生长素释放肽结合核酸

摘要

本发明涉及一种核酸，优选的与生长素释放肽结合的核酸，其中该核酸包含第一片段Box A和第二片段Box B，其中该第一片段Box A包含约25个连续核苷酸，该第二片段Box B包含约6至8个连续核苷酸，其中第一片段Box A的3′-端核苷酸片段与第二片段Box B杂交，其中杂交后形成第一个双链结构，其中此第一个双链结构包含凸起部分。

权利要求

1.一种L-核酸，其能够与生长素释放肽结合，并且具有如下的结构：或如下的结构：

其中

第一片段Box A包含序列5′UAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAC3′，第二片段Box B包含序列5′GUGAGG3′，第三片段Box C1包含2或3个连续核苷酸，第四片段Box C2包含2或3个连续核苷酸，第五片段Box D包含序列5′CA(X)n3′，其中X为选自A、G、T、C、U和I的任何核苷酸，且其中n为选自0、1、2、3和4的任何整数，第六片段Box E包含1至4个连续核苷酸，并且所述间隔子为由一个乙二醇部分或数个这样的乙二醇部分构成的亲水性非核酸间隔子；并且其中

所述核酸的序列选自下列：

GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG--S---CGGUGAGGCAGCAC(SOT-E-19；SEQ ID NO：

39)；

CGGUGAGGCAGCAC---S-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG(SOT-E-21；SEQ ID NO：

40)；

CGGUGAGGCAGC---S-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG(SOT-E-25；SEQ ID NO：41)；

GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG--S---CGGUGAGGCAGC(SOT-E-33；SEQ ID NO：42)；

和

5′-PEG-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG--S---CGGUGAGGCAGCAC(SOT-E-19-5′PEG；SEQ ID NO：51)，其中，在每个情况下“S”为亲水性非核酸间隔子，并且该间隔子的分子量为172至

688Da。

2.权利要求1的核酸，其中第一片段Box A的3′-端核苷酸片段与第二片段Box B杂交，其中杂交后形成第一个双链结构，其中此第一个双链结构包含凸起部分。

3.权利要求1的核酸，其中该间隔子的分子量为344Da。

4.权利要求1的核酸，其中该核酸能结合人类生长素释放肽。

5.权利要求4的核酸，其中该生长素释放肽由SEQ ID No.1的氨基酸序列组成。

6.权利要求1的核酸，其中该核酸包含修饰。

7.权利要求6的核酸，其中该修饰为由直链型或支链型PEG所组成的PEG部分。

8.权利要求7的核酸，其中该PEG部分的分子量为20至120kD。

9.权利要求8的核酸，其中该PEG部分的分子量为40kD。

10.权利要求6的核酸，其中该修饰为HES部分，并且该HES部分的分子量为10至

130kD。

11.一种药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项的核酸和可选择地其它成分，其中该其它成分选自药学上可接受的赋形剂及药学活性剂。

12.权利要求1-10中任一项的核酸在制备诊断工具中的用途。

13.一种复合物，其包含生长素释放肽和权利要求1-10中任一项的核酸。

说明书

生长素释放肽结合核酸

发明领域

[0001] 本发明涉及与生长素释放肽结合的核酸和其在制造药物中的用途以及其在制造诊断剂上的用途。

背景技术

[0002] 生长素释放肽被鉴定为生长激素促分泌素受体1a(GHSR1a)的天然配体。此受体在脑垂体腺及下丘脑部分中最多，但亦可在其它组织中检测到低浓度。自70年代后期开始，称为促分泌素的合成的肽类及其它化合物已显示出可刺激生长激素释放。然而，直到1999年发现生长素释放肽后才知道负责生长激素释放的天然配体。生长素释放肽为一种高度碱性的28个氨基酸的肽激素，其在N-端的第三个氨基酸(丝氨酸3)处具有辛酸侧链。
此不寻常的修饰对GHS-受体处的相互作用及其活性很重要。然而，在生物样本中存在着为生物活性生长素释放肽形式的辛酰基生长素释放肽与未经修饰或去辛酰基生长素释放肽二者的混合物。纯化的大鼠生长素释放肽的氨基酸序列经测定为GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ.ID.No.2)；该对应的人类序列与其仅在二个位置处有所差别，人类序列在氨基酸位置丝氨酸3处携带相同的正辛酰基侧链且经测定为

[0003] GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ.ID.No.1)。

[0004] 除了天然正辛酰基残基外，引入生长素释放肽的位置3处的不饱和或分支型辛酰基及较长的脂族链也介导受体识别。受体相互作用结构域位于生长素释放肽的最N端；缺失研究指出最小基序即氨基酸1-5(生长素释放肽(1-5)[GSSFL])即足够刺激GHSR1a，但可观察到对正辛酰基残基的肽修饰的强烈需求。

[0005] 生长素释放肽显示出介导与合成代谢状态相关的生理功能。其直接刺激垂体腺释放生长激素(GH)，因此，可为治疗肢端肥大病的适合靶标。在啮齿动物中进行的实验也显示出生长素释放肽通过作用在下丘脑的神经元上以GH非依赖性的方式来诱导进
食。有趣的是，制造生长素释放肽的主要部位在胃中的泌酸腺中，表示其是胃、垂体腺及下丘脑间的激素连接。给予大鼠生长素释放肽后所观察到的因能量摄取和/或能源利用的改变而造成体重增加的结果可为生长素释放肽扮演此角色的支持论点。再者，人类系统性施用生长素释放肽将引起测试对象的饥饿感而造成过度饮食。根据这些发现，生长素释放肽被认为在调节食欲及体重中扮演着关键角色，其是作为未饱状态的急性及慢性讯号。此假说的其它支持论点来自对胃改道术后个体的生长素释放肽水平及食欲降低，因而至少某种程度促成对有效减重程序的效率的观察。普-韦综合征患者的临床数据也显示与该疾病相关的饮食过量和肥胖是由血中生长素释放肽极度过多造成。再者，已发现：生长素释放肽可造成血糖过高并抑制胰岛素释放，此表示其涉及葡萄糖代谢。除了这些能量代谢中的功能外，生长素释放肽也牵涉多种胃肠道疾病领域中的其它过程，诸如胃部排空及调节肠蠕动。再者，也发现：生长素释放肽表达于多种神经内分泌肿瘤中，且除了刺激垂体腺释放GH外，还刺激ACTH、PRL及氢化可的松释放。为健康个体单次注射生长素释放肽时发现可增加心脏输出并降低血压。因此，生长素释放肽的作用显示出涉及多种不同工作。其它涉及此方面的背景资料可在下列文献中找到：M.Kojima，H.Hosoda，Y.Date，M.Nakazato，H.Matsu，K.Kangawa，″Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylatedpeptide from stomach″，Nature 402：656-60，1999；M.Tsch p，D.L.Smiley，M.L.Heiman， ″ Ghrelin induces adiposity inrodents ″，Nature 407：908-13，
2000；A.M.Wren et al.， ″ Ghrelin enhances appetite and increases food
intake in humans″，Journal of Clinical Endocrinology Metabolism 86：5992-6，
2001；M.Nakazato et al.， ″ Arole for ghrelin in the centralregulation of feeding ″，Nature 409：194-8，2001；N.Nagaya etal.，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2001 May；280(5)：R1483-7；Hemodynamic and hormonal effects of human ghrelin inhealthy volunteers；Volante M，et al，J Clin Endocrinol Met ab.2002 Mar；87(3)：1300-8.Expression of ghrelin and of the GHsecretagogue receptor by pancreatic islet cells and relatedendocrine tumors；Jeffery PL，et al.，J Endocrinol.2002 Mar；172(3)：R7-11 Expression and action of the growth hormonereleasing peptide ghrelin and its receptor in prostate cancercell lines；
Egido EM et al.，Eur J Endocrinol.2002 Feb；146(2)：241-4 Inhibitory effect of ghrelin on insulin andpancreatic somatostatin secretion；Broglio F，et al.，J ClinEndocrinol Metab.2001 Oct；86(10)：5083-6，Ghrelin，a naturalGH secretagogue produced by the stomach，induces hyperglycemiaand reduces insulin secretion in humans；Bednarek MA，et al.，J Med Chem.2000 Oct.；43：4370-6 Structure-function studieson the new growth hormone-releasing peptide，ghrelin：minimalsequence of ghrelin necessary for activation of growth hormonesecretagogue receptor 1a。

发明内容

[0006] 本发明的基本问题是提供生长素释放肽的特异拮抗剂。本发明的基本问题的进一步观点是提供生长激素促分泌素受体1a(GHSR 1a)的特异拮抗剂。本发明的基本问题的另一观点是提供用于分别治疗涉及生长素释放肽及GHSR 1a受体的疾病和病症的化合物。

[0007] 本发明的另一基本问题是提供用于结合生物活性的生长素释放肽的手段，更特别的是提供用于治疗由生物活性的生长素释放肽介导的疾病和病症的方法以及用于特异检测生物活性的生长素释放肽的方法。

[0008] 本发明的基本问题是在第一方面中通过核酸(优选为与生长素释放肽结合的核酸)解决，其中该核酸包含

[0009] 第一片段Box A，及

[0010] 第二片段Box B，

[0011] 其中

[0012] 该第一片段Box A包含约25个连续核苷酸，

[0013] 该第二片段Box B包含约6至8个连续核苷酸，

[0014] 其中

[0015] 第一片段Box A的3′-端核苷酸片段与第二片段Box B杂交，其中杂交后形成第一个双链结构，其中此第一个双链结构包含凸起部分(bulge)。

[0016] 在本发明的各个及任何方面的实施方案中，该生长素释放肽为生物活性的生长素释放肽，更优选为辛酰基生长素释放肽且最优选为正辛酰基生长素释放肽。

[0017] 在一种实施方案中，该双链结构是由第一片段Box A的5个3′-端的连续核苷酸与第二片段Box B的部分或全部核苷酸(优选为第二片段Box B的6至8个连续核苷酸)所形成。

[0018] 在一种实施方案中，该凸起部分是由不与该第一片段Box A的5个3′-端的连续核苷酸碱基配对的第二片段Box B的1至3个核苷酸(优选由第二片段Box B的1个核苷酸)所形成。

[0019] 在一种实施方案中，该凸起部分是由非碱基配对的嘌呤形成，其中该嘌呤优选为乌苷。

[0020] 在一种较佳的实施方案中，该非碱基配对的嘌呤是由第二片段Box B提供。

[0021] 在一种实施方案中，该核酸进一步包含第三片段Box C1及第四片段Box C2，

[0022] 其中该第三片段Box C1包含至少一个核苷酸且

[0023] 该第四片段Box C2包含至少一个核苷酸，且

[0024] 其中该第三片段Box C1以其3′-端连接第二片段Box B的5′-端，而第四片段Box C2以其5′-端连接第一片段Box A的3′-端。

[0025] 在一种较佳的实施方案中，该第三片段Box C1及第四片段Box C2可杂交，其中杂交后形成第二个双链结构。

[0026] 在一种实施方案中，该第一个双链结构形成第一个螺旋结构。

[0027] 在一种较佳的实施方案中，该第二个双链结构形成第二个螺旋结构。

[0028] 在一种更佳的实施方案中，该第二个螺旋结构为螺旋或似螺旋的结构，其包含1至10个碱基对，优选为1至3个碱基对，更优选为2至3个碱基对。

[0029] 在一种较佳的实施方案中，该第一个螺旋结构通过第二个螺旋结构延长。

[0030] 在一种较佳的实施方案中，该第三片段Box C1包含约1至10个连续核苷酸，优选为1至3个连续核苷酸且更优选为2或3个连续核苷酸。

[0031] 在一种较佳的实施方案中，该第四片段Box C2包含约1至10个连续核苷酸，优选为1至3个连续核苷酸且更优选为2或3个连续核苷酸。

[0032] 在一种较佳的实施方案中，该核酸进一步包含第五片段Box D，其中该第五片段Box D包含至少二个连续核苷酸。

[0033] 在一种更优选的实施方案中，该第五片段Box D包含序列5′-CA。

[0034] 在一种更优选的实施方案中，该第五片段Box D包含任何长度的连续核苷酸，其中该长度选自2、3、4、5和6个连续核苷酸。

[0035] 在一种较佳的实施方案中，该第五片段Box D包含序列

[0036] 5′CA(X)n3′

[0037] 其中X为任何核苷酸，其优选选自A、G、T、C、U和I，

[0038] 且其中n为选自0、1、2、3和4的任何整数。

[0039] 在一种更优选的实施方案中，该第五片段Box D是由序列5′CA(X)n3′所组成，其中n＝4。

[0040] 在一种较佳的实施方案中，该第五片段Box D以其5′-端连接第二片段Box B的3′-端。

[0041] 在一种较佳的实施方案中，该核酸进一步包含第六片段Box E，其中该第六片段Box E包含至少一个核苷酸。

[0042] 在一种更优选的实施方案中，该第六片段Box E包含约1至10个连续核苷酸，优选为1至4个连续核苷酸且更优选为3个连续核苷酸。

[0043] 在另一种更优选的实施方案中，其中该第六片段Box E的至少一个核苷酸选自U和G。

[0044] 在一种特别优选的实施方案中，其中该U或G核苷酸是直接位于第一片段Box A的5′-端旁。

[0045] 在一种优选的实施方案中，该第六片段Box E以其3′-端连接第一片段Box A的5′-端。

[0046] 在一种优选的实施方案中，该第五片段Box D的3′-端通过第一个间隔子连接第六片段Box E的5′-端。

[0047] 在一种优选的实施方案中，该第四片段Box C2的3′-端通过第二个间隔子连接第三片段Box C1的5′-端。

[0048] 在一种优选的实施方案中，该第一个及第二个间隔子各自分别且独立地选自亲水性间隔子。

[0049] 在一种更优选的实施方案中，该亲水性间隔子选自核酸间隔子和非核酸间隔子。

[0050] 在一种更优选的实施方案中，该第一个间隔子为核酸间隔子，其包含约1至20个连续核苷酸，优选为1至5个连续核苷酸且更优选为2个连续核苷酸。

[0051] 在一种可替换的更优选的实施方案中，该第二个间隔子为包含约3至20个连续核苷酸，优选为3至5个连续核苷酸且更优选为3个连续核苷酸的核酸间隔子。在一种甚至更优选的实施方案中，该第二个间隔子由ACA或CAA所构成。

