水合淫羊藿素的制备方法转让专利
申请号 : CN200710179673.8
文献号 : CN101200743B
文献日 : 2010-12-15
发明人 : 李靖 , 孟坤
申请人 : 北京珅奥基医药科技有限公司
摘要 :
本发明涉及“水合淫羊藿素的制备方法”，属于天然化合物的合成领域。一种水合淫羊藿素的制备方法，其特征在于：包括由淫羊藿苷经盐酸和纤维素酶两步水解反应得到。其去糖水解完全，并可改变淫羊藿苷元的化学结构，使其成为水合淫羊藿素，且收率较高。反应后处理方便，产物纯度完全符合药用标准。
权利要求 :
1.一种水合淫羊藿素的制备方法，其特征在于：包括由淫羊藿苷经盐酸和纤维素酶两步水解反应得到，所述盐酸水解反应中，盐酸浓度为3N-5N，反应物比例为每1g淫羊藿苷与20-100mL盐酸液反应，反应温度为50-100℃，反应时间为0.5-2小时；所述纤维素酶水解反应中，反应条件为40-50℃，pH为4.8-5.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中将盐酸水解反应产物用纤维素酶水解24-36小时，所述纤维素酶综合酶活力≥1.8万u/mL。
2.根据权利要求1所述的制备方法，所述水解反应步骤的顺序是淫羊藿苷经盐酸水解后再用纤维素酶水解。
3.根据权利要求1所述的制备方法，所述盐酸浓度为3N，反应物比例为每1g淫羊藿苷与50mL盐酸液反应，反应温度为80℃，加热时间为1小时。
4.根据权利要求1所述的制备方法，所述反应条件为40℃，pH为5.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中将盐酸水解反应产物用纤维素酶水解36小时。
5.根据权利要求1所述的制备方法，还包括水合淫羊藿素的纯化，所述纯化包括用溶剂从水解反应混合物中萃取、采用大孔吸附树脂去除杂质和甲醇-水溶液重结晶三个步骤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，所述溶剂为乙酸乙酯。
7.根据权利要求5所述的制备方法，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，水合淫羊藿素的洗脱采用50％，60％，70％乙醇-水溶液依次洗脱。
8.根据权利要求5所述的制备方法，所述甲醇-水溶液含甲醇95-98％(V/V)。
说明书 :
技术领域
本发明涉及天然化合物的合成，特别是涉及一种中药淫羊藿中的成分水合淫羊藿素的制备方法。
背景技术
淫羊藿是常用的中药材，是小檗科(Berberridaceae)淫羊藿属(Epimedium genus)多种植物的地上干燥部分，中华人民共和国药典(2000版)收录了如下五种淫羊藿药材，即淫羊藿(Epimedium brevicomum Maxim))、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanenes)、朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)等。淫羊藿具有补肾壮阳、强筋健骨、祛风除湿之功效，常用于治疗阳痿不举、小便淋漓、腰膝无力以及冠心病、慢性支气管炎、神经衰弱和小儿麻痹等症。现代药理研究证明，淫羊藿含有特殊的化学成分和显著的生物活性。
水合淫羊藿素，化学名：3，5，7-三羟基-4’-甲氧基-8-(3-甲基-3-羟基)-丁基-黄酮。化学结构(I)所示。
天然水合淫羊藿素有两种来源，一种是游离的水合淫羊藿素，早期有报道可从朝鲜淫羊藿中分离得到；另一种是来源于与糖结合的甙，经水解可得。但因其在植物中含量很低，故无法进行工业化制备(Chemical and pharmacological investigations of Epimediumspecies：a survey，Prog.Drug Res.2003；60，1-57。淫羊藿的研究新进展，中国药学杂志，1997，32，449-451)。
水合淫羊藿素，化学名：3，5，7-三羟基-4’-甲氧基-8-(3-甲基-3-羟基)-丁基-黄酮。化学结构(I)所示。
