一株副球菌及其在降解含氮杂环化合物中的应用

摘要

本发明公开了一株副球菌及其在降解含氮杂环化合物中的应用。该副球菌为副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225。本发明的副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225一方面可以吡啶为唯一碳源、氮源生长，对吡啶具有很强的降解活性(降解率达100％)，非常适合用于含有吡啶类污染物的有机废水(如焦化废水)的生物治理，可作为有机难降解废水生物治理工艺中的生物强化剂，并借此开发出相应的环保生物制剂，具有较高的研究、应用及市场价值。

权利要求

1.副球菌(Paracoccus sp.)BW001CGMCC№.2225。

2.副球菌(Paracoccus sp.)BW001CGMCC№.2225在降解含氮杂环化合物中的应用；

所述含氮杂环化合物为吡啶。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述降解含氮杂环化合物为降解污水中的吡啶，具体方法为将副球菌(Paracoccus sp.)BW001CGMCC№.2225悬浮于含有吡啶的污水中，在20-35℃，pH值为5-9的条件下培养。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述副球菌(Paracoccus sp.)BW001CGMCC№.2225悬浮于含有吡啶的污水培养的温度为30-35℃，pH值为7-9。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述污水的吡啶初始浓度为

91-2613mg/L。

6.以副球菌(Paracoccus sp.)BW001CGMCC№.2225为活性成分的生物菌剂。

说明书

一株副球菌及其在降解含氮杂环化合物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株副球菌及其在降解含氮杂环化合物中的应用。

背景技术

[0002] 受启于地球“自净”过程的生物治理具有成本低、二次污染轻、环境相容性好等优势，微生物治理废水技术的研究和利用越来越受到人们的关注。 在此技术中功能微生物群体充当着重要角色，传统的生物法处理废水利用的是自然的或是经过一定驯化的微生物菌群，任其自然降解，污染物的降解速率不高，已不能适应当今越来越多的工业废水种类。 因此，对特种微生物的分离、筛选，功能基因的分离、提取，以及借此构建各种环境工程菌已成为环境科学、生命科学中的研究热点。

[0003] 应运而生的生物强化技术(Bioaugmentation，简称BA技术)、基因强化技术(Gene-Enhanced-Technology，简称GET技术)是向污染体系中投加人工培育的功能菌株/菌群，导入功能基因，以增强体系中目标底物的降解、转化，并能提高生物处理过程的稳定性。 生物技术是水污染控制中最成熟也是最富有挑战性的技术，国际上许多环境生物技术成果已进入商品化、产业化发展。 美国、日本、英国等一些国外的科研机构，现已成功开发出商品化的环境生物制剂，其中著名的有日本的EM制剂，美国的AM制剂。

[0004] 吡啶是无色或淡黄色易燃液体，有恶臭，对人体和环境存在着危害。 但吡啶又是化工产业中广泛使用的化合物，用作化学合成单体，因此是一种常见的有毒污染物，是焦化、染料、化工、农药等工业废水的特征污染因子。 虽然，关于吡啶的生物降解的研究早在20世纪20年代就有相关报道，但是，由于吡啶属于难降解杂环芳烃化合物，自然界中很难找到对其可以有效降解的微生物，故至今各国仍将吡啶作为污染体系中的优先控制污染物和难降解有机化合物加以重点研究和处理，希望找到一些有效的微生物对其加以控制，从而保证各种排放的工业废水中吡啶含量不至于对环境造成污染。 我国的污染情况与其它国家明显不同，我国的环境现状以进入了“大范围复合型环境污染”的新阶段。 现有的商品化生物制剂对“三废”难以起到有效的治理效果，严重的污染情况亟待解决。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株副球菌及在降解含氮杂环化合物中的应用。

[0006] 本发明所提供的副球菌为副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225。

[0007] 所述副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225是一株革兰氏阴性菌，球形或短杆，长约1.0μm，直径约0.5μm，易聚堆，无鞭毛，无运动性；好氧呼吸代谢；在固体培养基中菌落呈淡黄色、圆形，边缘光滑；对头孢、卡那霉素、利福平有抗性，对氨苄青霉素、氯霉素、四环素、壮观霉素敏感，能以吡啶为唯一的碳、氮源生长，且具有固氮作用。 携带2个大质粒和1个小质粒。

[0008] 所述副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225，已于2007年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC №.2225。

[0009] 本发明的从一些被有毒/有害物质长期浸染的环境中采集、分离、筛选可用于降解特定污染物的功能微生物，并进一步用于特定的难处理工业废水的治理中。 因此，进行BW001关于吡啶的生物降解性能的研发，对我国含吡啶类难降解有机废水的生物治理有所贡献。