[0052] 在另一种可替换的优选的实施方案中，该间隔子是非核酸。在其一种特别优选的实施方案中，该第一个间隔子和/或第二个间隔子包含至少一个乙二醇部分或数个这样的乙二醇部分。

[0053] 在一种实施方案中，该间隔子的分子量为约172至688Da(优选为344Da)。

[0054] 在一种实施方案中，该核酸为环状核酸。

[0055] 在一种实施方案中，该核酸具有如下的结构：

[0056]

[0057] 或如下的结构：

[0058]

[0059] 在一种实施方案中，该第一片段Box A包含下述序列：UAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCUX5C(SEQ ID No.3)；

[0060] 其中

[0061] X1＝G或A；

[0062] X2＝A或U；

[0063] X3＝G或A；

[0064] X4＝A或C或U；且

[0065] X5＝G或A，

[0066] 优选为5′UAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUAC3′(SEQ ID No.4)。

[0067] 在一种实施方案中，该第二片段Box B包含序列5′GUGAGG3′。

[0068] 在一实施方案中，该核酸的序列选自下述的序列：

[0069]SEQ ID No. 內部參考
5 MS-P2-E3
6 MS-P2-G2
7 MS-P2-D2
8 MS-P2-A3
9 MS-P2-E1
10 MS-P2-B1
11 MS-P2-F1
12 MS-P2-C3
13 MS-P2-C2
14 MS-P2-H2
15 MS-P2-A4
16 MS-P2-B2
17 MS-P2-A2
18 MS-P3-H3
19 MS-P2-D1
20 SOT-C
21 F12
22 SOT-D(C12)
23 SOT-D-000
24 SOT-D-100
25 SOT-D-101
26 SOT-D-102
27 SOT-D-104
28 SOT-D-106
29 SOT-D-108
30 SOT-D-109
31 SOT-D-110
32 SOT-D-111
33 SOT-E或MS-P2-F1
34 SOT-E-02
35 SOT-E-09
36 SOT-E-11
37 SOT-E-12
38 SOT-E-14
39 SOT-E-19
40 SOT-E-21
41 SOT-E-25
42 SOT-E-33
43 SOT-E19-L
44 SOT-E19-L1
45 SOT-E19-L2
46 SOT-E19-L3
47 SOT-E19-L4
48 SOT-E19-L5
49 SOT-E19-L6
50 SOT-E19-L7
51 SOT-E19-5’-PEG
52 SOT-D-109(NOX-B11-2)
72 生物素化之NOX-B11

[0070] 在一种优选的实施方案中，该核酸序列选自下述的序列：SEQ ID No.29，SEQ ID No.30，SEQ ID No.33，SEQ ID No.36，SEQ ID No.38，SEQ ID No.39，SEQ ID No.40，SEQ ID No.41，SEQ ID No.42，SEQ IDNo.46，SEQ ID No.47，SEQ ID No.51及SEQ ID No.52。

[0071] 在一种实施方案中，该核酸可结合生长素释放肽，优选为人类生长素释放肽。

[0072] 在一种优选的实施方案中，该生长素释放肽具有SEQ ID No.1的氨基酸序列。

[0073] 在一种实施方案中，该核酸包含修饰。

[0074] 在一种优选的实施方案中，该修饰选自HES部分和PEG部分。

[0075] 在一种更优选的实施方案中，该修饰为由直链或分支PEG所组成的PEG部分，其中该PEG部分的分子量优选为约20至120kD，更优选为约30至80kD且最优选为约40kD。

[0076] 在一种可替换的更优选的实施方案中，该修饰为HES部分，其中该HES部分的分子量优选为约10至130kD，更优选为约30至80kD且最优选为约50kD。

[0077] 在一种实施方案中，该核酸的核苷酸为L-核苷酸。

[0078] 在另一种实施方案中，该核酸完全由L-核苷酸所组成。

[0079] 本发明的基本问题在第二方面中通过一种药物组合物解决，其包含如第一方面的核酸且可选择地包含其它成分，其中该其它成分选自药学上可接受的赋形剂及药学活性剂。

[0080] 本发明的基本问题在第三方面中通过使用根据第一方面的核酸制造药物来解决。

[0081] 本发明的基本问题在第四种方面中通过使用根据第一方面的核酸制造诊断工具来解决。

[0082] 在第三方面的实施方案中，该药物用于治疗和/或预防选自下列的疾病或病症：肥胖、进食障碍疾患、糖尿病、葡萄糖代谢障碍、肿瘤、血压失调、心血管疾病、肢端肥大病、及调节能量平衡、食欲、体重及胃肠道疾病。

[0083] 本发明的基本问题在第五方面中通过包含生长素释放肽及根据第一方面的核酸的复合物来解决，其中该复合物优选为晶体复合物。

[0084] 本发明的基本问题在第六方面中通过使用根据第一方面的核酸检测生长素释放肽来解决。

[0085] 本发明的基本问题在第七方面中通过筛选生长素释放肽拮抗剂或生长素释放肽激动剂的方法来解决，该方法包含下列步骤：

[0086] -提供候选的生长素释放肽拮抗剂和/或候选的生长素释放肽激动剂，

[0087] -提供根据第一方面的核酸，

[0088] -提供测试系统，该测试系统在生长素释放肽拮抗剂和/或生长素释放肽激动剂的存在下提供信号，及

[0089] -测定该候选的生长素释放肽拮抗剂是否为生长素释放肽拮抗剂和/或该候选的生长素释放肽激动剂是否为生长素释放肽激动剂。

[0090] 本发明的基本问题在第八方面中通过筛选生长素释放肽激动剂和/或生长素释放肽拮抗剂的方法来解决，该方法包含下列步骤：

[0091] -提供固定在一种相，优选为固相，上的生长素释放肽，

[0092] -提供根据第一方面的核酸，优选为经标记的根据第一方面的核酸，

[0093] -加入候选的生长素释放肽激动剂和/或候选的生长素释放肽拮抗剂，及

[0094] -测定该候选的生长素释放肽激动剂是否为生长素释放肽激动剂和/或该候选的生长素释放肽拮抗剂是否为生长素释放肽拮抗剂。

[0095] 在一种实施方案中，进行该测定法以评估该核酸是否被候选的生长素释放肽激动剂或候选的生长素释放肽拮抗剂所置换。

[0096] 本发明的基本问题在第九方面中通过一种用于检测生长素释放肽的试剂盒来解决，该试剂盒包含根据第一方面的核酸。

[0097] 本发明的基本问题在第十方面中通过利用根据第八方面的方法获得的生长素释放肽拮抗剂来解决。

[0098] 本发明的基本问题在第十一方面中通过利用根据第八方面的方法获得的生长素释放肽激动剂来解决。

[0099] 本发明基于可产生特异于生长素释放肽且以高亲和力与其结合的核酸的惊人发现。更具体地说，令人惊讶地，本发明人可产生特异结合生物活性的生长素释放肽(优选为辛酰基生长素释放肽，且以正辛酰基生长素释放肽为最优选)的核酸。

[0100] 生长素释放肽为一种具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的碱性肽，且优选为经脂肪酸侧链(优选为辛酰基侧链，且更优选正辛酰基侧链)修饰。人类生长素释放肽的计算出的生长素释放肽pI值为11.07，大鼠的生长素释放肽的pI值为10.56。在一种优选的实施方案中，与根据本发明的核酸结合的生长素释放肽为经脂肪酸侧链修饰的。在一种可替换的实施方案中，该生长素释放肽为不具有脂肪酸侧链的生长素释放肽。本文所使用的生长素释放肽一词是指任何生长素释放肽，包括，但不限于：哺乳动物生长素释放肽。优选的，该哺乳动物生长素释放肽选自下列：小鼠、大鼠、兔子、仓鼠或人类的生长素释放肽。最优选的，该生长素释放肽为人类生长素释放肽。

[0101] 当发现可鉴定出对生长素释放肽具高亲和力的核酸时是非常令人惊讶地，因为Eaton等人(Eaton，B.E.；Gold，L.；Hicke，B.J.；Janjic，N.；Jucker，F.M.；Sebosta，D.P.；Tarasow，T.M.；Willis，M.C.；Zichi，D.A.；Bioorganic & Medicinal Chemistry，Vol 5，No.6；pp1087-1096，1997)观察到：一般而言，产生与靶标分子结合，针对碱性蛋白质的适体(aptamer)(即：D-核酸)是非常困难的，因为此种靶标会产生高但非特异性的信噪比。
此高信噪比来自核酸对碱性靶标(诸如生长素释放肽)的高非特异性亲和力。

[0102] 甚至更令人惊讶的发现为：尽管生长素释放肽的总体pI值为强碱性，并且生长素释放肽的受体结合基序GSSFL[生长素释放肽(1-5)]为一种具有pI计算值5.5的相当酸的结构域，本发明者利用全长生长素释放肽鉴定出可特异辨识该肽的酸性受体结合结构域，但不辨识碱性的中央及羧基端结构域的核酸。就靶标分子(即生长素释放肽)的电荷及核酸的电荷的静电效果而言，此点颇令人惊讶。带负电荷的核酸与靶标分子的碱性结构域结合应较核酸与靶标分子的酸性结构域结合有利得多。因此，必须指出：本领域的普通技术人员没有理由期待可成功选择一个不与生长素释放肽的碱性部分结合但与靶标分子的酸性结构域结合的核酸配体。

[0103] 除了具有氨基端受体结合基序GSSFL外，生物学上活性的生长素释放肽(其在此文中也称为生物活性的生长素释放肽)的特征优选为其在氨基酸丝氨酸3处以正辛酰基酰化。根据本发明的核酸分子(其优选为此文所揭示的氨基端基序GSSFL的配体)优选能区分生物学上活性的生长素释放肽与生物失活或非生物活性形式的生长素释放肽。由于结合完全依赖二种部分(辛酰基及肽)的存在，因此，令人惊讶的是：核酸与辛酰基生长素释放肽的结合在1000倍过量的去辛酰基生长素释放肽(更优选为100倍过量的去辛酰基生长素释放肽且最优选为10倍过量的去辛酰基生长素释放肽)的存在下为特异性结合。

[0104] 如此文的优选实施方案中所使用的，生物活性的生长素释放肽为在优选的实施方案中基本上显示出所有天然生长素释放肽的特征的生长素释放肽。特别的是，如此文的优选实施方案中所使用的生物活性生长素释放肽为任何促成或可触发(更优选为经由与GHS受体相互作用来促成)生长激素释放的生长素释放肽及生长素释放肽衍生物。相对的，在优选的实施方案中，非生物活性的生长素释放肽为与生物活性的生长素释放肽不同的生长素释放肽，更优选的为不会触发(更优选为经由与GHS受体相互作用)生长激素释放。

[0105] 在一种优选的实施方案中，令人惊讶地，本发明者可产生与生长素释放肽结合的核酸，其中该生长素释放肽为一种生物活性的生长素释放肽或生物学上活性的生长素释放肽，该核酸可区别在其N端的第三氨基酸(丝氨酸3)处具有辛酰基酸性侧链的生长素释放肽，但其不与缺乏这类辛酰基酸侧链的生长素释放肽结合。

[0106] 此文所描述的根据本发明的核酸的特性可在任何使用核酸(不论是单独使用或在任何组合中使用)的本发明方面中了解。

[0107] 不欲受限于任何学说，本发明者假定所观察到的与生长素释放肽结合的根据本发明的核酸的特异性有一些共有的结构特性(其将于下述内容中讨论，其中可参考图20A)。然而，应了解的是：图20A具有数种该结构的特性，该特性不一定实现在本发明的各个及每一个核酸中。

[0108] 碱性结构特性为连续核苷酸的第一个片段(其在此文中也称为Box A或第一片段Box A)及连续核苷酸的第二片段(此文中也称为BoxB或第二片段Box B)。第一片段
Box A包含约25个连续核苷酸，而第二片段Box B包含约6至8个连续核苷酸。该第一片
段Box A的3′端片段与第二片段Box B杂交，其中杂交后形成第一个双链结构，其中此第一个双链结构包含凸起部分。该双链结构是由第一片段Box A的5个3′-端的连续核苷
酸与第二片段Box B的6至8个连续核苷酸中的一些所形成。该凸起部分是由少至1个，
多至3个不与该第一片段BoxA的5个3′-端的连续核苷酸作碱基配对的核苷酸所形成。
因此，该凸起部分可由1、2或3个非碱基配对的核苷酸(优选由第二片段Box B提供)所
组成。就此凸起部分的大小而言，该第二片段Box B可包含约6至8个连续核苷酸。更合适的为，该凸起部分是由第二片段Box B内、从第二片段Box B的5′-端数起的非碱基配对的第三个核苷酸所形成，且该第二片段Box B优选包含6个连续核苷酸。

[0109] 在一种优选的实施方案中，根据本发明的核酸为单一核酸分子。在另一种实施方案中，该单一核酸分子以许多单一核酸分子的形式存在。优选的，此文中所使用的核酸及核酸分子二词可互换使用，如果没有相反说明。

[0110] 本领域的普通技术人员应意识到本发明的核酸分子优选由核苷酸所组成，这些核苷酸优选通过磷酸二酯键彼此共价连接。

[0111] 另一种重要特性为第二个双链结构。此第二个双链结构是由连续核苷酸的第三片段(其也称为Box C1或第三片段Box C1)及连续核苷酸的第四片段(其也称为Box C2或第四片段Box C2)所形成。该第三片段Box C1以其3′-端连接第二片段Box B的5′-端，而第四片段BoxC2以其5′-端连接第一片段Box A的3′-端。此第二个双链结构通常
形成一种螺旋结构，此文中也称为第二个螺旋结构。此第二个螺旋结构优选为通常由第一个双链结构所形成的螺旋结构的延伸。该第一个双链结构(其优选为螺旋结构，此文也称为第一个螺旋结构)的长度是由第一片段Box A及第二片段Box B的长度界定，更精确地说，其是由彼此杂交的该二种Box所界定。由第二个双链结构提供给该第一个螺旋结构的延伸部分为(据本发明者目前所知)较稳定的种类(但本发明者并不欲受限于此理论)。
第二个螺旋结构是由1至10个碱基对(优选为1至3个碱基对且更优选为2或3个碱基
对)所组成。本领域的普通技术人员承认如1至3个碱基对这般少的数目并不一定适合形成螺旋。因此，此文中此种结构也称为螺旋样结构(helix-likestructure)，优选的，其中这类螺旋样结构为一种当通过一或数个碱基对延伸时可产生螺旋结构的结构。

