虫草胞外多糖的高效生产及分离纯化方法

摘要

本发明主要目的在于提供一种能够产业化高效生产虫草胞外多糖的培养方法，同时利用膜透析技术快速分离纯化具有生物活性的胞外多糖单一组分，且纯度≥95％，该纯化技术中不使用任何有机溶剂和化学试剂，以充分保证虫草胞外多糖的化学结构不被破坏，从而保持其生物活性。

权利要求

1.一种蛹虫草菌丝体深层发酵高效生产胞外多糖的发酵培养方法，包括以下步骤：在培养基中接入蛹虫草菌种，接种量5％-10％，在22-27℃条件下，静置培养5-9天，其中所用的培养基以重量百分含量计包含：酵母浸出粉0.5-1.5，红糖1-3％，雄蚕蛾油3-5％，KNO30.8-0.95％，MgSO40.1-0.2％和KH2PO40.1-0.2％。

2.一种利用膜透析技术快速分离纯化具有生物活性的胞外多糖的方法，该方法包括以下步骤：(1)利用权利要求1所述的发酵培养方法培养蛹虫草菌种；

(2)过滤培养液，并将滤液在10000-15000rmp/min离心收集上清夜，并对上清夜再过滤一次并收集滤液；

(3)将步骤(2)所得滤液利用0.20-0.45μm过滤膜过滤并收集滤液；

(4)对步骤(3)所得滤液用分子量为0.5万道尔顿的超滤膜高压过滤并收集滤液；

(5)用分子量截留值为1、5、10万道尔顿的不同超滤膜对步骤(4)所得滤液分级高压超滤浓缩，去除超滤液，得到分子量为1-5、5-10万道尔顿的截留浓缩液；

(6)对各组分截留浓缩液通过超低温真空冷冻干燥即得分子量控制在一定范围段的多糖粉。

3.根据权利要求2所述的方法，其中在步骤(4)后利用高效液相检测步骤(4)所得滤液中虫草胞外多糖的分布范围。

说明书

虫草胞外多糖的高效生产及分离纯化方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物发酵及分离纯化领域，具体涉及虫草菌丝体深层发酵高效生产胞外多糖的发酵培养方法及胞外多糖快速分离纯化的方法。

背景技术

[0002] 多糖是动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中的重要组成部分。对多糖的研究，最早是在20世纪40年代，但多糖作为广谱免疫促进剂引起人们极大的重视是在20世纪60年代。经过40多年的不断发展，人们对多糖这一类重要生命物质产生了新的认识，而使这一学科成为目前生命科学中研究最活跃的领域之一。

[0003] 目前，针对虫草多糖的研究主要集中在子实体或菌丝体(胞内)多糖，例如“王尊生，顾宇翔，周丽，袁勤生，俞永信，冬虫夏草(Cordyceps sinensis)菌丝体固体发酵粉化学成分的分析，天然产物研究与开发，2005，17(3)：331-336”、“孙月等，野生蛹虫草与组培蛹虫草子实体的成分测定与分析，辽宁师专学报，1999，1(1)：86-87”、“Shih-Jeng Huang et al，Nonvolatile taste components of fruit bodies and mycelia of Cordyceps militaris(Cordycepsmilitaris的菌丝体和果肉的味觉非易失性组份)，LWT39(2006)577-583”、“温鲁等，蚕虫草不同部位营养与活性成分分析，中国中药杂志，2006，
30(9)：659-661”和“温鲁等，蝉花与有关虫草活性成分检测比较，江苏中医药，2006，27(1)：
45-46”中所述。然而对胞外多糖的研究相对较少，尚处于实验室阶段，主要是利用发酵瓶、摇床等振荡培养，所得多糖含量相对较低，例如“王飞、刘霞、陈明辉，响应面法优化北虫草产多糖液体发酵培养基，安徽农业科学，2007，35(8)：2218-2224”、“陈宏伟、周冰斌、朱蕴兰、刘全德，虫草深层培养产多糖条件的优化及多糖组分的研究，徐州工程学院学报，2005，
20(1)：78-83”和“赵明文、吴燕娜、李玉详等，蛹虫草产胞外多糖的液体优化培养条件研究，中国食用菌，2000，19(4)：30-32”中所述。由于高效生产虫草胞外多糖的深层发酵培养条件及优良的分离纯化技术尚不完善，胞外多糖的理化性质及其生物活性功能与胞内多糖之间的差异研究目前还处于探索阶段，导致胞外多糖尚未能产业化生产。而在子实体多糖的分离纯化中，常用有机溶剂、化学试剂进行抽提、沉淀、脱脂、脱色等处理，例如“车振明等，人工蛹虫草子实体多糖分离最佳工艺研究，食品研究与开发，2004，25(5)：78-79”、“娄虹等，蛹虫草大米培养基中活性多糖的提取及免疫调节功能研究，46，特产研究”、“潘中华等，家蚕蛹虫草多糖的提取及纯化工艺研究，中国蚕业，2002，23(4)：20-21”、“肖建辉等，古尼拟青霉胞内多糖的提取分离工艺及条件，山地农业生物学，2003，22(2)：140-145”、“李连德等，地生枝顶孢(AT01)多糖提取工艺的研究，生物学杂志，1999，16(6)：22”、“Shao P.Li et al.A polysaccharide isolatedfrom Cordyceps sinensis，a traditional Chinese medicine，protects PC 12 cells against hydrogenperoxide-induced injury( 从Cordyceps sinensis、中药中分离的多糖保护PC12细胞免受过氧化氢引起的损伤).Life Sciences 2003，73：2503-2513” 和“Rongmin Yu et al.Isolation，purificationand identification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris(得自培养的Cordycepsmilitaris的多糖的分离、纯化和鉴定).Fitoterapia 2004，75：662-666”中所述。不仅破坏了多糖的结构、使其生物活性遭到极大的破坏，同时提高了产业化生产成本，造成了环境污染。现代药理学研究发现，虫草多糖的生物活性功能与其分子量、分子结构等具有直接相关性，因此若要充分发挥虫草多糖的生物活性，必须在提高虫草多糖产量的同时，改进分离纯化技术，保证虫草多糖的纯度，同时维持其天然结构不被破坏。

