源自蛋的骨强化组合物

摘要

本发明提供一种骨强化组合物，其是蛋黄蛋白质加水分解物，在通过凝胶渗透色谱仪分析分子量分布时，含有相对于蛋白质·肽·氨基酸的总和的面积比，分子量为500以上20,000以下的部分的面积比占50％以上的物质作为有效成分。该组合物具有成骨细胞增殖促进、骨生长以及骨强化作用，对以骨质疏松症为代表的各种骨疾病的预防以及治疗有效，可以广泛用于饮食品、医药品、或者饲料中，日常生活中可以持续摄取，作为安全且便宜的制品很有用。蛋黄蛋白质水解物优选在用有机溶剂对蛋黄进行脱脂后得到粉末，用蛋白质水解酶来水解该粉末得到的物质。

权利要求

1.一种骨强化组合物，其特征在于，含有具备下述要件(i)及(ii)的蛋黄蛋白质水解物作为有效成分，(i)在通过凝胶渗透色谱法分析分子量分布时，含有相对于蛋白质·肽·氨基酸的总和的面积比，分子量为500以上20,000以下的部分的面积比占50％以上，(ii)是通过用于食品加工的有机溶剂的至少一种对蛋黄进行脱脂处理而得到脱脂蛋黄，使用源自地衣芽孢杆菌的蛋白质水解酶直接对所述脱脂蛋黄进行水解而得到的物质。

2.如权利要求1所述的骨强化组合物，其含有0.05～50质量％的所述蛋黄蛋白质水解物。

3.配合有权利要求1所述的骨强化组合物的饮食品、医药品或者饲料。

说明书

源自蛋的骨强化组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及含有具有骨生长和骨强化作用的蛋黄蛋白质水解物的组合物。另外，本发明还涉及配合有该蛋黄蛋白质水解物组合物的饮食品、医药品、或饲料等。本发明的蛋黄蛋白质水解物具有使成骨细胞增殖、促进骨生长端的软骨细胞增殖的作用。所以，可以预防或治疗因骨代谢平衡的破坏而引起的骨疾病，对小孩等年轻一代生长期的骨强化也很有用。

背景技术

[0002] 近年来，骨质疏松症的增加或年轻一代的骨折率的增加等各种骨疾病的增加，正成为社会问题。据推算，在日本的骨质疏松症的患者大概已有1,000万人，而且随着高龄化的发展，估计患者数在2010年将达到1,600万人。就骨质疏松症而言，主要在绝经后的女性由于女性激素减少打乱骨形成和骨破坏的平衡而导致的疾病，而引人注目。不过伴随着老龄化，男性中也发现骨盐量减少，据推算50岁以上的骨质疏松症患者大概有200万人。而且，最近20年里中小学生的骨折率增加到2倍以上，所以，从预防骨质疏松症的观点来讲，提高年轻一代的骨盐量从而提高最大骨量是非常重要的。如上所述，不论性别或年龄，保持骨的健康是全社会所关心的大事。

[0003] 历来预防或者治疗骨疾病的方法有食疗补钙法，做轻运动，日光浴，药物治疗等。食疗补钙法主要使用碳酸钙，磷酸钙等钙盐或牛骨粉，蛋壳，鱼骨粉等天然钙制剂。但是，从溶解性或吸收性，呈味性等观点来讲，不能说是适合于口服摄取的原材料。适当的运动可以增加骨量和强化骨，所以散步或步行有益于骨的健康。但是，身体虚弱时就连做点轻运动也很麻烦，更何况卧病在床的老人基本上不能运动。日光浴虽然在补充活性维生素D方面来讲有好处，但是仅这一点是不够的。说到药物治疗，二磷酸或降钙素制剂等被使用，而且据说对骨质疏松症的治疗很有效。但是这些物质属于药物，有耳鸣，头痛，食欲不振等副作用的危险性，所以服用时必须特别注意，而且不能使用作持续性的食品原材料。

[0004] 所以，作为使用了天然原材料的骨强化剂，已开发出强化了维生素类的鸡蛋(专利文件1)或强化了锌的牡蛎提取物(专利文件2)，使用了源自奶的碱性蛋白质(专利文件3、4)等。