[0112] 另一种重要的特性为连续核苷酸的第五片段(此文中也称为Box D或第五片段Box D)。此额外的片段可改良该核酸的总体结合。虽然第五片段仅包含至少二个核苷酸，其对生长素释放肽的结合的有利影响可通过增加第五片段的长度(优选至多6个连续核苷酸)来进一步改良。再者，若该第五片段在其5′端含有CA二核苷酸且该第五片段具有序列5′CA(X)n3′(其中X为任一种核苷酸且优选选自下列：A、G、T、C、U和I)时，其将变成特别有效。

[0113] 根据本发明的核酸的另一特色为连续核苷酸的第六片段，其也称为Box E或第六片段Box E。优选的，该第六片段是由至少一个核苷酸所组成。

[0114] 从图20可知不同片段是彼此连接。如其中所描述的，优选的，第三片段Box C1及第四片段Box C2各包含1或2个核苷酸(更优选为2个核苷酸)，第五片段Box D包含至少2个核苷酸(优选为4个核苷酸且最优选为6个核苷酸)。

[0115] 在其中该第三片段Box C1及第四片段Box C2的长度为0的实施方案中，第一片段Box A及第二片段Box B可选择地通过连接体或间隔子连接，其中这类间隔子可为此文中所揭示的任何间隔子。若未另外指出，此文所使用的″间隔子″及″连接体″一词可互换使用。

[0116] 本发明中，优选的，第一片段及第二片段彼此连接(优选通过共价键)。在一种优选的实施方案中，该共价键为磷酸二酯键。在一种更优选的实施方案中，该第一片段的3′-端连接第二片段的5′-端。

[0117] 在另一种实施方案中，该第六片段Box E包含1至10个连续核苷酸(优选为1至4个连续核苷酸且最优选为3个连续核苷酸)。

[0118] 从这些不同的安排得知，第五片段及第六片段可能彼此连接或不连接，第三及第四片段可能彼此连接或不连接，且第一及第二片段彼此连接或不连接。应理解，该连接优选通过共价键。更优选的，该连接是通过亲水性间隔子，该亲水性间隔子包含至少一个，优选为多个乙二醇部分。本领域的普通技术人员已知多种不同的连接体及间隔子，且可利用如：Pils and Micura(Nucleic Acid Research(2000)，28(9)，1859-1863)所描述的下列标准选择。该连接体不应干扰碱基对本身。因此，含有堆叠在末端碱基对上的芳族碳环的连接体类型并不适合(J.Am.Chem.Soc.(1999)，121，9905-9906；J.Am.Chem.Soc.(1998)，120，
11004-11005)。然而，以乙二醇为基础或从乙二醇衍生的连接体符合此需求，因其具有良好的水溶性及高度的构象弹性的优点(J.Am.Chem.Soc.(1993)，115d，8483-8484；Nucleic AcidsResearch(1993)，21，5600-5603；Biochemistry(1993)，32，1751-1758；Nucleic Acid Research(1990)，18，6353-6359；J.Am.Chem.Soc.(1997)，119，11591-11597)。优选的，该间隔子包含一或数个乙二醇部分或是由其组成，其中氧被CH2、磷酸或硫所替换或取代。

[0119] 根据这些连接选择，可实现下列结构：

[0120]

[0121] 或

[0122]

[0123] 最后，本发明也包含：实现了一种图20D中所述的根据本发明的核酸的完全封闭(即：环形)结构。

[0124] 根据本发明的核酸也可包含与此文所揭示的特定序列基本上同源的核酸。基本上同源一词应被理解为至少75％，优选为85％，更优选为90％，最优选为超过95％、96％、97％、98％或99％同源。

[0125] 本发明的核酸或根据本发明的核酸一词也应包括那些包含此文所揭示的核酸序列或其部分的核酸，优选的，该核酸或该部分涉及与生长素释放肽结合，更优选的该核酸可区别生物活性的生长素释放肽与非生物活性的生长素释放肽，即尤其是区别辛酰基生长素释放肽与去辛酰基生长素释放肽。这类核酸可从此文所揭示的核酸衍生，如：通过截短衍生。截短可能与此文所揭示的核酸的任一端或两端有关。再者，截短可能与核苷酸的内部序列有关，即：其可能与介于5′及3′端的核苷酸间的核苷酸有关。再者，截短应包含从此文所揭示的核酸序列删除少至单一核苷酸。截短也可能与超过一个本发明核苷酸的片段有关，其中该片段可为少至一个核苷酸的长度。

[0126] 根据本发明的核酸可为D-核酸或L-核酸。优选的，本发明的核酸为L-核酸。另外，也可能为核酸的一或数个部分以D-核酸的形式存在或核酸的至少一或数个部分为L-核酸。核酸的″部分″一词应指少至一个核苷酸。此文中，这类核酸通常分别指D-及L-核酸。因此，在一种特别优选的实施方案中，根据本发明的核酸由L-核酸所组成且包含至少一个D-核苷酸。这类D-核苷酸优选连接与界定根据本发明核酸的片段不同的部分，优选的核酸本身的那些涉及与核酸的其它部分相互作用的部分。优选的，这类D-核苷酸分别连接任何片段及根据本发明的任何核酸的终端。在另一种优选的实施方案中，这类D-核苷酸可作为间隔子或连接体，优选的，连接修饰部分(诸如：PEG和HES)与根据本发明的核酸。

[0127] 本发明也包括：根据本发明的核酸为较长核酸的一部分，其中此较长的核酸包含数个部分，其中至少一部分为根据本发明的核酸或其部分。这些较长核酸的其它部分可为D-核酸或L-核酸。任何组合均可用于本发明中。这些较长核酸的其它部分可显示与结合不同的功能，优选与生长素释放肽的结合无关。一种可能的功能是容许与其它分子相互作用，其中这类其它分子优选与生长素释放肽不同，诸如：用于固定、交联、检测或扩增。

[0128] 此文所描述的L-核酸由L-核苷酸所组成，优选全部由L-核苷酸所组成。

[0129] 此文所描述的D-核酸由D-核苷酸所组成，优选全部由D-核苷酸所组成。

[0130] 不论本发明的核酸是否由D-核苷酸、L-核苷酸或此二者的组合(该组合为，如：随机的组合或界定的片段的序列，该片段是由至少一个L-核苷酸及至少一个D-核苷酸所组成)所组成，该核酸可由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合所组成。

[0131] 将本发明的核酸设计成L-核酸较为有利的理由有数种。L-核酸为天然核酸的对映体。然而，由于核酸酶广泛存在，D-核酸在水溶液中并非很稳定，尤其是在生物系统或生物样本中。天然核酸酶(尤其是来自动物细胞的核酸酶)无法将L-核酸降解。因此，L-核酸的生物半衰期在这类系统(包括动物及人体)中显著增加。由于缺乏L-核酸的降
解力，因而不会产生核酸酶降解产物，因此，不会观察到由此产生的副作用。此方面确定所有其它确实可用于治疗涉及生长素释放肽的疾病和/或病症的化合物的L-核酸的范围。通过与Watson Crick碱基配对不同的机制而特异结合靶标分子的L-核酸，或那些部分或完全由L-核苷酸所组成的适体(尤其是那些参与适体与靶标分子结合的适体部分)也称为
spiegelmers。

[0132] 本发明也包括：本发明的核酸(不论其是否为D-核酸、L-核酸或D，L-核酸的形式或其是否为DNA或RNA的形式)可以单链或双链核酸的形式存在。通常，本发明的核酸为单链核酸(其显示由一级序列所决定的确定的二级结构)，因此也可形成三级结构。然而，本发明的核酸也可为双链核酸，意指该彼此互补或部分互补的双链彼此杂交。此提供该核酸稳定性，若该核酸是以天然D-型而非L-型存在，则此点特别有利。

[0133] 本发明的核酸可加以修饰。这类修饰可能与核酸的单一核苷酸有关且为本领域所熟知。这类修饰的实例描述于，尤其是下列文献中：Venkatesan N.et al.(2003)Curr Med Chem.Oct；10(19)：1973-91；Kusser，W.(2000)J Biotechnol，74：27-38；Aurup，H.et al.(1994)Nucleic Acids Res，22，20-4；Cummins，L.L.et al，(1995)NucleicAcids Res，23，2019-24；Eaton，B.E.et a1.(1995)Chem Biol，2，633-8；Green，L.S.et al.，(1995)Chem Biol，2，683-95；Kawasaki，A.M.et al.，(1993)J Med Chem，36，831-41；Lesnik，E.A.et al.，(1993)Biochemistry，32，7832-8；Miller，L.E.et al.，(1993)J Physiol，
469，213-43。这类修饰可为在组成该核酸的核苷酸个体的2′位置处的H原子、F原子或O-CH3基团或NH2基团。再者，根据本发明的核酸可包含至少一个LNA核苷酸。在一种实施方案中，根据本发明的核酸由LNA核苷酸所组成。

[0134] 在一种实施方案中，根据本发明的核酸可为多部分核酸(multipartite nuclei acid)。此文所使用的多部分核酸是指由至少二条核酸链所组成的核酸。此至少二条核酸链形成功能单位，其中该功能单位为靶标分子的配体。该至少二条核酸链可通过将核酸裂解以产生二条链或可通过合成对应于本发明的第一部分的一个核酸(即：总体核酸)及另一对应于总体核酸的第二部分的核酸而从任何本发明的核酸衍生。裂解及合成法二者均可用来产生多部分核酸，此种核酸中具有超过二条如上述例示的链。换言之，该至少二条核酸链通常与彼此互补且杂交的两条链不同(但不同的核酸部分之间仍可能存在某种程度的互补性)。

[0135] 本发明者发现：根据本发明的核酸显示出非常良好的Kd值范围。更特别地，包含(除了完整Box A及Box B外)各具有最少二个核苷酸的Box C1及Box C2、具有最少六个核苷酸的Box D及具有最少三个核苷酸的Box E的寡核苷酸(例如：SOT-E)对生长素释放肽显示出较SOT-C好六倍的结合亲和力。

[0136] 确定结合常数的一种可能方法是使用称为拜尔可(Biocore)的装置，此也为本领域的普通技术人员所已知。此文所使用的亲和力也通过实施例中所描述的″平衡分析″测量。用来表示根据本发明的核酸与靶标(此处为生长素释放肽)间的结合强度的合适度量值称为Kd值，此值与其测量方法为本领域的普通技术人员所已知。

[0137] 根据本发明的核酸的特征为一定的Kd值。优选的，根据本发明的核酸所显示的Kd值低于1μM。约1μM的Kd值为核酸对靶标的非特异结合的特征。本领域的人士认为：一组化合物(诸如根据本发明的核酸)的Kd值是在某一范围内。上述约1μM的Kd值为Kd值的优选上限。与靶标结合的核酸的Kd值的优选下限为10μM或更高。本发明包括：与生长素释放肽结合的核酸个体的Kd值优选在此范围内。优选的范围可通过选择此范围内的任何第一个数字及此范围内的任何第二个数字来界定。优选的上限值为0.25μM、0.1μM及0.01μM，优选的下限值为100nM、10nM、1nM及0.05nM。

[0138] 根据本发明的核酸分子可具有任何长度，只要其仍可结合靶标分子并区分生物活性的生长素释放肽与非生物活性的生长素释放肽，即：优选的，区分辛酰基生长素释放肽与去辛酰基生长素释放肽。本领域承认根据本发明的核酸具有优选的长度。通常，该长度是介于15至120个核苷酸之间。本领域的普通技术人员承认：根据本发明的核酸的可能长度是介于15至120个核苷酸间的任何数目的核苷酸。根据本发明的核酸的长度的更优选范围是介于约20至100个核苷酸之间、约20至80个核苷酸之间、约20至60个核苷酸之间、约20至50个核苷酸之间及约30至50个核苷酸之间。

[0139] 本发明也包括：此文所揭示的核酸包含部分(moiety)，优选为高分子量的部分和/或优选的，该部分容许修饰核酸特性，尤其是，在动物体内(优选为人体)的停留时间。这类修饰的特别优选实施方案为将根据本发明的核酸PEG化及HES化。此处使用PEG代表聚(乙二醇)，HES代表羟乙基淀粉。此文所使用的PEG化优选为修饰根据本发明的核酸，其中这类修饰包含连接根据本发明的核酸的PEG部分。此文所使用的HES化优选为修饰根据本发明的核酸，其中这类修饰包含连接根据本发明的核酸的HES部分。这些修饰及利用这类修饰来修饰核酸的过程描述于欧洲专利申请案EP 1 306 382号(其公开内容全部并入本文作为参考)中。

[0140] 优选的，尤其是在PEG这类高分子量部分的情况中，包含或由高分子量部分组成的修饰部分的分子量是约2000至200,000Da(优选为40,000至120,000Da)，尤其是，在HES这类高分子量部分的情况中，修饰部分的分子量是约3000至100,000Da，以5,000至
60,000Da更优选。HES修饰的方法，如：描述于德国专利申请案DE 1 2004 006249.8(其公开内容全部并入本文作为参考)中。

[0141] 不欲受限于任何学说，以高分子量部分(诸如：聚合物，更特别的是此文所揭示的聚合物，且优选为生理学上可接受)修饰根据本发明的核酸时似乎改变排出动力学。更特别的是，似乎由于这类经修饰的本发明核酸的分子量增加且由于核酸不被代谢(尤其是为L型时)因而减少其从动物体内(优选为从哺乳动物体内，更优选为从人体内)排出来。由于排出通常是经由肾脏，本发明者假设：与不具有此种高分子量修饰部分的核酸相较下，此种经修饰的核酸的肾小球过滤速率显著降低(其造成在体内的停留时间增加)。因此，尤其值得注意的是：尽管具有这类高分子量的修饰部分，根据本发明的核酸的特异性不会以有害的方式受到影响。根据本发明的核酸具有此令人惊讶的特性(此特性通常无法期待自药学化合物取得)，这使得提供持续释放时不一定需要可提供持续释放的药物制剂。更确切地说，包含高分子量部分的根据本发明的核酸的修饰型可因此直接以持续释放的制剂形式使用。

