一种转化甘油生产1,3-丙二醇的方法

摘要

本发明公开了一种转化甘油生产1，3-丙二醇的方法，包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1，3-丙二醇，该方法在发酵过程中通过控制发酵液的渗透压来促进菌体生长以及产物1，3-丙二醇的生成。采用本发明的方法生成1，3-丙二醇，不仅产物浓度高，生产强度大，转化率高，过程控制简单；并且发酵产生的发酵液由于盐浓度处于较低的水平，因此可以大大降低后期分离、纯化的难度。

权利要求

1.一种克雷伯氏肺炎杆菌转化转化甘油生产1，3-丙二醇的方法，包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1，3-丙二醇，其特征在于，该方法在发酵过程中通过控制发酵液的渗透压来促进菌体生长以及产物1，3-丙二醇的生成；所述控制渗透压的发酵过程的具体条件如下：初始甘油浓度30～60g/L，发酵温度35～40℃；通气量0.5～2.0vvm；搅拌转速20～

50rpm；

在发酵过程中，通过加入NaOH溶液控制发酵液的pH值范围在5.5～8.5；

在发酵的各个时期，通过补加甘油溶液控制发酵液中甘油浓度在10～60g/L，同时碱和转速联动，控制渗透压；

当1，3-丙二醇的生产速率低于1g/L·h时，发酵结束；

其中所述发酵各个时期的具体控制方法如下：

0～10h：通过加入2mol/L NaOH调节pH，当盐浓度高于17.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％；

10～24h：补加800g/L的甘油溶液，当盐浓度高于27.0g/L，改为补加600g/L甘油溶液；

24～30h：通过2mol/L NaOH调节pH，当盐浓度高于32.0g/L后，停止加碱，降低转速

10～20％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养包括二级种子培养。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养采用厌氧培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括种子培养过程中控制种子液的渗透压来调节菌体的生长。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述控制种子液的渗透压是控制种子液中的盐浓度。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子液的盐浓度控制在10.0～

20.0g/L。

说明书

一种转化甘油生产1，3-丙二醇的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于一种通过控制渗透压转化甘油生产1，3-丙二醇的方法。

背景技术

[0002] 1，3-丙二醇(1，3-porpanediol，简称1，3-PD)是一种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、精细化工原料以及新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋(PTT)和聚氨醋的单体。PTT已被证明是一种性能优异的新型聚酯材料。现有的1，3-PD生产法有化学合成法和生物合成法。目前国际上1，3-PD的合成主要是通过化学法进行的。但是相对于化学合成法而言，生物法合成1，3-PD的条件更温和、操作简单、副产物少、更绿色环保。随着1，3-PD需求量的日趋扩大，对于1，3-PD的生物合成法的研究已越来越受到国内外研究人员的重视。

[0003] 生物合成法的主要路线是在生物催化剂的作用下将甘油转化为1，3-PD。目前，最常用的、能将甘油转化为1，3-PD的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella)、弗氏柠檬菌(Citrobacter)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium)等等。

[0004] 现在国内生物法生产1，3-PD的方法包括：1、刘德华等，一种发酵生产1，3-PD的高产工艺(申请号：CN200710063347.0)，该方法以中间代谢产物3-羟基丙醛为控制指标来促进微生物合成1，3-PD；2、杜铭等，氧化还原电势调控厌氧发酵生产1，3-PD方法(申请号：CN200410086573.7)，该方法通过调控发酵体系的氧化还原电势来促进微生物合成1，3-PD。

发明内容

[0005] 本申请的发明人在研究中发现，用于转化甘油生产1，3-丙二醇的微生物对于渗透压比较敏感，因此本发明的目的就在于提供一种转化甘油生产1，3-PD的方法，其通过控制发酵液的渗透压来控制菌体的生长和1，3-PD的合成。

[0006] 本发明的转化甘油生产1，3-丙二醇的方法，包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1，3-丙二醇，该方法在发酵过程中通过控制发酵液的渗透压来促进菌体生长以及产物1，3-丙二醇的生成。