[0005] 专利文件1：特开平10-56978号公报

[0006] 专利文件2：特开2002-80380号公报

[0007] 专利文件3：专利2974604号公报

[0008] 专利文件4：专利3112637号公报

[0009] 发明内容

[0010] 本发明的课题在于，作为在日常生活中也可以持续摄取的骨强化剂，提供具有骨强化作用、而且安全便宜、可以广泛应用于饮食品中的新型食品原材料。

[0011] 蛋在37度下孵化3周就可变成幼雏，它富含有生命体诞生所需的所有材料，是产生下一代的生物宝箱(biocapsule)，所以，可能还未发现的生理活性也很多。而且，从古时候开始就有吃蛋的历史，它的营养价值又高又安全，作为食品原材料的利用价值非常高。 [0012] 本发明人等对蛋黄的各种组分进行了促进骨生长，骨强化的成分的探索，结果首次发现了蛋黄蛋白质水解物有成骨细胞增殖及钙化促进作用。而且，也发现了口服该成分可以促进骨生长、改善骨代谢，就此完成了本发明。

[0013] 本发明的骨强化组合物含有下述蛋黄蛋白质水解物作为有效成分，即，所述蛋黄蛋白质水解物在用凝胶渗透色谱法分析分子量分布时，相对于蛋白质·肽·氨基酸的总的面积比，分子量为500以上20,000以下的部分的面积比占50％以上。

[0014] 尚且，在本发明中使用的蛋黄蛋白质水解物，优选把经脱脂处理后的蛋黄本身用蛋白质分解酶水解后得到的物质。

[0015] 蛋黄的脱脂处理优选使可以用于食品加工的有机溶剂(例如乙醇，异丙醇，己烷等)的至少一种作用于蛋黄来实施。另外，作为蛋白质水解酶，可以使用源自芽孢杆菌属细菌的蛋白酶，特别优选使用源自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的蛋白质水解酶。

[0016] 上述本发明的骨强化组合物是使用天然物的安全的物质，所以可以作为在日常生活中可摄取的骨强化原材料，饮食品，医药品或饲料而广泛使用。

[0017] 在本发明中使用的蛋黄蛋白质水解物，在用凝胶渗透色谱法分析的分子量分布中，只要是含有相对于蛋白质·肽·氨基酸的总的面积比，分子量为500以上20,000以下的部分的面积比占50％以上的物质就可以，但更优选上述面积比占55％以上的物质，特别是优选上述面积比占65％以上的物质。上述蛋黄蛋白质水解物具有如下所述的活性，即1)促进成骨细胞增殖(促进合成骨的细胞的增殖)，2)促进成骨细胞分化(提高合成骨的细胞的功能，促进胶原蛋白的产生，促进钙化)，3)抑制破骨细胞的分化增殖(抑制溶骨后使其代谢的细胞的功能和增殖)，4)促进骨生长，也有促进软骨细胞增殖而促进骨的生长的活性。

[0018] 以上述蛋黄蛋白质水解物为主要成分的骨强化组合物，可以口服，所以可以添加到干酪、黄油、发酵乳等含乳食品，饮料乳、酸牛奶、咖啡饮料、果汁等的饮料，果冻、布丁、小甜饼干、饼干、维夫饼干等糕点，冷冻食品等各种形态的饮食品中，可以作为具有骨强化作用的饮食品。并且，也可以以胶囊、片剂等形态用于补充剂。所以，作为以预防骨质疏松症、改善症状为目的的饮食品，医药品或者饲料的原材料是很有用的。

