本发明涉及一种交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)CGMCCN0.2155。该菌的生长温度范围为0-35℃，最适生长温度为25℃；生长pH范围为4-11，最适生长pH为8；生长NaCl浓度范围为0-11％，最适NaCl浓度为3％。本发明还公开了一种利用交替假单胞菌产低温纤维素酶的方法及按该方法得到的低温纤维素酶，该低温纤维素酶由于反应最适温度较低，不但在低温条件下可以高效反应，而且在生产工艺中可以通过较低温度的热处理使酶失活，节约能量与费用，在医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域具有广泛的应用前景。
1.一种交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)CGMCC N0.2155。
2.根据权利要求1所述交替假单胞菌Z6 CGMCC N0.2155，其特征在于，该菌株具有以下特征：
菌株为革兰氏阴性杆状细菌、有荚膜、无芽孢，大小约为1～1.8μm×0.5～0.8μm；
菌株在纤维素固体培养基25℃培养2d后，菌落直径3mm-4mm，圆形白色、湿润、边缘光滑、中间隆起、半透明、易挑取，能产生明显的纤维素透明圈；菌株能水解淀粉，不产生硫化氢，液化明胶，不产生色素，不能利用柠檬酸盐，吲哚试验、过氧化氢酶试验和V-P试验阳性，MR试验阴性，能利用乳糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、糖原、木糖和淀粉为碳源，不能利用蔗糖、纤维二糖、D-葡萄糖、甘油和乙酸钠，能利用硫酸铵、酪氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙酮酸钠和甲硫氨酸。
3.根据权利要求1所述交替假单胞菌Z6 CGMCC N0.2155，其特征在于，其生长特性为：
该菌的生长温度范围为0-35℃；生长pH范围为4-11；生长NaCl浓度范围为0-11％。
4.根据权利要求1所述交替假单胞菌Z6 CGMCC N0.2155，其特征在于，其生长特性为：
菌株的适合生长温度为25℃；适合生长pH为8；适合生长NaCl浓度为3％。
5.根据权利要求1所述交替假单胞菌Z6 CGMCC N0.2155，其特征在于，该菌株16S rRNA 序列如下：
tagctagtag cgatgagagt ttgatcctgg ctccggtcga aaaaggtagc cgaaggaaat 60ttgacccccg gaggacgggt gagtaatgct tgggaacatg ccttgaggtg ggggacaaca 120gttggaaacg actgctaata ccgcataatg tctacggacc aaagggggct tcggctctcg 180cctttagatt ggcccaagtg ggattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac 240gatccctagc tggtttgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccacact 300ccaacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc 360cgcgtgtgtg aagaaggcct tcgggttgta aagcactttc agtcaggagg aaaggttagt 420agttaatacc tgctagctgt gacgttactg acagaagaag caccggctaa ctccgtgcca 480gcagccgcgg taatacggag ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtac 540gcaggcggtt tgttaagcga gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ctgcatttcg 600aactggcaaa ctagagtgtg atagagggtg gtagaatttc aggtgtagcg gtgaaatgcg 660tagagatctg aaggaatacc gatggcgaag gcagccacct gggtcaacac tgacgctcat 720gtacgaaagc gtggggagca aacgggatta gataccccgg tagtccacgc cgtaaacgat 780gtctactaga agctcggagc ctcggttctg tttttcaaag ctaacgcatt aagtagaccg 840cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctacact tgacatacag 960agaacttacc agagatggtt tggtgccttc gggaactctg atacaggtgc tgcatggctg 1020tcgtcagctc gtgttgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctatcct 1080tagttgctag caggtaatgc