天然水合淫羊藿素有两种来源，一种是游离的水合淫羊藿素，早期有报道可从朝鲜淫羊藿中分离得到；另一种是来源于与糖结合的甙，经水解可得。但因其在植物中含量很低，故无法进行工业化制备(Chemical and pharmacological investigations of Epimediumspecies：a survey，Prog.Drug Res.2003；60，1-57。淫羊藿的研究新进展，中国药学杂志，1997，32，449-451)。
发明内容
淫羊藿苷，化学命名为：3，5，7-三羟基-4′甲氧基-8-异戊烯基黄酮-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其结构式如(II)所示
因天然存在的淫羊藿苷在植物中含量丰富，故本发明提供一种从淫羊藿苷制备水合淫羊藿素的方法，反应收率较高，整个工艺过程操作简便，反应后处理方便，纯化简单。
一种水合淫羊藿素的制备方法，其特征在于：包括由淫羊藿苷经盐酸和纤维素酶两步水解反应得到。
上述水解反应步骤是淫羊藿苷经盐酸水解后再用纤维素酶水解。
所述盐酸水解反应中，盐酸浓度为1N-5N，反应物比例为每1g淫羊藿苷与20-100mL盐酸液反应，反应温度为50-100℃，反应时间为0.5-2小时。
优选盐酸浓度为3N，比例为每1g淫羊藿苷与50mL盐酸液反应，反应温度为80℃，加热时间为1小时。
所述纤维素酶水解反应中，反应条件为40-50℃，pH为4.8-5.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中将上述盐酸反应产物用纤维素酶水解24-36小时，所述纤维素酶综合酶活力≥1.8万u/mL。
优选反应条件为40℃，pH为5.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中将上述盐酸反应产物用纤维素酶水解36小时。
一种水合淫羊藿素的制备方法，还包括水合淫羊藿素的纯化，所述纯化包括用溶剂从水解反应混合物中萃取、采用大孔吸附树脂去除杂质和甲醇-水溶液重结晶三个步骤。
所述溶剂为乙酸乙酯。
所述大孔吸附树脂上水合淫羊藿素的吸脱采用50％，60％，70％乙醇-水溶液依次洗脱。
所述甲醇-水溶液含甲醇95-98％(V/V)。
从淫羊藿苷到水合淫羊藿素，关键是不仅要将淫羊藿苷的3-，7-上的糖取代基水解掉，而且要在淫羊藿苷的8-异戊烯基上加合一分子水，使其生成水合淫羊藿素。发明人作了长期的研究和探索，发现纤维素酶能水解7-葡萄糖取代基，但只水解少量的3-鼠李糖取代基。盐酸溶液能完全水解3-鼠李糖取代基，但部分水解7-葡萄糖取代基，同时盐酸的水解反应能在双键上与一分子水形成加合反应。在不同浓度的盐酸溶液中，不同的反应温度下，以及不同的盐酸和纤维素酶水解顺序中，其生成的水合淫羊藿素的得率是不同的。本发明优选第一步用3N盐酸与淫羊藿苷反应，第二步用纤维素酶水解，可得到比其他已尝试的其他方法更高的水合淫羊藿素得率。
本发明制备的水合淫羊藿素的纯化在酶解反应后直接用乙酸乙酯从反应液中萃取出水合淫羊藿素。乙酸乙酯层经过滤可除去不溶杂质，作为第一次纯化，并可用于下一步的纯化处理。
下步纯化步骤包括：将上述含有反应产物的乙酸乙酯层用大孔吸附树脂拌样，回收乙酸乙酯，反应产物吸附于树脂上，拌样后的树脂加于大孔吸附树脂柱上，用50％，60％，70％乙醇溶液依次洗脱，收集含有水合淫羊藿素的馏分，浓缩回收乙醇至小体积，即有水合淫羊藿素沉淀析出。析出的水合淫羊藿素用95-98％甲醇反复多次溶解，过滤，浓缩，析出，可得到99％以上的纯度，并使水合淫羊藿素呈针状结晶。
本发明采用盐酸和纤维素酶对水合淫羊藿苷进行反应，其去糖水解完全，并可改变淫羊藿苷元的化学结构，使其成为水合淫羊藿素，且收率较高。反应后处理方便，产物纯度完全符合药用标准。
因天然存在的淫羊藿苷在植物中含量丰富，故本发明提供一种从淫羊藿苷制备水合淫羊藿素的方法，反应收率较高，整个工艺过程操作简便，反应后处理方便，纯化简单。
一种水合淫羊藿素的制备方法，其特征在于：包括由淫羊藿苷经盐酸和纤维素酶两步水解反应得到。
上述水解反应步骤是淫羊藿苷经盐酸水解后再用纤维素酶水解。
所述盐酸水解反应中，盐酸浓度为1N-5N，反应物比例为每1g淫羊藿苷与20-100mL盐酸液反应，反应温度为50-100℃，反应时间为0.5-2小时。