附图说明

[0019] 图1是表示在实施例1中所得到的蛋黄蛋白质水解物用凝胶渗透色谱法分析分子量的结果的图。斜线部分表示分子量500以上20,000以下的部分。

[0020] 图2是表示使用在实施例1中得到的蛋黄蛋白质水解物测定骨生长促进效果的结果的图。

[0021] 图3是表示使用在实施例1中得到的蛋黄蛋白质水解物测定钙化促进 效果的结果的图。

[0022] 图4是表示使用利用不同的酶所得到的蛋黄蛋白质水解物来测定成骨细胞增殖促进活性的结果的图。

具体实施方式

[0023] 本发明中所使用的蛋黄，可以举出鸡、鸭、鹌鹑等的蛋的蛋黄，可是从生产率的观点来讲，优选使用鸡蛋的蛋黄。而且，在使用鸡蛋的情况下，可以使用蛋黄液、蛋黄粉末、或者脱脂蛋黄粉末，其中优选使用蛋黄粉末、或者脱脂蛋黄粉末。

[0024] 本发明的骨强化组合物，使用可以用于食品加工的有机溶剂把蛋黄粉末脱脂而得到粉末，再用蛋白质水解酶将其水解而得到。作为用于脱脂的有机溶剂，可以使用乙醇、异丙醇、己烷等一般可用于食品加工的有机溶剂，但是从简便性和安全性的观点来讲，优选使用乙醇。

[0025] 另外，当从蛋黄中制造蛋黄油或蛋黄卵磷脂时，可以将作为副产物所产生的脱脂蛋黄用于水解的原料。

[0026] 在本发明中，作为蛋白质水解酶，使用源自芽孢杆菌属细菌的蛋白酶，特别是使用源自地衣芽孢杆菌的蛋白质水解酶、例如诺维信投资有限公司制造的“诺维信 水解蛋白酶”是很重要的。

[0027] 蛋白质水解酶的浓度随着使用的酶的不同而适当改变，但是酶和脱脂蛋黄的质量比优选从1∶20到1∶1,000。还有，酶的反应温度或反应时间也随着使用的酶的不同而不同，不过优选在25～75℃下进行水解反应1～24小时。即使反应时间过长或过短，得到的水解产物不能充分得出成骨细胞增殖促进作用、骨生长以及骨强化作用。 [0028] 以上述方法所得到的蛋黄蛋白质水解物在适当脱盐后，可以直接用作本发明的骨强化组合物的原材料。而且，也可以用超过滤膜、凝胶过滤法或各种柱色谱法、膜滤器、利用等电点放入方法等来纯化或分离。

[0029] 以上述方法得到的蛋黄蛋白质水解物，用凝胶渗透色谱法分析分子量分布，相对于蛋白质·肽·氨基酸的总和的面积比，分子量在500以上20,000以下的部分的面积比占50％以上很重要，更优选上述面积比占55％以上，特别优选上述面积比占65％以上。如果分子量分布在上述范围之外， 容易产生效果的降低或消失，也可因加热而引起变性或凝聚等等。不过，只要分布能满足上述范围，即使尚未分解的蛋黄蛋白质残留有10～20质量％也没关系。

[0030] 本发明的骨强化组合物中的蛋黄蛋白质水解物，优选成骨细胞增殖促进活性相对于未添加蛋黄蛋白质水解物相对照组有1.2倍以上的活性，进而优选即便在65℃～90℃下进行3分钟～6分钟的加热处理，成骨细胞增殖促进活性与上述对照相比仍维持1.2倍以上。

[0031] 上述成骨细胞增殖促进活性的测定，可以通过使用小鼠成骨细胞的MC3T3-T1细胞或源自人的成骨细胞样细胞U20S细胞的定法来进行。

[0032] 对本发明的骨强化组合物中蛋黄蛋白质水解物的含量没有特别限制，但优选含有0.05～50质量％的蛋黄蛋白质水解物，更优选含有0.1～25质量％。

[0033] 如果蛋黄蛋白质水解物的含量不到0.05质量％，得在食品中以高浓度添加本骨强化组合物，所以不优选。如果为50质量％以上，对溶解性有影响，所以不优选。 [0034] 本发明的骨强化组合物适用于骨质疏松症或者各种骨疾病的预防或改善，它的有效摄取量以蛋黄蛋白质水解物来换算的话，成人每天50mg至5g。