[0010] 本发明的第二个目的是提供副球菌(Paracoccus sp.)BW001的培养方法和应用。

[0011] 副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225可用普通细菌LB培养基或含有吡啶的无机盐选择培养基在30～35℃，180rpm条件下培养；所述含有吡啶的无机盐选择培养基为每1000mL水中含500mg吡啶；Na2HPO4·2H2O，1.42g；KH2PO4，1.36g；MgSO4·7H2O，0.216g；CaCl2·2H2O，0.006g；H3BO3，0.00116g；ZnSO4·7H2O，
0.00115g；MnSO4·H2O，0.00169g；CuSO4·5H2O，0.00038g；CoCl2·6H2O，0.00024g；
Na2MoO4·2H2O，0.0000024g；FeSO4·7H2O，0.00278g；pH 6.5。

[0012] 副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225在LB培养基中30～35℃，9 10
180rpm，培养20～24h，活细胞数可达10 ～10 cfu/mL；在含有吡啶的无机盐选择培养
8 9
基中30～35℃，180rpm，培养20～24h，活细胞数可达10 ～10cfu/mL，吡啶的降解率几乎达到100％。

[0013] 本发明的副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225可用于污水体系中吡啶的降解，具体方法可为将副球菌(Paracoccus sp.)BW001CGMCC №.2225接种于含有吡啶和/或其衍生物的污水中，在20～35℃，pH值为5～9的条件下培养，pH值优选为7～9。

[0014] 为了副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225保持较高的降解活性，在处理污水前可将污水中的吡啶初始浓度调节为91～2613mg/L。

[0015] 以上述副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围；该菌剂中可根据需要，添加可接受的辅料。

[0016] 本发明的副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225可以吡啶为唯一碳源、氮源生长，对吡啶具有很强的降解活性(降解率达100％)，并且其具有培养方法简单，生长速度快的优点。从微生物的生理生化功能而言，副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225是非常适合用于含有吡啶类污染物的有机废水(如焦化废水)的生物治理，可作为有机难降解废水生物治理工艺中的生物强化剂，并借此开发出相应的环保生物制剂，因而副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225具有较高的研究、应用及市场价值。

附图说明

[0017] 图1为副球菌(Paracoccus sp.)BW001的电镜照片

[0018] 图2为副球菌(Paracoccus sp.)BW001对吡啶的降解曲线及菌体生长曲线[0019] 图3为副球菌(Paracoccus sp.)BW001对不同浓度吡啶的降解情况(A、吡啶降解曲线，B、菌体长曲线)

[0020] 图4为不同温度条件下副球菌(Paracoccus sp.)BW001对吡啶的降解情况[0021] 图5为不同pH值条件下副球菌(Paracoccus sp.)BW001对吡啶的降解情况[0022] 图6为副球菌(Paracoccus sp.)BW001的质粒提取电泳图

具体实施方式

[0023] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0024] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

[0025] 实施例1、副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225的分离、纯化及其鉴定

[0026] 1、副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225的分离、纯化及鉴定[0027] 副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225是从武汉钢铁集团下属焦化厂的废水处理厂曝气池中采集活性污泥，对活性污泥进行驯化培养后从中分离、纯化得到的一株革兰氏阴性细菌，具体富集、分离、纯化过程如下：

[0028] 在选择压力吡啶500mg/L的条件下，即以吡啶作为唯一碳源与氮源，从长期驯养的活性污泥中，经过富集、分离、筛选、纯化等步骤得到副球菌(Paracoccus sp.)BW001。 具体分离过程如下所述：

[0029] 将所采集的活性污泥样品接种到装有液体MSM选择培养基(在MSM无机盐溶液中添加吡啶作为唯一碳源与氮源)的摇瓶中，30℃，180rpm下振荡培养三个周期，每个周期约5d，添加的吡啶的终浓度分别为200mg/L、500mg/L、500mg/L，得到富集液。

[0030] 将富集液稀释至10-6倍涂布到含有终浓度为500mg/L吡啶的固体MSM无机盐培养基上，30℃恒温培养，直至长出明显可见的菌落。 挑取单菌落，采用平板划线纯化法对菌种进行纯化观察菌落形态并记录。 检测纯度，直至获得了一株以吡啶为唯一碳源与氮源生长的纯种菌株，将其命名为BW001。