优选盐酸浓度为3N，比例为每1g淫羊藿苷与50mL盐酸液反应，反应温度为80℃，加热时间为1小时。
所述纤维素酶水解反应中，反应条件为40-50℃，pH为4.8-5.5的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中将上述盐酸反应产物用纤维素酶水解24-36小时，所述纤维素酶综合酶活力≥1.8万u/mL。
优选反应条件为40℃，pH为5.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中将上述盐酸反应产物用纤维素酶水解36小时。
一种水合淫羊藿素的制备方法，还包括水合淫羊藿素的纯化，所述纯化包括用溶剂从水解反应混合物中萃取、采用大孔吸附树脂去除杂质和甲醇-水溶液重结晶三个步骤。
所述溶剂为乙酸乙酯。
所述大孔吸附树脂上水合淫羊藿素的吸脱采用50％，60％，70％乙醇-水溶液依次洗脱。
所述甲醇-水溶液含甲醇95-98％(V/V)。
从淫羊藿苷到水合淫羊藿素，关键是不仅要将淫羊藿苷的3-，7-上的糖取代基水解掉，而且要在淫羊藿苷的8-异戊烯基上加合一分子水，使其生成水合淫羊藿素。发明人作了长期的研究和探索，发现纤维素酶能水解7-葡萄糖取代基，但只水解少量的3-鼠李糖取代基。盐酸溶液能完全水解3-鼠李糖取代基，但部分水解7-葡萄糖取代基，同时盐酸的水解反应能在双键上与一分子水形成加合反应。在不同浓度的盐酸溶液中，不同的反应温度下，以及不同的盐酸和纤维素酶水解顺序中，其生成的水合淫羊藿素的得率是不同的。本发明优选第一步用3N盐酸与淫羊藿苷反应，第二步用纤维素酶水解，可得到比其他已尝试的其他方法更高的水合淫羊藿素得率。
本发明制备的水合淫羊藿素的纯化在酶解反应后直接用乙酸乙酯从反应液中萃取出水合淫羊藿素。乙酸乙酯层经过滤可除去不溶杂质，作为第一次纯化，并可用于下一步的纯化处理。
下步纯化步骤包括：将上述含有反应产物的乙酸乙酯层用大孔吸附树脂拌样，回收乙酸乙酯，反应产物吸附于树脂上，拌样后的树脂加于大孔吸附树脂柱上，用50％，60％，70％乙醇溶液依次洗脱，收集含有水合淫羊藿素的馏分，浓缩回收乙醇至小体积，即有水合淫羊藿素沉淀析出。析出的水合淫羊藿素用95-98％甲醇反复多次溶解，过滤，浓缩，析出，可得到99％以上的纯度，并使水合淫羊藿素呈针状结晶。
本发明采用盐酸和纤维素酶对水合淫羊藿苷进行反应，其去糖水解完全，并可改变淫羊藿苷元的化学结构，使其成为水合淫羊藿素，且收率较高。反应后处理方便，产物纯度完全符合药用标准。
附图说明
图1 实施例1制得的水合淫羊藿素HPLC图谱
图2 实施例1制得的水合淫羊藿素X散射图谱
图2 实施例1制得的水合淫羊藿素X散射图谱
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
1.1淫羊藿苷与盐酸溶液的反应：
取淫羊藿苷5g(含量90％以上)，加入至250mL 3N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按3∶7的体积比配制)，搅拌，逐步升温至80℃，并维持1小时。反应结束后，冷却，放置，使沉淀完全。过滤，沉淀物用水洗涤数次至中性(如无法洗至中性，可用少量NaOH溶液中和酸性)。滤液弃去或留至下次反应用。
1.2盐酸反应产物与纤维素酶的反应
将上述的盐酸反应产物加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH5.0，50uM)的缓冲液中，再加入纤维素酶(综合酶活力≥1.8万u/mL)约5mL，于40℃搅拌36小时。反应结束后，冷却，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，过滤，除去不溶性杂质。
1.3反应液的后处理：
上述乙酸乙酯溶液中加入约50g DM130树脂拌样，回收乙酸乙酯至干。拌样后的树脂加于200g大孔吸附树脂柱上，用50％，60％，70％乙醇溶液依次洗脱，收集含有水合淫羊藿素的馏分，浓缩回收乙醇至小体积，既有水合淫羊藿素沉淀析出。过滤，得水合淫羊藿素粗品约2g，得率约为40％。
