一种微生物固定化包埋颗粒的制备方法

摘要

本发明涉及微生物固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃(PAHs)污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，按照重量5-20％的比例将培养12～14h的种子液与凝胶液混匀，在25-40℃和pH自然条件下，通过直径为1-4.00mm的制粒器，按照20～30滴/min的流滴速度制得固定化颗粒，颗粒经10～18h化学交联，然后在固定剂中静置加固23～58h，最后以无菌水浸泡24-72h，冲洗净残留药液后，增殖培养，备用；凝胶液质量百分配比为：海藻酸钠(Na·Alg)2～3％，(150目)活性炭、红砖粉、泥炭土和/或粉煤灰0.3～0.6％，余量为水。本发明可使固定化颗粒的机械强度、弹性和缓释性能大大提高。

权利要求

1.一种微生物固定化包埋颗粒的制备方法，其特征在于：按照重量5-20％的比例将培养16～20h的种子液与凝胶液混匀，在25-40℃和pH自然条件下，通过直径为1-4.00mm的制粒器，按照20～30滴/min的流滴速度制得固定化颗粒，颗粒经10～18h化学交联，然后在固定剂中静置加固23～58h，最后以无菌水浸泡24-72h，冲洗净残留药液后，增殖培养，备用；

凝胶液质量百分配比为：海藻酸钠(Na·Alg)2～3％，活性炭、红砖粉、泥炭土和/或粉煤灰0.3～0.6％，余量为水；

所述交联剂质量百分配比为：2～4％CaCl2溶液，pH值自然或含有2～4％CaCl2的饱和硼酸溶液，pH值自然；

加固剂质量百分配比为：a.壳聚糖1.0％水溶液，先用浓HCl溶解后再加水定容，pH自然；b.0.6mol/L乙二胺水溶液，pH自然；或c.4％PVA水溶液，pH自然；

增殖培养过程为，在无菌条件下，将制备的固定化颗粒按照20～25％的质量浓度加入增殖培养基中，控制温度在28～30℃，摇床转速130rpm～150rpm，培养时间24h，之后更换培养基，共3次培养，备用。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

凝胶液配制过程为：以所需自来水重量的20％浸润Na·Alg凝胶剂12～20h，

100-110℃高温加热，完全溶解后冷却到35～45℃，再向凝胶液中添加辅助载体，定容，使用前于110℃下湿热灭菌30min，冷却到35～45℃，备用。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：微生物培养所采用的培养基为：种子培养基：葡萄糖 1.25％，牛肉膏 0.25％，NH4NO3 0.1％，MgSO47H2O0.02％，KCl

0.02％，pH 7.0～7.2；

增殖培养基：葡萄糖 4.0％，酵母膏 0.3％，KH2PO4 0.05％，MgSO47H2O0.025％，(NH4)2HPO4 0.2％，pH 7.0～7.2。

说明书

一种微生物固定化包埋颗粒的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃(PAHs)污染土壤修复的固定化颗粒制备方法，其是以海藻酸钠(Na·Alg)为主要载体材料，以泥炭土、红砖粉、粉煤灰等为辅助载体的包埋固定化微生物工艺，可使固定化颗粒的机械强度、弹性和缓释性能大大提高。

背景技术

[0002] 采用传统的游离微生物技术修复受PAHs污染的土壤时存在一些缺陷，如单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、与土著菌竞争处于劣势、抗毒性侵害能力差、对环境条件敏感，加入到修复现场环境中的微生物可能由于竞争或难以适应环境而导致作用结果与实验结果有较大出入，使得不能很好的应用于原位污染土壤修复。而固定化微生物技术有望克服这些缺点和弊端。

[0003] 固定化微生物技术(IM)是利用化学或物理的手段，将游离的微生物定位于限定的空间区域使其保持活性并能反复使用的一种技术。固定化方法很多，由于包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都较高，且应用灵活，是最为实用方便的固定化方法。

[0004] 包埋固定化是使微生物包埋在半透明的聚合物或膜内，或使微生物细胞扩散进入多孔性的载体内部，小分子底物及代谢物可自由出入这些多孔或凝胶膜，而微生物细胞却不能移动。尽管包埋固定化法已经广泛应用于修复污染的流体介质，但在修复污染的非流体介质中应用该技术还未见成功的实例。主要原因：一方面是因为非流体介质本身所具有的复杂性和特殊性给该技术提出了许多不同于在流体介质中应用该技术时所面临的科学问题，如固定化微生物颗粒的载体如何选择，如何克服在非流体介质中固定化颗粒的不可回收性，如何克服污染物浓度的非均质性对固定化颗粒造成的冲击；如果提高固定化颗粒的机械强度以抵抗环境胁迫造成的物理损伤；另一方面是包埋法本身存在的缺陷，如：颗粒的扩散传质性能差、空隙不均匀、抗温度变化和酸碱度变化能力弱等。此外，传统的采用Na·Alg固定化方法常常对应单一菌种，缺乏广谱适应性，对其他属菌株的固定不利。