[0031] MSM无机盐培养基组成为：每L含有Na2HPO4·2H2O，1.42g；KH2PO4，1.36g；MgSO4·7H2O，0.216g；CaCl2·2H2O，0.006g；H3BO3，0.00116g；ZnSO4·7H2O，
0.00115g；MnSO4·H2O，0.00169g；CuSO4·5H2O，0.00038g；CoCl2·6H2O，0.00024g；
Na2MoO4·2H2O，0.0000024g；FeSO4·7H2O，0.00278g；调节pH至6.5。

[0032] 副球菌(Paracoccus sp.)BW001在LB培养基中30～35℃，180rpm，培养20～9 10
24h，活细胞数可达10 ～10 cfu/mL；在含有吡啶的无机盐选择培养基中30～35℃，
8 9
180rpm，培养20～24h，活细胞数可达10 ～10cfu/mL，吡啶的降解率几乎达到100％。

[0033] 对所获得的菌株BW001进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明该菌株BW001可在普通细菌LB培养基及无机盐加吡啶(500mg/L吡啶)选择培养基上生长，菌落淡黄-色、呈圆形，边缘光滑，菌株为G 球形或短杆菌，长约1.0μm，直径约0.5μm，易聚堆，无鞭毛，不运动。 好氧，呼吸代谢，且具有固氮作用。 该菌株BW001的扫描电镜照片如图1所示。

[0034] 此外又对该菌株的16S rRNA经PCR后测序获得BW001的16S rRNA序列，具体方法为：

[0035] 以TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取BW001菌的基因组DNA，作为PCR反应的模板，设计引物进行PCR片断基因扩增。 上下游引物序列分别为：

[0036] 27F：5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3’

[0037] 1492R：5’TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3’

[0038] PCR设定程序为：先94℃预变性2min；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃终延伸15min，4℃保存。 PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶分离，纯化与回收后测序。 测序结果BW001菌的16S rRNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。

[0039] 将上述获得的BW001的16S rRNA序列在GenBank中经BLAST软件进行了序列同源性比较，最后综合形态特征、生理生化特征和16S rRNA序列特征，将该菌株鉴定为副球菌(Paracoccus sp.)。 将该菌株命名为副球菌(Paracoccus sp.)BW001。

[0040] 所述副球菌Paracoccus sp.BW001，已于2007年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCC №.2225。

[0041] 2、副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225的抗性谱检测[0042] 副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225的抗性检测中，分别考察了其对头孢霉素、卡那霉素、利福平、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、壮观霉素七种抗生素的抗性，采用稀释涂布法将该副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225分别接种于浓度为100mg/L的头孢霉素、50mg/L的卡那霉素、100mg/L的利福平、60mg/L的氨苄青霉素、170mg/L的氯霉素、40mg/L的四环素或100mg/L的壮观霉素的LB固体培养基中，30℃静置培养一周左右，观察菌体在培养基表面上形成菌落的情况。 结果表明副球菌(Paracoccus sp.)BW001除对头孢霉素、卡那霉素、利福平3种抗生素有抗性外，对其余抗生素敏感。

[0043] 实施例2、副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对吡啶的生物降解的检测和降解条件筛选

[0044] 1、副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对吡啶的生物降解检测[0045] 1)副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225菌悬液的制备[0046] 挑取2环斜面培养的副球菌(Paracoccus sp.)BW001菌接种于装有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，于30℃，180rpm振荡培养36h，4000rpm离心10min收集菌体；然后再用无菌生理盐水洗涤该菌液，再离心，如此反复两次，离心条件也为4000rpm，
8 9
10min；最后将所得菌体用MSM水溶液重悬，制备成菌悬液(浓度为10 ～10cfu/mL)。

[0047] 2)副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对吡啶的生物降解检测将步骤1)中制备得到的副球菌(Paracoccus sp.)BW001菌悬液按照接种量为0.03g/L的量接种于含有终浓度为493.4mg/L的吡啶的MSM无机盐培养基中，使培养基的初始pH值为6.5，取
100mL置于一个250mL三角瓶中，在30℃，180rpm恒温摇床上振荡培养(图2中实验组)，以装有100mL含有终浓度为493.4mg/L的吡啶的MSM无机盐培养基的250mL三角瓶，在30℃，180rpm恒温摇床上振荡培养作为空白对照(图2中对照组)。培养过程中，间隔1～2小时分别取在实验组及空白组的反应液，测定吡啶浓度和菌液吸光度。 检测方法如下所述：