1.4水合淫羊藿素纯品制备：
收集到的水合淫羊藿素粗品，用95-98％甲醇600mL加热溶解，过滤除去杂质，浓缩至约150mL，有结晶析出。如此反复用甲醇结晶约6-10次，并用高效液相监测纯度，直至达到药用标准。可得水合淫羊藿素纯品约1.5g。高效液相流动相为乙腈和0.3％磷酸水溶液，比例为52∶48，色谱柱为C18，200×4.6mm，5um。水合淫羊藿素保留时间约为18min。见图1。
1.5结构确证及理化参数：
1.5.1水合淫羊藿素，甲醇-水重结晶，得黄色针状晶体，熔点为238-9℃。
1.5.2 NMR数据
NMR仪器：Brucker AM-400 NMR Spectrometer.
溶剂：DMSO
测试项目：1H，13C，DEPT-135。
测式结果：：1H-NMR：1.18(6H，s)；1.55(2H，m)；2.50(2H，m)；3.85(3H，s)；4.31(1H，s)；6.28(1H，s)；7.09(2H，d，J＝9Hz)；8.23(2H，d，J＝9Hz)；9.50(1H，s)；10.61(1H，s)；12.33(1H，s)。13C-NMR：18.09；29.81；43.58；56.03；69.53；98.46；103.72；107.52；114.64；124.31；129.94；136.55；146.62；154.13；158.75；161.13；162.02；176.95。
1.5.3 Mass数据
MS仪器：Agilent LC/MS Apparatus.
测定条件：ESI Source.
测定结果：(M+H)+m/z 387.2。
1.5.4 X散射图谱见图2.
实施例2
2.1淫羊藿苷与纤维素酶的反应
取淫羊藿苷5g(含量90％以上)，加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH4.8，50uM)的缓冲液中，再加入纤维素酶(综合酶活力≥1.8万u/mL)约5mL，于50℃搅拌24小时。反应结束后，冷却，放置，使沉淀完全。过滤，沉淀物用水洗涤数次。
2.2酶解产物与盐酸溶液的反应：
将上述的酶解产物加入至500mL 1N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按1∶10的体积比配制)，搅拌，逐步升温至60℃，并维持8小时。反应结束后，冷却，放置，使沉淀完全，过滤。沉淀物用水洗至中性。
2.3反应液的后处理：(同实施例1)，得率约为10％。
2.4水合淫羊藿素纯品制备：(同实施例1)
实施例3
3.1淫羊藿苷与盐酸溶液的反应：
取淫羊藿苷5g(含量90％以上)，加入至500mL 1N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按1∶10的体积比配制)，搅拌，逐步升温至80℃，并维持8小时。反应结束后，冷却，放置，使沉淀完全。过滤，沉淀物用水洗涤数次至中性(如无法洗至中性，可用少量NaOH溶液中和酸性)。滤液弃去或留至下次反应用。
3.2盐酸反应产物与纤维素酶的反应
将上述的盐酸反应产物加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH5.5，50uM)的缓冲液中，再加入纤维素酶(综合酶活力≥1.8万u/mL)约5mL，于40℃搅拌32小时。反应结束后，冷却，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，过滤，除去不溶性杂质。
3.3反应液的后处理：(同实施例1)，得率约为20％。
3.4水合淫羊藿素纯品制备：(同实施例1)。
实施例1
1.1淫羊藿苷与盐酸溶液的反应：
取淫羊藿苷5g(含量90％以上)，加入至250mL 3N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按3∶7的体积比配制)，搅拌，逐步升温至80℃，并维持1小时。反应结束后，冷却，放置，使沉淀完全。过滤，沉淀物用水洗涤数次至中性(如无法洗至中性，可用少量NaOH溶液中和酸性)。滤液弃去或留至下次反应用。
1.2盐酸反应产物与纤维素酶的反应