tgagaactct aaggagactg ccggtgataa accggaggaa 1140ggtggggacg acgtcaagtc atcatggccc ttacgtgtag ggctacacac gtgctacaat 1200ggcgcataca gagtgctgcg aactcgcgag agtaagcgaa tcacttaaag tgcgtcgtag 1260tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgtatca 1320gaatgacgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacactcc tcccttccca gttggggcca 1380aggttgcccc tgaagttttt tcctggccca ggtcgtaaca aggagccggg agagtagca 1439
6.一种如权利要求1-5中任何一项所述的交替假单胞菌Z6 CGMCCN0.2155产低温纤维素酶的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)将种子液按2％接种量接入发酵培养基中，180r/min，20℃，培养24h；
(2)将培养好的发酵液10000r/min，离心10min，取上清液，加入65％硫酸铵，静置2h后，10000r/min离心25min，用适量25mM，pH为8.0的Tris-HCL缓冲液溶解沉淀，然后4℃透析12h，再经过DEAE-sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200方法得到低温纤维素酶。
海洋低温纤维素酶与产酶方法及其产生菌交替假单胞菌
技术领域
[0001] 本发明涉及一种微生物，特别是一种分离自连云港海域的交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)CGMCC N0.2155(已于2007年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.2155)；本发明还涉及该菌株产低温纤维素酶的方法及其产品。
背景技术
[0002] 纤维素酶(EC 3.2.1)是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。普通纤维素酶的最适作用温度多为45～65℃。低温纤维素酶最适作用温度可低至20℃。由于反应温度较低，不但在低温条件下可以高效反应，而且在生产工艺中可以通过较低温度的热处理使酶失活，节约能量与费用，成为人们研究开发的热点。
[0003] 在过去的半个多世纪里，人们主要从寒带和冰川等不同环境的陆地开发和获得低温纤维素酶。但是，随着研究的不断深入，从陆地生物开发低温纤维素酶的机会大大减小，满足不了人们的需要。因此，科学工作者们将眼光投向占地球表面积3/4的资源丰富的海洋。海洋环境十分独特，并包罗了低温环境，分布着数量极其庞大、种类繁多的低温微生物，有利于获得新的低温纤维素酶及其产生菌。新型海洋低温酶研究不但为生物起源及进化、微生物的分类、酶催化机制等基础研究提供新的依据，而且推动酶在工业中的广泛应用。
[0004] 目前，已报道的交替假单胞菌产生的适冷纤维素酶的最适温度分别为40℃和35℃。其它筛选获得的海洋嗜冷菌所产低温纤维素酶最适温度为40℃。菌株Z6所产纤维素酶最适作用温度更低，在常温下催化活性高，更适于工业生产。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的能产低温纤维素酶的交替假单胞菌。
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题是研究交替假单胞菌菌株的生长特性，及其产低温纤维素酶的方法及产品。
[0007] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。
[0008] 本发明的特征包括交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)菌株本身，以及利用该菌株产低温纤维素酶的方法，以及利用该菌株所产的低温纤维素酶产品。
[0009] 本发明所涉及的菌株是在中国黄海连云港海域的海水中分离到的交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)，该交替假单胞菌Z6于2007年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.2155。
[0010] 一、本发明菌株的形态特征与生理生化特征
[0011] 1.1形态特征：
[0012] 菌株为革兰氏阴性杆状细菌、有荚膜、无芽孢，大小约为1～1.8μm×0.5～0.8μm(图1、图2)。菌株在纤维素固体培养基25℃培养2d后，菌落直径3mm-4mm，圆形白色、湿润、边缘光滑、中间隆起、半透明、易挑取，能产生明显的纤维素透明圈(图3)。
[0013] 1.2菌株的生理生化特征
