一种从木豆枝叶提取物中分离纯化木豆素和球松素的方法

摘要

本发明涉及中草药功能性成分木豆素和球松素的分离纯化方法，目的是要提供一种简便安全经济有效的从木豆枝叶提取物中分离纯化得到单体化合物木豆素和球松素的方法，所采取的技术方案是：以木豆枝叶的乙醇提取物为原料，采用超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术等得到精制的木豆素和球松素，纯度达95％以上。本发明中对提取物经简单除杂再纯化，方法简单、易行，目标化合物的损失少，产品得率和纯度都很高。适用于工业应用，对产业化生产具有重要意义。

权利要求

1.一种从木豆枝叶提取物中分离纯化木豆素和球松素的方法，其特征在于：称取木豆干枝叶的乙醇提取物300g，加入1.5L的60℃温水中，于超声波提取器中30-60KHz条件下振荡絮凝20min，静止15min，取粘稠絮凝物，以0.05MPa负压为动力用4.5L乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，以30％乙醇配制成料液浓度为4mg/mL混悬药液，上样量0.8BV，流速为每小时8mL/g树脂、PH＝4条件下过NKA-9型大孔过吸附树脂柱，吸附后用30％乙醇2BV洗杂质，然后用85％乙醇8BV解吸，收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入300g目数为500-800的层析硅胶拌匀、40℃减压蒸干，预先称取提取物质量

2.5～3倍的500-800目硅胶，采用石油醚湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，先后以15BV 60-90℃石油醚、石油醚∶三氯甲烷为10∶1的石油醚和三氯甲烷的混合液、三氯甲烷连续中压洗脱，TLC监测收集流分，浓缩依次得到球松素和木豆素，低温析晶得到产品，重结晶后得到33.82mg纯度为95％的球松素，31.36mg纯度为96％的木豆素。

说明书

一种从木豆枝叶提取物中分离纯化木豆素和球松素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及从植物中分离纯化功能性成分的一种方法，具体是从木豆枝叶乙醇提取物中分离纯化木豆素和球松素。

背景技术

[0002] 木豆[Cajanus cajan(L.)Millsp.]为豆科木豆属一年生或多年生木本植物、常绿灌木。又名鸽子豆、树黄豆等，是一种民间用药。有清凉、消热、解毒、止痛止血、抑菌消炎等功效，民间用于治疗外伤、烧伤、感染、褥疮和抗菌消炎等(刘中秋等，1998；孙绍美等，1995)。此外，木豆提取物制剂在印度、巴西、古巴、墨西哥、南非等国用于治疗感冒、支气管炎、麻疹、痢疾、肝炎、皮肤病、烧伤、溃疡、肿瘤等疾病(Abbiw DK.，1990；Duke JA.et al，
1994；Milliken W.，1997；Grover JK.，2002)，疗效显著。我国临床组方用于治疗股骨头坏死以及循环系统疾病(袁浩等，2004)。

[0003] 现在已知的木豆中活性成分包括芹菜素、木犀草素、牡荆苷、异牡荆苷、木豆素、木豆素A、木豆素C、球松素、水杨酸、β-谷甾醇、柚皮素-4′、7-二甲醚、三十一烷、二十一烷、Cajanol和一些挥发油类成分(林励等，1999；Christopher JC.et al，1982；程誌青等，1992)。

[0004] 木豆中的木豆素和球松素含量较高并且活性突出。木豆素与另外两种芪类化合物组方可以抑制骨丢失，维持骨小梁结构完整；木豆素的类雌激素作用具有良好的药用开发前景(陈迪华，孙兰等，2007)。而球松素是一种具有较强活性的天然黄酮类成分(刘香等，2006)，具有抗菌(Bhamarapravati et al，2006)、抗芳香、抗增殖等活性(Jean-Christophe Le Bail，2000)，近年来的药理研究发现其对抗溃疡、抗炎、止痛、胃排空即(胃胀)等方面具有明显的生理活性(潘永峰等，2005)。尽管从天然植物中获得的木豆素和球松素的活性突出，但是到目前为止关于其生产过程的报道很少，只有中国专利(CN1666745A)“一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物”中涉及到木豆素和球松素提取纯化方法，但提纯采用传统的技术手段，经过多次硅胶柱层析，过程漫长、目标化合物易损失，而且毒性较大的有机溶剂使用量大，不利于健康生产。此外，涉及到球松素的分离纯化均为传统的方法(周立东，
1999；刘雯霞，2006)。

[0005] 综上所述，在利用植物提取物分离纯化木豆素和球松素的过程中，主要的影响因素在于分离过程中普遍存在耗时长，目的化合物流失大，使得成本升高。因此，有必要寻找一种简便安全经济高效地分离纯化木豆素和球松素的方法。本发明旨在建立一种通过多种现代分离纯化技术手段相结合的方法，实现简单快速、损失少的分离纯化得到木豆素和球松素。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种以木豆枝叶的乙醇提取物为原料，通过超声波振荡絮凝技术、负压空化混悬液固萃取技术、大孔吸附树脂富集技术、正相硅胶中压柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术大量、快速获得木豆素和球松素单体，该方法简单易行、目标化合物损失少。本发明的目的是通过以下方案来达到的：