发明内容

[0004] 为了解决上述问题，本发明的主要目的在于提供一种能够产业化高效生产虫草胞外多糖的蛹虫草培养方法，还提供了一种利用膜透析技术快速分离纯化具有生物活性的胞外多糖单一组分的方法，该方法不使用任何有机溶剂和化学试剂，充分保证了虫草胞外多糖的化学结构不被破坏。

[0005] 本发明可以利用常用的蛹虫草菌种，采用不同培养方式及新研制的培养基配方培养，控制适宜的温度等培养条件，筛选得到了虫草胞外多糖高产量的最优化培养条件；同时研究出了一种能够对产生的胞外多糖利用不同分子量的超滤膜截留分离，通过高效液相色谱技术检测，获得纯度高、均一性好的活性多糖的方法。

[0006] 其中，蛹虫草菌种为本领域常用菌种，可以是市场上能够购买到的任意蛹虫草菌种，例如本发明实施例中所用到的蛹虫草菌种购买自山东省济宁市梁山县灵芝虫草科技开发有限公司。

[0007] 本发明的一个目的是提供一种蛹虫草菌种的蛹虫草菌丝体深层发酵高效生产胞外多糖的发酵培养方法，该方法包括静置培养步骤，具体操作是在培养基中接入蛹虫草菌种，接种量5％-10％，在22-27℃条件下，静置培养5-9天，其中所用的培养基包含(重量百分含量)：酵母浸出粉0.5-1.5，红糖1-3％，雄蚕蛾油3-5％，KNO3 0.8-0.95％，MgSO40.1-0.2％和KH2PO40.1-0.2％。

[0008] 本发明的另一个目的是提供一种利用膜透析技术快速分离纯化具有生物活性的胞外多糖单一组分的方法，该方法不使用任何有机溶剂和化学试剂，充分保证虫草胞外多糖的化学结构不被破坏，且纯度达95％以上。该方法具体包括以下步骤：

[0009] (1)静置培养菌种：在培养基中接入蛹虫草菌种，接种量5％-10％，在22-27℃条件下，培养5-9天，其中所用的培养基包含(重量百分含量)：酵母浸出粉0.5-1.5，红糖1-3％，雄蚕蛾油3-5％，KNO3 0.8-0.95％，MgSO4 0.1-0.2％和KH2PO4 0.1-0.2％。

[0010] (2)过滤培养液，并将滤液在10000-15000rmp/min离心收集上清夜，除去培养基中固态杂质，并对上清夜再过滤一次并收集滤液；

[0011] (3)将步骤(2)所得滤液利用0.20-0.45μm过滤膜过滤并收集滤液，该步骤除去了滤液中的悬浮颗粒杂质；

[0012] (4)对步骤(3)所得滤液用分子量为0.5万道尔顿的超滤膜高压过滤并收集滤液，该步骤除去滤液中色素、培养基中小分子量的糖、肽等杂质；

[0013] (5)用分子量截留值为1、5、10万道尔顿的不同超滤膜对步骤(4)所得滤液分级高压超滤浓缩，去除超滤液，得到分子量为1-5、5-10万道尔顿的截留浓缩液；