[0005] 耐用廉价的微生物固定化载体或包埋材料的研究和开发已成为进一步降低处理成本、促进技术推广应用的关键。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明提出一种用于修复多环芳烃污染土壤的包埋固定化载体配方及其工艺。本发明以海藻酸钠(Na·Alg)为主体载体材料，以活性炭、泥炭土、红砖粉、粉煤灰等材料为辅助载体，改进了传统的Na·Alg包埋固定化工艺，使固定化条件更加简化和温和，提高了固定化颗粒的多种技术指标(性能更加优良)，并可对多种不同属微生物进行固定化。将制得的固定化微生物应用于多环芳烃污染土壤的修复，结果表明：按照该配方制得的固定化生物产品机械强度高，对高分子量多环芳烃污染土壤具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物产品。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0008] 一种微生物固定化包埋颗粒的制备方法，

[0009] 按照重量5-20％的比例将培养12～14h的种子液与凝胶液混匀，在25-40℃和pH自然条件下，通过直径为1-4.00mm的制粒器，按照20～30滴/min的流滴速度制得固定化颗粒，颗粒经10～18h化学交联，然后在固定剂中静置加固23～58h，最后以无菌水浸泡24-72h，冲洗净残留药液后，增殖培养，备用；

[0010] 凝胶液质量百分配比为：海藻酸钠(Na·Alg)2～3％，(150目)活性炭、红砖粉、泥炭土和/或粉煤灰0.3～0.6％，余量为水。

[0011] 凝胶液配制过程为：以所需自来水重量的20％浸润Na·Alg凝胶剂12～20h，100-110℃高温加热，完全溶解后冷却到35～45℃，再向凝胶液中添加定量辅助载体，定容，使用前于110℃下湿热灭菌30min，冷却到35～45℃，备用。

[0012] 所述交联剂质量百分配比为：质量百分比为4％的CaCl2溶液，pH值自然或4％CaCl2～饱和硼酸溶液，pH值自然；

[0013] 加固剂质量百分配比为：a.壳聚糖1.0％水溶液，先用微量浓HCl溶解后再加水定容，pH自然；b.0.6mol/L乙二胺水溶液，pH自然；或c.4％PVA水溶液，pH自然。

[0014] 增殖培养过程为，将制备的固定化颗粒再无菌条件下按照20～25％的质量浓度加入增殖培养基中，控制温度在28～30℃，摇床转速130rpm～150rpm，培养时间24h，之后更换培养基，共3次培养，备用。

[0015] 细菌的菌体培养基为：

[0016] 基础培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％，1.5～2.0％琼脂，pH7.0～7.2；

[0017] 种子培养基：葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO47H2O0.02％，KCl0.02％，pH7.0～7.2；

[0018] 增殖培养基：葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO47H2O0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH7.0～7.2。

[0019] 本发明具有如下优点：

[0020] 1、通过优化Na·Alg凝胶液配方各组分的含量，并利用交联和2次加固等技术措施，制备的固定化颗粒微观结构均匀，制备的固定化颗粒为微生物提供了更适合的微环境，与土著菌的竞争力增强，对环境中毒物的抗性增加，可以在不良环境中仍然发挥高效降解菌对多环芳烃的降解作用；孔隙率超过90％，提高了固定化效率扩散传质性能优异，为微生物提供了良好的生活环境。

[0021] 2、通过向凝胶液中添加泥炭土、粉煤灰、红砖粉等辅助材料，使得固定化颗粒机械2
强度大为提高，最高可达44.23kg/cm，颗粒弹性优良，传质性提高，材料的保温性能使得微生物在低温仍能保持很好的活性。此外，泥炭土主要组分是木质素和纤维素，具有多孔结构，为微生物提供优良的微环境，有利的屏蔽了外界土著菌的干扰，使固定化微生物很好的发挥对多环芳烃降解作用，高分子量多环芳烃一般以共代谢的方式被降解，泥炭土组分中的木质素和纤维素还可为微生物提供初级共代谢底物，诱导微生物产生降解多环芳烃所必需的酶类，从而实现对高分子量多环芳烃的共代谢降解。

[0022] 3、固定化颗粒对环境的耐性得到显著增强，固定化细菌适应更低的环境温度，在5～35℃范围内均能保持较好的活性，固定化细菌对pH变化呈惰性，在pH＝5～8范围内，固定化细菌的活性没有发生明显的改变。