[0142] 然而，本发明也包含：此文所揭示的核酸不包含任何修饰，尤其是无高分子量修饰，诸如：PEG化及HES化。当需要在给药后令核酸从体内快速清除时尤其需要这类实施方案。在使用根据本发明的核酸或含此种核酸的药物的活体内造影或暂时性压抑食欲的情况中可能需要这类快速清除。

[0143] 本发明的核酸(此文中称为根据本发明的核酸)和/或根据本发明的拮抗剂可用来生产或制造药物。这类药物包含至少一种本发明的核酸，可选择地加上其它药学活性化合物，其中该本发明的核酸优选本身作为药学活性化合物。在优选的实施方案中，这类药物包含至少一种药学上可接受的载体。这类载体可为，例如：水、缓冲剂、PBS、葡萄糖溶液(优选为5％葡萄糖盐平衡溶液)、淀粉、糖、明胶或任何其它可接受的载体物质。这类载体为本领域的普通技术人员普遍所知。

[0144] 在另一种实施方案中，该药物包含另外的药学活性剂。这类另外的药学活性化合物可为那些已知可降低食欲者，优选选自下列：PYY3-45、CCK、瘦素及胰岛素。或者，或附加地，这类另外的药学活性剂为另一种根据本发明的核酸。或者，该药物至少还包含一种与生长素释放肽不同的靶标分子结合的核酸或显示出与根据本发明的核酸不同的功能的核酸。在一种实施方案中，这类核酸与缺乏辛酸部分的生长素释放肽结合。

[0145] 可使用这类药物治疗和/或预防的疾病和/或病症和/或疾病状态包括，但不限于：肥胖、调节能量平衡、食欲及体重、进食障碍疾患、胃肠道疾病、糖尿病、葡萄糖代谢、肿瘤、血压、心血管疾病、肢端肥大病以及其它GH失衡。如本领域技术人员所承认：本发明的核酸可确实用于任何其中可将生长素释放肽拮抗剂施用给有此需要的患者的疾病中，这类拮抗剂适合用来排除疾病或病症的原因，或至少减轻该疾病或病症的作用。这类作用包括，但不限于：肥胖、调节能量平衡、食欲及体重、进食障碍疾患、胃肠道疾病、糖尿病、葡萄糖代谢、肿瘤治疗、血压、心血管疾病、肢端肥大病以及其它GH失衡。根据本发明的核酸在这些及其它疾病或病症方面的可应用性是来自(尤其是)本专利说明书引言部分所概述的生长素释放肽涉及的事项。为本发明的目的，能量平衡的调节被视为一种疾病。更特别地，该用途是用于治疗任何其中调节能量平衡受到生长素释放肽影响(直接或间接)且其中需要降低生长素释放肽的生物利用度的疾病。同样地，其可应用在葡萄糖代谢、血压、食欲及体重。其它可利用根据本发明的核酸治疗的疾病(可能应用在系统或局部治疗)为选自下列的
疾病：垂体肿瘤、肢端肥大病、中枢库兴(Cushing)综合征、肾上腺库兴综合征、副肿瘤性库兴综合征、异位性库兴综合征、肾上腺肿瘤、压力、皮质醇增多症、心机能不全、心肌梗塞、中风、肾上腺皮质机能不全、肌张力减退、主动脉狭窄、高肺压、缩窄性心包炎、感染性疾病、感染性毒性张力减退、低血容量及低血钠症。

[0146] 如此文所使用者，可利用根据本发明的核酸治疗的胃肠道疾病包含胃部疾病及病症、肠疾病及病症、结肠病症及疾病和胃及结肠运动性的调节。在一种优选的实施方案中，肠病症及肠疾病包含炎性肠疾病。更优选的炎性肠疾病为溃疡性结肠炎及克罗恩病。根据本发明的核酸用于治疗此种疾病的适合性来自生长素释放肽参与所述疾病，如下列文献中所描述：Karmiris Ket al.(Karmiris K，KoutroubakisIE，Xidakis C，Polychronaki M，Voudouri T，Kouroumalis EA.Circulating levels of leptin，adiponectin，resistin，andghrelin in inflammatory bowel disease.Inflamm Bowel Dis.2006Feb；12(2)：100-5)，Tebbe JJ et al.(Tebbe JJ，Mronga S，TebbeCG，Ortmann E，Arnold R，Schafer MK。由生长素释放肽造成的对结肠推进的刺激依赖下丘脑神经肽Y1释放因子1受体及促皮质素释放因子1受体的活化。J Neuroendocrinol.2005 Sep；17(9)：570-6)and Fukuda H.et al.(Fukuda H，Mizuta Y，Isomoto H，TakeshimaF，Ohnita K，Ohba K，Omagari K，Taniyama K，Kohno S.Ghrelinenhances gastric motility through direct stimulation ofintrinsic neural pathways and capsaicin-sensitive afferentneurones in rats.Scand J Gastroenterol.2004 Dec；39(12)：1209-14)。

[0147] Kobelt et al.(Kobelt P，Helmling S，Stengel A，Wlotzka B，Andresen V，Klapp BF，Wiedenmann B，Klussmann S，Monnikes H.Anti-ghrelin SPIEGELMER NOX-B11 inhibits neurostimulstory andorexigenic effects of peripheral ghrelin inrats.Gut.2005 Jun30，Epub ahead of print)发表的刊物报导在施用抗生长素释放肽Spiegelmer NOX-B11时，由外周生长素释放肽所引起的剂量依赖性的短期食物摄取量减少。更具体地说，与载体/载体组(1.13±0.59克/公斤-体重，p＜0.0002)相较下，以
PBS及3nmol生长素释放肽(载体/生长素释放肽组)治疗的阳性对照组在腹膜内注射
(4.94±0.63克/公斤-体重)后的前半小时内显著增加食物摄取(Kobelt，等人(同上)
的图2A)。以30nmol Spiegelmer NOX-B11(＝SOT-C＝B11trc)预先治疗可阻断生长素
释放肽对摄取食物的刺激(0.58±0.58克/公斤-体重；p＜0.0001)(Kobelt，等人(同
上)的图2A)。相反的，施用由随机序列组成的对照Spiegelmer并无这类抑制效果，使得由生长素释放肽引起的摄取食物的刺激仍然完整(4.77±0.66克/公斤-体重；p＞0.864)
(Kobelt，等人(同上)的图2A)。

[0148] NOX-B11(＝SOT-C＝B11trc)对摄取食物的抑制作用证明为绝对的剂量依赖性。1nmol剂量的Spiegelmer NOX-B11(＝SOT-C＝B11trc)对由生长素释放肽引起的食物摄
取刺激并无作用(Kobelt，等人(同上)的图2A)。10nmol NOX-B11(＝SOT-C＝B11trc)
的剂量可观察到中等效果：在此剂量水平下，3nmol生长素释放肽在前30分钟的刺激作用为适中(3.51±0.66克/公斤-体重对4.94±0.63克/公斤-体重，相对于单独的生长素
释放肽，p＞0.159)(Kobelt，等人(同上)的图2A)。

[0149] 由Shearman et al.(Shearman LP，Wang SP，Helmling S，Stribling DS，Mazur P，Ge L，Wang L，Klussmann S，Macintyre DE，Howard AD，Strack AM.Ghrelin Neutralisation by a RibonucleicAcid-SPM Ameliorates Obesity in Diet-Induced Obese Mic.；Endocrinology.2006 Mar；147(3)：1517-26.Epub 2005 Dec 8)发表的刊物报导当给予由饮食引起肥胖(DIO)的小鼠抗生长素释放肽Spiegelmer NOX-B11-2(SOT-D-109)时，其
体重减轻且食物摄取量减少。更具体地说，与对照组相较下，输注NOX-B11-2(SOT-D-109)可引起体重减少(见Shearman，等人(同上)的图4A)。与经载体处理的小鼠相较下，
输注NOX-B11-2(SOT-D-109)可在第1-10天及笫12天观察到显著的体重减少；与输注
Spiegelmer的对照组(对照组SPM)相较下，可在第1-13天观察到体重减少(相对于载体
组或对照组SPM，p＜0.05)。第13天前，输注NOX-B11-2的小鼠体重平均增加0.32克，而接受对照组Spiegelmer者，体重平均增加1.85克，而那些接受载体者，体重平均增加0.91克。再者，输注NOX-B11-2(SOT-D-109)显著减少食物摄取量(见：Shearman，等人(同上)的图4B)。与载体组相较下，在第1-8天可观察到对累积的食物摄取量有显著效果，与对照组Spiegelmer组相较下，在第1-13天可观察到对累积的食物摄取量有显著效果(第13天为39.33克对42.61克；p＜0.05)(Shearman，等人(同上)的图4C)。另外，在第1-5天及
6-13天计算喂食效率(每食入千卡所增加的体重)(其为表示用来增加身体质量的食物能量的效率如何的指标)(见：Shearman，等人(同上)的图4D)。输注NOX-B11-2(SOT-D-109)后第1-5天可观察到喂食效率降低，但在第6-13天则无法观察到此作用，这表示暂时
减少体重增加并不仅因为减少食物摄取。另外，以NOX-B11-2(SOT-D-109)治疗时可改
变DIO小鼠的身体组成(Shearman，等人(同上)的图4E)。与瘦肉含量不变相反，输注
NOX-B11-2(SOT-D-109)的小鼠的脂肪质量含量减少，即使在校正总体重后(Shearman，等人(同上)的图4F)。输注NOX-B11-2(SOT-D-109)不会改变白色脂肪组织储存重量，而输注对照Spiegelmer不会改变身体组成或白色脂肪组织重量。

[0150] 在利用DIO生长素释放肽缺陷小鼠及野生型小鼠，以NOX-B11-2(SOT-D-109)进行的长期输注研究中，当将NOX-B11-2(SOT-D-109)输注给野生型小鼠时可在第1至6天观察到明显的体重减轻(见：Shearman，等人(同上)的图5A)。相反的，NOX-B11-2(SOT-D-109)不会改变Ghr1-/-小鼠的体重(见：Shearman，等人，同上，图5 B)。另外，输注NOX-B11-2(SOT-D-109)会减少野生型小鼠第1天的日食物摄取量(见：Shearman，等人(同上)的图5C)。输注NOX-B11-2(SOT-D-109)不会改变Ghr1-/-小鼠的食物摄取量(见：
Shearman，等人(同上)的图5D)。

[0151] 本发明也包含：替换地或额外地使用药物，以原则上预防所揭示的任何与使用该药物治疗的有关疾病。用于此的各别标记选自下列：心血管风险因子(例如：胆固醇及低有氧活性)及一般需要管理体重的因子。

[0152] 原则上，根据本发明的药物可以任何本领域的普通技术人员已知的形式施用。优选的施用途径为系统性施用，以经由注射途径施用更优选。或者，可将药物局部施用。其它施用途径包含肌肉内、腹膜内及皮下、perorum或鼻内，优选的施用途径为最不具侵入性但可确保功效的途径。

[0153] 本发明的另一方面涉及药物组合物。这类药物组合物包含至少一种根据本发明的核酸及优选的，包含药学上可接受的结合剂。这类结合剂可为任何本领域所使用和/或已知的结合剂。更特别地，这类结合剂为任何与制造此文所揭示的药物有关的结合剂。在另一种实施方案中，该药物组合物包含另外的药学活性剂。

[0154] 本发明也包含：此文所描述的构成此文所揭示的药物组合物的药物。

[0155] 本发明的另一方面涉及用于治疗需要此种治疗的个体的方法，其中该方法包含施用至少一种药学活性量的根据本发明的核酸。在一种实施方案中，该个体患有疾病或处于发展这类疾病的风险中，其中该疾病为任何此文所揭示的疾病，尤其是所揭示的那些与可用来制造药物的本发明核酸的用途有关的任何疾病。

[0156] 需了解：该根据本发明的核酸及拮抗剂不仅可作为药物或用来制造药物，也可用于美容目的，尤其是与生长素释放肽在肥胖方面所涉及部分有关。为了相同的目的和/或相同理由，根据本发明的核酸及拮抗剂可作为食品添加剂，控制体重的手段、控制食欲的手段和/或诊断剂。含有根据本发明的核酸及拮抗剂的组合物可用于任何上述目的。

[0157] 优选的，此文所使用的诊断或诊断剂或诊断工具适合检测(直接或间接)生长素释放肽(优选为此文所描述的生长素释放肽且更优选为与此文所描述的不同病症或疾病相关的生长素释放肽)。该诊断剂适合分别用于检测和/或追踪此文所描述的任何病症或疾病。这类检测可能通过根据本发明的核酸与生长素释放肽结合。这类结合可被直接或间接检测。该相关方法及手段为本领域的普通技术人员所已知。尤其是，根据本发明的核酸可包含可令根据本发明的核酸(优选为与生长素释放肽结合的核酸)被检测到的标记。这类标记优选选自下列：放射活性标记、酶标记及荧光标记。原则上，所有研发出的用于抗体的已知分析均可用于根据本发明的核酸，但应将该与靶标结合的抗体替换成与靶标结合的核酸。在使用未标记的与靶标结合的抗体的抗体分析中，优选通过二级抗体(其经放射活性标记、酶标记及荧光标记修饰)并与该结合靶标的抗体的Fc片段结合来完成检测。在核酸(优选为根据本发明的核酸)的情况中，该核酸优选以选自下列的这类标记修饰：生物素、Cy-3及Cy-5，且标记是通过针对这类标记的抗体(如：抗-生物素抗体、抗-Cy-3抗体或抗-Cy-5抗体)检测，或者，在该标记为生物素的情况中，该标记是通过链霉抗生物素或抗生物素蛋白(其天然与生物素结合)检测。这类抗体、链霉抗生物素或抗生物素蛋白优选以各自的标记(如：放射活性标记、酶标记或荧光标记)修饰(如同二级抗体)。

[0158] 在另一种实施方案中，该根据本发明的核酸分子通过第二种检测手段检测或分析，其中该检测手段为分子信标。分子信标的方法学为本领域的普通技术人员所已知。简单地说，核酸探针(也称为分子信标)与欲检测的核酸样本反向互补并因此与欲检测的核酸样本的一部分杂交。当与核酸样本结合时，该分子信标的荧光基团分开，使荧光信号改变(优选为强度改变)。此改变与核酸样本存在量相关。