[0014] (6)对各组分截留浓缩液通过超低温真空冷冻干燥即得分子量控制在一定范围段的多糖粉；其中在步骤(4)后可以利用高效液相检测步骤(4)所得滤液中虫草胞外多糖的分布范围。

[0015] 该方法不使用任何有机溶剂和化学试剂，以充分保证虫草胞外多糖的化学结构不被破坏，且胞外多糖的纯度达95％以上。对于终产物的检测是通过HPLC检测，检测结果如图。

附图说明

[0016] 图1蛹虫草胞外粗多糖HPLC分布图谱。

[0017] 图2分子量分布于5-10万道尔顿的蛹虫草胞外多糖HPLC检测图谱。

[0018] 图3分子量分布于1-5万道尔顿的蛹虫草胞外多糖HPLC检测图谱。具体实施方方式

[0019] 实施例1

[0020] 在5升的培养瓶中，接种蛹虫草菌，接种量10％，培养基的量为：3升，按培养基酵母浸出粉1.5％，红糖2.5％，雄蚕蛾油5％，KNO3 0.95％，MgSO4 0.2％，KH2PO4 0.2％的配方，静置培养8天。对所得培养液普通滤纸过滤，滤液12000rmp/min离心，得滤液用0.22μm滤过膜过滤，滤液继续用分子量为0.5万道尔顿的超滤膜高压过滤，后用分子量截留值为1、5、10万道尔顿的不同超滤膜对所得滤液分级高压超滤浓缩，对所得截留浓缩液真空冷冻干燥即得分子量分布均一、纯度≥95％的单一组分。

[0021] 实施例2

[0022] 在50升的发酵罐，接种蛹虫草菌，接种量6％，发酵罐培养基的量为：30升，按培养基酵母浸出粉0.8％，红糖1.5％，雄蚕蛾油4％，KNO3 0.85％，MgSO4 0.1％，KH2PO4 0.1％的配方，静置培养6天。对所得培养液普通滤纸过滤，滤液12000rmp/min离心，得滤液用0.22μm滤过膜过滤，滤液继续用分子量为0.5万道尔顿的超滤膜高压过滤，后用分子量截留值为1、5、10万道尔顿的不同超滤膜对所得滤液分级高压超滤浓缩，对所得截留浓缩液真空冷冻干燥即得分子量分布均一、纯度≥95％的单一组分。

[0023] 实施例3

[0024] 在100升的发酵罐，接种蛹虫草菌，接种量8％，发酵罐培养基的量为：60升，按培养基酵母浸出粉1％，红糖2.0％，雄蚕蛾油3％，KNO3 0.88％，MgSO4 0.15％，KH2PO4 0.15％的配方，静置培养7天。对所得培养液普通滤纸过滤，滤液12000rmp/min离心，得滤液用0.22μm滤过膜过滤，滤液继续用分子量为0.5万道尔顿的超滤膜高压过滤，后用分子量截留值为1、5、10万道尔顿的不同超滤膜对所得滤液分级高压超滤浓缩，对所得截留浓缩液真空冷冻干燥即得分子量分布均一、纯度≥95％的单一组分。

[0025] 本发明的有益效果。通过本发明方法获得虫草胞外多糖具有如下有益效果，如下表1-4：

[0026] 表1.相同条件下振荡、静置两种培养方式对蛹虫草胞外多糖的产量影响[0027]蛹虫草胞外多糖含量(g/L)
振荡培养 静置培养
1.9736 3.9956

[0028] 表2.不同碳源对蛹虫草多糖产量的影响

[0029]多糖含量(g/L)
碳源
振荡培养 静置培养
白砂糖 3.3462 4.1906
红糖 4.1186 5.7643
蔗糖 2.1589 2.7220
葡萄糖 1.3797 4.1131
玉米粉 0.9319 1.0742
麦胚 1.1593 1.2716
荞麦粉 0.9135 1.4031

[0030] 表3.不同氮源对蛹虫草胞外多糖产量的影响

[0031]多糖含量(g/L)
氮源
振荡培养 静置培养
蛋白胨 1.6866 2.8198
蚕蛹粉 1.4842 5.7950
黄豆粉 1.3555 3.0790
酵母粉 1.5183 2.4742
KNO3 1.5345 5.7950
NH4NO3 1.5513 3.4530
酵母膏 1.8044 5.7950
酵母浸出粉 2.1984 2.9155

[0032] 表4.不同蚕蛾油对蛹虫草胞外多糖产量的影响

[0033]

[0034] 表1-4表明了通过本发明的静置培养菌种能够提高胞外多糖的产量，在培养基成分中，红糖、蚕蛹粉、KNO3、酵母膏、雄蚕蛾油更适合于本发明的方法，能够使得胞外多糖的含量提高。