下出现的荧光来源于非-凋亡细胞，F下出现的荧光来源于正在经历凋亡的细胞。该表描述了经历凋亡的细胞百分比，它是以各个峰下的面积为基础计算的。校正未转染细胞中的背景细胞凋亡和转染效率后，有80％用pHM6-eIF5A1转染的细胞显示凋亡。用pHM6-LacZ，pHM6-eIF5A2或pHM6-截短的eIF5A1转染的细胞仅仅显示背景水平的凋亡。

[0244] 图43提供蛋白的蛋白质印迹，所述蛋白是从用0.25μg/ml放线菌素D处理0，3，7，24，和48小时的RKO细胞中分离的。在12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离
5μg(抗-eIF5A1)或10μg(抗-p53)的总蛋白，并转移到聚偏二氯乙烯薄膜上。上面描述使用抗-p53作为第一抗体的蛋白质印迹。中间描述使用抗-eIF5A1作为第一抗体的蛋白质印 迹。下面描述用于抗-eIT5A1印迹的薄膜，该印迹是在化学发光检测以证实等量加样后，用考马斯蓝染色的。p53和eIF5A1都是通过用放线菌素D处理而上调的。

[0245] 序列表

[0246] <110>SENESCO，INC.

[0247] <120>核酸，多肽，以及调节细胞凋亡的方法

[0248] <130>10799/40

[0249] <140>PCT/US02/23254

[0250] <141>2002-07-23

[0251] <150>10/200,148

[0252] <151>2002-07-23

[0253] <150>10/141,647

[0254] <151>2002-07-05

[0255] <150>09/909,796

[0256] <151>2001-07-23

[0257] <160>30

[0258] <170>PatentIn Ver.2.1

[0259] <210>1

[0260] <211>1139

[0261] <212>DNA

[0262] <213>大鼠(Rattus sp.)

[0263] <220>

[0264] <221>CDS

[0265] <222>(33)..(494)

[0266] <400>1

[0267] caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53 [0268] Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe [0269] 1 5

[0270] gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca 101 [0271] Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser [0272] 10 15 20

[0273] gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag 149 [0274] Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys [0275] 25 30 35

[0276] atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 [0277] Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys [0278] 40 45 50 55 [0279] gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 [0280] Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp [0281] 60 65 70

[0282] atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat 293 [0283] Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn [0284] 75 80 85

[0285] gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag 341 [0286] Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln [0287] 90 95 100

[0288] gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389 [0289] Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu [0290] 105 110 115

[0291] ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc 437 [0292] Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile [0293] 120 125 130 135 [0294] aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc 485 [0295] Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala [0296] 140 145 150

[0297] atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc 534 [0298] Met Ala Lys

[0299] atgagcctac agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca 594 [0300] atttatttga cgttttattt tggttttcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc 654 [0301] ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc 714 [0302] ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc 774 [0303] cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg 834 [0304] gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat agtccttcac 894 [0305] ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa 954 [0306] acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc 1014 [0307] atctgggaag gccttgcccc catgggcttt accctttcct gtgggctttc tccctgacac 1074 [0308] atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa 1134 [0309] aaaaa 1139 [0310] <210>2

[0311] <211>154

[0312] <212>PRT

[0313] <213>大鼠

[0314] <400>2

[0315] Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala [0316] 1 5 10 15

[0317] Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val [0318] 20 25 30

[0319] Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr [0320] 35 40 45

[0321] Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe [0322] 50 55 60

[0323] Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp [0324] 65 70 75 80 [0325] Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp [0326] 85 90 95

[0327] Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu [0328] 100 105 110

[0329] Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp [0330] 115 120 125

[0331] Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu [0332] 130 135 140

[0333] Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

[0334] 145 150

[0335] <210>3

[0336] <211>462

[0337] <212>DNA

[0338] <213>人(Homo sapiens)

[0339] <400>3

[0340] atggcagatg acttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 [0341] cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 [0342] gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180 [0343] attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 [0344] gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300 [0345] ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360 [0346] aaggagattg agcagaagta cgactgtgga gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420 [0347] atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 [0348] <210>4