[0035] 而且，本发明的骨强化组合物未呈现大鼠的急性毒性。

[0036] 如此制备出来的骨强化组合物，通常是粉末化后使用。粉末化可以通过冻干、或者喷雾干燥来进行，通常以饮食品经口服用。

[0037] 本发明的骨强化组合物除了上述成分以外，也可以含有赋形剂、乳化剂、稳定剂、甜调味品、pH调节剂、增稠剂、蛋白质、肽、氨基酸、类脂物、多糖类、寡糖等通常可用于食品中的成分。

[0038] 本发明的骨强化组合物不但可以添加到饮食品中，而且，由给药方法的不同而调制成不同形式，可以以粉末(或颗粒)、饮用剂、片剂、胶囊等形式被使用。另外，蛋是从古时候开始具有食用经验的安全原材料，所以作为即使持续使用也不会产生副作用的原材料，还可以用于医药或饲料。

[0039] 实施例

[0040] 下面举出实施例来详细说明本发明，但并不是限制本发明只能应用该实施例。 [0041] A.脱脂蛋黄的制备

[0042] 在蛋黄粉末1kg中加入5L乙醇，用混合机搅拌30分钟后，回收固形物质。把该操作重复3次并对蛋黄进行脱脂，风干，得出568g脱脂蛋黄。

[0043] B.蛋黄的水溶性组分的制备

[0044] 在A得到的脱脂蛋黄284g中加入37℃的温水3L，一边保持温度一边用搅拌器充分搅拌后，在8,000rpm下进行30分钟的离心分离，得到上清。然后，得到的上清用冻干而粉末化，得到13.4g蛋黄的水溶性组分。

[0045] 实施例1(蛋黄蛋白质水解物的制造)

[0046] 在和A用同样的方法得到的脱脂蛋黄粉末500kg中，加入2.5吨水以及诺维信投资有限公司制造的诺维信 水解蛋白酶(商品名，芽孢杆菌属细菌(bacillus licheniformis)由来的蛋白酶)25kg，在pH7，55℃下进行3个小时酶反应，此后，在80℃下用15分钟的热处理使酶失活，在离心力3,000g下离心分离20分钟，除去沉淀，过滤后，把滤液喷雾干燥，得到蛋黄蛋白质水解物大约140kg 。

[0047] 用以下条件的凝胶渗透色谱法对从实施例1中得到的蛋黄蛋白质水解物进行分子量分析。

[0048] 柱：Diol 60(6.0×300mm)(商品名，YMC Co.，Ltd制造)

[0049] 洗脱液：0.2M磷酸钾缓冲液，0.2M氯化钠(pH6.9)/乙腈(70∶30)

[0050] 流速：0.7ml/分钟

[0051] 检测波长：280nm

[0052] 把其结果显示在图1中。由图1可以明显得出，相对于蛋白质·肽·氨基酸的合计的总面积，所得到的蛋黄蛋白质水解物中分子量在500以上20,000以下的部分的面积比(斜线部分)大约占85％。

[0053] 其次，对实施例1的蛋黄蛋白质水解物实施了以下的试验。把未使用蛋黄蛋白质水解物的示为各试验的对照。

[0054] 试验1(骨生长促进效果)

[0055] 用Sprague-Dawley系大鼠评价在实施例1中得到的蛋黄蛋白质水解物的骨成长促进效果。具体来讲，给作为荧光物质的四环素，利用四环素 和钙形成螯合物沉积于骨的现象，观察形成骨的荧光带，由此来测定胫骨的生长。即，用胃探针(sonde)使Sprague-Dawley系大鼠经口服用(每天，每1kg体重给10mg，20mg或者50mg)溶解于精制水而得到的试料(浓度20mg/mL)。然后，在试验期间中的第3天和第5天以注射的方式给荧光物质(四环素10mg/kg)，第7天摘出胫骨，测定在荧光显微镜下观察到的2条荧光带的间隔(从给四环素的第3天到第5天的2天间的胫骨骨端的伸长)。其结果显示在图2。从图2中得知了投与量依赖性的骨生长促进效果。

[0056] 试验2(钙化促进效果)