[0048] 菌液吸光度：以岛津UV2401型紫外-可见光分光光度计，在波长602nm处测定反应液的吸光度。

[0049] 吡啶的检测采用高效液相色谱(HPLC)法。 样品处理：在好氧降解过程中，每隔1～2小时取反应液，用0.45μm的滤膜过滤后进行HPLC定量分析(色谱仪为岛津SHIMADZU，LC-VP系列，色谱柱为Diamosil(TM)钻石C18柱，250mm×4.6mm，粒度为5μm；流动相为80％(v/v)的甲醇水溶液，流动相流速为1.0mL/min。测定波长254nm)测定吡啶浓度。

[0050] 结果发现副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对吡啶有较好的降解效果，在33h对所试浓度吡啶的降解率几乎达到100％，绘制了副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225在该浓度下对吡啶降解的Error bar曲线图，结果如图2所示。

[0051] 由图2可见，副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225仅在投加入反应体系的初期受到抑制，但抑制期很短约为8h，随后进入快速降解阶段。 伴随着吡啶的降解，菌密度也相应有明显的增加。直到30h后，吡啶几乎降解完全。 将抑制期排除后对BW001菌的降解曲线进行拟和，结果发现在快速降解阶段吡啶降解曲线基本符合零级反应动力学规律。

[0052] 2、吡啶初始浓度对副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对吡啶的生物降解的影响检测

[0053] 将步骤1的步骤1)中制备得到的副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225菌悬液按照接种量为0.03g/L的量分别接种于含有不同终浓度(90.9mg/L、393mg/L、922mg/L、1919mg/L或2613mg/L)吡啶的MSM无机盐培养基中，使培养基的初始pH值为6.5，分别取100mL，分别置于5个250mL三角瓶中，在30℃，180rpm恒温摇床上振荡培养(图3中A、B中的吡啶初始浓度90.9mg/L、吡啶初始浓度393mg/L、吡啶初始浓度922mg/L、吡啶初始浓度1919mg/L或吡啶初始浓度2613mg/L)，以未接种的100mL含吡啶终浓度为2613mg/L的MSM无机盐培养基装入一个250mL三角瓶，在相同条件下培养，作为空白对照(图3中A的空白对照)。 培养过程中按照步骤1的步骤2)所述的菌密度(OD602)检测方法和吡啶浓度检测方法检测不同培养时间的菌密度和吡啶浓度，并绘制菌密度变化曲线(图3中B)和吡啶浓度变化曲线(图3中A)。

[0054] 结果如图3所示，结果表明副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对的吡啶有较好的降解效果，对吡啶初始浓度为2000mg/L以下的各试验组30h内降解完全；对初始浓度为2613mg/L在37.5h时吡啶降解率达68.5％(图3中A)，相应的菌量由0.03g/L增长至0.12g/L(图3中B)，降解进行至50h时吡啶降解率几乎达到100％(图3中A)。

[0055] 综上所述，副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对于吡啶污染废水中的吡啶降解有很好的效果，对高浓度吡啶废水有很强的降解能力，基本可以在很短的时间内将吡啶降到可以排放的标准，表明副球菌(Paracoccus sp.)BW001CGMCC №.2225具有用于污染体系中吡啶类杂环化合物生物降解的巨大潜力。

[0056] 3、副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对吡啶生物降解的最佳温度条件筛选

[0057] 将步骤1的步骤1)中制备得到的副球菌(Paracoccus sp.)BW001菌悬液按照接种量为0.03g/L的量接种于含吡啶终浓度为487.0mg/L的MSM无机盐培养基中，使培养基的初始pH值为6.5，分别取100mL置于4个250mL三角瓶中，分别置于20℃(图4中20℃)、25℃(图4中25℃)、30℃(图4中30℃)、或35℃(图4中35℃)，180rpm恒温摇床上振荡培养，以装有100mL含吡啶终浓度为487.0mg/L的MSM无机盐培养基的
250mL三角瓶，在30℃，180rpm恒温摇床上振荡培养作为空白对照(图4中空白)。 培养过程中按照步骤1的步骤2)所述的吡啶浓度检测方法检测不同培养时间的吡啶浓度，并绘制吡啶浓度变化曲线(图4)。

[0058] 结果如图4所示，结果表明，副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225在温度30℃和35℃条件下，12h内将487.0mg/L的吡啶降解完全，用时最短，且菌体有明显生长。试验结果表明，在该实验条件下副球菌(Paracoccus sp.)BW001CGMCC №.2225的最适生长繁殖温度为30～35℃，在此温度范围内菌种能更好地发挥降解性能。