[0023] 4、固定化颗粒中的Na·Alg不发生自溶解现象，连续使用365天增殖再生后，细菌活性恢复原始状态。

[0024] 5、该载体及其固定化工艺可用于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、动胶杆菌属(Zoogloea sp.)、微球菌(Micrococcus sp.)等多菌种微生物的固定化，具有一定的广谱适用性。

[0025] 6、固定化细菌对受芘(PYR)或苯并[a]芘(BaP)等高分子量多环芳烃污染土壤的修复中具有明显的修复效果，在投粒比为8％～20％、修复时间为42d的条件下，土壤中PYR去除率最高可达50.6％，而对BaP的去除率为41.3％，较游离菌提高20％。

[0026] 7、本发明所用载体材料价格便宜，成本低，来源广泛，通气性良好，无毒，不会造成土壤的二次污染。

[0027] 具体实施方案

[0028] 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。

[0029] 实施例1(比较例)

[0030] (1)细菌斜面培养

[0031] 在牛肉膏蛋白栋基础培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白栋，0.5％NaCl，1.5～2.0％琼脂，pH7.0～7.2)的试管中分别接入芽孢杆菌(Bacillus sp.)置于28～30℃培养箱中培养48h。

[0032] (2)细菌种子液制备

[0033] 分别用接种环在斜面培养基上接取2环菌苔，接入到液体种子培养基(葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO47H2O0.02％，KCl0.02％，pH7.0～7.2)中，在摇床转速130rpm～150rpm、28～30℃条件下，培养16～20小时，制得细菌种子液。

[0034] (3)凝胶液制备

[0035] 按照总质量200g，称取2％海藻酸钠(Na·Alg)，1％明胶，以40g自来水浸润12～20h，定容后于110℃下湿热灭菌30min，冷却到35～45℃，备用。

[0036] (4)交联剂配制

[0037] 按照总600g，称取24gCaCl2，溶于蒸馏水中，pH值自然，制得交联剂。

[0038] (5)加固剂制备

[0039] 按照总质量600g，配置0.6mol/L乙二胺水溶液，pH自然，制得加固剂。

[0040] (6)固定化颗粒制备

[0041] 按照20％的质量百分比，量取40ml种子液，与200g凝胶液混合，迅速搅拌5min，装入出口直径3.00mm的玻璃制粒器，通过真空抽吸控制出口流滴速度为24滴/min，凝胶粒-子滴入交联剂，制粒结束后，继续交联1018h，然后将粒子转移至加固剂中，加固反应23～
25h，将粒子转移到加固剂中，再次加固24h，最后用无菌水冲洗，浸泡24h，制得固定化颗粒。

[0042] 经上述步骤制得的固定化颗粒机械强度达到3.89kg/cm2。

[0043] (7)增殖培养

[0044] 将固定化颗粒接入增殖培养基(葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH7.0～7.2)中，在摇床转速130rpm、28℃条件下，培养24h，然后更换增殖培养基2次，每次重复增殖培养步骤。

[0045] (8)土壤修复效果

[0046] 固定化颗粒投粒比10％，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，修复42d，PYR的去除率为40.2％，BaP去除率为31.8％。

[0047] 实施例2(比较例)

[0048] 与实施例1不同之处之一在于：交联剂配制时，按照总600g，配4％CaCl2～饱和硼酸水溶液，pH值自然。

[0049] 不同处之二在于：加固剂制备时，按照总质量600g，配1.0％的壳聚糖水溶液，先用微量浓HCl溶解后再加水定容，pH自然。

[0050] 制得的固定化颗粒机械强度仅为1.00kg/cm2，在制粒时，颗粒薄，成粒不均匀，而且颗粒中含泡沫多。将制得的固定化颗粒在摇床上增殖培养后，用于土壤中PAHs污染的修复，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，投粒比12％，修复42d，PYR的去除率为21.1％，BaP去除率为12.8％。

[0051] 实施例3

[0052] 与实施例1不同之处之一在于：凝胶液配制时，按照总质量200g，称取3％海藻酸钠(Na·Alg)，活性炭(150目)0.3％，以40g自来水浸润12h，定容后于110℃下湿热灭菌30min，冷却到35℃。

[0053] 与实施例1不同处之二在于：加固剂配制时，按照总质量600g，配4％PVA水溶液，pH自然。

[0054] 与实施例1不同处之三在于：固定化颗粒制备时，种子液与凝胶液混合，迅速搅拌5min，装入出口直径1.00mm的玻璃制粒器，通过真空抽吸控制出口流滴速度为20滴/min[0055] 按照以上步骤制得的固定化颗粒机械强度达到22.12kg/cm2，。在摇床上增殖培养后，用于土壤中PAHs污染的修复，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，投粒比10％，修复42d，PYR的去除率为42.1％，BaP去除率为36.7％。

