非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺及其制备与应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基因载体材料，即非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺，及其制备与应用。PEI作为非病毒载体还存在细胞毒性大等缺点，目前使用生物相容性的亲水性聚合物如聚乙二醇修饰PEI虽降低毒性，但转染效率下降。本发明的目的在于提供一种基于PEI，细胞毒性小、转染效率高的基因载体。本发明提供一种聚氧乙烯硬脂酸酯修饰的聚乙烯亚胺，本发明还提供了它的制备与应用。修饰后的聚乙烯亚胺在体外显示出了更低的细胞毒性和更高的转染效率，克服了聚乙烯亚胺的缺点，为聚乙烯亚胺的广泛应用提供了可靠的技术保障。

权利要求

1.一种非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺，其特征在于非离子表面活性剂是聚氧乙烯-12-羟基硬脂酸酯Solutol，并通过以下方法制得：取0.550g聚氧乙烯-12-羟基硬脂酸酯Solutol在50℃下真空干燥24h，溶解在40ml甲苯和二氯甲烷体积比为3∶1的混合溶剂中，加入三光气0.149g，磁力搅拌过夜，使用旋转蒸发仪将有机溶剂在50℃下蒸干，剩余物重新溶解在30ml甲苯和二氯甲烷体积比为

2∶1的混合溶剂中，加入0.060g N-羟基琥珀酰亚胺，滴加入无水三乙胺0.071ml，反应4h后，反应液过滤除去不溶物，旋转蒸发除去有机溶剂，得到活化的聚氧乙烯-12-羟基硬脂酸酯Solutol；

取5份0.25g、0.01mmol、25kd的聚乙烯亚胺分别溶解在10ml的10％乙醇溶液中，在持续搅拌下分别加入0.01，0.02，0.05，0.1，和0.2mmol量的活化的聚氧乙烯-12-羟基硬脂酸酯Solutol，室温搅拌24h，反应液离心除去不溶物，过Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱除去未反应的原料，经冷冻干燥后得到。

2.一种如权利要求1所述的非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺作为基因载体材料的应用。

说明书

非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺及其制备与应用

技术领域：

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基因载体材料，即非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺，及其制备与应用。背景技术：

[0002] 基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。但是由于缺乏安全、有效的基因载体，限制了其临床应用。目前使用的基因载体一般分为病毒和非病毒载体，病毒载体转染效率较高但存在着运载能力低，有潜在的安全威胁等问题，所以非病毒载体逐渐引起了人们的重视。在众多非病毒载体中，聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)因其在体内外有较高的转染效率，并且无免疫源性、成本低、稳定性好等优点而备受人们的重视。PEI的转染效率与其分子量相关，其分子量大于22kd时才可获得满意的转染效果，然而随着PEI的分子量的增大，其细胞毒性随之增加，这就限制了它在临床的应用。为了克服PEI的缺点，一般使用生物相容性的亲水性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)修饰PEI(Kichler A，Chillon M，Leborgne C，Danos O，Frisch B.Intranasalgene delivery with a polyethylenimine-PEG conjugate.J Control Release，2002，81(3)：379-88)，以此提高PEI/DNA复合物的稳定性，降低它的毒性，由于PEI被亲水性聚合物修饰后与细胞的亲和力降低，使得基因无法进入细胞，转染效率下降。

[0003] 因此如何将PEI改造成细胞毒性小及转染效率高的基因载体材料，是解决PEI应用难题的突破口。发明内容：

[0004] 本发明的目的在于提供一种基于PEI，细胞毒性小、转染效率高的基因载体。

[0005] 本发明提供一种非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺，使用的非离子表面活性剂是聚氧乙烯硬脂酸酯(polyoxyethylene stearate)。聚乙烯亚胺和聚氧乙烯硬脂酸酯的摩尔比为1∶1-20，较佳的摩尔比为1∶1-5，最佳的摩尔比为1∶1和1∶2。

[0006] 聚氧乙烯硬脂酸酯包含PEG链和硬脂酸链，PEG链可以降低PEI的细胞毒性，而硬脂酸链可以增加PEI的亲脂性，提高PEI对细胞的亲和力，进而提高转染效率。

[0007] 本发明还提供了聚氧乙烯硬脂酸酯修饰的PEI的制备、修饰后的PEI的细胞毒性、修饰后的PEI/DNA复合物体外转染。

[0008] 一种非离子表面活性剂修饰的聚乙烯亚胺的制备方法：

[0009] (A)聚氧乙烯硬脂酸酯的活化

[0010] 将聚氧乙烯硬脂酸酯溶于甲苯和二氯甲烷的混合溶剂中，加入三光气，磁力搅拌过夜，将有机溶剂蒸干，残留物再用甲苯和二氯甲烷的混合溶剂溶解，加入N-羟基琥珀酰亚胺，在磁力搅拌下缓慢滴加无水三乙胺，反应3-8小时后，将溶液过滤，滤液蒸干后得到活化的聚氧乙烯硬脂酸酯；