[0007] 根据本发明，所述控制渗透压通过控制发酵液中盐的浓度来实现，即控制的参数渗透压由发酵液中盐的浓度来表征。

[0008] 根据本发明，所述控制渗透压的发酵过程的具体条件如下：

[0009] 初始甘油浓度30～60g/L，发酵温度35～40℃；通气量0.5～2.0vvm；搅拌转速20～50rpm；

[0010] 在发酵过程中，通过加入NaOH溶液控制发酵液的pH值范围在5.5～8.5；

[0011] 在发酵的各个时期，通过补加甘油溶液控制发酵液中甘油浓度在10～60g/L，同时碱和转速联动，控制渗透压；

[0012] 当1，3-丙二醇的生产速率低于1g/L·h时，发酵结束。

[0013] 优选的，所述发酵各个时期的具体控制方法如下：

[0014] 0～10h：通过加入2mol/LNaOH调节pH，当盐浓度高于15.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％；

[0015] 10～24h：补加800g/L的甘油溶液，当盐浓度高于25.0±2.0g/L，改为补加600g/L甘油溶液；

[0016] 24～30h：通过2mol/L NaOH调节pH，当盐浓度高于30.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％。

[0017] 根据本发明，所述种子培养包括二级种子培养。

[0018] 根据本发明，所述方法还包括种子培养过程中控制种子液的渗透压，即控制种子液中的盐浓度，优选的，在一、二级种子培养过程中盐的浓度控制在10.0～20.0g/L。

[0019] 相比现有的转化甘油生产1，3-PD的方法，本发明的方法的主要优点包括：产物浓度高，生产强度大，转化率高，过程控制简单；并且，利用本发明的方法发酵产生的发酵液由于盐浓度处于较低的水平，因此后期分离、纯化的难度也大大降低。

附图说明

[0020] 图1显示了菌浓与OD620之间关系。

[0021] 图2显示了渗透压对菌体生长的影响。

[0022] 图3显示了实施例3的发酵过程中盐浓度和菌体比生长速率、产物比生成速率的关系。

[0023] 图4显示了实施例4的发酵过程中盐浓度和菌体比生长速率、产物比生成速率的关系。

[0024] 图5显示了实施例5的发酵过程中盐浓度和菌体比生长速率、产物比生成速率的关系。

[0025] 图6显示了实施例6的发酵过程中盐浓度和菌体比生长速率、产物比生成速率的关系。

具体实施方式

[0026] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。

[0027] 以下实施例中：

[0028] 菌株：克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumoniae)As 1.1639购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

[0029] 斜面培养基的配方如下：

[0030] K2HPO43H2O 7g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 2g/L，MgCl27H2O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0，琼脂2 g/L。

[0031] 种子培养基的配方如下：

[0032] K2HPO43H2O 7g/L，(NH4)2SO4 1g/L，KH2PO4 2g/L，MgCl27H2O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0后加入NaCl调节盐浓度、控制渗透压。

[0033] 发酵罐培养基的配方如下：

[0034] KCl 0.75g/L，NaH2PO4 1.38g/L，(NH4)2SO4 5.35g/L，Na2SO4 0.28g/L，MgSO46H2O0.26g/L，柠檬酸0.42g/L，酵母粉2g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0。

[0035] 微量元素的配方如下：

[0036] ZnCl2 34.2g/L，FeCl36H2O 2.7g/L，MnCl24H2O 10g/L，CuCl22H2O 0.85g/L，CoCl22H2O 23.8g/L，H3BO3 0.31g/L，Na2MoO4 0.25g/L。

[0037] 测定发酵液中菌体干重的方法如下：

[0038] 取1.0mL发酵液稀释7～10倍，以去离子水为对照，在721分光光度计上于620nm读取OD。取不同菌浓(即不同620nm吸光值)的菌液10mL，经离心收集菌体，并用去离子水洗涤二遍洗涤，将再次离心收集后的菌体于80℃烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体干重与OD620的标准曲线，并回归出关系式。以后菌体的干重根据测定的菌液的OD620值由标准曲线回归关系式计算得出。

[0039] 测定发酵液中1，3-丙二醇浓度的方法如下：

[0040] 用气相色谱仪作为检测手段检测，色谱型号为GC112A，色谱柱采用毛细管柱ATSE-54柱(30m×0.53mm×1.0μ)，色谱工作站为杭州普惠科学仪器有限公司产的Sepu3000。采用FID氢火焰检测器，氮气作为载气。柱温120℃，进样器和检测器250℃。