[0014] 菌株Z6的生理生化特征见表1，菌株Z6能水解淀粉，不产生硫化氢，液化明胶，不产生色素，不能利用柠檬酸盐，吲哚试验、触酶试验和V-P试验阳性，MR试验阴性，能利用乳糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、糖原、木糖和淀粉为碳源，不能利用蔗糖、纤维二糖、D-葡萄糖、甘油和乙酸钠，能利用硫酸铵和酪氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙酮酸钠、甲硫氨酸。通过Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(second edition)分析比较，初步判定该菌株为Pseudoalteromonas属。
[0015] 表1菌株Z6的生理生化特征
[0016]
[0017] 注：“+”：阳性结果；“-”：阴性结果
[0018] 1.3菌株Z6的分子生物学鉴定
[0019] PCR扩增和序列分析：采用Takara试剂盒提出高纯度细菌的基因组DNA。正向引物P1：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物P2：5′-CGGCTACCTTGTTACGAC-3′。反应体系50μl，Taq酶2U。反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸7min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成，所测序列提交GenBank进行同源性比较，采用邻接法构建出进化树(图4)，进化树表明菌株Z6与Pseudoalteromonascarrageenovora(AM69100800)亲缘关系最近，同源性在99％以上。该菌株16S rRNA序列见说明书最后部分。
[0020] 二、本发明菌株的生长特性
[0021] 本发明提供的交替假单胞菌Z6，对其生长特性进行了细致的研究，基本摸清不同条件下该菌的生长情况。
[0022] 2.1关于本发明中的培养基
[0023] 2216E培养基(g/L)：蛋白胨5，酵母粉1，海水配制，pH 7.2；
[0024] 纤维素固体培养基(g/L)：羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)10，蛋白胨10，酵母膏5，KH2PO41，琼脂20，陈海水配制，pH 8.0。
[0025] 发酵培养基(g/L)：羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)10，蛋白胨10，酵母膏5，KH2PO41，陈海水配制，pH 8.0。
[0026] 微量矿物盐(每升)：CuSO4·5H2O，0.01g；ZnSO4·7H2O，0.1g；CoCl2·6H2O，0.005g；MnCl2·4H2O，0.2g；Na2MoO4·2H2O，0.1g；KBr，0.05g；KI，0.05g；H3BO3，0.1g；NaF，0.05g；
LiCl，0.05g；Al2(SO4)3，0.05g；NiCl2·6H2O，0.01g；VoSO4·2H2O，0.005g；H2WO4·2H2O，
0.002g；Na2SeO4，0.005g；SrCl·6H2O，0.005g；BaCl2，0.005g.
[0027] 2.2种子液的制备：将保藏在2216E培养基的斜面菌株接种到发酵培养基中，转速180r/min，装液量20％，25℃培养16h。
[0028] 2.3温度对生长的影响：种子液2％接种于发酵培养基，pH自然，转速180r/min，装液量20％，分别在不同温度下培养，测定细胞浓度。结果见图5，菌的生长温度范围为0-35℃，最适生长温度为25℃。
[0029] 2.4pH对生长的影响：在发酵培养基中加入终浓度为10mmol/L的磷酸∶醋酸∶硼酸(1∶1∶1)作为缓冲液，使发酵培养基的pH分别为3.0-11.0之间，在25℃培养24小时，其他条件同2.2，测定细胞浓度。结果见图6，生长pH范围为4-11，最适生长pH为8。
[0030] 2.5NaCl对生长的影响：在发酵培养基(将用海水配制改用微量矿物盐溶液代替，每升培养基加入10ml)中加入NaCl，使之为0％到15％的NaCl，在25℃培养24小时，其他条件同2.2，测定细胞浓度。结果见图7，生长的NaCl浓度范围为0-11％，最适NaCl浓度为3％。
[0031] 2.6细胞浓度的测定：选择在600nm波长下测定吸光值。
[0032] 三、菌株产低温纤维素酶的方法
[0033] 将种子液按2％接种量接入发酵培养基中，180r/min，20℃，培养24h；将培养好的发酵液10000r/min，离心10min，取上清液，加入65％硫酸铵，静置2h后，10000r/min离心25min，用适量25mM，pH为8.0的Tris-HCL缓冲液溶解沉淀，然后4℃透析12h，再经过DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200方法得到低温纤维素酶。
[0034] 四、低温纤维素酶的性质
[0035] 4.1酶作用温度对酶活性的影响：将粗酶液分别在4℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃条件下测定方法酶活，结果见图8，纤维素酶的最适作用温度为30℃，在
4℃仍有22％的残余酶活，20℃仍有80％的残余酶活，是一种低温纤维素酶。