[0349] <211>462

[0350] <212>DNA

[0351] <213>人

[0352] <220>

[0353] <221>修饰的碱基

[0354] <222>(455)..(456)

[0355] <223>a，t，c或g

[0356] <400>4

[0357] atggcagacg aaattgattt cactactgga gatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60 [0358] cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120 [0359] gtggagatgt caacttccaa aactggaaag catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180 [0360] attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gatatttgtc cttctactca caacatggat 240 [0361] gttccaaata ttaagagaaa tgattatcaa ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300 [0362] ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360 [0363] aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420 [0364] atgagtgaag aatatgctgt agccataaaa ccctnngcaa at 462 [0365] <210>5

[0366] <211>462

[0367] <212>DNA

[0368] <213>大鼠

[0369] <400>5

[0370] atggcagatg atttggactt cgagacagga gatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 [0371] cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 [0372] gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag catggccatg ccaaggtcca tctggttggc 180 [0373] attgacattt ttactgggaa gaaatatgaa gatatctgcc cgtcgactca taatatggat 240 [0374] gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 [0375] ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc 360 [0376] aaggagattg agcagaagta tgactgtgga gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc 420 [0377] atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaag gccatggcaa aa 462 [0378] <210>6

[0379] <211>606

[0380] <212>DNA

[0381] <213>大鼠

[0382] <220>

[0383] <221>CDS

[0384] <222>(1)..(453)

[0385] <400>6

[0386] gct gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48 [0387] Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro [0388] 1 5 10 15

[0389] gca ctc aca gac ggc tca ctg ggt gac atg atc ttt ttc cat tcc tat 96 [0390] Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr [0391] 20 25 30

[0392] aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac atc gtt gaa gac ctg cgg ctc atc 144 [0393] Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile [0394] 35 40 45

[0395] aac atg cag gcc att ttc gcc aag cgc act ggg atg atc atc ctg ggt 192 [0396] Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly [0397] 50 55 60

[0398] gga ggc gtg gtc aag cac cac atc gcc aat gct aac ctc atg cgg aat 240 [0399] Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Ash Leu Met Arg Asn [0400] 65 70 75 80 [0401] gga gct gac tac gct gtt tat atc aac aca gcc cag gag ttt gat ggc 288 [0402] Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly [0403] 85 90 95

[0404] tca gac tca gga gcc cgg cca gat gag gct gtc tcc tgg ggc aag atc 336 [0405] Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile [0406] 100 105 110

[0407] cgg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat gct gat gca tct ctg gtt 384 [0408] Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val [0409] 115 120 125

[0410] ttc ccc ttg ctg gtg gct gag aca ttc gcc caa aag gca gat gcc ttc 432 [0411] Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe [0412] 130 135 140

[0413] aga gct gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggcttctg 483 [0414] Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp

[0415] 145 150

[0416] ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag 543 [0417] catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603 [0418] aaa 606 [0419] <210>7

[0420] <211>151

[0421] <212>PRT

[0422] <213>大鼠

[0423] <400>7

[0424] Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His Ile Pro Val Leu Ser Pro [0425] 1 5 10 15

[0426] Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met Ile Phe Phe His Ser Tyr [0427] 20 25 30

[0428] Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp Ile Val Glu Asp Leu Arg Leu Ile [0429] 35 40 45

[0430] Asn Met Gln Ala Ile Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met Ile Ile Leu Gly [0431] 50 55 60

[0432] Gly Gly Val Val Lys His His Ile Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn [0433] 65 70 75 80 [0434] Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr Ile Asn Thr Ala Gln Glu Phe Asp Gly [0435] 85 90 95

[0436] Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys Ile [0437] 100 105 110

[0438] Arg Met Asp Ala Gln Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val [0439] 115 120 125

[0440] Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gln Lys Ala Asp Ala Phe [0441] 130 135 140

[0442] Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp

[0443] 145 150

[0444] <210>8

[0445] <211>453

[0446] <212>DNA

[0447] <213>人

[0448] <400>8

[0449] tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac 60 [0450] ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac 120 [0451] atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg 180 [0452] atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac 240 [0453] ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt 300 [0454] gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag 360 [0455] gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag 420 [0456] atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453 [0457] <210>9