[0041] 1，3-丙二醇的生成速率定义为：每小时每升发酵液生成的1，3-丙二醇克数，单位为g/L·h。

[0042] 菌体比生长速率定义为：单位质量菌体，每小时生成的菌体质量，单位为h-1。

[0043] 产物比生成速率定义为：单位质量菌体，每小时生成的产物质量，单位为g/g·h。

[0044] 实施例1、种子培养

[0045] 挑取克雷伯氏肺炎杆菌(K.pneumoniae)As 1.1639的单菌落，接种于斜面培养基上，斜面培养条件：培养温度37℃，培养12h。

[0046] 一级种子培养条件：采用厌氧培养，1000mL三角瓶，装液量200mL，培养温度37℃，加入NaCl控制培养液中的盐浓度在10.0～20.0g/L，摇床转速200rpm，培养12h。

[0047] 二级种子培养条件：采用厌氧培养，500L发酵罐(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)，装液量300L，接种量5％，培养温度37℃，加入NaCl控制培养液中的盐浓度在10.0～20.0g/L，转速40rpm，培养12h。

[0048] 实施例2、渗透压对菌体生长的影响

[0049] 通过对发酵液中人为添加NaCl，增加发酵液中盐浓度、渗透压的方法，我们研究了渗透压对菌体浓度的影响。

[0050] 按照实施例1的方法获得种子液，接入5m3的发酵罐中(发酵液装液量3m3)，分别在发酵液中加入不同浓度的NaCl(0、2、4、6g/L)，按常规方法进行发酵，每隔2小时取样，测定菌体干重，以菌体干重对发酵时间作图，结果如图2所示。

[0051] 由图2的结果可见，渗透压对菌体生长的影响非常明显，渗透压越高，对菌体生长的抑制作用越明显。以最高菌浓为例，2g/L、4g/L、6g/L分别只有对照组的94％、86％、60％。

[0052] 实施例3、转化甘油生产1，3-PD

[0053] 根据实施例2的结果，通过控制发酵液的渗透压来调控菌体的生长以及产物1，3-PD的生成。

[0054] 按照实施例1的方法获得种子液，接入5m3的发酵罐中(发酵液装液量3m3)，按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。

[0055] 初始甘油浓度60g/L，发酵温度35℃；通气量1.0vvm；搅拌转速20rpm；

[0056] 在发酵过程中通过加入NaOH溶液控制pH值为5.5～8.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/L，与此同时碱和转速联动，控制渗透压。

[0057] 具体的，发酵过程中的工艺条件如下：

[0058] 0～10h：通过加入2mol/LNaOH调节pH，当盐浓度高于15.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％；

[0059] 10～24h：补加800g/L的甘油溶液，当盐浓度高于25.0±2.0g/L，改为补加600g/L甘油溶液；

[0060] 24～30h：通过2mol/L NaOH调节pH，当盐浓度高于30.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％。

[0061] 发酵过程中每隔2小时取样，测定发酵液中的菌体浓度以及1，3-丙二醇的浓度，并根据发酵液中加入盐的量计算盐浓度，将数据处理后以盐浓度、菌体比生长速率、产物比生成速率对发酵时间作图，结果如图3所示。

[0062] 实施例4、转化甘油生产1，3-PD

[0063] 根据实施例2的结果，通过控制发酵液的渗透压来调控菌体的生长以及产物1，3-PD的生成。

[0064] 按照实施例1的方法获得种子液，接入5m3的发酵罐中(发酵液装液量3m3)，按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。

[0065] 初始甘油浓度40g/L，发酵温度37℃；通气量0.5vvm；搅拌转速30rpm；

[0066] 在发酵过程中通过加入NaOH溶液控制pH值为5.5～8.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/L，与此同时碱和转速联动，控制渗透压。

[0067] 具体的，发酵过程中的工艺条件如下：

[0068] 0～10h：通过加入2mol/LNaOH调节pH，当盐浓度高于15.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％；