[0159] 用于区分根据本发明生物活性及非生物活性的生长素释放肽的分析可利用本领域的普通技术人员所已知的标准技术执行。需了解：这类分析也可用来检测生长素释放肽(优选为将在下文中概述的生物活性的生长素释放肽)。

[0160] 本领域承认：使用根据本发明的核酸检测生长素释放肽特别容易检测到如此文所定义的生物活性的生长素释放肽。另外，生物活性的生长素释放肽可分开检测，因此可通过(尤其是)下列程序区别去辛酰基生长素释放肽，其中其它程序对本领域的普通技术人员将是明白清楚的。

[0161] 涉及检测生物活性的生长素释放肽的优选方法包含下列步骤：

[0162] (a)提供欲检测是否存有生物活性的生长素释放肽的样本，

[0163] (b)提供根据本发明的核酸，

[0164] (c)将样本与核酸反应，优选在反应容器中进行

[0165] 其中步骤(a)可在步骤(b)之前执行，或者步骤(b)可在步骤(a)之前执行。

[0166] 在一种优选的实施方案中，提供另一步骤(d)，其为检测该样本与核酸的反应。优选的，步骤(b)的核酸固定在表面上。该表面可为反应容器(例如：反应管、板上的孔、或包含在这类反应容器中的装置，诸如：小珠)的表面。将核酸固定在表面上可通过本领域的普通技术人员已知的任何方式完成，包括，但不限于：非共价或共价连接。优选的，该连接是经由介于表面及核酸间的共价化学键建立。然而，本发明也包含：该核酸是间接固定在表面上，其中这类间接固定涉及使用另外的成分或一对相互作用的配偶体。这类另外的成分优选为与欲固定的核酸(其也称为相互作用的配偶体)特异相互作用的化合物，以促成将核酸附着在表面上。该相互作用的配偶体优选选自下列：核酸、多肽、蛋白质及抗体。优选的，该相互作用的配偶体为抗体，更优选为一种单克隆抗体。或者，该相互作用的配偶体为核酸，优选为功能性核酸。更优选的，这类功能性核酸选自下列：适体、Spiegelmer及与该核酸至少部分互补的核酸。在另一种替换的实施方案中，该核酸与表面的结合优选由多部分的相互作用配偶体介导。这类多部分的相互作用的配偶体优选为一对相互作用的配偶体或为由第1员及第2员所组成的相互作用配偶体，其中该第1员包含在该核酸内或附着于该核酸，且该第2员附着于或包含在表面内。该多部分的相互作用配偶体优选选自包含下列的成对的相互作用配偶体：生物素及抗生物素蛋白，生物素及链霉抗生物素和生物素及中性链亲和素(neuravidin)。优选的，该成对的相互作用配偶体的第1员为生物素。

[0167] 这类方法的优选结果是形成生物活性的生长素释放肽与核酸的固定的复合物，其中更优选的检测该复合物。在一种实施方案中是从该复合物检测生物活性的生长素释放肽。更优选的，该生物活性的生长素释放肽是通过一种特异于生物活性的生长素释放肽的检测手段检测。在一种特别优选的实施方案中，该生物活性的生长素释放肽是通过检测生物活性的生长素释放肽及非生物活性的生长素释放肽的检测手段检测。

[0168] 顺应此需求的各种检测手段为，例如：任何特异于生物活性的生长素释放肽与去辛酰基生长素释放肽中的相同部分的检测手段。优选的，这类检测手段结合生长素释放肽的C-端，或至少不与由N-端及正辛酰基侧链所形成的结构域结合。特别优选的检测手段为选自下列的检测手段：核酸、多肽、蛋白质及抗体，其制造方法为本领域的普通技术人员所已知。

[0169] 用于检测生长素释放肽的方法也包含将样本从反应容器(优选为曾用来执行步骤c的)移除。

[0170] 另一种实施方案中的方法也包含将生物活性和/或去辛酰基生长素释放肽的相互作用配偶体固定在表面上(优选为如上述定义的表面)的步骤，其中该相互作用的配偶体为如此文所定义者，优选为如上文中涉及该个别方法中所定义者，且更优选为在其不同的实施方案中包含核酸、多肽、蛋白质及抗体。在此实施方案中，特别优选的检测手段为根据本发明的核酸，其中这类核酸优选为经标记或未经标记者。在这类核酸经过标记的情况中可直接或间接检测核酸。这类检测也可能涉及使用第二种检测手段，优选的，在此文所描述的不同实施方案中其也选自下列：核酸、多肽、蛋白质及抗体。这类检测手段优选特异于根据本发明的核酸。在一种更优选的实施方案中，该第二种检测手段为分子信标。在一种优选的实施方案中，该核酸或第二种检测手段或此二者可包含检测标记。该检测标记优选选自下列：生物素、溴-脱氧尿苷标记、洋地黄毒苷标记、荧光标记、UV-标记、放射标记及螯合剂分子。或者，该第二种检测手段与该检测标记相互作用，该检测标记优选包容在、包含在或附着于核酸。特别优选的组合如下：

[0171] 该检测标记为生物素且该第二种检测手段为针对生物素的抗体，或者，其中

[0172] 该检测标记为生物素且该第二种检测手段为抗生物素蛋白或携带抗生物素蛋白的分子，或者，其中

[0173] 该检测标记为生物素且该第二种检测手段为链霉抗生物素或携带链霉抗生物素的分子，或者，其中

[0174] 该检测标记为生物素且该第二种检测手段为中性链亲和素或携带中性链亲和素的分子，或者

[0175] 该检测标记为溴-脱氧尿苷且该第二种检测手段为针对溴-脱氧尿苷的抗体，或者，其中

[0176] 该检测标记为洋地黄毒苷且该第二种检测手段为针对洋地黄毒苷的抗体，或者，[0177] 其中该检测标记为螯合剂且该第二种检测手段为放射性核素，

[0178] 其中优选的，该检测标记附着于核酸。此种组合也可被接受用于其中该核酸附着于表面的实施方案中。在这类实施方案中，优选的该检测标记附着于该相互作用的配偶体。

[0179] 最后，本发明也包含利用第三种检测手段检测该第二种检测手段，优选的，该第三种检测手段为一种酶，更优选的，其在检测该第二种检测手段时显示出酶促反应，或者，该第三种检测手段为用于检测放射线(以由放射性核素发射的放射线更优选)的手段。优选的，该第三种检测手段特异检测和/或与该第二种检测手段相互作用。

[0180] 再者，在具有固定在表面上的生物活性和/或去辛酰基生长素释放肽的相互作用配偶体且，优选的，根据本发明的核酸分子加入由相互作用的配偶体及生长素释放肽所形成的复合物的实施方案中，可将样本从反应物(更优选为执行步骤c)及步骤d)的反应容器)移除。

[0181] 在一种实施方案中，根据本发明的核酸包含荧光部分，其中该荧光部分的荧光在形成核酸与生物活性的生长素释放肽间的复合物时及游离的生物活性的生长素释放肽会不相同。

[0182] 在另一种实施方案中，该核酸为根据本发明的核酸的衍生物，其中该核酸的衍生物包含至少一种取代腺苷的腺苷的荧光衍生物。在一种优选的实施方案中， 该腺苷的荧光衍生物为乙烯腺苷(ethenoadenosine)。

[0183] 在另一种实施方案中，由根据本发明的核酸的衍生物及生物活性的生长素释放肽所组成的复合物是利用荧光检测。

[0184] 在该方法的一种实施方案中，在步骤(c)或步骤(d)中产生信号，且优选的，该信号与样本中的生物活性的生长素释放肽的浓度相关。

[0185] 在一种优选的实施方案中可在96-孔板中执行分析，其中将成分固定在如上述的反应容器中，且该孔是作为反应容器。

[0186] 上述的反应步骤的顺序及随之描述的不同实施方案原则上是适合用来检测生物活性的生长素释放肽(即：辛酰基生长素释放肽且更优选的，正辛酰基生长素释放肽)及去辛酰基生长素释放肽。在下述的前提条件下，此项是可行的：在检测生物活性的生长素释放肽时，至少一种相互作用的配偶体及根据本发明的核酸适合特异检测该生物活性的生长素释放肽。原则上，使用特异于生物活性的生长素释放肽的根据本发明的核酸即足够。此种特异于样本中所包含的生长素释放肽量的方法所读出的数据可作为分析生物活性的生长素释放肽的结果。然而，此结果也可能用于测定生长素释放肽总含量(优选为生物活性的生长素释放肽及去辛酰基生长素释放肽)的方法中。为了这类目的，优选执行一种与上述方法相一致的方法，其是使用特异于去辛酰基生长素释放肽或适合检测生物活性及去辛酰基生长素释放肽(即：总生长素释放肽的内容或其量)的检测手段或相互作用配偶体。若该相互作用的配偶体或手段适合检测任何生长素释放肽，不论其是为生物活性的生长素释放肽或去辛酰基生长素释放肽，该样本中所包含的生长素释放肽的总含量可通过可测定样本中的生物活性生长素释放肽百分比的读出方法，将生物活性的生长素释放肽的值除以生长素释放肽的总含量值来计算。在另一种实施方案中，该方法用来特异检测去辛酰基生长素释放肽。这类去辛酰基生长素释放肽可，例如：通过特异于去辛酰基生长素释放肽的检测手段或相互作用配偶体检测，诸如针对缺乏正辛酰基部分的生长素释放肽的C-端或N-端。然后，可将由此测定的生长素释放肽量，即：去辛酰基生长素释放肽的量加上生物活性的生长素释放肽的量以产生样本中的总生长素释放肽含量。

[0187] 本发明的核酸可进一步作为设计药物的起始物质。基本上有二种可能的方法。一种方法是筛选化合物文库，然而，这类化合物文库优选为低分子量化合物文库。在一种实施方案中，该筛选法为高通量筛选法。优选的，高通量筛选法在基于靶标的分析中快速、有效、试错性地评估化合物。在最优选的情况中，该分析通过比色(colormatic)测量。随之使用的化合物文库为本领域的一般技术人士所已知。

[0188] 或者，根据本发明的核酸可用来理性设计(rational design)药物。优选的，理性的药物设计为设计药物前导结构。从靶标的三维结构(其通常通过诸如X-射线结晶图或核磁共振分光谱的方法鉴定)开始，使用计算机程序搜寻含有多种不同化学化合物的结构的数据库。通过计算机完成选择，该鉴定出的化合物可接着在实验室中进行测试。

[0189] 药物的理性设计可从任何根据本发明的核酸开始且涉及一种结构(优选为三维结构)，该结构类似于本发明核酸的结构或与本发明核酸的结构的介导结合的部分相同。这类结构在任何情况中仍均显示出与本发明核酸相同或类似的结合特性。在理性的药物设计的进一步步骤或替换的步骤中，优选的，通过与核苷酸及核酸不同的化学基团来模拟与神经递质结合的核酸部分的三维结构。通过此模拟可设计出与该核酸不同的化合物。这类化合物优选为小分子或肽。

[0190] 在筛选化合物文库的情况中(诸如使用本领域的普通技术人员已知的竞争性分析)可找出合适的生长素释放肽类似物、生长素释放肽激动剂或生长素释放肽拮抗剂。这类竞争性分析可依下述设立。将本发明的核酸(优选为Spiegelmer，其为与靶标结合的L-核酸)与固相偶联。为了鉴定生长素释放肽类似物，可将经标记的生长素释放肽加入分析中。可能的类似物将与生长素释放肽分子竞争与Spiegelmer结合，这将使得相关标记的信号减少。激动剂或拮抗剂的筛选可能涉及使用本领域的普通技术人员所已知的细胞培养分析。

[0191] 根据本发明的试剂盒可包含至少一种或数种本发明的核酸。另外，该试剂盒可包含至少一种或数种阳性或阴性对照。阳性对照可为，如：生长素释放肽，尤其是本发明核酸所选择或结合的生长素释放肽，优选为液态形式。阴性对照可为，如：在生物性质上类似于生长素释放肽，但不被本发明的核酸识别的肽。再者，该试剂盒可包含一或多种缓冲剂。试剂盒中可包含多种不同成分，这些成分可为干燥或冻干型或溶解在液体中。该试剂盒可包含一或多个容器，该容器可包含试剂盒的一或多种成分。在另一种实施方案中，该试剂盒包含提供使用者如何使用该试剂盒及其不同成分的说明书或说明书页。

[0192] 优选的，在优选的实施方案中，此文中所使用的治疗一词额外或替换地包含预防和/或追踪(follow-up)。

[0193] 优选的，此文中所使用的疾病及病症一词应可互换使用，如果没有相反的说明。

[0194] 优选的，此文中所使用的包含一词不欲限制该名词后所连接的或该名词所描述的主体。然而，在替换的实施方案中，包含一词应被理解为含有且因此限制该名词后所连接的或该名词所描述的主体。

[0195] 下表中列出根据本发明的核酸分子的多种不同SEQ ID Nos.和化学性质，以及此文中所使用的靶标分子生长素释放肽，其实际序列及内部参考编号。

[0196] 表1(A)

[0197]序列ID RNA/肽 序列 内部参考
1 L-肽 GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 人类生长素释放肽
2 L-肽 GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR 大鼠生长素释放肽
3 L-RNA UAAX1X2CCGAAX3GUAX4CCAUUCCUX5C 其中
X1＝G或A；
X2＝A或U；
X3＝G或A；
X4＝A或C或U；且
X5＝G或A
4 L-RNA UAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUAC 优选序列Seq.ID3
5 L-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAAGUAACCAAUCCUACCGUAUAUACGGUGAGGCAGCACMS-P2-E3
6 L-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACAGUGAGGCAGCACMS-P2-G2
7 L-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCACMS-P2-D2
8 L-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAUCGUAUCUAUGGUGAGGCAGCACMS-P2-A3
9 L-RNA GGGUAUGCAUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCACMS-P2-E1
10 L-RNA GGGUAUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCACMS-P2-B1
11 L-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCACMS-P2-F1
12 L-RNA GGGUGUAUGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCAUAUCUACGGUGAGGCAGCACMS-P2-C3
13 L-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCAUAUCUACGGUGAGGCAGCACMS-P2-C2
14 L-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAUCAUAUCUACGGUGAGGCAGCACMS-P2-H2
15 L-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUACCUACUAACUGGUGAGGCAGCACMS-P2-A4[0198] 表1(B)