[0036] 4.2酶的热稳定性：粗酶液在4℃、25℃、30℃、50℃条件下分别保温0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h后，在30℃测定剩余酶活力。该酶在4℃时稳定性最好，随着温度升高，稳定性下降，25℃的半衰期为1.5h，30℃的半衰期为1h。(见图9)。
[0037] 4.3酶作用pH对酶活性的影响：配制不同的pH缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4(pH6-8)、Tris-HCl(pH8-9)、Gly-NaOH(pH9-11)。在不同pH条件下测定酶活力。纤维素酶的最适作用pH为8～9，该酶在pH10仍有68％的残余酶活，该酶在pH11仍有41％的残余酶活，是碱性的低温纤维素酶(见图10)。
[0038] 4.4酶pH稳定性：将酶在30℃不同pH下保温1h后在最适作用温度下测定剩余酶活力，该酶在pH7～10时稳定性较好，具有耐碱性能。(见图11)。
[0039] 5、纤维素酶活测定。
[0040] 5.1纤维素酶活测定方法：纤维素酶活性采用CMC为底物测定。
[0041] 5.2酶活力单位定义：在30℃、pH8.0的条件下每分钟水解纤维素产生1μg葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
[0042] 五、低温纤维素酶产品的应用。
[0043] 本发明所述的低温纤维素酶可用于洗涤、医药、食品、棉纺、环保及可再生资源利用等领域。
附图说明
[0044] 图1为菌株革兰氏染色的光学显微镜镜检图。
[0045] 图2为菌株的荚膜染色的光学显微镜镜检图。
[0046] 图3为菌株在纤维素固体培养基上的透明圈图。
[0047] 图4为菌株16S rRNA进化树分析图。
[0048] 图5为培养温度对菌株生长的影响图，10℃(◆)，15℃(■)，20℃(▲)，25℃(◇)，30℃(口)，35℃(△)。
[0049] 图6为pH对菌株生长的影响图。
[0050] 图7为NaCl对菌株生长的影响图。
[0051] 图8为温度对纤维素酶活力的影响图。
[0052] 图9为温度对纤维素酶稳定性的影响图，4℃(◆)，25℃(■)，30℃(▲)，50℃(●)。
[0053] 图10为pH对纤维素酶活力的影响图，pH6.0-8.0(◆)，pH8.0-9.0(■)，pH9.0-11.0(▲)。
[0054] 图11为pH对纤维素酶稳定性的影响图，pH6.0-8.0(◆)，pH8.0-9.0(■))，pH9.0-11.0(▲)。
[0055] 本发明涉及的交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)已于2007年9月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.2155。
具体实施方式
[0056] 实施例1。一种交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)CGMCCN0.2155。该菌株具有以下特征：菌株为革兰氏阴性杆状细菌、有荚膜、无芽孢，大小约为1～
1.8μm×0.5～0.8μm；菌株在纤维素固体培养基25℃培养2d后，菌落直径3mm-4mm，圆形白色、湿润、边缘光滑、中间隆起、半透明、易挑取，能产生明显的纤维素透明圈；菌株能水解淀粉，不产生硫化氢，液化明胶，不产生色素，不能利用柠檬酸盐，吲哚试验、过氧化氢酶试验和V-P试验阳性，MR试验阴性，能利用乳糖、麦芽糖、果糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、糖原、木糖和淀粉为碳源，不能利用蔗糖、纤维二糖、D-葡萄糖、甘油和乙酸钠，能利用硫酸铵、酪氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙酮酸钠和甲硫氨酸。
[0057] 实施例2。实施例1所述的一种交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)CGMCC N0.2155。其生长特性为：该菌的生长温度范围为0-35℃；生长pH范围为4-11；生长NaCl浓度范围为0-11％。
[0058] 实施例3。实施例1所述的一种交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)CGMCC N0.2155。其生长特性为：菌株的适合生长温度为25℃；适合生长pH为8；适合生长NaCl浓度为3％。
[0059] 实施例4。一种实施例1或2或3任何一项所述的交替假单胞菌Z6CGMCC N0.2155产低温纤维素酶的方法，其步骤如下：
[0060] (1)将种子液按2％接种量接入发酵培养基中，180r/min，20℃，培养24h；
[0061] (2)将培养好的发酵液10000r/min，离心10min，取上清液，加入65％硫酸铵，静置2h后，10000r/min离心25min，用适量25mM，pH为8.0的Tris-HCL缓冲液溶解沉淀，然后
4℃透析12h，再经过DEAE-sepharose Flat Flow和Sephacryl S-200方法得到低温纤维素酶。
[0062] 实施例5。一种实施例4所述的方法所产低温纤维素酶，该低温纤维素酶具有以下特征：