[0011] 聚氧乙烯硬脂酸酯的活化方法还包括如文献Nguyen HK，Lemieux P，Vinogradov SV，Gebhart CL，Guérin N，Paradis G，Bronich TK，Alakhov VY，Kabanov AV.Evaluation of polyether-polyethyleneimine graft copolymers as genetransfer agents.Gene Ther，2000，7(2)：126-38；曹荣月，钱之玉，刘飞键，胡燕，刘景晶.重组L-门冬酰胺酶的聚乙二醇化学修饰及修饰后酶的稳定性研究.中国生化药物杂志，2004，25(3)：135-8记载的方法。

[0012] (B)活化后的聚氧乙烯硬脂酸酯修饰聚乙烯亚胺

[0013] 将聚乙烯亚胺溶解在5-30％的乙醇溶液中，在搅拌下加入活化后的聚氧乙烯硬脂酸酯，反应16-48小时，将反应液过葡聚糖凝胶柱，将未反应的聚乙烯亚胺去除，再经过超滤纯化，纯化后的反应液冷冻干燥得到经聚氧乙烯硬脂酸酯修饰的聚乙烯亚胺。

[0014] 本发明修饰后的PEI的细胞毒性实验：

[0015] 将PEI及修饰后的PEI以不同浓度梯度加入到Hela细胞的96孔板中，培养24小时后使用MTT法测定细胞毒性。结果是修饰后的PEI比未修饰的PEI显示出了较高的细胞活性。

[0016] 本发明修饰后的PEI/DNA复合物体外转染细胞实验：

[0017] Hela细胞消化后，均匀接种在24孔板上，加入培养液。培养24h，使细胞汇合度达到70％，转染前，换上无血清的培养液。将修饰后的PEI溶于超纯水中，加入到等体积的质粒DNA溶液中，在室温下孵育30分钟制成复合物。每孔加入100μl的复合物(含DNA2μg)，轻轻摇动24孔板使复合物铺匀，孵育5h后换含有10％血清的培养液，继续培养。36h后测定虫荧光素酶。结果是修饰后的PEI比未修饰的PEI显示出很强的转染效率。
附图说明：

[0018] 图1是修饰后的PEI与未修饰的PEI细胞毒性测定结果。

[0019] 图2是修饰后的PEI与未修饰的PEI体外转染实验测定结果。具体实施方式：

[0020] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但本发明的实施并不仅限于此。

[0021] 实施例1 PEI的修饰

[0022] 取0.550g聚氧乙烯硬脂酸酯(Solutol，德国巴斯夫公司)在50℃下真空干燥24h，溶解在40 ml甲苯和二氯甲烷的混合溶剂中(3∶1)，加入三光气0.149g，磁力搅拌过夜。使用旋转蒸发仪将有机溶剂在50℃下蒸干，剩余物重新溶解在30ml甲苯和二氯甲烷的混合溶剂中(2∶1)，加入0.060g N-羟基琥珀酰亚胺，滴加入无水三乙胺0.071ml。反应
4h后，反应液过滤除去不溶物，旋转蒸发除去有机溶剂，得到活化的聚氧乙烯硬脂酸酯。

[0023] 取5份PEI(0.25g，0.01mmol，25kd，sigma公司)分别溶解在10ml乙醇溶液中(10％)，在持续搅拌下分别加入0.01，0.02，0.05，0.1，和0.2mmol量的活化的聚氧乙烯硬脂酸酯，室温搅拌24h，反应液离心除去不溶物，过葡聚糖凝胶柱(Sephadex G-75)除去未反应的原料，经冷冻干燥后得到纯化的反应物，将不同修饰度的反应物分别 命 名 为 Solutol-1g-PEI，Solutol-2g-PEI，Solutol-5g-PEI，Solutol-10g-PEI 和Solutol-20g-PEI。

[0024] 实施例2修饰后的PEI的细胞毒性评价实验

[0025] 将Hela细胞接种在96孔板上，每孔约10,000个细胞，培养24小时后分别加入一系列浓度(2、4、6、8、16、24、32μg/ml)的PEI和修饰后的PEI(Solutol-g-PEI)，继续培养24h，MTT法测定细胞毒性。从图1中可以看出经修饰的PEI(Solutol-g-PEI)与未修饰的PEI相比，在各个浓度都显示出了较强的细胞活性。

[0026] 实施例3修饰后的PEI的体外基因转染实验

[0027] 将Hela细胞接种在24孔板上，每孔约10,000个细胞，培养24h。将PEI和经修饰的PEI(Solutol-g-PEI)与质粒pGL3(可表达虫荧光素酶，购自Promega公司)在不同N/P比(N/P＝10，20，30)下混合形成复合物，室温孵育30min，复合物分散在无血清的培养液中，加入到24孔板上，培养5h，替换含有血清的培养液继续培养48h，测定细胞内虫荧光素酶的表达。从图2中可以看到，在N/P＝20或30时各种修饰度的PEI都比未修饰的PEI显示出很强的转染效率，在N/P＝10时Solutol-1g-PEI和Solutol-2g-PEI显示了较强的转染效率。

[0028] 以上实验结果表明经聚氧乙烯硬脂酸酯修饰的PEI作为基因载体，毒性小，转染效率高，应用前景广泛。