[0057] 把6×105个MC3T3-E1细胞接种于(α-MEM培养基，10％FCS，2mmol/L甘油磷酸)3.5cm的培养皿中，加入浓度为100μg/mL的实施例1中得到的蛋黄蛋白质水解物，每隔两天更换一次培养基，连续培养4周，用PBS(磷酸缓冲液)冲洗细胞，加入5(v/v)％高氯酸，用超音波处理，把沉积在细胞中的钙洗脱，测定洗脱的钙量「Calcium E-Test Wako」(商品名，和光纯药工业株式会社制造)作为钙化活性。其结果显示在图3中。由图3可知，通过添加蛋黄蛋白质水解物，钙化活性显著上升(p＜0.001)。

[0058] 试验3(破骨细胞的分化以及增殖抑制效果)

[0059] 从小鼠的骨髓中分离出骨髓细胞，测定向破骨细胞的分化以及增殖。首先，把小鼠大腿骨的骨髓细胞，用含有作为分化诱导因子的RANKL(receptor activator of NF-κBligand：NF-kB活化受体配体)的α-MEM培养基培养3天后，用样品处理，再培养4天。然后，用固定液把细胞固定，应用TRAP染色试剂盒(商品名，“387-A Acid Phosphatase，Leukocyte”SIGMA-Aldrich Japan公司制造)进行TRAP染色，在显微镜下观察染成红色的破骨细胞的个数。对于添加实施例1的蛋黄蛋白质水解物50μg/mL、100μg/mL以及200μg/mL而培养的细胞和未添加来培养的细胞，测定破骨细胞的产生频度，将结果显示在下表。

[0060] ·蛋黄蛋白质水解物 破骨细胞(被染成红色的细胞)

[0061] ·添加量(μg/mL) 发生频度(％)

[0062] ·0 22.5

[0063] ·50 16

[0064] ·100 2.5

[0065] ·200 0

[0066] 从上表中可知，破骨细胞的发生频度的受抑制依赖于蛋黄蛋白质水解物的浓度。 [0067] 实施例2(蛋黄蛋白质水解物)

[0068] 在A得到的脱脂蛋黄粉末300g中加入3L水，在表1中所显示的酶·条件下进行酶反应，此后，在沸腾水浴中达到80℃后进行10分钟加热使酶失活，加入30g过滤助剂(硅藻土制品)，用布氏漏斗过滤，对得到的滤液进行冻干，得到7种蛋黄蛋白质水解物。 [0069] [表1]

[0070]

[0071] 注：「所定分子量的面积比」是指用凝胶渗透色谱仪分析蛋黄蛋白质加水分解物的分子量分布时，在蛋白质·肽·氨基酸合计的面积比中，分子量在500以上20,000以下的部分的面积比。

[0072] 试验1(成骨细胞增殖促进活性)

[0073] 使用含有10％FBS的α-MEM培养液，在37℃，5％CO2-95％air下培养 小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞直到汇合后，用胰蛋白酶处理来收集细胞。使收集的细胞在上述的α-MEM培养液中悬浮而制备细胞悬浮液(2×104个/mL)。把该细胞悬浮液接种于96孔板中且各接种0.1mL，另外添加作为钙化促进剂的α-甘油磷酸盐(2mmol/L)，在37℃，5％CO2-95％air下进行培养。24小时后，把在实施例2中所得到的各样品溶解于50(V/V)％DMSO中并添加到细胞，使样品的浓度成为100μg/mL(使添加的DMSO成为培养液的1(v/v)％)。此外，在培养24小时后，使用MTT(3-(4，5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2，
5-diphenyltetrazolium Bromide：3，(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)并利用常规方法来测定成骨细胞的个数。

[0074] 用将对照(未添加蛋黄蛋白质水解物)的增殖数设为100时的相对值来表示各蛋黄蛋白质水解物(100μg/mL)的成骨细胞增殖促进活性，结果显示在图4中。由图4中可知，使用源自地衣芽孢杆菌的蛋白水解酶而得到的蛋黄蛋白质水解物(图4的1)，具有最高的成骨细胞增殖促进活性(图4的1～6与对照相比均有显著差异(p＜0.005))。