[0199]序列ID RNA/肽 序列 内部参考
16 L-RNA GGGUGACGUAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUACCUUUCCUGAGGUGAGGCAGCAC MS-P2-B2
17 L-RNA GGGUGCUGUGAGGCAAAAAAGUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUACAGCAC MS-P2-A2
18 L-RNA GGGUGCUGUGAGGCAAUGCGUAAGUCCGAAGGUAUCCAAUCCUGCAGCAC MS-P3-H3
19 L-RNA GGGUGUUGUGAGGCAAUAAGUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUGCAGCAC MS-P2-D1
20 L-RNA CGUGUGAGGCAAUAAAACUUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUACACG SOT-C(B11trc＝NOX-
B11)
21 L-RNA CGUGUGAGGUAGUAAAAAAAAAAAAACGUAAAUCCGAAGGUAACCAAUCCUACACG F12
22 L-RNA CGUGCGGUGAGGCAAAAACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCCACG SOT-D(C12)
23 L-RNA CGUGCGGUGAGGCAGACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCCACG SOT-D-000
24 L-RNA CGGUGAGGCAGACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCG SOT-D-100
25 L-RNA CGGUGAGGCAGAUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCG SOT-D-101
26 L-RNA CGGUGAGGCAAUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCG SOT-D-102
27 L-RNA GGUGAGGCAGACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACC SOT-D-104
28 L-RNA GGUAGGCAGACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACC SOT-D-106
29 L-RNA CCGGUGAGGCAGACGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG SOT-D-108
30 L-RNA CCGGUGAGGCAGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG SOT-D-109(NOX-B11-2)
31 L-RNA CCGGUGAGGCAGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG SOT-D-110
32 L-RNA CCGGUGAGGCCGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG SOT-D-111
33 L-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC SOT-E或MS-P2-F1[0200] 表1(C)

[0201]序列ID RNA/肽 序列 内部参考
34 L-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACC---S----GGUGAGGCAGCAC SOT-E-02
35 L-RNA CGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC SOT-E-09
36 L-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG--S---CGGUGAGGCAGCAC SOT-E-11
37 L-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGC SOT-E-12
38 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC SOT-E-14
39 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG--S---CGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19
40 L-RNA CGGUGAGGCAGCAC---S-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG SOT-E-21
41 L-RNA CGGUGAGGCAGC---S-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG SOT-E-25
42 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG--S---CGGUGAGGCAGC SOT-E-33
43 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-L
44 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGAAACGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-L1
45 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGAUACGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-L2
46 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGACACGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-L3
47 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGCAACGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-L4
48 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGAUCUCGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-L5
49 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUUUCGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-L6
50 L-RNA GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-L7
51 L-RNA 5′-PEG-GCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCG--S---CGGUGAGGCAGCAC SOT-E-19-5′-PEG
52 L-RNA 5′-PEG-CCGGUGAGGCAGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG SOT-D-109(NOX-B11-2)[0202] 表1(D)

[0203]序列ID RNA/肽 序列 内部参考
53 GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR 生物素.人类D-生长素释放肽
54 D-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAAGUAACCAAUCCUACCGUAUAUACGGUGAGGCAGCAC MS-P2-E3
55 D-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACAGUGAGGCAGCAC MS-P2-G2
56 D-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC MS-P2-D2
57 D-RNA GGGUAAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAUCGUAUCUAUGGUGAGGCAGCAC MS-P2-A3
58 D-RNA GGGUAUGCAUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC MS-P2-E1
59 D-RNA GGGUAUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC MS-P2-B1
60 D-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC MS-P2-F1
61 D-RNA GGGUGUAUGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCAUAUCUACGGUGAGGCAGCAC MS-P2-C3
62 D-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCAUAUCUACGGUGAGGCAGCAC MS-P2-C2
63 D-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAUCAUAUCUACGGUGAGGCAGCAC MS-P2-H2
64 D-RNA GGGUGUGCGUAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUACCUACUAACUGGUGAGGCAGCAC MS-P2-A4
65 D-RNA GGGUGACGUAAGACCGAAGGUACCCAAUCCUACCUUUCCUGAGGUGAGGCAGCAC MS-P2-B2
66 D-RNA GGGUGCUGUGAGGCAAAAAAGUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUACAGCAC MS-P2-A2
67 D-RNA GGGUGCUGUGAGGCAAUGCGUAAGUCCGAAGGUAUCCAAUCCUGCAGCAC MS-P3-H3
68 D-RNA CGUGUGAGGCAAUAAAACUUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUACACG SOT-C(B11trc＝NOX-B11)
69 D-RNA CCGGUGAGGCAGUAAGACCGAAGGUAACCAUUCCUACCGG SOT-D-109(NOX-B11-2)
70 D-RNA GGGUGAGCGUAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUACCGUAUCUACGGUGAGGCAGCAC SOT-E或MS-P2-F1
71 L-RNA 5′-PEG-UAAGGAAACUCGGUCUGAUGCGGUAGCGCUGUGCAGAGCU 对照Spiegelmer
72 L-RNA 5′-biotin-CGUGUGAGGCAAUAAAACUUAAGUCCGAAGGUAACCAAUCCUACACG 生物素化的NOX-B11附图说明

[0204] 本发明通过附图、实施例及列出的序列进一步说明，从这些附图、实施例及序列可得知另外的特性、实施方案及优点，其中

[0205] 图1显示与人类生长素释放肽结合的RNA配体的序列的排列比对；

[0206] 图2显示截短的适体相对于已知序列SOT-C(B11trc)竞争与生长素释放肽的结合的竞争分析；

[0207] 图3显示选出的RNA配体序列的比对，其公开于专利申请案WO2004/013274 A2中；

[0208] 图4显示计算出的与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-C的二级结构，该二级结构是以程序″RNAfold″(Hofacker et al.，1994，Monatsh Chem 125：
167-188)计算出；

[0209] 图5显示计算出的与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-D-000的二级结构，该二级结构是以程序″RNAfold″(Hofacker etal.，1994，Monatsh Chem 125：
167-188)计算出；

[0210] 图6显示计算出的与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-D的二级结构，该二级结构是以程序″RNAfold″(Hofacker et al.，1994，Monatsh Chem 125：
167-188)计算出；

[0211] 图7显示计算出的与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆F-12的二级结构，该二级结构是以程序″RNAfold″(Hofacker et al.，1994，Monatsh Chem 125：167-188)计算出；

[0212] 图8显示SOT-D-000衍生物(其为截短与理性设计实验的结果)的比对；

[0213] 图9显示在室温以Spiegelmer SOT-C、SOT-D-000及其变异体抑制由生长素释放++肽所诱导的Ca 释放的单点测量；以预先在室温下温育的5nM生长素释放肽及不同量的
Spiegelmer SOT-C、SOT-D-000或D-000的变异体刺激细胞，结果显示荧光信号的百分比(其相对于无Spiegelmer时所取得的信号进行标准化)；

[0214] 图10显示与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-D-109的推定的二级结构；

[0215] 图11显示在室温以Spiegelmer D-109及5′-聚乙二醇化的D-109抑制由生长素++释放肽所诱导的Ca 释放的剂量-反应曲线；以预先在室温下温育的5nM生长素释放肽及不同量的Spiegelmer D-109及5′-聚乙二醇化的-D-109刺激细胞；结果显示荧光信号的百分比(其相对于无Spiegelmer时所取得的信号进行标准化)；据发现：SpiegelmerD-109++
及其修饰的变化体可以同样的IC50抑制由生长素释放肽所诱导的Ca 释放；

[0216] 图12显示计算出的与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E的二级结构，该二级结构是以程序″RNAfold″(Hofacker et al.，1994，Monatsh Chem 125：
167-188)计算出；

[0217] 图13显示以细胞培养实验测试的Spiegelmer SOT-E的截短变异体的结合分析；

[0218] 图14显示与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E-19的推定的二级结构；

[0219] 图15显示与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E-21的推定的二级结构；

[0220] 图16显示与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E-33的推定的二级结构；

[0221] 图17显示与生长素释放肽结合的RNA Spiegelmer克隆SOT-E-25的推定的二级结构；

[0222] 图18显示指出与D-生长素释放肽结合的RNA克隆SOT-C及SOT-E的KD值的Biacore 2000传感图(sensorgram)；

[0223] 图19显示在37℃以Spiegelmer SOT-E、SOT-E-19-5′-氨基、SOT-E-19-5′-PEG++或SOT-D-109抑制由生长素释放肽所诱导的Ca 释放的剂量-反应曲线；以预先在37℃
下温育的2nM人类生长素释放肽及不同量的Spiegelmer SOT-E、SOT-E-19-5′-氨基、
SOT-E-19-5′-PEG或SOT-D-109刺激细胞；结果显示荧光信号的百分比(其相对于无
Spiegelmer时所取得的信号进行标准化)；据发现：SpiegelmerSOT-E-19及其修饰的变体+
可以约4nM的IC50抑制由生长素释放肽所诱导的Ca 释放；

[0224] 图20A显示序列Box的定义，其为与生长素释放肽结合的Spiegelmer的特征；

[0225] 图20B显示图20A的一种变体；

[0226] 图20C显示图20A的一种变体；

[0227] 图20D显示图20A的一种变体；

[0228] 图21显示SOT-D-109、SOT-E、SOT-E-19、SOT-E-21、SOT-E-33及SOT-E-25的序列；

[0229] 图22显示施用外源性生长素释放肽后，抗生长素释放肽SpiegelmerSOT-E-19-5′-PEG对生长激素释放的抑制作用；

[0230] 图23显示SOT-E-19的不同衍生物(其包含取代内部连接子的额外核苷酸)的概观，观察到的IC50值以nM表示；

[0231] 图24显示以辛酰基生长素释放肽、去辛酰基生长素释放肽及SpiegelmerSOT-E-19进行的细胞竞争分析的结果，该成分的组合及浓度概述于黑带下；

[0232] 图25显示通过EIA型检测分析记录的吸收对人类生长素释放肽(辛酰基化)浓度的标准曲线，而与生长素释放肽结合的SpiegelmerNOX-B11用来固定人类生长素释放肽(辛酰基化)，以定量人类生长素释放肽(辛酰基化)；

[0233] 图26A-D显示用于定量辛酰基生长素释放肽的方法的多种步骤，此方法是利用与生长素释放肽结合的根据本发明的核酸进行。

具体实施方式

[0234] 实施例1：与生长素释放肽结合的序列

[0235] 如果没有明确的相反说明，这些实施例中所使用的生长素释放肽为其辛酰基化生长素释放肽的形式。

[0236] 利用从DE 10349441.3中所描述的技术衍生的技术在活体外选择针对生物素化的人类D-生长素释放肽的RNA。克隆富集的dsDNA分子群并将其测序。序列分析的结果可在图1中见到。

[0237] 所有序列包含已知的与生长素释放肽结合的序列SOT-C(B11trc；见专利申请案WO 2004/013274 A2号)的生长素释放肽-结合基序A(25个核苷酸)。在这些23个克隆中仅有4个的基序A位于序列的3′端。19种序列中的基序A是位于克隆的5′端。另外
的称为基序D的基序是位于基序A的3′端。

[0238] 序列的结合特征

[0239] 选出15个在不同位置处显示变化的克隆(图1)，在37℃，利用实施例2中所描述的″竞争分析″进行评级实验。使用经放射标记的适体SOT-C(B11trc)作为参考。
数种候选物与D-生长素释放肽结合的结合力较SOT-C(B11trc)来得强，其显示出较低
的KD或较大量的活性构象而无法在″竞争分析″中区分。克隆MS-P2-G2、MS-P2-D2、
MS-P2-A2、MS-P2-H3似乎具有较对照组克隆SOT-C(B11trc)为佳的结合力，克隆MS-P2-E1、MS-P2-B1、MS-P2-F1、MS-P2-C3、MS-P2-C2、MS-P2-A4及MS-P2-B2显示出更好的结合力。与SOT-C(B11trc)相较下，克隆MS-P2-E3、MS-P2-A3、MS-P2-H2及MS-P2-D1可测定出与其类似的结合结果(图2；该评估见图1)。因此，在37℃下，测试具有在平衡分析中作为适体的活性及在细胞培养分析中作为Spiegelmer的活性的最优选克隆(实验计划见图2)。结果概述于图1中。在37℃下，于平衡分析中测得克隆MS-P2-D2、MS-P2-F1、MS-P2-C2、MS-P2-A4及MS-P2-B2具有22-34nM的KD值(约60％的活性分子)，而在37℃下，于细胞培养实验
中可检测到3.0-8.0nM的IC50值。相比之下，在37℃检测到的SOT-C(B11trc)的IC50值为
20nM，而在37℃测定出的KD值为100nM(47％的活性分子)(如专利申请案WO 2004/013274 A2号中所描述者，室温下，SOT-C的IC50值为约5nM)。结果指出：SpiegelmerMS-P2-F1、MS-P2-C2及MS-P2-D2的生物活性在37℃下可能较SOT-C(B11trc)甚至高出约5倍。在后
续的截短实验中，选择克隆MS-P2-F1(IC50值为4.0nM)(二级结构预测，见图12)。

[0240] 需了解：图1中所示的任何序列为根据本发明的核酸，包括那些为其截短型，然而仍可与靶标结合者。

[0241] 实施例2：序列的结合特征

[0242] 2.1使用″平衡结合分析″评估经放射标记的适体的等级

[0243] 就其对生物素化的人类D-生长素释放肽的结合行为，使用″平衡结合分析″将大部分此文所揭示的克隆(尤其是图1中所列者)以经放射标记的适体(D-RNA)形式进行评级。

[0244] 完成分子对人类D-生长素释放肽的结合行为的评级。为此，使用如此处所描述的标准实验方案，将鉴定出的适体合成为如图1所描述的截短适体(无引物结合位点)的形式。

[0245] 利用下列实验方案，以γ-P32-ATP将适体序列在5′端做放射标记。

[0246] 成分 [终浓度]