[0069] 10～24h：补加800g/L的甘油溶液，当盐浓度高于25.0±2.0g/L，改为补加600g/L甘油溶液；

[0070] 24～30h：通过2mol/L NaOH调节pH，当盐浓度高于30.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％。

[0071] 发酵过程中每隔2小时取样，测定发酵液中的菌体浓度以及1，3-丙二醇的浓度，并根据发酵液中加入盐的量计算盐浓度，将数据处理后以盐浓度、菌体比生长速率、产物比生成速率对发酵时间作图，结果如图4所示。

[0072] 实施例5、转化甘油生产1，3-PD

[0073] 根据实施例2的结果，通过控制发酵液的渗透压来调控菌体的生长以及产物1，3-PD的生成。

[0074] 按照实施例1的方法获得种子液，接入5m3的发酵罐中(发酵液装液量3m3)，按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。

[0075] 初始甘油浓度50g/L，发酵温度38℃；通气量2.0vvm；搅拌转速40rpm；

[0076] 在发酵过程中通过加入NaOH溶液控制pH值为5.5～8.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/L，与此同时碱和转速联动，控制渗透压。

[0077] 具体的，发酵过程中的工艺条件如下：

[0078] 0～10h：通过加入2mol/LNaOH调节pH，当盐浓度高于15.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％；

[0079] 10～24h：补加800g/L的甘油溶液，当盐浓度高于25.0±2.0g/L，改为补加600g/L甘油溶液；

[0080] 24～30h：通过2mol/L NaOH调节pH，当盐浓度高于30.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％。

[0081] 发酵过程中每隔2小时取样，测定发酵液中的菌体浓度以及1，3-丙二醇的浓度，并根据发酵液中加入盐的量计算盐浓度，将数据处理后以盐浓度、菌体比生长速率、产物比生成速率对发酵时间作图，结果如图5所示。

[0082] 实施例6、转化甘油生产1，3-PD

[0083] 根据实施例2的结果，通过控制发酵液的渗透压来调控菌体的生长以及产物1，3-PD的生成。

[0084] 按照实施例1的方法获得种子液，接入5m3的发酵罐中(发酵液装液量3m3)，按照如下所示的工艺条件控制发酵过程。

[0085] 初始甘油浓度30g/L，发酵温度40℃；通气量1.0vvm；搅拌转速50rpm；

[0086] 在发酵过程中通过加入NaOH溶液控制pH值为5.5～8.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/L，与此同时碱和转速联动，控制渗透压。

[0087] 具体的，发酵过程中的工艺条件如下：

[0088] 0～10h：通过加入2mol/LNaOH调节pH，当盐浓度高于15.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％；

[0089] 10～24h：补加800g/L的甘油溶液，当盐浓度高于25.0±2.0g/L，改为补加600g/L甘油溶液；

[0090] 24～30h：通过2mol/L NaOH调节pH，当盐浓度高于30.0±2.0g/L后，停止加碱，降低转速10～20％。

[0091] 发酵过程中每隔2小时取样，测定发酵液中的菌体浓度以及1，3-丙二醇的浓度，并根据发酵液中加入盐的量计算盐浓度，将数据处理后以盐浓度、菌体比生长速率、产物比生成速率对发酵时间作图，结果如图6所示。

[0092] 将实施例3-6的结果归纳整理，其中包括产物1，3-丙二醇的浓度、转化率以及生产强度，结果如表1所示。

[0093] 表1

[0094]1，3-PD浓度 转化率 生产强度
(g/L) (mol/mol) (g/L·h)
实施例3 62.4 0.61 2.08
实施例4 63.5 0.63 2.17
实施例5 61.8 0.65 2.06
实施例6 65.4 0.60 2.18

[0095] 现有的转化甘油生产1，3-丙二醇的方法，如刘德华等“一种发酵生产1，3-PD的高产工艺”(申请号：CN200710063347.0)，其产物1，3-PD的浓度大致可以达到60～80g/L，转化率0.45～0.5mol/mol，生产强度0.86～1.14g/L·h。

[0096] 由表1的结果可见，与现有的方法相比，本发明的通过调节发酵液中渗透压来促进菌体生长以及产物1，3-PD的生成的方法，不仅能够使过程控制简单，而且产物浓度高，生产强度大，转化率高。