[0458] <211>20

[0459] <212>DNA

[0460] <213>人工序列

[0461] <220>

[0462] <223>人工序列说明：引物

[0463] <220>

[0464] <221>修饰的碱基

[0465] <222>(12)

[0466] <223>a，t，c或g

[0467] <400>9

[0468] tcsaarachg gnaagcaygg 20 [0469] <210>10

[0470] <211>42

[0471] <212>DNA

[0472] <213>人工序列

[0473] <220>

[0474] <223>人工序列说明：引物

[0475] <400>10

[0476] gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42 [0477] <210>11

[0478] <211>972

[0479] <212>DNA

[0480] <213>大鼠

[0481] <220>

[0482] <221>CDS

[0483] <222>(1)..(327)

[0484] <400>11

[0485] tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att 48 [0486] Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile [0487] 1 5 10 15

[0488] gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat atc tgc ccg tcg act cat 96 [0489] Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His [0490] 20 25 30

[0491] aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc 144 [0492] Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly [0493] 35 40 45

[0494] atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag gac agt ggg gag gta cga 192 [0495] Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg [0496] 50 55 60

[0497] gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag 240 [0498] Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln [0499] 65 70 75 80 [0500] aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc aca gtg ctg tcc gcc atg 288 [0501] Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met [0502] 85 90 95

[0503] aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gcc atg gca aaa taactggctt 337 [0504] Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

[0505] 100 105

[0506] ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagcctac agaggcccct cccccagctc 397 [0507] tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct 457 [0508] caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga 517 [0509] gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag 577 [0510] ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg 637 [0511] gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca 697 [0512] tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca 757 [0513] gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag 817 [0514] ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt 877 [0515] accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact 937 [0516] acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972 [0517] <210>12

[0518] <211>109

[0519] <212>PRT

[0520] <213>大鼠

[0521] <400>12

[0522] Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile [0523] 1 5 10 15

[0524] Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His [0525] 20 25 30

[0526] Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly [0527] 35 40 45

[0528] Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg [0529] 50 55 60

[0530] Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln [0531] 65 70 75 80 [0532] Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met [0533] 85 90 95

[0534] Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

[0535] 100 105

[0536] <210>13

[0537] <211>24

[0538] <212>DNA

[0539] <213>人工序列

[0540] <220>

[0541] <223>人工序列说明：引物

[0542] <400>13

[0543] caggtctaga gttggaatcg aagc 24 [0544] <210>14

[0545] <211>30

[0546] <212>DNA

[0547] <213>人工序列

[0548] <220>

[0549] <223>人工序列说明：引物

[0550] <400>14

[0551] atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc 30 [0552] <210>15

[0553] <211>489

[0554] <212>DNA

[0555] <213>大鼠

[0556] <220>

[0557] <221>CDS

[0558] <222>(33)..(485)

[0559] <400>15

[0560] caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53 [0561] Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe [0562] 1 5

[0563] gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc acc ttc cca atg cag tgc tca 101 [0564] Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser [0565] 10 15 20

[0566] gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg ctc aag ggc cgg cca tgt aag 149 [0567] Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys [0568] 25 30 35

[0569] atc gtc gag atg tct act tcg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 [0570] Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys [0571] 40 45 50 55 [0572] gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 [0573] Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp [0574] 60 65 70

[0575] atc tgc ccg tcg act cat aac atg gat gtc ccc aac atc aaa agg aat 293 [0576] Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn [0577] 75 80 85

[0578] gat ttc cag ctg att ggc atc cag gat ggg tac cta tcc ctg ctc cag 341 [0579] Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln [0580] 90 95 100

[0581] gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389 [0582] Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu [0583] 105 110 115

[0584] ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag atc ctg atc 437 [0585] Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile [0586] 120 125 130 135 [0587] aca gtg ctg tcc gcc atg aca gag gag gca gct gtt gca atc aag gct 485 [0588] Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala [0589] 140 145 150