[0247] 寡核苷酸 5μM

[0248] T4向反应缓冲液(Invitrogen) 1x

[0249] T4多核苷酸激酶(Invitrogen) 10U/10微升反应体积

[0250] [γ-32P]ATP 1微升/10微升反应体积

[0251] 将反应物在37℃温育1小时。接着，将经放射标记的适体进行凝胶纯化。

[0252] 将2-5皮摩尔的经放射标记的RNAs在95℃，于不含Ca++及Mg++的选择缓冲液(根据人类血液中的生理条件：20mM Tris、150mM NaCl、5mM KC1，在37℃调整为pH7.4)中变性3分钟，经由在37℃下加入这些离子，使最终浓度为1mM，使之折叠，并在37℃下与浓度为0.4至3000nM的生物素化的人类D-生长素释放肽一起温育1小时。接着，加
入固定量的作为基质的中性链亲和素琼脂糖，并将RNA：肽复合物在37℃摇动超过30分钟。然后，将具有结合的肽的基质沉淀，去除上清液，以100微升选择缓冲液清洗基质，利用Beckman Coulter测量放射活性，以测定结合及未结合的RNA间的差异。将作为对照
组(0nM生物素化的人类D-生长素释放肽)的背景值从计算出的数字减去。利用软件程
序″GraFIT″(4.0.10版，Erithacus Software Ltd.，Surrey，UK)计算平衡常数。

[0253] 2.2利用竞争分析将适体评级

[0254] 为了将克隆与已知的与生长素释放肽结合的序列SOT-C(B11trc；见专利申请案WO 2004/013274 A2号)相比较，利用如此文所描述的标准实验方案(实施例4)将SOT-C32
合成为适体形式(D-RNA)。利用如此文所描述的标准实验方案，以γ-P -ATP将适体序列的5′端做放射标记。

[0255] 按照用于平衡分析的描述制备经放射标记的SOT-C及鉴定出的克隆(D-RNA)。在20nM的肽浓度(生物素化的人类D-生长素释放肽)下进行分析。然后，测试等摩尔量的经放射标记的SOT-C与二种不同浓度(40nM及200nM)的适体(结果描述于图2中)。依类似
平衡分析的方法进行分析。

[0256] 2.3与生长素释放肽结合的Spiegelmer对由生长素释放肽所诱导的钙释放的抑制作用

[0257] 在监测人类(L-)生长素释放肽与人类生长激素促分泌素受体(GHS-R)的相互作用的细胞分析系统中确定与生长素释放肽结合的Spiegelmer的功能性特征。通过荧光钙指示剂目视检查由受体-配体的相互作用造成的胞内钙释放。

[0258] 将表达人类生长素释放肽受体(GHS-R1a)的经稳定转染的CHO细胞(从4
Euroscreen，Gosselies，Belgium取得)以每孔5-7×10 细胞的浓度接种在黑色有透明底的96孔板(Greiner)中，在37℃及5％CO2下，于UltraCHO介质(Cambrex)(其额外含有
100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、400微克/毫升遗传霉素及2.5微克/毫升
两性霉素)中培养一整夜。

[0259] 在加入钙指示剂染料fluo-4前，以200微升CHO-U+清洗细胞一次。然后，加入50微升指示剂染料溶液(在CHO-U+中的10μMfluo-4(Molecular Probes)、0.08％
pluronic127(Molecular Probes))并将细胞在37℃下培养60分钟。然后，以180微升
CHO-U+清洗细胞三次。最后，在每一孔中加入90微升CHO-U+。

[0260] 将多种不同量的Spiegelmer在0.2毫升low profile96孔板中，在含5mM西磺舒(probenecid)和20mM HEPES的UltraCHO介质(CHO-U+)中与人类(L-)生长素释放肽(从Bachem购得)在室温或37℃下培育15至60分钟。在对照组方面，分析仅含肽的样本(最
大的钙释放量)及不含肽的样本(最少的钙释放量)。在这些刺激溶液中，与分析相较下，肽及Spiegelmer(若加入)为10倍浓缩。

[0261] 为了检测钙的释放量，将刺激溶液加入细胞(10微升/孔)中并监测荧光信号的变化。在配备注射泵的Fluostar Optima多重检测板读数计(BMG)中，于485nm的激发波长及520nm的发射波长处测量荧光信号。

[0262] 在并行测量数种样本方面，同时记录96孔板中的一排孔(垂直的)。前三次读数有4秒的时间落差以完成基线测定。然后，中断记录并将板从仪器移出。利用多道型吸量管(multi-channel pipette)将10微升刺激溶液加入孔中，再将板再次移入仪器中继续测量。在全部20次记录中执行4秒的时间间隔。

[0263] 测定各孔的最大荧光与基线值间的差异，并相对于人类(L-)生长素释放肽(辛酰基化)浓度绘图，或者，在Spiegelmer对钙释放的抑制作用的实验中，相对于Spiegelmer浓度绘图，以测定50％-最大抑制常数(IC50)。

[0264] 2.4表面等离子共振(SPR)测量

[0265] 依说明，利用BIAcore 2000仪(BIAcore AB，Uppsals Sweden)，通过SPR实时动力分析确定与生物素化的人类D-生长素释放肽结合的适体的特征。将100RU(Flowcell2)和300RU(Flowcell 3)的C-端生物素化的肽固定在与链霉抗生物素结合的传感芯片
(BIAcore AB，Freiburg，Germany)上，并利用Kinject注射浓度0.1μM至1μM的样本，控制360秒的结合时间及360秒的解离时间。使用Flowcell 1作为缓冲液及葡聚糖基质对照组(BIAcore SA-Chip表面)，然而，将非特异性D-肽固定在Flowcell 4上以测定适体的非特异性结合。在37℃下反应。以BIAevaluation 3.0软件(BIAcore AB，Uppsals，Sweden)分析数据，使用Langmuir 1∶1化学计量拟合算法。

[0266] 实施例3：与生长素释放肽结合的Spiegelmer基序的界定

[0267] 3.1SOT-D-000的截短

[0268] 3.1.2预先选定的Spiegelmer SOT-D-000的末端截短

[0269] 依专利申请案WO 2004/013274 A2号中所提出的内容，预先取得图3中所示的与生长素释放肽结合的Spiegelmer。在预测二级结构(最小自由能构象[Hofackeret al.，1994，Monatsh.Chem 125：167-188])时，所有Spiegelmer在5′-及3′-端间很可能有典型的分子内碱基配对(图4-7；图3中的有下划线的碱基)。Spiegelmer中出现这类结
构成分可能为正确折叠该活性三维结构所不可少的，但对经济节省的Spiegelmer的合成方法而言，该分子的长度应尽可能短。选择Spiegelmer SOT-D-000(不含引物结合位点的SOT-R04-DR14-F7的截短变体的别名)作为末端截短的基础，因其为所选择的具有形成最长末端螺旋的潜力的最短Spiegelmer。

[0270] 合成具有8个(SOT-D-108)、7个(SOT-D-100)及6个(SOT-D-104)个，而非10个碱基对的螺旋长度的SOT-D-000截短变体并依实施例2中的描述在细胞培养中测试(图
9)。SOT-D-104(39mer)明显丧失结合活性，而SOT-D-100(41mer)及SOT-D-108(43mer)则保持全部的生长素释放肽拮抗效能。变体SOT-D-106(SOT-D-104的另一截短体，其中G4已被移除)几乎无活性。令人惊讶地，此非匹配的G(其出现在所有选定的生长素释放肽Spiegelmer的螺旋中)可能不易去除。相反，其显示出对与生长素释放肽结合而言为必须的。

[0271] 3.1.2SOT-D-100及-108的内部缺失突变体

[0272] 当考虑图3中所选出的生长素释放肽结合子的比对时，所有比对分子中在直接与5′端的末端螺旋相邻处似乎均存有高可变区。为了在生长素释放肽结合子的进一步截短中利用此明显的变化性，使用最短的完全活性SOT-D变异体SOT-D-100及-108作为进一步截短的基础。在内部SOT-D-100变异体的情况中，可单纯将相应碱基删去，然而，在SOT-D-108变异体的情况中，其是在合成期间被一有弹性的亲水性间隔子所取代。然后，依实施例2的描述，在细胞培养中测试SOT-D-100及其衍生物SOT-D-101和-102，
以及SOT-D-108衍生物SOT-D-109、-110和-111(图9)。如图8中所呈现，删除二个，
但非三个内部核苷酸可能不丧失活性(SOT-D-101；-102)。相反地，当被间隔子取代时(SOT-D-109、-110、-111)，可删除3个核苷酸。间隔子的理想位置在SOT-D-109中实现(图
10)。

[0273] 以40kDa部分修饰SOT-D-109的5′端可能不会丧失与生长素释放肽结合的活性(图11)。

[0274] 3.2SOT-E的截短

[0275] 接着，与生长素释放肽结合的序列MS-P2-F1(其被选定作为前导序列)称为SOT-E(图1及图12)。

[0276] 在预测二级结构(最小自由能构象[Hofacker et al.，1994，Monatsh.Chem125：167-188])时，Spiegelmer SOT-E在C30及G50间很可能有典型的分子内碱基配对
(图12)。下列实验中描述将Spiegelmer SOT-E截短的实验。在细胞培养中测试所有
SpiegelmerSOT-E各经截短的变异体的活性(见实施例2)。

[0277] 3.2.1Spiegelmer SOT-E的末端截短

[0278] 3′端的六个核苷酸似乎不与分子的其它部分杂交。相反的，5′端的核苷酸可被部分配对。令人惊讶地，在不降低结合力的情况下，该3′端无法被截短(Spiegelmer SOT-E-012)，而SpiegelmerSOT-E-104(截去5′端的6个核苷酸)可保留完全的生长素释放肽拮抗活性(图13)。

[0279] 3.2.2Spiegelmer SOT-E的内部缺失突变体

[0280] 当考虑图1中所示的选定的生长素释放肽结合子MS-P2-E3、MS-P2-G2、MS-P2-D2、MS-P2-A3、MS-P2-E1、MS-P2-B1、MS-P2-C3、MS-P2-C2、MS-P2-H2、MS-P2-A4及SOT-E(序列家族I)的比对时，所有比对的分子末端处似乎均存在高可变区并直接与螺旋相邻(SOT-E中的G36-C43)。Spiegelmer SOT-E的二级结构预测显示出含4个核苷酸的环(A38-U41；图12)。为了在生长素释放肽结合子的进一步截短中利用此明显的可变性，首先，在合成期间以有弹性的亲水性间隔子取代Spiegelmer SOT-E的相应碱基。删去6个(U37-A42；
SOT-E-011)核苷酸，但非8个(G36-C43；SOT-E-008)核苷酸可能不会丧失活性。在5′端(G1-A6)截短及以有弹性的亲水性间隔子取代6个核苷酸(U37-A42)的组合可产生44-核
苷酸的Spiegelmer SOT-E-019(图14)，其在细胞培养中显示出与56-核苷酸Spiegelmer SOT-E(图12)相相同的IC50。

[0281] 3.2.3SOT-E-019内的序列片段的重排

[0282] 序列MS-P2-A2、MS-P2-H3、MS-P2-D1(图1)所代表的序列家族II与序列家族I(包括SOT-E)具有相似性。这些序列同源性在图1中以Box A(UAAGACCGAAGGUAACCAAUCCUAC)体现。在序列家族II中，Box A位于3′端，而在序列家族I中，Box A接近5′端。鉴于体外选择的该结果及Spiegelmer SOT-E的二级结构的预测，可设计其中Box A是位于5′端的SOT-E-019的变异体。为了达到此目的，将SOT-E-019的原始5′端及3′端以有弹性的亲水性间隔子连接并移除环，以产生新5′及3′端(变异体SOT-E-021；图15及21)。令人惊讶地，对于SOT-E-021未观察到活性丧失。基于SOT-E-019及SOT-E-021做进一步截短(SOT-E-33(图16及21)及SOT-E-25(图17及21))不可能不降低生长素释放肽的拮抗功能性(图13)。

[0283] 3.3SOT-C、SOT-D-109及SOT-E的比较

[0284] 通过表面等离子共振(实施例2)测量Spiegelmer SOT-E，与SOT-C相较下，可测得较优6倍的KD值(图18)。与D-109相较下，在细胞培养实验(实施例2)中，以Spiegelmer SOT-E可检测到相同的改良的结合(好5倍)(图19)。为了改良在动物体内的停留时间，以40kDa-PEG部分修饰Spiegelmer SOT-E-19的5′端(SOT-E19-5′-PEG)。在细胞培养
实验中，与SOT-E相较下，Spiegelmer SOT-E19-5′-PEG显示出类似的结果(图19)且另外显示出体内活性(实施例5；图22)。

[0285] 3.4与生长素释放肽结合的Spiegelmer基序的界定

[0286] 所有与生长素释放肽(尤其是此文所定义的具有辛酰基侧链的生长素释放肽)结合的分子主要的特征为存有具25个核苷酸的基序(″Box A″)，其对与生长素释放肽结合而言为必要的。″Box A″内的25个核苷酸中有些似乎可与其它碱基交换(图20A)。

[0287] 在与生长素释放肽结合的Spiegelmer内的″Box A″的功能性而言，″BoxA″3′端处的5个核苷酸(5′-CCUAC)与序列5′-GUGAGG的互补链杂交形成具有位于中
央的非配对鸟苷(Box B)的螺旋结构为其必须要素。删除Box B中此中央鸟苷导致明显丧失结合力(″由Box A界定的螺旋″，非配对G；图20A)。3′-邻接″Box A″，″由Box A界定的螺旋″应最少以一个，优选为二或多个额外、非限定的碱基对延长(″Box C1″及″Box C2″，图20A)。

[0288] 在″Box B″的3′端必须有另外的核苷酸供结合。至少需要另二个核苷酸(优选为5′-CA)供结合。经由在此位置加入另二个(理想上为4个)核苷酸(″Box D″，图20A)产生包含2、3、4、5或6个核苷酸的BoxD可显著改良结合。在″Box A″的5′端必须有另外的核苷酸供结合。至少需要另一个核苷酸(优选为U或G)供结合。经由在此
位置加入另二个核苷酸(″Box E″，图20A)产生包含1、2、3或4个核苷酸的Box E可显著改良结合。

[0289] 若Box D及E经由一有弹性的亲水性间隔子连接，该间隔子也可插在不同的位置中(见图8；SOT-D-109、SOT-D-110及SOT-D-111)。

[0290] 令人惊讶地，当″Box C1″及″Box C2″而不是Box D及E以有弹性的亲水性间隔子连接时，该限定的序列元件具功能性。

[0291] 变异体1：

[0292]

[0293] 变异体2：

[0294]