[0059] 4、副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对吡啶生物降解的最佳pH值条件筛选

[0060] 将步骤1的步骤1)中制备得到的副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225菌悬液按照接种量为0.04g/L的量接种于含吡啶终浓度为513.3mg/L的MSM无机盐培养基中，分别取100mL置于7个250mL三角瓶中，分别调节培养基pH值为4、5、6、7、8、9或10，在30℃，180rpm恒温摇床上振荡培养。 培养过程中按照步骤1的步骤2)所述的吡啶浓度检测方法检测不同培养时间的吡啶浓度，并绘制吡啶浓度变化曲线(pH值为4、5、6、7、8、9或10条件下的吡啶浓度变化曲线分别为图5中pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9或pH＝10所示)。

[0061] 结果如图5所示，结果表明，副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225在降解进行至9.5h时，pH值7、8、9对应的吡啶降解率分别为65.1％、69.2％、67.1％。pH值为4或10时，菌株在培养过程中未见明显生长，并且对吡啶去除效率较低。 试验结果表明副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225适宜生长的pH值范围是7～9，最佳值为8。

[0062] 综上3和4的试验结果，副球菌(Paracoccus sp.)BW001 CGMCC №.2225对于吡啶的最佳降解条件为：温度30～35℃，pH值7～9。

[0063] 实施例3、副球菌(Paracoccus sp.)BW001的质粒检测

[0064] 采用改进的碱变性法，从BW001菌的培养液中提取质粒，具体的质粒提取过程如下：

[0065] 1、所用材料：

[0066] (1)培养基：LB培养基

[0067] (2)质粒提取所用溶液：

[0068] P1：溶解6.06g Tris base，3.72g Na2EDTA·2H2O于800mL蒸馏水中，用HCl调整pH至8.0，用蒸馏水定容至1L，加入100mg RNase A。

[0069] P2：在950mL蒸馏水中溶解8.0gNaOH，50mL20％的SDS(w/v)溶液，蒸馏水定容至1L。

[0070] P3：在500mL蒸馏水中溶解294.5g醋酸钾。 用冰醋酸(约110mL)调整pH至5.5，蒸馏水定容至1L。

[0071] TE buffer：每升蒸馏水加入1.576g Tris·Cl，调整pH至8.0；加入0.3722g EDTA·Na2。

[0072] 2、质粒提取：采用温和的碱裂解法，具体步骤如下：

[0073] 细菌细胞的制备、细胞的裂解和质粒DNA的回收。 具体的实验步骤如下：

[0074] (1)LB培养基培养副球菌(Paracoccus sp.)BW001菌体生长到OD602约为3时，取3mL左右菌悬液，8000rpm离心5min，去除残余液体。

[0075] (2)加入溶液P1 300μL，使菌体彻底悬浮。

[0076] (3)加入300μL溶液P2，上下轻柔颠倒5～6次，然后室温放置5min。

[0077] (4)加入300μL溶液P3，上下轻柔颠倒5～6次，冰浴10min然后13000rpm离心10min。

[0078] (5)移上清至另一干净的EP管，加等体积苯酚和氯仿-异戊醇混合液(氯仿和异戊醇的体积比为24∶1)(各0.4mL左右)抽提，轻柔颠倒摇匀，然后13000rpm离心5min。

[0079] (6)移上清至另一干净的EP管，加入0.7体积异丙醇(约600μL)，轻轻颠倒混匀，从上清中沉淀核酸，13000rpm离心10～20min。

[0080] (7)倒出上清，将EP管倒置流干残余液体，然后加入1mL 70％(体积百分含量)乙醇，使沉淀的核酸完全溶解，回收质粒DNA，13000rpm离心10min。

[0081] (8)倒出上清，晾干多余液体，质粒DNA沉淀用20μL TE buffer溶解，于-20℃保存。

[0082] (9)电泳检测

[0083] 实验结果：提取质粒的凝胶电泳检测如图6所示。副球菌(Paracoccus sp.)BW001具有三个质粒，分别是两个大质粒，一个小质粒。 因大质粒超出了2-Log Ladder的线性标定范围，故其大小在图中并不能准确辨别出。 小质粒的大小约为4.5～5kb，因其较小，在几何尺度上是适合于用作基因操作质粒载体的，具有成为克隆/表达载体的优势和潜力。图6中泳道1为2-Log Ladder分子量标准，泳道2为副球菌(Paracoccus sp.)BW001质粒提取的电泳图。

[0084] 序列表

[0085] <160>1

[0086] <210>1

[0087] <211>1425

[0088] <212>DNA

[0089] <213>副球菌(Paracoccus sp.)

[0090] <400>1

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