[0056] 实施例4

[0057] 与实施例1不同处之一在于：凝胶液配制时，按照总质量200g，称取2％海藻酸钠(Na·Alg)，红砖粉(150目)0.6％，以40g自来水浸润12h，定容后于110℃下湿热灭菌30min，冷却到45℃。

[0058] 与实施例1不同处之二在于：加固剂配制时，按照总质量600g，配4％PVA水溶液，pH自然，加固24h。

[0059] 与实施例1不同处之三在于：固定化颗粒制备时，用无菌水中冲洗后在无菌水中浸泡24h，制得固定化颗粒，不需要2次加固。

[0060] 按照以上步骤制得的固定化颗粒机械强度达到30.96kg/cm2。在摇床上增殖培养后，用于土壤中PAHs污染的修复，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，投粒比10％，修复42d，PYR的去除率为45.3％，BaP去除率为38.1％。

[0061] 实施例5

[0062] 与实施例1不同处之一在于：凝胶液配制时，按照总质量200g，称取2％海藻酸钠(Na·Alg)，泥炭土(150目)0.4％，以40g自来水浸润12h，定容后于110℃下湿热灭菌30min，冷却到35℃。

[0063] 与实施例1不同处之二在于：固定化颗粒制备时，种子液与凝胶液混合，迅速搅拌5min，装入出口直径4.00mm的玻璃制粒器，通过真空抽吸控制出口流滴速度为30滴/min[0064] 按照以上步骤制得的固定化颗粒机械强度达到22.99kg/cm2。在摇床上增殖培养后，用于土壤中PAHs污染的修复，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，投粒比10％，修复42d，PYR的去除率为49.6％，BaP去除率为41.3％。而且在4℃冰箱中经过365d的保存后，增殖培养后的固定化粒子活性保持为85％以上。

[0065] 实施例6

[0066] 与实施例1不同处之一在于：凝胶液配制时，按照总质量200g，称取2％海藻酸钠(Na·Alg)，粉煤灰(150目)0.3％，以40g自来水浸润12h，定容后于110℃下湿热灭菌30min，冷却到38℃。

[0067] 与实施例1不同处之二在于：加固剂配制时，按照总质量600g，配4％PVA水溶液，pH自然，加固40min后。

[0068] 与实施例1不同处之三在于：固定化颗粒制备时，用无菌水中冲洗后在无菌水中浸泡24h，制得固定化颗粒，不需要二次加固。

[0069] 按照以上步骤制得的固定化颗粒机械强度达到44.23kg/cm2，制粒时，颗粒下滴有力，分散好，颗粒均匀。将制得的固定化颗粒在摇床上增殖培养后，用于土壤中PAHs污染的修复，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，投粒比10％，修复42d，PYR的去除率为54.1％，BaP去除率为45.8％。

[0070] 实施例7

[0071] 与实施例1不同处之一在于：凝胶液配制时，按照总质量200g，称取2％海藻酸钠(Na·Alg)，粉煤灰(150目)0.6％，以40g自来水浸润20h，定容后于110℃下湿热灭菌30min，冷却到40℃。

[0072] 与实施例1不同处之二在于：加固剂配制时，按照总质量600g，配4％PVA水溶液，pH自然，加固24h后。

[0073] 与实施例1不同处之三在于：固定化颗粒制备时，种子液与凝胶液混合，迅速搅拌5min，装入出口直径2.00mm的玻璃制粒器，通过真空抽吸控制出口流滴速度为24滴/min[0074] 按照以上步骤制得的固定化颗粒机械强度达到43.34kg/cm2，制粒时，颗粒下滴有力，分散好，颗粒均匀。将制得的固定化颗粒在摇床上增殖培养后，用于土壤中PAHs污染的修复，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，投粒比10％，修复42d，PYR的去除率为
50.6％，BaP去除率为41.3％。

[0075] 实施例8

[0076] 与实施例7不同处在于：细菌斜面培养制备时，在牛肉膏蛋白栋基础培养基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白栋，0.5％NaCl，1.5～2.0％琼脂，pH7.0～7.2)的试管中分别接入动胶杆菌(Zoogloea sp.)、微球菌(Microbacterium sp.)置于28～30℃培养箱中培养48h。

[0077] 按照以上步骤制得的固定化颗粒机械强度达到42.13kg/cm2，将制得的固定化颗粒在摇床上增殖培养后，用于土壤中PAHs污染的修复，当土壤中初始PYR/BaP浓度为50mg/kg时，投粒比10％，修复42d，动胶杆菌(Zoogloea sp.)对PYR的去除率为31.4％，对BaP