[0295] 本专利说明书、权利要求和/或附图中所揭示的本发明特性可分别地及以其任何组合作为用于实现本发明的多种不同形式的材料。

[0296] 实施例4：适体及Spiegelmer的化学合成法

[0297] 化学固相合成法

[0298] 小规模合成法

[0299] 以ABI 394合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，利用2′TBDMS RNA亚磷酰胺化学(M.J.Damha，K.K.Ogilvie，Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols foroligonucleotides and analogs，ed.S.Agrawal，p.81-114，HumanaPress Inc.1993)通过固相合成法制造适体。从ChemGenes(麻省Wilmington市)购买D-rA(N-Bz)-、D-rC(Ac)-、D-rG(N-ibu)-、D-rU-及六乙二醇亚磷酰胺。通过凝胶电泳法纯化适体。

[0300] 以ABI394合成仪(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)，利用2′TBDMS RNA亚磷酰胺化学(M.J.Damha，K.K.Ogilvie，Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols foroligonucleotides and analogs，ed.S.Agrawal，p.81-114，HumanaPress Inc.1993)通过固相合成法制造未经修饰(无聚乙二醇化)的Spiegelmer。从ChemGenes(麻省Wilmington市)购买L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-、L-rU-及六乙二醇亚磷酰胺。通过凝胶电泳法纯化适体。

[0301] 大规模合成法加修饰

[0302] 以 ktaPilot100 合 成 仪 (Amersham Biosciences；GeneralElectricHealthcare，Freiburg)，利用2′TBDMS RNA亚磷酰胺化学(M.J.Damha，K.K.Ogilvie，Methods in Molecular Biology，Vol.20 Protocols for oligonucleotides and analogs，ed.S.Agrawal，p.81-114，Humana Press Inc.1993)通过固相合成法制造经修饰的
Spiegelmer SOT-E-19。从ChemGenes(麻省Wilmington市)购买L-rA(N-Bz)-、L-rC(Ac)-、L-rG(N-ibu)-、L-rU-及六乙二醇亚磷酰胺。在经L-riboC修饰的孔径1000 的CPG(Link Technology，Glasgow，UK)上开始合成。关于偶联(每一循环15分钟)，使用在乙腈中的
0.3M苄基硫代四唑(CMS-Chemicals，Abinhfon，UK)及在乙腈中的3.5当量的相应0.1M亚磷酰胺溶液。通过与胺己基亚磷酰胺(ChemGenes)偶联来连接Spiegelmer的5′端的氨基。
使用氧化-加帽循环。从Biosolve(Valkenswaard，NL)购买另外的合成寡核苷酸的标准溶剂及试剂。以DMT-ON模式合成Spiegelmer；去保护后利用Source15RPC介质(Amersham)，经由制备性RP-HPLC纯化(Wincott Fet al 1995 NucleicAcids Res.23：2677)。以80％醋酸去除5′DMT-基团(在室温下30分钟)。接着，加入2M NaOAc水溶液并利用5K再生
的纤维素膜(Millipore，Bedford，MA)，通过切向流过滤将Spiegelmer脱盐。

[0303] 聚乙二醇化

[0304] 为了减少在体内的肾脏清除率，将Spiegelmer SOT-E-19与40kDa聚乙二醇(PEG)部分在5′端共价偶联。使用具这类增加的分子量的Spiegelmer可显著延长血浆中的保持时间，因此可延长效果。

[0305] 关于聚乙二醇化(见欧洲专利申请案EP 1 306 382)，将纯化的5′-氨基经修饰的Spiegelmer溶解在H2O(2.5毫升)、DMF(5毫升)及缓冲液A(5毫升，其是经由下述方法制备：将柠檬酸.H2O[7克]、硼酸[3.54克]、磷酸[2.26毫升]及1M NaOH[343毫升]混合，再加入H2O，使最终体积为1升；以1M HC1将pH调整为8.4)的混合物中。

[0306] 以1M NaOH将Spiegelmer溶液的pH调整为8.4。然后，在37℃下，将40kDaPEG-NHS酯(Nektar Therapeutics，Huntsville，AL)分成四份，每份0.6当量，每隔30分钟加入其中，直到达到75-85％的最大产量。加入PEG-NHS酯的期间，以1M NaOH将反应混合物的pH值保持在8-8.5。

[0307] 将反应混合物与4毫升脲溶液(8M)、4毫升缓冲液A及4毫升缓冲液B(在H2O中的0.1M醋酸三乙铵)混合，并在95℃加热15分钟。然后，以Source 15RPC介质(Amersham)，利用乙腈梯度(缓冲液B；缓冲液C：在乙腈中的0.1M醋酸三乙铵)将聚乙二醇化的
Spiegelmer通过RP-HPLC纯化。在5％缓冲液C中洗脱过量的PEG，在10-15％缓冲液C中
洗脱聚乙二醇化的Spiegelmer。将纯度＞95％(通过HPLC评估)的产物级分合并，并与
40毫升的3M NaOAc混合。通过切向流过滤将聚乙二醇化的Spiegelmer脱盐(5K再生的纤维素膜，Millipore，Bedford MA)。

[0308] 实 施 例 5：施 用 外 源 性 生 长 素 释 放 肽 后，抗 生 长 素 释 放肽-SpiegelmerSOT-E19-5′-PEG对生长激素释放的抑制作用

[0309] 已知施用大鼠外源性生长素释放肽后可触发生长激素(GH)释放。预先施用与生长素释放肽结合的Spiegelmer可遏制由生长素释放肽所引起的GH释放。

[0310] 让史普格道利(Sprague Dawley)大鼠适应其新环境7天。实验包含5组，其中各组包含5只动物：一组阳性对照及4组不同剂量的Spiegelmer SOT-E19-5′-PEG。在
实验期间，以氯胺酮(Ketamine)/甲苯噻嗪(Xylazine)将所有动物麻醉，并接受二次通过尾静脉的静脉内注射。第一次注射是在第二次注射前30分钟进行，并包含PBS(阳性对照组)及图22所指出的Spiegelmer SOT-E19-5′-PEG的剂量。第二次施用包含给予所有
动物3nmol大鼠生长素释放肽并将其记为实验的时间0。在第二次施用前先从眶窦抽出第一次血液样本。在给予大鼠生长素释放肽后的5、15、30及45分钟后采取另外的样本。以市售的酶促免疫分析系统，依照制造者的指示(Growth hormone，Rat，Biotrak Assay Kit，RPN2561，Amersham Biosciences Europe GmbH，Freiburg)，分析所产生的血浆样本中的生长激素浓度。

[0311] 如图22中所见，经由注射大鼠生长素释放肽可强烈刺激生长激素释放，但其可经由预先施用SOT-E19-5′-PEG受到抑制。在75nmolSOT-E19-5′-PEG/公斤体重时可取得最大抑制效果。进一步增加施用剂量至150nmol SOT-E19-5′-PEG/公斤体重时无法进一步遏制GH释放。结果证明了抗生长素释放肽Spiegelmer SOT-E19-5′-PEG的体内活性。

[0312] 实施例6：无内部连接体的SOT-E-19的衍生物

[0313] 如实施例3中所描述，抗生长素释放肽Spiegelmer SOT-E-19是由L-核苷酸及内部连接体所组成，内部连接体被并入原始分子SOT-E中以取代6个核苷酸。6个核苷酸中有4个形成Spiegelmer SOT-E中的环，剩余的2个核苷酸(来自该6个核苷酸)可彼此杂交
(SOT-E，见图23，第1排，杂交的核苷酸下方划线)。

[0314] 为了使得无内部连接体的SOT-E-19的衍生物尽可能短，以3个核苷酸的不同模块取代该连接体。以Spiegelmer的形式合成所有衍生物(实验方案见实施例4)，
并在细胞培养实验中分析之(实验方案见实施例2)。下列模块：ACA(SOT-E-19-L3)及
CAA(SOT-E-19-L4)显示出可成功取代SOT-E19的内部连接体但不会丧失结合及抑制效力(IC50)。SOT-E-19的不同衍生物显示于图23中。

[0315] 实施例7：通过与生长素释放肽结合的Spiegelmer区别辛酰基生长素释放肽及去辛酰基生长素释放肽

[0316] 根据实施例2中所描述的方法，在竞争分析中进一步分析Spiegelmer SOT-E19与生长素释放肽结合的特征。在这些分析中，在刺激细胞前，将Spiegelmer与不同组合的生长素释放肽肽类(辛酰基生长素释放肽与去辛酰基生长素释放肽)在刺激溶液中一起培育。

[0317] 肽组合的方案及以全长辛酰基生长素释放肽(人类生长素释放肽＝hu生长素释放肽)进行的实验的结果概述于图24中(条带从左至右编号)：在无任何辛酰基生长素释放肽(人类生长素释放肽＝hu生长素释放肽)或最终浓度为300nm的去辛酰基生长素释放肽时未检测到对细胞的刺激(第1及2条黑带)，而浓度13nM的辛酰基生长素释放肽(人类生长素释放肽＝hu生长素释放肽)则已足够介导钙的释放(第3条黑带)；进一步加入
300nM的去辛酰基生长素释放肽(第4条黑带)不会干扰细胞的刺激，这表示该生物上去活性的去辛酰基生长素释放肽不是受体拮抗剂。由3nM辛酰基生长素释放肽(人类生长素释放肽＝hu生长素释放肽)介导的钙的释放可被10倍过量的SOT-E19抑制(第5条黑带)，
即使存在超过辛酰基生长素释放肽(人类生长素释放肽＝hu生长素释放肽)100倍的去辛酰基生长素释放肽也不会竞争抑制(第6条黑带)。相反地，300nM辛酰基生长素释放肽及
30nM Spiegelmer的分析浓度显示出可增加钙的释放(第7条黑带)，证明在分析条件下可取得辛酰基生长素释放肽(人类生长素释放肽＝hu生长素释放肽)增强的刺激。此实验
证明SOT-E19可特异区分辛酰基型及去辛酰基型的生长素释放肽。

[0318] Spiegelmer NOX-B11与生长素释放肽的结合特征(与辛酰基生长素释放肽结合，但与去辛酰基生长素释放肽不结合或仅微弱地结合)类似于SOT-E19(先前依
WO2005/049828中的描述进行同样的实验)。

[0319] 由于二种分子具有高结构相关性(见实施例3)(其主要基于BoxA)，结果支持该基序A对根据本发明的核酸分子对于辛酰基化生长素释放肽(尤其是在包括该辛酰基基的N端处的5个氨基酸)的高特异性而言为必要的。

[0320] 实施例8：利用与生长素释放肽结合的Spiegelmer NOX-B11定量辛酰基生长素释放肽

[0321] 与生长素释放肽结合的Spiegelmer NOX-B11可用在与用来定量辛酰基化的人类及大鼠生长素释放肽的非放射活性的酶促免疫分析(EIA)类似的分析模式中。

[0322] 原理

[0323] 在此分析中，将标准物、对照组及未知的经处理的血浆在96-孔微量滴定板中培育，该96-孔微量滴定板已预先涂覆与生长素释放肽结合的Spiegelmer(如：Spiegelmer NOX-B11，其可识别辛酰基生长素释放肽的N端)。培育及清洗后，以抗生长素释放肽抗体(第1种抗体)或与生长素释放肽在生长素释放肽的C端结合的核酸处理滴定板的孔。此抗体或核酸可经标记或不标记，其中核酸优选经过标记。若(第1种)抗体为未经标记，则培育后，去除该(第1种)抗生长素释放肽抗体，清洗数次后加入第二种抗体(该抗体是针对第一种抗体的Fc-片段且经标记)。该第二种抗体的标记可为辣根过氧化酶(HRP)。将孔与第二种抗体培育后，去除未结合的部分，将孔与HRP底物四甲基联苯胺(TMB)一起培育。
然后，加入酸性终止溶液，并在450nm处通过吸收测量来测定底物的酶促转化程度。测得的吸收与样本中所存在的辛酰基生长素释放肽的浓度直接成正比。使用一组生长素释放肽标准来绘制吸收-生长素释放肽浓度标准曲线，由此可计算未知样本中的生长素释放肽。

[0324] 实验方案

[0325] 首先，以包含0.1％吐温(Tween)的PBS-Dulbecco(带有Mg2+及Ca2+，Biochrom AG，Berlin，Germany)清洗经链霉抗生物素涂覆的96-孔板(Reacti-Bind Streptavidin Coated High Bind Capacity Black96-well Plates，Perbio Science，Bonn，Germany)。将各孔与100微升50μM的生物素化的Spiegelmer NOX-B11(溶解在PBS中；SEQ ID72)在室温中培育1小时。将生物素化的Spiegelmer NOX-B11固定后，通过单次清洗步骤(100微升PBS)去除未结合的Spiegelmer。此说明于图26A中。

[0326] 在移除清洗缓冲液后，将带有确定浓度的辛酰基生长素释放肽的原液加入其中并在室温中培育1小时。移除上清液并清洗孔一次(100微升PBS)。此说明于图26B中。

[0327] 将抗生长素释放肽抗体(来自Phoenix Peptides，Belmont，CA，USA；1°ab)在封闭溶液(来自Phoenix Peptides，Belmont，CA，USA)中培育1小时，通过5个清洗步骤(各100微升PBS)去除未结合的抗体。此说明于图26C中。

[0328] 为了检测结合的抗生长素释放肽抗体，使用特异识别抗-生长素释放肽抗体(1°ab)的Fc-片段的第二种抗体(来自Phoenix Peptides，Belmont，CA，USA；
2°ab-HRP)，该第二种抗体以辣根过氧化酶修饰。通过5个清洗步骤(100微升PBS)去除
未结合的第二种抗体(2°ab-HRP)。此说明于图26D中。

[0329] 为了定量，加入100微升TBS底物(Amersham Biosciences，LittleChalfont，UK)，将板密封并在暗室中培育30分钟。然后，加入50微升终止溶液。在450nm处通过吸收测量来测定底物的酶促转化程度并记录吸收单位的差异。

[0330] 如图25中所示，使用一组生长素释放肽标准来绘制吸收-生长素释放肽浓度标准曲线。

[0331] 结果

[0332] 原则上，实验数据证明可使用Spiegelmer NOX-B11以浓度-依赖方式固定辛酰基生长素释放肽，因此，其具有作为EIA型检测分析中的试剂的潜力。

[0333] 本专利说明书中所揭示的本发明特性、权利要求和/或附图可分别及以其任何组合作为用来实现本发明的多种不同形式的材料。