[0590] cgag 489 [0591] <210>16

[0592] <211>151

[0593] <212>PRT

[0594] <213>大鼠

[0595] <400>16

[0596] Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala [0597] 1 5 10 15

[0598] Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val [0599] 20 25 30

[0600] Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr [0601] 35 40 45

[0602] Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe [0603] 50 55 60

[0604] Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp [0605] 65 70 75 80 [0606] Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp [0607] 85 90 95

[0608] Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu [0609] 100 105 110

[0610] Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp [0611] 115 120 125

[0612] Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu [0613] 130 135 140

[0614] Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala

[0615] 145 150

[0616] <210>17

[0617] <211>20

[0618] <212>DNA

[0619] <213>人工序列

[0620] <220>

[0621] <223>人工序列说明：引物

[0622] <400>17

[0623] gtctgtgtat tattgggccc 20 [0624] <210>18

[0625] <211>42

[0626] <212>DNA

[0627] <213>人工序列

[0628] <220>

[0629] <223>人工序列说明：引物

[0630] <400>18

[0631] gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42 [0632] <210>19

[0633] <211>18

[0634] <212>DNA

[0635] <213>人工序列

[0636] <220>

[0637] <223>人工序列说明：引物

[0638] <400>19

[0639] ttgaaggggt gaggaaaa 18 [0640] <210>20

[0641] <211>15

[0642] <212>DNA

[0643] <213>人工序列

[0644] <220>

[0645] <223>人工序列说明：引物

[0646] <400>20

[0647] ttgagtggga taaag 15 [0648] <210>21

[0649] <211>18

[0650] <212>DNA

[0651] <213>人工序列

[0652] <220>

[0653] <223>人工序列说明：引物

[0654] <400>21

[0655] aatcatctgc cattttaa 18 [0656] <210>22

[0657] <211>26

[0658] <212>DNA

[0659] <213>人工序列

[0660] <220>

[0661] <223>人工序列说明：引物

[0662] <400>22

[0663] gccaagctta atggcagatg atttgg 26 [0664] <210>23

[0665] <211>25

[0666] <212>DNA

[0667] <213>人工序列

[0668] <220>

[0669] <223>人工序列说明：引物

[0670] <400>23

[0671] ctgaattcca gttattttgc catgg 25 [0672] <210>24

[0673] <211>27

[0674] <212>DNA

[0675] <213>人工序列

[0676] <220>

[0677] <223>人工序列说明：引物

[0678] <400>24

[0679] aatgaattcc gccatgacag aggaggc 27 [0680] <210>25

[0681] <211>20

[0682] <212>DNA

[0683] <213>人工序列

[0684] <220>

[0685] <223>人工序列说明：引物

[0686] <400>25

[0687] aaactaccat ctcccctgcc 20 [0688] <210>26

[0689] <211>20

[0690] <212>DNA

[0691] <213>人工序列

[0692] <220>

[0693] <223>人工序列说明：引物

[0694] <400>26

[0695] tgccctacac aggctgaaag 20 [0696] <210>27

[0697] <211>26

[0698] <212>DNA

[0699] <213>人工序列

[0700] <220>

[0701] <223>人工序列说明：引物

[0702] <400>27

[0703] atcaagcttg cccaccatgg cagacg 26 [0704] <210>28

[0705] <211>26

[0706] <212>DNA

[0707] <213>人工序列

[0708] <220>

[0709] <223>人工序列说明：引物

[0710] <400>28

[0711] aacgaattcc atgcctgatg tttccg 26 [0712] <210>29

[0713] <211>25

[0714] <212>DNA

[0715] <213>人工序列

[0716] <220>

[0717] <223>人工序列说明：引物

[0718] <400>29

[0719] tccgaattcg tacttctgct caatc 25 [0720] <210>30

[0721] <211>17

[0722] <212>PRT

[0723] <213>人工序列

[0724] <220>

[0725] <223>人工序列说明：合成肽

[0726] <400>30

[0727] Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr [0728] 1 5 10 15

[0729] Asp