[0063] (1)纤维素酶的适合作用温度为30℃，在4℃有22％的残余酶活，20℃有80％的残余酶活，是一种低温纤维素酶；该酶在4℃时稳定，随着温度升高，稳定性下降，25℃的半衰期为1.5h，30℃的半衰期为1h；
[0064] (2)纤维素酶的适合作用pH为8～9，该酶在pH 10有68％的残余酶活，该酶在pH11有41％的残余酶活，是碱性的低温纤维素酶；该酶在pH7～10时稳定，具有耐碱性能。
[0065] <110>淮海工学院
[0066] <120>海洋低温纤维素酶与产酶方法及其产生菌交替假单胞菌
[0067] <160>1
[0068] <210>1
[0069] <211>1439
[0070] <212>RNA
[0071] <213>交替假单胞菌Z6(Pseudoalteromonas sp.Z6)
[0072] <400>1
[0073] tagctagtag cgatgagagt ttgatcctgg ctccggtcga aaaaggtagc cgaaggaaat 60[0074] ttgacccccg gaggacgggt gagtaatgct tgggaacatg ccttgaggtg ggggacaaca 120[0075] gttggaaacg actgctaata ccgcataatg tctacggacc aaagggggct tcggctctcg 180[0076] cctttagatt ggcccaagtg ggattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac 240[0077] gatccctagc tggtttgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccacact 300[0078] ccaacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagccatgc 360[0079] cgcgtgtgtg aagaaggcct tcgggttgta aagcactttc agtcaggagg aaaggttagt 420[0080] agttaatacc tgctagctgt gacgttactg acagaagaag caccggctaa ctccgtgcca 480[0081] gcagccgcgg taatacggag ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagcgtac 540[0082] gcaggcggtt tgttaagcga gatgtgaaag ccccgggctc aacctgggaa ctgcatttcg 600[0083] aactggcaaa ctagagtgtg atagagggtg gtagaatttc aggtgtagcg gtgaaatgcg 660[0084] tagagatctg aaggaatacc gatggcgaag gcagccacct gggtcaacac tgacgctcat 720[0085] gtacgaaagc gtggggagca aacgggatta gataccccgg tagtccacgc cgtaaacgat 780[0086] gtctactaga agctcggagc ctcggttctg tttttcaaag ctaacgcatt aagtagaccg 840[0087] cctggggagt acggccgcaa ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900[0088] gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct tacctacact tgacatacag 960[0089] agaacttacc agagatggtt tggtgccttc gggaactctg atacaggtgc tgcatggctg 1020[0090] tcgtcagctc gtgttgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccctatcct 1080[0091] tagttgctag caggtaatgc tgagaactct aaggagactg ccggtgataa accggaggaa 1140[0092] ggtggggacg acgtcaagtc atcatggccc ttacgtgtag ggctacacac gtgctacaat 1200[0093] ggcgcataca gagtgctgcg aactcgcgag agtaagcgaa tcacttaaag tgcgtcgtag 1260[0094] tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgtatca 1320[0095] gaatgacgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacactcc tcccttccca gttggggcca 1380[0096] aggttgcccc tgaagttttt tcctggccca ggtcgtaaca aggagccggg agagtagca 1439