[0007] 木豆枝叶70～95％乙醇提取物中加入50～60℃温水超声波振荡、静止絮凝，所得到粘稠絮凝物经负压空化混悬液固萃取、大孔树脂法富集和一次正相硅胶中压柱层析后分别得到木豆素和球松素的产品，纯度大于80％，经过低温析晶和重结晶得到纯度大于95％的纯品。

[0008] 上述的木豆素和球松素提取纯化方法，其特征在于，取一定量的木豆枝叶乙醇提取物，加入3～5倍体积的50～60℃温水，于超声波振荡提取器中30～60KHz条件下振荡絮凝15～25min，静止10～15min，得到粘稠絮凝物，以0.04～0.06MPa负压为动力用乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，萃取所用的溶剂体积为提取物质量的0.5～2％(L：g)，萃取次数为3～5次，所用溶剂除乙酸乙酯外还包括三氯甲烷、二氯甲烷，浓缩萃取液至干，得到的固形物以20-40％乙醇混悬，配置成料液浓度为2～4mg/mL混悬药液，同时将大孔吸附树脂采用湿法装柱，保留液面，将混悬的药液通过吸附柱，上样量0.5～1BV，以流速为每小时6～8mL/g树脂、PH＝4条件下过吸附柱。吸附后用30-40％乙醇2BV洗杂质，然后用75-85％乙醇6～8BV解吸。收集解析液，浓缩至干得到固形物。预先称取质量为提取物质量的2.5～3倍的硅胶，采用湿法装柱，所用溶剂除石油醚外，还包括乙醚、正己烷。将所得固形物用少量有机溶剂溶解，加入与提取物等质量的层析硅胶拌匀、减压旋干，装入正相硅胶中压柱。先后以10-20BV石油醚(60-90℃)、石油醚∶三氯甲烷(10∶1)、三氯甲烷连续中压洗脱，收集洗脱液，每份1/40～1/20BV。TLC监测收集流分，合并相同部分，展开剂为石油醚∶三氯甲烷＝5∶1～0∶1，紫外波长为254nm和360nm。依次得到球松素和木豆素溶液，低温析晶得到产品，重结晶后得到纯品。

[0009] 上述的木豆中木豆素和球松素的提取纯化方法所用的大孔吸附树脂为D101、NKA-9、NKA-2、H103型等。

[0010] 上述的木豆中木豆素和球松素的提取纯化方法所用硅胶为300～800目。中压硅胶柱流动相包括(石油醚、乙醚、正己烷)-(二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇)的不同比例梯度。

[0011] 重结晶所用的溶剂为石油醚、乙醚、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙腈和甲醇，重结晶所用溶剂比例为石油醚(或乙醚、正己烷)∶三氯甲烷(或二氯甲烷、丙酮、乙腈、甲醇)＝50∶1～1∶1。低温析晶温度为-10℃～25℃。

[0012] 本发明的优点：

[0013] 1.该方法简单易行，周期短，可实现大规模的产业化生产。

[0014] 2.产品得率高、纯度高。

附图说明

[0015] 图1为木豆素的结构

[0016] 图2为球松素的结构

[0017] 具体实施方案

[0018] 实施例1

[0019] 称取木豆干枝叶的乙醇提取物300g，加入60℃温水(1.5L)中，于超声波提取器中30-60KHz条件下振荡絮凝20min，静止15min，取粘稠絮凝物，以0.05MPa负压为动力用4.5L乙酸乙酯进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，以30％乙醇配置成料液浓度为4mg/mL混悬药液，上样量0.8BV，流速为每小时8mL/g树脂、PH＝4条件下过NKA-9型大孔过吸附树脂柱。吸附后用30％乙醇2BV洗杂质，然后用85％乙醇8BV解吸。收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入300g目数为500-800的层析硅胶拌匀、40℃减压蒸干。预先称取提取物质量2.5～3倍的500-800目硅胶，采用石油醚湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，先后以15BV石油醚(60-90℃)、石油醚∶三氯甲烷(10∶1)、三氯甲烷连续中压洗脱，TLC监测收集流分，浓缩依次得到球松素和木豆素，低温析晶得到产品，重结晶后得到化合物1为球松素，33.82mg，纯度为95％、化合物2为木豆素，31.36mg，纯度为96％。

[0020] 实施例2

[0021] 称取木豆新鲜枝叶的乙醇提取物300g，加入55℃温水(2L)中，于超声波提振荡取器中30～60KHz条件下振荡絮凝20min，静止15min，取粘稠絮凝物，以0.06MPa负压为动力用三氯甲烷进行负压空化混悬液固萃取，浓缩萃取液，以30％乙醇配置成料液浓度为2mg/mL混悬药液，上样量0.6BV，流速为每小时8mL/g树脂、PH＝4条件下过NKA-2型大孔过吸附树脂柱。吸附后用30％的乙醇洗杂质，之后用85％乙醇7BV解吸，收集解吸液，浓缩至干后用少量甲醇溶解，加入300g目数为300-400层析硅胶拌匀、40℃减压蒸干。预先称取提取物质量2.5～3倍的300-400目硅胶，采用石油醚湿法装柱，将拌好样品的硅胶装入中压柱内，先后以13BV石油醚(60-90℃)、石油醚∶三氯甲烷(10∶1)、三氯甲烷连续中压洗脱，TLC监测收集流分，浓缩依次得到球松素和木豆素，低温析晶得到产品，重结晶后得到化合物1为球松素，30.18mg，纯度为95％；化合物2为木豆素，28.63mg，纯度为95％。