将上述的盐酸反应产物加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH5.0，50uM)的缓冲液中，再加入纤维素酶(综合酶活力≥1.8万u/mL)约5mL，于40℃搅拌36小时。反应结束后，冷却，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，过滤，除去不溶性杂质。
1.3反应液的后处理：
上述乙酸乙酯溶液中加入约50g DM130树脂拌样，回收乙酸乙酯至干。拌样后的树脂加于200g大孔吸附树脂柱上，用50％，60％，70％乙醇溶液依次洗脱，收集含有水合淫羊藿素的馏分，浓缩回收乙醇至小体积，既有水合淫羊藿素沉淀析出。过滤，得水合淫羊藿素粗品约2g，得率约为40％。
1.4水合淫羊藿素纯品制备：
收集到的水合淫羊藿素粗品，用95-98％甲醇600mL加热溶解，过滤除去杂质，浓缩至约150mL，有结晶析出。如此反复用甲醇结晶约6-10次，并用高效液相监测纯度，直至达到药用标准。可得水合淫羊藿素纯品约1.5g。高效液相流动相为乙腈和0.3％磷酸水溶液，比例为52∶48，色谱柱为C18，200×4.6mm，5um。水合淫羊藿素保留时间约为18min。见图1。
1.5结构确证及理化参数：
1.5.1水合淫羊藿素，甲醇-水重结晶，得黄色针状晶体，熔点为238-9℃。
1.5.2 NMR数据
NMR仪器：Brucker AM-400 NMR Spectrometer.
溶剂：DMSO
测试项目：1H，13C，DEPT-135。
测式结果：：1H-NMR：1.18(6H，s)；1.55(2H，m)；2.50(2H，m)；3.85(3H，s)；4.31(1H，s)；6.28(1H，s)；7.09(2H，d，J＝9Hz)；8.23(2H，d，J＝9Hz)；9.50(1H，s)；10.61(1H，s)；12.33(1H，s)。13C-NMR：18.09；29.81；43.58；56.03；69.53；98.46；103.72；107.52；114.64；124.31；129.94；136.55；146.62；154.13；158.75；161.13；162.02；176.95。
1.5.3 Mass数据
MS仪器：Agilent LC/MS Apparatus.
测定条件：ESI Source.
测定结果：(M+H)+m/z 387.2。
1.5.4 X散射图谱见图2.
实施例2
2.1淫羊藿苷与纤维素酶的反应
取淫羊藿苷5g(含量90％以上)，加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH4.8，50uM)的缓冲液中，再加入纤维素酶(综合酶活力≥1.8万u/mL)约5mL，于50℃搅拌24小时。反应结束后，冷却，放置，使沉淀完全。过滤，沉淀物用水洗涤数次。
2.2酶解产物与盐酸溶液的反应：
将上述的酶解产物加入至500mL 1N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按1∶10的体积比配制)，搅拌，逐步升温至60℃，并维持8小时。反应结束后，冷却，放置，使沉淀完全，过滤。沉淀物用水洗至中性。
2.3反应液的后处理：(同实施例1)，得率约为10％。
2.4水合淫羊藿素纯品制备：(同实施例1)
实施例3
3.1淫羊藿苷与盐酸溶液的反应：
取淫羊藿苷5g(含量90％以上)，加入至500mL 1N的盐酸溶液中(浓盐酸与水按1∶10的体积比配制)，搅拌，逐步升温至80℃，并维持8小时。反应结束后，冷却，放置，使沉淀完全。过滤，沉淀物用水洗涤数次至中性(如无法洗至中性，可用少量NaOH溶液中和酸性)。滤液弃去或留至下次反应用。
3.2盐酸反应产物与纤维素酶的反应
将上述的盐酸反应产物加至250mLNaH2PO4-Na2HPO4(pH5.5，50uM)的缓冲液中，再加入纤维素酶(综合酶活力≥1.8万u/mL)约5mL，于40℃搅拌32小时。反应结束后，冷却，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯层，过滤，除去不溶性杂质。
3.3反应液的后处理：(同实施例1)，得率约为20％。
3.4水合淫羊藿素纯品制备：(同实施例1)。